Summary
Aqui, apresentamos um protocolo robusto para quantificar 40 compostos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia em reações de síntese de proteínas livres de células. A mistura de síntese livre de células é derivada com aniline para separação eficaz usando cromatografia líquida de fase invertida e, em seguida, quantificada pela espectrometria de massa usando padrões internos isotópicos rotulados.
Abstract
A síntese de proteínas livres de células (CFPS) é uma tecnologia emergente em sistemas e biologia sintética para a produção in vitro de proteínas. No entanto, se cfps vai ir além do laboratório e se tornar um padrão generalizado e apenas no tempo de fabricação de tecnologia, temos de compreender os limites de desempenho desses sistemas. Em relação a essa questão, desenvolvemos um protocolo robusto para quantificar 40 compostos envolvidos na glicolíse, a via de fosfato de pentose, o ciclo de ácido tricarboxílico, o metabolismo energético e a regeneração do cofator nas reações da CFPS. O método utiliza padrões internos marcados com 13C-aniline, enquanto os compostos na amostra são derivados com 12C-aniline. Os padrões internos e a amostra foram mistos e analisados por cromatografia líquida de fase invertida-espectrometria de massa (LC/MS). A co-elução de compostos eliminou a supressão de íons, permitindo a quantificação precisa de concentrações de metabolizados em 2-3 ordens de magnitude, onde o coeficiente de correlação média foi de 0,988. Cinco dos quarenta compostos não foram marcados com aniline, entretanto, foram detectados ainda na amostra de CFPS e quantificados com um método padrão da curva. A corrida cromatográfica leva aproximadamente 10 min para ser concluída. Em conjunto, desenvolvemos um método rápido e robusto para separar e quantificar com precisão 40 compostos envolvidos no CFPS em uma única execução lc/ms. O método é uma abordagem abrangente e precisa para caracterizar o metabolismo livre de células, de modo que, em última análise, podemos entender e melhorar o rendimento, produtividade e eficiência energética dos sistemas livres de células.
Introduction
A síntese de proteínas livres de células (CFPS) é uma plataforma promissora para a fabricação de proteínas e produtos químicos, uma aplicação que tradicionalmente tem sido reservada para células vivas. Sistemas livres de células são derivados de extratos de células brutas e eliminar as complicações associadas com o crescimento celular1. Além disso, o CFPS permite o acesso direto aos metabólitos e às máquinas biossintéticas sem a interferência de uma parede celular. No entanto, tem faltado uma compreensão fundamental dos limites de desempenho dos processos livres de células. Métodos de alta taxa de produção para quantificação de metabólitos são valiosos para a caracterização do metabolismo e são fundamentais para a construção de modelos computacionais metabólicos2,3,4. Os métodos comuns usados para determinar concentrações de metabolizados incluem ressonância magnética nuclear (RM), espectroscopia transformo-infravermelha de Fourier (FT-IR), ensaios baseados em enzimas e espectrometria de massa (MS)5,6,7 8. No entanto, estes métodos são muitas vezes limitados pela sua incapacidade de medir eficientemente vários compostos de uma só vez e muitas vezes exigem um tamanho amostral maior do que as reações típicas livres de células. Por exemplo, ensaios baseados em enzimas muitas vezes só podem ser usados para quantificar um único composto em uma corrida, e são limitados quando o tamanho da amostra é pequeno, como em reações de síntese de proteínas livres de células (normalmente executado em uma escala de 10-15 μL). Enquanto isso, nmr requer uma alta abundância de metabólitos para detecção e quantificação5. Para essas deficiências, os métodos de cromatografia em conjunto com a espectrometria de massa (LC/MS) fornecem várias vantagens, incluindo alta sensibilidade e a capacidade de medir várias espécies simultaneamente9; no entanto, a complexidade analítica aumenta consideravelmente com o número e a diversidade de espécies sendo medidos. É importante, portanto, desenvolver métodos que realizem plenamente o potencial de alta taxa de veiviação dos sistemas LC/MS. Os compostos em uma amostra são separados pela cromatografia líquida e identificados através da espectrometria de massa. O sinal do composto depende de sua eficiência de concentração e ionização, onde a ionização pode variar entre compostos e também pode depender da matriz da amostra.
Alcançar a mesma eficiência de ionização entre a amostra e os padrões é um desafio ao usar LC/MS para quantificar os analitos. Além disso, a quantificação torna-se mais desafiadora com a diversidade de metabólitos devido à divisão de sinais e heterogeneidade na afinidade e polaridade de prótons10. Por fim, a matriz de co-eluting da amostra também pode afetar a eficiência de ionização dos compostos. Para resolver esses problemas, os metabólitos podem ser quimicamente derivatizados, aumentando a resolução e sensibilidade de separação por sistemas LC/MS, ao mesmo tempo em que diminuem a divisão de sinais em alguns casos10,11. A derivatização química funciona marcando grupos funcionais específicos de metabólitos para ajustar suas propriedades físicas, como carga ou hidrofóbica, para aumentar a eficiência de ionização11. Vários agentes de marcação podem ser usados para atingir diferentes grupos funcionais (por exemplo, aminas, hidroxils, fosfatos, ácidos carboxílicos, etc.). Aniline, um tal agente de derivatização, tem como alvo vários grupos funcionais ao mesmo tempo, e adiciona um componente hidrofóbico em moléculas hidrofílicas, aumentando assim a sua resolução de separação e sinal12. Para abordar o efeito de supressão de íons de matriz cooperativa, Yang e colegas de trabalho desenvolveram uma técnica baseada na rotulagem da Tecnologia De Padrão Interno Específico do Grupo (GSIST), onde os padrões são marcados com isótopos aniline 13C e misturados com a amostra 12,13. O metabolito e o padrão interno correspondente têm a mesma eficiência de ionização desde que co-elute, e sua razão de intensidade pode ser usada para quantificar a concentração na amostra experimental.
Neste estudo, desenvolvemos um protocolo para detectar e quantificar 40 compostos envolvidos na glicolíse, a via de fosfato de pentose, o ciclo de ácido tricarboxílico, metabolismo energético e regeneração de cofator em reações de CFPS. O método é baseado na abordagem GSIST, onde usamos 12C-aniline e 13C-aniline para marcar, detectar e quantificar metabólitos usando LC/MS de fase invertida. A escala linear de todos os compostos mediu 2-3 ordens do valor com um coeficiente médio da correlação de 0.988. Assim, o método é uma abordagem robusta e precisa para interrogar o metabolismo livre de células e, possivelmente, extratos de células inteiras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação de reagentes para marcação de aniline
- Prepare uma solução aniline de 6 M no pH 4.5. Trabalhando em um capô, combinar 550 μL de aniline com 337,5 μL de água grau LCMS e 112,5 μL de 12 M ácido clorídrico (HCl) em um tubo de centrífuga. Vortex bem e armazenar a 4 °C.
NOTA: A aniline pode ser armazenada a 4 °C por 2 meses.
CUIDADO: Aniline é altamente tóxico e deve ser trabalhado com em um capô de fumaça. O ácido clorídrico é altamente corrosivo - Prepare uma solução aniline 6 M 13C no pH 4.5. Combine 250 mg de 13C6-aniline com 132 μL de água e 44 μL de 12 M HCl. Vortex bem e armazenar a 4 °C.
- Prepare 200 mg/mL N-(3-dimetilaminopropyl)-N-etilcarbodiimide hidrochloride (EDC) solução. Dissolva 2 mg de EDC em 10 μL de água para cada amostra a ser marcada e vórtice bem.
NOTA: A solução EDC deve ser preparada no mesmo dia da reação. Edc atua como um catalisador para a derivatização de compostos com aniline12.
2. Preparação de normas
- Faça soluções de estoque separadas de todos os compostos dissolvidos em água de grau LC/MS(Tabela 1).
-
Preparação da solução de ações padrão interno
- Combine todos os compostos com exceção do dinucleotídeo de adenina (NAD), fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida adenina (NADP), flavin adenina dinucleotídeo (FAD), coenzima acetil A (ACA) e glicerol 3-fosfato (Gly3P), com os volumes apropriados para criar uma solução de estoque de 2 mM de todos os compostos.
- Combine NAD, NADP, FAD, ACA e Gly3P com os volumes apropriados para criar uma solução de estoque de 2 mM.
3. Preparação daamostra (Figura 1)
- Saciar e precipitar as proteínas em uma reação de síntese de proteínas livre de células, adicionando um volume igual de etanol gelado 100% à reação. Centrífuga a amostra a 12.000 x g por 15 min a 4 °C. Transfira o supernatant para um novo tubo de centrífuga.
NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -80 °C neste momento e analisadas em um momento posterior
4. Reação de rotulagem
-
Amostra de rotulagem com solução 12C-animenais
- Transfira 6 μL de amostra em um novo tubo de centrífuga e elevará o volume para 50 μL comágua.
NOTA: O tamanho da amostra de volume pode depender da reação específica do CFPS. - Adicione 5 μL de 200 mg/mL solução EDC.
- Adicione 5 μL de 12solução c-aninilina.
NOTA: A solução de aniline separa em duas fases. Misture bem antes de adicionar à reação. - Vortex a reação com agitação suave por 2 h à temperatura ambiente.
- Após 2 h, retire os tubos da coqueteleira e adicione 1,5 μL de trietimamina (TEA) à reação em um capô de fumaça.
NOTA: Trietimamina levanta o pH da solução que pára a reação de marcação de aniline e estabiliza os compostos.
CUIDADO: A trietimamina é tóxica e causa irritação dos olhos e do trato respiratório. - Centrífuga a 13.500 x g por 3 min.
- Transfira 6 μL de amostra em um novo tubo de centrífuga e elevará o volume para 50 μL comágua.
-
Rotulagem de padrões internos com 13solução c-animenaline
- Diluir a solução de estoque interno para 80 μM com um volume final de 50 μL.
NOTA: A concentração de padrões internos pode ser ajustada a níveis próximos à amostra experimental. - Adicione 5 μL de 200 mg/mL solução EDC.
- Adicione 5 μL de 13solução c-aninilina.
- Vortex a reação com agitação suave por 2 h à temperatura ambiente.
- Após 2 h, retire os tubos da coqueteleira e adicione 1,5 μL de CHÁ à reação em um capô de fumaça.
- Centrífuga a 13.500 x g por 3 min.
- Diluir a solução de estoque interno para 80 μM com um volume final de 50 μL.
-
Combinando padrão interno marcado e amostra marcada
- Misture 25 μL de 12amostra rotulada de aninilidade C com 25 μL de 13padrão de metais C.
- Transfira para um frasco de amostra automática e analise pelo procedimento LC/MS.
-
Criando uma curva padrão para metabólitos não marcados
- Solução de estoque diluído de metabólitos não escalonados (NAD, NADP, FAD, ACA e Gly3P) para concentrações finais de 320 μM, 80 μM, 20 μM e 5 μM com um volume de 50 μL.
- Adicione 5 μL de 200 mg/mL solução EDC.
- Adicione 5 μL de 12solução c-aninilina.
- Vortex a reação com agitação suave por 2 h à temperatura ambiente.
- Após 2 h, retire os tubos da coqueteleira e adicione 1,5 μL de CHÁ à reação em um capô de fumaça.
- Centrífuga a 13.500 x g por 3 min.
- Transfira o supernatant a um frasco do auto-sampler e analise pelo procedimento do LC/MS.
NOTA: Os metabólitos não marcados seguem o mesmo procedimento que a amostra para replicar a matriz da amostra, a fim de manter a eficiência de ionização semelhante.
5. Configuração do procedimento LC/MS
-
Preparação de solventes
- Prepare 5 m tri-butilamina (TBA) solução aquosa ajustada ao pH 4.75 com ácido acético.
NOTA: TBA na fase móvel ajuda os analitistas alcançar boa resolução e separação14. - Prepare 5 mM TBA em acetônio (ACN).
- Prepare o solvente da lavagem com água de 5% e 95% ACN.
- Prepare o solvente da remoção com água de 95% e 5% ACN.
- Prepare 5 m tri-butilamina (TBA) solução aquosa ajustada ao pH 4.75 com ácido acético.
- Criação das condições da EM
- Defina o espectrômetro de massa para o modo de íon negativo com uma temperatura de sonda de 520 °C, tensão capilar negativa de -0,8 kV, tensão capilar positiva de 0,8 kV e defina o software para adquirir dados em 5 pontos/s.
- Defina gravações de íons selecionados (SIR) para cada metabólito com tensões de cone especificadas e valores de massa acima da carga (m/z). Veja a Tabela 1.
-
Inicialização da LC/MS de acordo com as instruções do fabricante
- Primeiras linhas solventes no gerente de solvente por 3 min.
- Solvente de lavagem prime (5% de água, 95% ACN) e solvente de purga (95% de água, 5% ACN) para 15 s por 5 ciclos.
- Defina o gerente da amostra a 10 °C.
- Instale uma coluna C18 (1,7μm, 2,1mm x 150mm) e ininicialize a coluna com 100% ACN a 0,3 mL/min por 10 min.
- Condicionar a coluna em 95% de água e 5% ACN em 0,3 mL/min por 10 minutos antes da introdução de solventes com buffers.
- Condicionar a coluna a 95% solvente A (5mM TBA aquoso, pH 4.75) e 5% solvente B (5 mM TBA em ACN) em 0.3 mL/min por 10 min.
- Configure um protocolo de gradiente com a elução a partir de 95% solvente A e 5% solvente B, aumentado para 70% solvente B em 10 min, aumentado para 100% solvente B em 2 min e mantido em 100% solvente B por 3 min. Retorno às condições iniciais (95% solvente A , 5% solvente B) mais de 1 min e segurar por 9 min para reequilibrar a coluna.
- Condicionar a coluna com o protocolo de gradiente 3 vezes antes de quaisquer injeções na coluna.
-
Injetar amostra e padrões
- Injete 5 μL da amostra na coluna e adquira as intensidades apropriadas do íon do m/z para a amostra marcada 12C-aniline.
- Injete 5 μL da mesma amostra novamente, mas desta vez adquirir as intensidades de íons m/z para os 13padrões marcados c-aniline.
NOTA: Nosso sistema LC/MS é incapaz de adquirir intensidades de 12C e 13C m/z nas janelas de tempo SIR especificadas, uma vez que são dados demais para adquirir na janela de tempo especificada. Portanto, injetamos a mesma amostra duas vezes. - Injete padrões de metabolizados não marcados da menor concentração para a mais alta e registre as intensidades adequadas de íons m/z.
6. Quantificação
- Criação do método de exportação
- No software de aquisição de dados, selecione Arquivo > Novo Método > Métodode Exportação .
- Especifique um nome de arquivo, como AnilineTagging_Date.
- Verifique o Arquivo Export ASCII e escolha um diretório para exportar o arquivo de texto para.
- No tipo de relatório,selecione resumo por todos.
- Em Delimiters,para coluna selecione a,. Para Row,selecione [cr][se].
- Na tabela,selecione exportação e, em seguida, eitie tabela para incluir SampleName, Área, Altura, Quantidade e Unidades.
- Salvar o método de exportação.
- Quantificar metabólitos com padrões internos usando software de aquisição de dados
- De acordo com a guia Sample Sets, clique na execução LC/MS correspondente e selecione View as > Canais.
- Selecione todos os canais SIR para os 13padrões internos c-aniline de uma injeção, clique certo e revisãoselecionada.
- Se a janela de layout do método de processamento LC não aparecer automaticamente, acesse o Layout do Método de Processamento View >.
- No layout do método de processamento,acesse a guia integração e defina o ApexTrack como algoritmo.
- Vá para a guia de suavização e definir o tipo de média e o nível de suavização para 13.
NOTA: Qualquer nível de suavização pode ser selecionado, desde que seja consistente em todas as amostras. - Na aba MS Channel, desabilitar MS 3D Processing.
- Na janela do canal SIR, integrar cada pico, um canal de cada vez. Uma vez que um pico é integrado, vá para opções > Preencha a partir do resultado e os detalhes do pico serão preenchidos na guia Componentes. Alterar o nome de pico para o nome composto correspondente.
- Uma vez que todos os canais SIR foram avaliados, salvar o método de processamento e fechar janela.
- Selecione todos os canais SIR da amostra 13C-aniline e 12com marcação C-aniline, clique direito e processoseleto.
- Verifique a caixa de processo, selecione use o método de processamento especificadoe escolha o método de processamento que é apenas salvo. Verifique também a caixa de exportação, selecione método de exportação especificado use e escolha o método de exportação salvo criado anteriormente. Clique ok.
- Abra o arquivo de texto exportado com o Excel e calcule a concentração do composto desconhecido usando:
onde Cx, i é a concentração da amostra desconhecida para metabólito i, Ax,i é a área integrada do metabolito desconhecido i, Astd,i é a área integrada do padrão interno de metabolito i, Cstd, i é o concentração do padrão interno de metabólito i, e D é o fator de diluição.
- Quantificar metabólitos não marcados com curva padrão
- De acordo com a guia Sample Sets, clique na execução LC/MS correspondente e selecione View as > Canais.
- Selecione todos os canais SIR para os padrões não marcados de uma injeção, clique certo e selecione Revisão.
- Se a janela de layout do método de processamento LC não aparecer automaticamente, acesse o Layout do Método de Processamento View >.
- No layout do método de processamento, acesse a guia integração e defina o ApexTrack como algoritmo.
- Vá para a guia de suavização e definir o tipo de média e o nível de suavização para 13.
NOTA: Qualquer nível de suavização pode ser selecionado, desde que seja consistente em todas as amostras. - Na aba MS Channel, desabilitar MS 3D Processing.
- Na janela do canal SIR, integrar cada pico, um canal de cada vez. Uma vez que um pico é integrado, vá para opções > Preencha a partir do resultado e os detalhes do pico serão preenchidos na guia Componentes. Alterar o nome de pico para o nome composto correspondente.
- Uma vez que todos os canais SIR foram avaliados, salvar o método de processamento e fechar janela.
- De acordo com a guia Sample Sets, clique no conjunto de amostras e selecione Alter Sample.
- Selecione valor na nova janela.
- Selecione a cópia do método Process e escolha o método de processo que acabou de ser salvo.
- Digite a concentração de cada metabólito para cada frasco e entre na unidade como <μM para cada componente (ou a unidade correspondente) e selecione OK.
- Selecione a amostra definida novamente, clique direito, Ver como > Canais.
- Selecione todos os canais SIR dos metabólitos não marcados para os padrões, clique direito e processoseleto.
- Verifique a caixa do processo e escolha o método de processamento especificadouse. Selecione o método de processamento apropriado e clique em OK.
- Selecione os canais SIR para todos os metabólitos não marcados para as amostras, clique direito e processoselecionado.
- Verifique a caixa do processo, selecione use o método de processamento especificado e escolha o método de processamento que acabou de ser salvo. Verifique também a caixa de exportação, selecione método de exportação especificado use e escolha o método de exportação salvo criado anteriormente. Clique OK.
- Quantifique os metabólitos não escalonados com a curva padrão e exporte os resultados para um arquivo de texto para o diretório especificado.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Como prova de conceito, usamos o protocolo para quantificar metabólitos em um sistema cfps baseado em E. coli expressando proteína fluorescente verde (GFP). A reação do CFPS (14 μL) foi saciada e desproteinizada com etanol. A amostra cfps foi então marcada com 12C-aniline, enquanto os padrões foram marcados com 13C-aniline. A amostra e os padrões marcados foram então combinados e injetados no LC/MS (Figura 1). O protocolo detectou e quantificou 40 metabólitos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia utilizando normas internas, enquanto também foi desenvolvida uma curva padrão para 5 dos metabólitos que não foram marcados com aniline (Figura 2). Os diversos metabólitos envolvidos nessas vias foram uma classe de açúcares fosforilados, ácidos fosforcarboxílicos, ácidos carboxílicos, nucleotídeos e cofatores. A derivatização com aniline introduziu uma moiety hidrofóbica em moléculas hidrofílicas que facilitaram uma separação mais eficaz usando cromatografia de fase invertida12. Além disso, o método possibilitou a separação de pares de isômeros estruturais, como glicose 6-fosfato e frutose 6-fosfato em uma única execução LC/MS. A relação de carga excessiva de cada composto (m/z) e o tempo de retenção foram identificados antes do experimento injetando 1 mM de um composto de cada vez e comparando o espectro de massa com o espaço em branco(Tabela 1).
O limite de detecção e alcance de linearidade para todos os compostos foi estimado pela produção de uma curva padrão que variou de 0,10 μM a 400 μM(Tabela 2). O coeficiente de correlação média (R2)para todos os compostos foi de 0,988 e a maioria dos compostos tinha uma faixa linear de 3 ordens de magnitude. Três compostos tiveram efeitos notáveis da saturação, especial alfa-ketoglutarate que tiveram uma escala linear de 0.1 μM a 25 μM. Isocitrate e citrate igualmente tiveram efeitos da saturação acima de 100 μM.
Figura 1: Esquemático do fluxo de trabalho para marcação de aniline. A reação de síntese de proteína sem células é desproteinizada e marcada com 12C-aniline, enquanto uma mistura de estoque padrão é marcada com 13C-aniline. Ambas as misturas são então misturadas em uma relação volumétrica de 1:1 e analisadas pela LC/MS. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Cromatogramas de íons selecionados sobrepostos para 40 metabólitos. Cromatograma de massa de uma única série LC/MS de uma mistura padrão de 40 μM de 40 metabólitos. Os picos foram identificados por seu tempo de retenção e valores de m/z para cada composto. Nomes compostos completos e suas abreviaturas estão listados na Tabela 1. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
| Número de pico | Metabólito | Abreviação | Id KEGG | Tempo de retenção (min) | 12C m/z 12C m/z | 13C m/z 13C m/z | não-rótulo m/z | Cv | MS Espécies | |
| 1 | Glicerol 3-fosfato | Gly3P Gly3P | C00093 C00093 | 3.85 | 153 | 10 | M - H2O - H | |||
| 2 | Dinucleotídeo de adenina nicotinamida | Nad | C00003 C00003 | 3.96 | 698 | 10 | M + Cl - H | |||
| 3 | Glicose | Glc | C00031 C00031 | 4.06 | 289.9 | 296 | 15 | M + A + Cl - H | ||
| 4 | Sedoheptulose 7-fosfato | S7P S7P | C05382 C05382 | 5.41 | 364 | 370 | 10 | M + A - H | ||
| 5 | Frutose 6-fosfato | F6P F6P | C00085 C00085 | 5.48 | 334 | 340 | 10 | M + A - H | ||
| 6 | Monofosfato guanosina | Gmp | C00144 C00144 | 5.57 | 437.05 | 443 | 10 | M + A - H | ||
| 7 | Ribulose 5-fosfato | RL5P RL5P | C00199 C00199 | 5.58 | 304 | 310 | 10 | M + A - H | ||
| 8 | Monofosfato de cianofosfato | Cmp | C00055 C00055 | 5.59 | 397.09 | 403 | 10 | M + A - H | ||
| 9 | Lactato | Lac | C00186 C00186 | 5.77 | 164.05 | 170 | 10 | M + A - H | ||
| 10 | Monofosfato de adenosina | Amp | C00020 C00020 | 5.85 | 421.1 | 427.1 | 10 | M + A - H | ||
| 11 | Uridine monofosfato | Ump | C00105 C00105 | 5.88 | 398.07 | 404 | 10 | M + A - H | ||
| 12 | Fosfato de dinucleotídeo de adenina nicotinamida | NADP NADP | C00006 C00006 | 6.39 | 724 | 10 | M - H2O - H | |||
| 13 | 3-Ácido fosforglicérico | 3PG 3PG 3PG | C00197 C00197 | 6.63 | 242 | 248.06 | 15 | M + A - H2O - H | ||
| 14 | Difosfato de ciana | Cdp | C00112 C00112 | 6.72 | 477 | 483 | 10 | M + A - H | ||
| 15 | Diphosfato guanosina | Pib | C00035 C00035 | 6.87 | 517 | 523 | 10 | M + A - H | ||
| 16 | Difosfato de adenosina | Adp | C00008 C00008 | 6.94 | 501 | 507 | 10 | M + A - H | ||
| 17 | Difosfato de Uridine | Udp | C00015 C00015 | 6.97 | 478 | 484 | 10 | M + A - H | ||
| 18 | Flavin adenine dinucleotídeo | Moda | C00016 C00016 | 7.03 | 784.15 | 15 | M - H | |||
| 19 | Frutose 1,6-bisfosfato | F16P F16P | C05378 C05378 | 7.1 | 395.95 | 402.1 | 10 | M + A - H2O - H | ||
| 20 | Gluconato 6-fosfato | 6PG 6PG | C00345 C00345 | 7.11 | 425.1 | 437 | 10 | M + 2A - H | ||
| 21 | O dinucleotídeo de adenina à nicotinamida reduzido | Nadh | C00004 C00004 | 7.23 | 633.13 | 639.08 | 10 | M + A + H2O - nicotinamida - H | ||
| 22 | Glicose 6-fosfato | G6P G6P | C00668 C00668 | 7.32 | 409.1 | 421.1 | 10 | M + 2A - H | ||
| 23 | Ribose 5-fosfato | R5P R5P | C00117 C00117 | 7.54 | 379.1 | 391.1 | 15 | M + 2A - H | ||
| 24 | Erythrose 4-fosfato | E4P E4P | C00279 C00279 | 7.71 | 348.9 | 361 | 10 | M + 2A - H | ||
| 25 | Triphosfato de ciadina | Ctp | C00075 C00075 | 7.84 | 557 | 563 | 5 | M + A - H | ||
| 26 | Guanosine triphosfato | Gtp | C00044 C00044 | 7.93 | 597 | 603 | 5 | M + A - H | ||
| 27 | Oxalacetate Oxalacetate | OAA OAA | C00036 C00036 | 7.94 | 281 | 293 | 25 | M + 2A - H | ||
| 28 | Alfa-ketoglutarate Alfa-ketoglutarate | Akg | C00026 C00026 | 7.95 | 295 | 307.1 | 15 | M + 2A - H | ||
| 29 | Uridine triphosfato | Utp | C00075 C00075 | 7.97 | 558 | 564 | 10 | M + A - H | ||
| 30 | Triphosfato de adenosina | Atp | C00002 C00002 | 8.03 | 581 | 587 | 15 | M + A - H | ||
| 31 | Fumarate | Fum | C00122 C00122 | 8.09 | 265 | 277.1 | 10 | M + 2A - H | ||
| 32 | Piruvato | Pyr | C00022 C00022 | 8.09 | 162 | 168 | 25 | M + A - H | ||
| 33 | Malato | MAL MAL | C00149 C00149 | 8.09 | 283.06 | 295.15 | 10 | M + 2A - H | ||
| 34 | D-gliceraldeído 3-fosfato | Lacuna | C00118 C00118 | 8.09 | 319 | 331.1 | 5 | M + 2A - H | ||
| 35 | Acetil-coenzima A | Aca | C00024 C00024 | 8.16 | 790 | 10 | M - H2O - H | |||
| 36 | Fosfato de dinucleotídeo de adenina nicotinamida reduzido | Nadph | C00005 C00005 | 8.23 | 694.92 | 700.82 | 10 | M + A - nicotinamida - H | ||
| 37 | Phosphoenolpyruvate Phosphoenolpyruvate | Pep | C00074 C00074 | 8.28 | 317 | 329.1 | 20 | M + 2A - H | ||
| 38 | Succinato | Succ | C00042 C00042 | 8.64 | 267.07 | 279.1 | 15 | M + 2A - H | ||
| 39 | Isocitão | Icit | C00311 C00311 | 10.13 | 398 | 416 | 10 | M + 3A - H2O - H | ||
| 40 | Citrato | Cit | C00158 C00158 | 10.46 | 416.1 | 434.06 | 20 | M + 3A - H | ||
Tabela 1: Resultados de identificação e rotulagem de metabólitos. Número de pico correspondente de cada composto, tempo de retenção, valor m/z para espécies não rotuladas, 12C e 13C. MS Species, A significa tag Aniline.
| Pico no. | Metabólito | Abreviação | Id KEGG | Concentração (mM) | SD (n = 3) | Limite de detecção (μM) | Limite da faixa linear (μM) | R^2 R^2 | |
| 1 | Glicerol 3-fosfato | Gly3P Gly3P | C00093 C00093 | 0.377 | 0.034 | 0.1 | 400 | 0.995 | |
| 2 | Dinucleotídeo de adenina nicotinamida | Nad | C00003 C00003 | 0.052 | 0.010 | 0.39 | 400 | 0.993 | |
| 3 | Glicose | Glc | C00031 C00031 | 0.002 | 0.000 | 0.1 | 400 | 0.997 | |
| 4 | Sedoheptulose 7-fosfato | S7P S7P | C05382 C05382 | 0.007 | 0.000 | 0.16 | 400 | 0.988 | |
| 5 | Frutose 6-fosfato | F6P F6P | C00085 C00085 | 0.029 | 0.004 | 0.1 | 400 | 0.986 | |
| 6 | Monofosfato guanosina | Gmp | C00144 C00144 | 0.007 | 0.001 | 0.39 | 100 | 0.992 | |
| 7 | Ribulose 5-fosfato | RL5P RL5P | C00199 C00199 | 0.035 | 0.002 | 0.39 | 400 | 0.996 | |
| 8 | Monofosfato de cianofosfato | Cmp | C00055 C00055 | 0.045 | 0.001 | 0.1 | 100 | 0.992 | |
| 9 | Lactato | Lac | C00186 C00186 | 2.134 | 0.048 | 0.1 | 400 | 0.988 | |
| 10 | Monofosfato de adenosina | Amp | C00020 C00020 | 0.020 | 0.002 | 0.1 | 100 | 0.992 | |
| 11 | Uridine monofosfato | Ump | C00105 C00105 | 0.021 | 0.000 | 0.1 | 100 | 0.997 | |
| 12 | Fosfato de dinucleotídeo de adenina nicotinamida | NADP NADP | C00006 C00006 | 0.014 | 0.002 | 0.34 | 400 | 0.950 | |
| 13 | 3-Ácido fosforglicérico | 3PG 3PG 3PG | C00197 C00197 | 6.125 | 0.239 | 0.1 | 100 | 0.996 | |
| 14 | Difosfato de ciana | Cdp | C00112 C00112 | 0.202 | 0.029 | 0.39 | 400 | 0.997 | |
| 15 | Diphosfato guanosina | Pib | C00035 C00035 | 0.146 | 0.027 | 1.5625 | 400 | 0.984 | |
| 16 | Difosfato de adenosina | Adp | C00008 C00008 | 0.797 | 0.161 | 0.39 | 400 | 0.995 | |
| 17 | Difosfato de Uridine | Udp | C00015 C00015 | 0.212 | 0.036 | 0.39 | 400 | 0.991 | |
| 18 | Flavin adenine dinucleotídeo | Moda | C00016 C00016 | 0.008 | 0.001 | 0.1 | 400 | 0.958 | |
| 19 | Frutose 1,6-bisfosfato | F16P F16P | C05378 C05378 | 3.643 | 0.105 | 0.39 | 400 | 0.989 | |
| 20 | Gluconato 6-fosfato | 6PG 6PG | C00345 C00345 | 0.017 | 0.001 | 0.39 | 400 | 0.989 | |
| 21 | O dinucleotídeo de adenina à nicotinamida reduzido | Nadh | C00004 C00004 | 0.063 | 0.028 | 0.39 | 100 | 0.972 | |
| 22 | Glicose 6-fosfato | G6P G6P | C00668 C00668 | 0.046 | 0.002 | 0.1 | 400 | 0.984 | |
| 23 | Ribose 5-fosfato | R5P R5P | C00117 C00117 | 0.055 | 0.005 | 0.39 | 100 | 0.999 | |
| 24 | Erythrose 4-fosfato | E4P E4P | C00279 C00279 | 0.038 | 0.007 | 0.39 | 400 | 0.979 | |
| 25 | Triphosfato de ciadina | Ctp | C00075 C00075 | 0.896 | 0.078 | 6.25 | 100 | 0.998 | |
| 26 | Guanosine triphosfato | Gtp | C00044 C00044 | 0.870 | 0.109 | 6.25 | 100 | 0.993 | |
| 27 | Oxalacetate Oxalacetate | OAA OAA | C00036 C00036 | 0.023 | 0.008 | 0.56 | 400 | 0.997 | |
| 28 | Alfa-ketoglutarate Alfa-ketoglutarate | Akg | C00026 C00026 | 0.391 | 0.020 | 0.1 | 25 | 0.979 | |
| 29 | Uridine triphosfato | Utp | C00075 C00075 | 0.845 | 0.092 | 1.5625 | 400 | 0.998 | |
| 30 | Triphosfato de adenosina | Atp | C00002 C00002 | 1.557 | 0.188 | 1.5625 | 400 | 0.991 | |
| 31 | Fumarate | Fum | C00122 C00122 | 0.576 | 0.100 | 1.5625 | 100 | 0.999 | |
| 32 | Piruvato | Pyr | C00022 C00022 | 5.813 | 0.804 | 0.39 | 400 | 0.993 | |
| 33 | Malato | MAL MAL | C00149 C00149 | 2.548 | 0.269 | 0.1 | 400 | 0.991 | |
| 34 | D-gliceraldeído 3-fosfato | Lacuna | C00118 C00118 | 2.194 | 0.367 | 0.1 | 100 | 0.974 | |
| 35 | Acetil-coenzima A | Aca | C00024 C00024 | 0.196 | 0.044 | 0.1 | 100 | 0.991 | |
| 36 | Fosfato de dinucleotídeo de adenina nicotinamida reduzido | Nadph | C00005 C00005 | 0.006 | 0.010 | 0.14 | 100 | 0.990 | |
| 37 | Phosphoenolpyruvate Phosphoenolpyruvate | Pep | C00074 C00074 | 3.442 | 0.345 | 0.1 | 100 | 0.962 | |
| 38 | Succinato | Succ | C00042 C00042 | 5.683 | 0.573 | 0.1 | 320 | 0.999 | |
| 39 | Isocitão | Icit | C00311 C00311 | 0.003 | 0.006 | 0.39 | 100 | 0.998 | |
| 40 | Citrato | Cit | C00158 C00158 | 0.002 | 0.001 | 0.1 | 100 | 0.981 | |
Tabela 2: Quantificação de metabólitos em uma amostra representativa do CFPS. A concentração de cada metabólito e o desvio padrão. Limite de detecção, alcance de linearidade e coeficiente de correlação identificado a partir de curvas padrão.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Os sistemas livres de células não têm parede celular, portanto, há acesso direto a metabólitos e as máquinas biossintéticas sem a necessidade de preparação complexa da amostra. No entanto, muito pouco trabalho tem sido feito para desenvolver protocolos completos e robustos para interrogar quantitativamente sistemas de reação livres de células. Neste estudo, desenvolvemos um método rápido e robusto para quantificar metabólitos em misturas de reação livre de células e potencialmente em extratos de células inteiras. Quantificação individual de metabólitos em misturas complexas, como as encontradas em reações livres de células, ou extratos de células inteiras, é um desafio por várias razões. Central entre estas razões é a diversidade química. A matriz de grupos funcionais simultaneamente presentes nessas misturas (por exemplo, ácidos carboxílicos, aminas, fosfatos, hidroxils, etc.) aumenta muito a complexidade analítica. Para contornar isso, usamos um método de derivatização de aniline em combinação com padrões internos de 13C para introduzir componentes hidrofóbicos nas misturas de metabólitos. Usando este método, detectamos e quantificamos robustamente 40 metabólitos em uma reação livre de células em uma única execução lc/ms. O protocolo marcou 35 dos 40 compostos neste estudo, enquanto os 5 compostos restantes foram quantificados com um método de curva padrão. Trabalhos anteriores sugeriram que as condições de reação formavam um sal intramolecular entre o grupo de amina e fosfato que inibia a derivatização12. As condições de reação não foram identificadas para derivatização simultânea de todos os 40 compostos; no entanto, a alternativa atual é a quantificação com um método de curva padrão. Embora demonstreos essa técnica em uma mistura de reação livre de células, ela também provavelmente poderia ser aplicada a extratos de células inteiras, permitindo, portanto, potencialmente a quantificação absoluta das concentrações de metabólitos intracelulares. Esta última aplicação tem relevância para uma variedade de questões importantes em biotecnologia e saúde humana.
O método apresentado aqui foi baseado em uma técnica anterior (GSIST) que foi aplicada a extratos de células inteiras do fermento S. cerevisiae12,13. Neste estudo, expandimos o número de compostos que poderiam ser detectados e quantificados, incluindo todos os 12 nucleotídeos (xMP, xDP, xTP, onde x é A, C, G e U). A adição destes compostos pode ter implicações biológicas importantes. Por exemplo, esses nucleotídeos estão fortemente envolvidos em processos de transcrição e tradução, que é um dos processos centrais de interesse em aplicações cfps, e mais geralmente os compostos são importantes em uma variedade de funções fisiológicas. Além disso, fomos capazes de detectar ácido acético que é um metabólito importante ao examinar o metabolismo do transbordamento. No entanto, não incluímos no estudo porque houve uma redução significativa do sinal em vários compostos, especialmente o dinucleotídeo de adenina à nicotina reduzido (NADH) e o fosfato de dinucleotídeo de adenina à nicotina reduzido (NADPH) quando o ácido acético foi adicionado à mistura padrão. O ácido acético tinha um alto limite de detecção de 612 μM, assim, nesses altos níveis, teve um efeito negativo sobre os sinais dos outros metabólitos. Apesar disso, o ácido acético ainda pode ser detectado e quantificado em amostras, criando uma curva padrão com apenas ácido acético no frasco. O ácido acético teve um valor m/z de 134,0, tempo de retenção de 5,78 min e uma faixa linear de 612 μM a 5000 μM (R2 = 0,986) quando marcado com 12C-anilatana. Os metabólitos restantes não alteraram o sinal de íon sion uns dos outros e representam uma mistura abrangente para caracterizar o metabolismo do CFPS. O protocolo aqui apresentado é limitado a metabólitos envolvidos no metabolismo central de carbono e energia. Assim, o método atual é incapaz de medir a abundância de metabolizados de outras vias que podem ser de importância, como ácidos graxos e metabolismo de aminoácidos.
Tomados em conjunto, desenvolvemos um protocolo rápido e robusto para a caracterização e quantificação absoluta de 40 compostos envolvidos na glicolíse, a via de fosfato de pentose, o ciclo de ácido tricarboxílico, metabolismo energético e regeneração de cofator na CFPS Reações. O método baseou-se em padrões internos marcados com 13C-aniline, enquanto a amostra foi marcada com 12C-aniline. Os padrões internos e compostos de amostra co-eluted e eliminaram efeitos da íon-supressão que permitiram a quantificação exata de metabólitos individuais em misturas complexas do metabolito. Identificamos um total de 40 compostos (41, se incluindo ácido acético) que podem ser detectados e quantificados em uma mistura de reação livre de células; no entanto, a lista de metabólitos poderia ser expandida e ajustada para o processo de interesse bioquímico específico. Assim, o método fornece uma abordagem robusta e precisa para caracterizar o metabolismo livre de células, que é potencialmente fundamental para melhorar o rendimento, produtividade e eficiência energética dos processos livres de células.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
O trabalho descrito foi apoiado pelo Centro de Física do Metabolismo do Câncer através do Prêmio Número 1U54CA210184-01 do Instituto Nacional do Câncer (https://www.cancer.gov/). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional do Câncer ou dos Institutos Nacionais de Saúde. Os financiadores não tiveram nenhum papel no projeto do estudo, na coleta e na análise de dados, na decisão de publicar ou na preparação do manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12C Aniline | Sigma-Aldrich | 242284 | Aniline 12C |
| 13C labeled aniline | Sigma-Aldrich | 485797 | Aniline 13C6 |
| 3-Phosphoglyceric acid | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
| Acetic Acid | FisherScientific | AC222140010 | ACE |
| Acetonitrile, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
| Acetyl-coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column | Waters | 186002353 | Column |
| Adenosine diphosphate | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
| Adenosine monophosphate | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
| Alpha-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
| Citrate | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
| Cytidine diphosphate | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
| Cytidine monophosphate | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
| Cytidine triphosphate | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
| D-glyceraldehyde 3-phosphate | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
| Erythrose 4-phosphate | Sigma-Aldrich | E0377 | E4P |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
| Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge | FisherScientific | Centrifuge | |
| Flavin adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
| Fructose 1,6-bisphosphate | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
| Fructose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
| Fumarate | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
| Gluconate 6-phosphate | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
| Glucose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
| Glycerol 3-phosphate | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
| Guanosine diphosphate | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
| Guanosine monophosphate | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
| Guanosine triphosphate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
| Isocitrate | Sigma-Aldrich | I1252 | ICIT |
| Lactate | Sigma-Aldrich | L1750 | LAC |
| Malate | Sigma-Aldrich | 02288 | MAL |
| myTXTL - Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Cell-free protein synthesis |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
| Nicotinamide adenine dinucleotide reduced | Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
| Ribose 5-phosphate | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
| Ribulose 5-phosphate | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
| Sedoheptulose 7-phosphate | CarboSynth | MS07457 | S7P |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
| Tributylamine | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
| Triethylamine | FisherScientific | O4884 | TEA |
| ultrapure water | FisherScientific | 10977-015 | water |
| Uridine diphosphate | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
| Uridine monophosphate | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
| Uridine triphosphate | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
| VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
| Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
| Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity Qda detector | Waters | LCMS | |
| Waters Empower 3 | Waters | Software | |
| Waters LCMS Total Recovery Vial | Waters | 186000384c | LCMS Vial |
References
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
- Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
- Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
- Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012 (2017).
- Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
- Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
- Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
- Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
- Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
- Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
- Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
- Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
- Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). Metz, T. O. , Humana Press. New York, NY. 159-171 (2011).
- Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).
