Summary
该协议提供了一个开源的、编译的MATLAB程序，用于为脑电图数据生成多发图谱图。
Abstract
当前的 Web 资源提供有限的用户友好工具，用于计算用于可视化和量化脑脑学 （EEG） 数据的频谱图。本文介绍了一个基于 Windows 的开源代码，用于创建 EEG 多星编频谱图。Windows 用户无需软件许可即可访问已编译的程序。对于 Macintosh 用户，该程序仅限于具有 MATLAB 软件许可证的用户。程序通过EEG光谱图进行说明，这些光谱图因睡眠和觉醒状态以及这些状态的阿片剂引起的改变而变化。C57BL/6J小鼠的EEGs在注射盐水（车辆控制）和抗皮药剂量吗啡、丁丙诺啡和芬太尼后无线记录4小时。分光图显示，丁丙诺啡和吗啡在1~3赫兹和8×9赫兹的脑电图功率上引起类似变化。光谱图对EEG频率和功率的蒙版差鸦片作用进行了揭开面纱。这些基于计算机的方法可跨药物类别通用，并可轻松修改，以量化和显示广泛的有节奏的生物信号。
Introduction
脑电图数据可以在频域中有效分析，以表征行为和神经生理唤醒1的水平。多分频光谱图将 EEG 波形转换为时间和频率域，从而实现不同频率动态信号功率的可视化。多分透镜光谱图使用傅立叶分析来生成光谱密度估计。光谱密度估计将波形分离成构成信号的纯正弦波，类似于通过棱镜看到整个颜色光谱的白光的衍射2。EEG的多管分频图表示神经元多个网络的组合活动，其放电模式在不同的频率2振荡。由于其时移不变，傅立叶变换被认为是时间和频率域3之间的最佳转换。傅立叶分析也有许多局限性。脑电图信号是非静止的。因此，在傅立叶方法下可能不会察觉到细微的变化，并且分析可能会根据数据集的大小而变化。但是，在将傅立叶变换应用于非静止信号时，将使用窗口。这假定信号频谱在短时间内仅发生轻微变化。光谱分析的另一种方法是小波变换，这可能更适合于检测脑病3。
从功能上看，包括EEG信号的不同振荡是较低层次、较高层次的特征、状态表型（如睡眠和觉醒2）或一般麻醉剂4、5、6引起的觉醒损失。关于睡眠和觉醒状态，光谱图清楚地说明了内生产生的睡眠节律是连续的和动态的7。睡眠状态和觉醒状态的定量描述传统上涉及一个分箱过程，该过程将睡眠或唤醒分类分配给脑电图记录的每个特定定义的纪元（例如 10 s）。然后，这些状态箱绘制为时间的函数。时间过程数据图，通常被称为催眠图，用于区分正常睡眠和睡眠，这是由疾病，药物管理，昼夜节律的变化，轮班工作等中断。催眠图的一个限制是，它们通过表示唤醒状态作为方波形来歪曲 EEG 信号。Hypnogram 绘图涉及唤醒状态2的离散化，并且不允许对中间阶段或过渡阶段进行细粒度显示。此外，10个计分时间，通过在时间尺度上施加下限，产生时间的离散化。状态和时间的离散化的结果是失去关于意识状态2和药物引起的这些状态4之间的动态相互作用的神经生理学信息。例如，不同的麻醉剂作用于不同的分子靶点和神经网络。这些神经网络的药理学操作可靠地产生药物、剂量和给药途径4所特有的光谱图。
本协议的制定是为了便于研究阿片类药物改变睡眠8、呼吸9、受体10和脑神经化学11的机制。此协议描述了为 EEG 分析创建多锥形频谱图所需的步骤，这些分析可以使用专有软件或没有 MATLAB 许可的系统完成。C57BL/6J （B6） 小鼠用于验证这种基于计算机的方法在正常、不受干扰的睡眠和觉醒状态以及阿片类药物系统给药后创建新型 EEG 光谱图的能力。B6小鼠接受盐水注射（车辆控制）和抗nocept剂量吗啡、丁丙诺啡和芬太尼后，通过系统比较EEG光谱图之间的差异，证实了分析的可靠性和有效性。
新生儿小鼠脑电图动力学的定量研究具有转化意义，为旨在更好地了解新生儿人脑电图12的研究提供了一个模型。量化EEG动力学不仅仅是描述性的，而且有助于机器学习方法，可以部分基于EEG数据13来预测觉醒。本报告的目标是通过提供一个广泛访问的用户友好代码来计算多管分量谱图，以描述药物引起的小鼠脑电图变化，从而促进转化科学。
Protocol
涉及小鼠的所有程序都遵守了《实验室动物护理和使用指南》（第8版，美国国家科学院出版社，华盛顿特区），并经田纳西大学动物护理和使用委员会审查和批准。
1. 植入记录电极和初始数据收集
- 购买小鼠，并把它们放在湿度和温度控制的房间，并可获得食物和水。允许小鼠在手术植入记录电极前一周适应新环境。植入程序已详细描述1，14。
- 消毒所有手术设备。
- 用异常脱胶麻醉小鼠，在2.5%~3%的100%氧气中分娩。
- 失去正确的反射后，将小鼠从麻醉感应室中取出，并将其转移到立体框架。
- 在两只眼睛上涂抹眼膏。
- 将分路胶降低至1.7%，通过面罩持续交付。
- 做一个中线头皮切口，以暴露头骨。
- 钻两个颅骨以上左右皮层（每个在立体坐标前 = 1.0 和横向 = 3.0 相对于布雷格马15）。
- 将 EEG 电极插入每个颅骨切除术中，用牙科丙烯酸固定。
- 在背椎梯形肌肉中植入双极电极，用于记录肌电图 （EMG）。
注：四个电极被引导到一个无线遥测仪，植入下皮以上右下身体象限。这些手术技术可以在这里查看（https://www.datasci.com/services/dsi-surgical-services/surgical-videos）。 - 手术后，施用镇痛卡洛芬，并将小鼠放在温暖的恢复笼中。观察鼠标，直到它处于流动。房子单独植入小鼠。
- 手术后完全康复后，每天处理小鼠，并评估EEG和EMG录音的质量。
- 将数据采集系统配置为记录所有信号 = 1，000 mV。
- 获取所需持续时间的 EEG 和 EMG 录像。
- 使用睡眠评分软件将数字 EEG 和 EMG 录制的每个 10 s 箱评分为觉醒、快速眼动 （REM） 睡眠或非 REM （NREM） 睡眠。
注：在小鼠菌株中，脑电图功率存在基因型和状态差异，以总功率16的百分比表示。在B6小鼠中，觉醒状态的特点是75~100 mV，混合频率脑电图，EMG信号显示突出的肌肉张力，运动过程中振幅增大。NREM 睡眠评分标准包括相对于唤醒的 EMG 振幅降低 EMG 振幅。与觉醒相比，NREM 睡眠 EEG 的频率较慢，振幅增加（100~150 mV）。REM睡眠的特点是肌肉肌张力和脑电图信号，类似于脑电图的觉醒。 - 指示两个人独立获得相同的记录。至少有一个人应该对治疗状况视而不见。两个睡眠评分器之间的协调值应大于 90%。
2. 设施和设备
- 使用数据采集仪器和软件放大和数字化未过滤的 EEG 和 EMG 信号。
注：冷泉港实验室Mitra实验室开发的Chronux光谱分析工具箱用于将脑电图信号表示为与时间和频率域相关的功率。
3. 频谱计算
- 如果是 Windows 用户，请使用已编译的程序。
- 如果是 Macintosh 用户，请运行原始代码文件。
- 以 EDF 或 CSV 文件格式获取原始的、未处理的 EEG 数据，并将其放置在与编译的程序文件相同的位置。
- 使用以下约束为数据文件命名：名称必须仅包含字母、数字、下划线或破折号。
- 使用以下约束为数据文件命名：文件名不得包含句点、逗号、空格或任何其他符号。
- 下载已编译的多光片频谱图程序 （https://drive.google.com/）
- 启动频谱图程序并按照弹出提示进行操作。选择文件类型： *。CSV 或 *。Edf。
注：更多程序安装详细信息位于 readme.txt 文件中。 - 键入整个 EEG 文件名（例如，419eeg.edf 或 419.eeg.csv）。
- 选择光谱图计算的参数：默认值或"新建"。在计算频谱图时，此步骤需要最长的处理时间。数学窗口函数（分量器）提供与基础频谱的统计无关估计值。录制持续时间越长，此步骤的时间越长。在运行 Windows 10 的 PC 平台上，4 小时录制最多需要大约 3⁄4 分钟。
- 使用以下默认光谱图参数：
采样频率 = 500 Hz。这表示每秒的样本数。
fpass = 0.3 Hz 和 30 Hz。 Fpass 定义输入的频率，并控制输出中提供的频率范围。
填充 = 2。填充工作可以精细地插值输出，而不会影响结果计算。这可能有助于可视化和光谱线的精确识别。该字段是从 -1 到向上的任何整数。
时间带宽产品 （NW） = 15。信号时间持续时间和光谱宽度的积。
锥数 = 29。选择锥数时，必须使用 2NW-1。使用的锥数没有限制。使用的锥度越多，就会在指定的频率带宽中包含浓度较差的锥度。
审判平均 = 1。此参数控制是否执行试用或通道平均。如果此参数设置为 0，则没有通道平均，并且函数将输出作为输入数据传递的每个试验或通道的独立结果。但是，如果试验平均值设置为 1，则通过试验或通道对用户的结果输出进行平均。
计算 FFT =30 s 的时间。 用于通过计算许多小窗口上的频谱来跟踪频谱的演变。
FFT 计算的窗口的步长大小 = 5。执行每个频谱计算后滑动时间窗口前进的数量。
注：步骤 3.7.1 中所述的默认光谱图参数可根据需要进行更改。
- 使用以下默认光谱图参数：
- 输入频谱图和 EEG 的标题。
- 保存生成的频谱图和 EEG。
- 单击"文件 " 保存图形|保存在图形窗口中。
注：这些数字将为节目用户提供可发展成出版物质量数字的摘要。
- 单击"文件 " 保存图形|保存在图形窗口中。
4. 故障排除
- 下载样本鼠标睡眠脑电图数据，以进行样本光谱图计算。
- 使用示例数据运行程序，以确保用户正确使用该程序。在附录中查找这些示例数据的数字，以确保从样本数据创建的数据准确无误。
注：所有使用的设备和材料都已在材料表中提供。
Representative Results
下图说明了光谱图提供的对大脑兴奋性 EEG 指数的新颖见解类型。
图 1A说明了觉醒、NREM 睡眠和 REM 睡眠期间皮质 EEG 的相似性和差异。许多调查人员使用这些类型的跟踪，以及EMG记录（未显示），来量化睡眠和觉醒。图 1B使用催眠图表示基于 EEG 和 EMG 记录的评估的睡眠和觉醒状态的时间组织。国家在10个里氏纪元中得分，这些纪元在14，400年代绘制为催眠图，包括4小时记录。Hypnogram 图没有说明状态之间的转换是连续的和非线性的这一事实。与催眠图相比，光谱图（图1C）显示了EEG频率和功率作为时间函数的高度动态变化。光谱图还突出了在觉醒期间和REM睡眠期间皮质EEG信号之间的相似性。三个框叠加在光谱图（图1C）上，标记状态识别为觉醒（WAKE）、NREM睡眠和REM睡眠（图1B），并用于帮助可视化EEG频率和功率的详细变化。整个记录的频谱图提供了对脑电图作为一个连续过程的细微理解。
图2提供了四个多管分量谱图，每个图谱汇总了盐水、吗啡、丁丙诺啡和芬太尼的腹内分管后4小时的脑电图记录。所有四个录音都来自同一个鼠标，并在光启动后 2 小时开始。阿片剂，但不是盐水，抑制NREM和REM睡眠，并增加了觉醒量。光谱图可以直观地显示许多新颖的特征。新型脑电图特征的检测表明，阿片剂在化学威胁环境中具有潜在的分化应用。盐水注射后（图2A）的最大功率驻留在2⁄4赫兹范围内，表示NREM休眠。请注意，EEG 光谱图通过阿片剂给给从根本上改变了，并且每个阿片剂都会导致独特的光谱变化。
图3表明，光谱图所描绘的脑电图变化可以量化，并表示为每个半频的平均主导光谱功率（图3A），以及特定EEG频带内的平均光谱功率（图3B）。与盐水的最大差异是由丁丙诺啡引起的，发生在三角洲和塔地区。
图1：用于创建催眠图和光谱图的皮质脑电图记录。（A） 在基线（无注射）记录期间记录的电脑波形、NREM 睡眠和 REM 睡眠期间。每个跟踪显示 90 s 的录制。（B） 催眠图使用条形的高度来传达意识状态（坐标）与 4 小时记录（abscissa）。（C） 锥形光谱图使用色条以分贝（dB、右纵坐标）或光谱功率密度（以赫兹（Hz，左纵坐标）表示以不同EEG频率表示EEG功率，作为4小时记录时间（abscissa）的函数。在频谱图中添加了黑色垂直线，以逐一测量一个情节的觉醒、NREM 睡眠和 REM 睡眠。（频谱图参数：采样频率 = 500 Hz，fpass = 0.3 Hz 和 30 Hz，填充 = 2，时间带宽 = 15，锥度数 29，试验平均值 = 1，计算 FFT =30 s 的持续时间，FFT 计算窗口的步长大小 = 5）。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：说明阿片剂管理引起的脑电图功率和频率变化的光谱图。每个频谱图在（A）盐水、（B） 吗啡、（C） 丁丙诺啡和 （D） 芬太尼后，使用色条（右纵坐标）绘制 EEG 频率（Hz、左纵坐标）和 EEG 功率的分贝 （dB）。（频谱图参数：采样频率 = 500 Hz，fpass = 0.3 Hz 和 30 Hz，填充 = 2，时间带宽 = 15，锥数 29，试验平均值 = 1，计算 FFT =30 s 的时间，FFT 计算窗口的步长大小 = 5）。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：阿片剂差分改变三角洲和Ta EEG频带内的平均EEG功率。（A） 总结图2所示，每4小时记录的平均脑电图功率。纵坐标绘制每个半频率的平均 EEG 功率（abscissa）。相对于盐水控制，其他三个函数中的每一个都显示平均 EEG 功率的阿片剂特定变化。（B） 说明盐水（S）、丁丙诺啡（B）、吗啡（M）和芬太尼（F）后四个脑电图频带（delta、ta、α和β）的平均脑电图功率。A中的电源功能和B中的平均功率带的颜色编码是相同的。请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
此处描述的程序是使用协议第 3 部分"频谱图计算"中概述的九个步骤来创建频谱图的。这些步骤包括获取频谱图程序、确保正确的文件格式以及更改生成独特用户频谱图的计算参数。用户可以创建针对一系列概念问题和实验设计量身定制的光谱图。为了提高此开发过程的简便性和效率，必须以正确的文件格式提供原始 EEG 数据，并根据上述约束进行命名。尽管为小鼠脑电图数据提供了示例信号，但频谱图程序很容易适用于没有信号处理限制的人类和非人脑电图数据。
建议的故障排除和方法修改方法是从分析小型数据集开始。要考虑的主要程序输出包括过滤的 EEG 图以及频谱图。锥形光谱仪的一个吸引人之处是，它可以应用于各种周期性的生物信号。品种范围从长持续时间昼夜 （24 h） 节律17到非常快的节奏，如 1，000 Hz 放电率的伦肖细胞18。
数据格式是此频谱图协议的约束。欧洲数据格式 （EDF） 广泛用于脑电图数据。但是，还有许多其他格式设置选项。因此，原始代码文件已包含在内（请参阅上面的 3.2），以防用户希望更改文件格式。对于原始程序文件，另一个限制是需要使用计算机编程语言来更改文件格式。并非所有调查人员都可以访问专有软件和全套插件。此协议旨在通过提供在基于 WINDOWS 的设备上运行的编译程序来规避此问题，无需软件许可。这是通过运行时插件实现的，该插件包含在编译的程序中，不需要用户进行任何软件注册。
此 EEG 频谱图例程是一种新颖的、开源的、基于计算机的程序，允许用户从各种数据创建个性化的多星图。用户可以完全控制频谱图生成的所有计算方面。如果没有事先的信号处理和计算机编程知识，频谱图可能很难生成。此处描述的协议将促进频谱图的生成。有关进一步的信号处理读数和多组分光谱指南，请参阅补充材料部分。
补充材料
http://chronux.org
http://www-users.med.cornell.edu/~jdvicto/pdfs/pubo08.pdf
http://www.fieldtriptoolbox.org/tutorial/timefrequencyanalysis/
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4502759/#SD3-data
Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作部分得到了NIH赠款HL-65272的支持。作者感谢扎卡里·格洛瓦克和克拉伦斯·洛克利尔对这个项目的贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dental acrylic | Lang Dental Manufacturing Co | Jet powder and liquid | |
| EEG/EMG Amplifier | Data Science International | model MX2 | |
| macOS Mojave | Apple | v10.14.4 | |
| MATLAB | Mathworks | v9.4.0.813654 | software for spectrogram comp. |
| Mouse anesthesia mask | David Kopf Instruments | model 907 | |
| Neuroscore | Data Science International | v3.3.9317-1 | software for scoring sleep and wakefulness |
| Ponemah | Data Science International | v5.32 | software for EEG/EMG Data Acquisition |
| Stereotaxic frame | David Kopf Instruments | model 962 | |
| Stereotaxic frame, mouse adapter | David Kopf Instruments | model 921 | |
| Windows 10 | Microsoft | v10.0.17763.503 | |
| Wireless Telemeter | Data Science International | model HD-X02 |
References
- Wasilczuk, A. Z., Proekt, A., Kelz, M. B., McKinstry-Wu, A. R. High-density electroencephalographic acquisition in a rodent model using low-cost and open source resources. Journal of Visualized Experiments. 117, 10 (2016).
- Prerau, M. J., Brown, R. E., Bianchi, M. T., Ellenbogen, J. M., Purdon, P. L. Sleep neurophysiological dynamics through the lens of multitaper spectral analysis. Physiology. 32, 60-92 (2017).
- Akin, M. Comparison of wavelet transform and FFT methods in the analysis of EEG signals. Journal of Medical Systems. 26 (3), 241-247 (2002).
- Purdon, P. L., Sampson, A., Pavone, A., Brown, E. N. Clinical electroencephalography for anesthesiologists Part 1: Background and basic signatures. Anesthesiology. 123 (4), 937-960 (2015).
- Liu, Q., et al. Frontal EEG temporal and spectral dynamics similarity analysis between propofol and desflurane induced anesthesia using Hilbert-Huang Transform. BioMed Research International. 2018, 4939480 (2018).
- Akeju, O., et al. Spatiotemporal dynamics of dexmedetomidine-induced electroencephalogram oscillations. PLoS One. 11 (10), (2016).
- Ogilvie, R. D. The process of falling asleep. Sleep Medicine Reviews. 5 (3), 247-270 (2001).
- Baghdoyan, H. A., Lydic, R. Basic Neurochemistry. Brady, S. T., Albers, R. W., Price, D. L., Siegel, G. J. , Elsevier. 982-999 (2012).
- Angel, C., et al. Buprenorphine depresses respiratory variablity in obese mice with altered leptin signaling. Anesthesiology. 128 (5), 984-991 (2018).
- Glovak, Z. T., Mihalko, S., Baghdoyan, H. A., Lydic, R. Leptin status alters buprenorphine-induced antinociception in obese mice with dysfunctional leptin receptors. Neuroscience Letters. 660, 29-33 (2017).
- Zhang, X., et al. Morphine and fentanyl delivered to prefrontal cortex of behaving mice depress breathing and alter neurotransmitter concentrations. Anesthesia & Analgesia. , In Press (2019).
- Cornelissen, L., Kim, S. E., Purdon, P. L., Brown, E. N., Berde, C. B. Age-dependent electroencephalogram (EEG) patterns during sevoflurane general anesthesia in infants. eLIFE. 4, e06513 (2015).
- Chini, M., et al. Neural correlates of anesthesia in newborn mice and humans. Front Neural Circuits. 13 (Article 38), 1-13 (2019).
- Flint, R. R., Chang, T., Lydic, R., Baghdoyan, H. A. GABA-A receptors in the pontine reticular formation of C57BL/6J mouse modulate neurochemical, electrographic, and behavioral phenotypes of wakefulness. Journal of Neuroscience. 30 (37), 12301-12309 (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 4th edn, Academic Press. (2018).
- Franken, P., Malafosse, A., Tafti, M. Genetic variation in EEG activity during sleep in inbred mice. American Journal of Physiology. 257 (4), (1998).
- Ko, C. H., et al. Emergence of noise-induced oscillations in the central circadian pacemaker. PLoS Biol. 8 (10), e1000513 (2010).
- Steriade, M., Curró Dossi, R., Conteras, D. Electrophysiological properties of intralaminar thalamocortical cells discharging rhythmic (40 Hz) spike-bursts at 1000 Hz during waking and rapid eye movement sleep. Neuroscience. 56, 1-9 (1993).
