Summary
يمكن ان تكون منقوشة الدهون مصفوفة خارج الخلية علي المواد الهلامية بولياكريلاميد لتمكين ثقافة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في المستعمرات المحصورة علي ركائز متوافقة. ويمكن الجمع بين هذه الطريقة مع المجهر قوه الجر والاختبارات البيوكيميائية لفحص التفاعل بين هندسه الانسجه ، والقوات المتولدة من الخلايا ، ومواصفات مصير.
Abstract
تظهر الخلايا الجذعية الجنينية البشرية قدره فريدة علي الاستجابة للموفوينات في المختبر من خلال أنماط التنظيم الذاتي لمواصفات مصير الخلية التي تتوافق مع تكوين الطبقة الجرثومية الاوليه اثناء الاجنه. التالي ، تمثل هذه الخلايا أداه قويه لدراسة أليات التي تدفع بالتنمية البشرية المبكرة. لقد وضعنا طريقه للثقافة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في المستعمرات المحصورة علي ركائز المتوافقة التي توفر السيطرة علي كل من هندسه المستعمرات وبيئتها الميكانيكية من أجل تلخيص المعلمات المادية التي تكمن وراء تولد الاجنه. الميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو القدرة علي توليد الهلام المائي بولياكريلاميد مع أنماط محدده من الخلايا مصفوفة خارج الخلية علي السطح لتعزيز المرفقات الخلية. ويتحقق ذلك عن طريق افتعال الاستنسل مع الأنماط الهندسية المطلوبة ، وذلك باستخدام هذه الاستنسل لخلق أنماط من الخلايا مصفوفة خارج الخلية علي الزجاج الشفتين ، ونقل هذه الأنماط إلى بولياكرياميد هيدروجيل خلال البلمره. هذا الأسلوب هو أيضا متوافق مع المجهر قوه الجر ، مما يسمح للمستخدم لقياس وتعيين توزيع القوات التي تولدها الخلايا داخل المستعمرات المحصورة. في تركيبه مع اختبارات الكيمياء الحيوية القياسية ، ويمكن استخدام هذه القياسات لفحص دور العظة الميكانيكية اللعب في تحديد المصير و تخلق خلال التنمية البشرية في وقت مبكر.
Introduction
الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) تحمل وعدا كبيرا لاستخدامها في الطب التجديدي وتطبيقات هندسه الانسجه. الطبيعة المستحثة لهذه الخلايا تمنحهم القدرة علي التفريق في اي نوع من أنواع الخلايا البالغة. وعلي الرغم من الخطوات الكبيرة التي تم القيام بها في توجيه مصير hESCs إلى أنواع معينه من الخلايا ، فقد ظل من الصعب جدا توليد انسجه كامله أو أجهزه من نوفو1،2،3،4، 5- ويرجع ذلك ، في جزء كبير منه ، إلى فهم محدود للأليات التي تقود تشكيل هذه الانسجه اثناء التنمية البشرية. ومن أجل سد هذه الفجوة في المعرفة ، برز عدد من الطرق في السنوات الاخيره لنمذجة الاجنه المبكرة والمراحل اللاحقة من التنمية مع الخلايا الجذعية الجنينية6،7،8،9 ،10،11،12،13.
بعد فتره وجيزة من اشتقاق الخطوط الاولي لل hESC14، ثبت ان الأجسام الجنينية التي تشكلت من hesc كانت قادره علي إنتاج خلايا تلقائيا من الطبقات الجرثومية الاوليه الثلاثة6. ومع ذلك ، ونظرا للافتقار المتاصل في السيطرة علي حجم وشكل الأجسام الجنينية ، فان تنظيم الطبقات الجرثومية اختلف كثيرا وأخفق في مضاهاة تنظيم الجنين المبكر. في الاونه الاخيره ، وارفلش وآخرون وضعت طريقه لحصر مستعمرات hESCs علي ركائز الزجاج عن طريق ميكروباتيرنينج ، وتوفير السيطرة والاتساق علي حجم وهندسه المستعمرات8. وفي وجود BMP4 ، وهو من المتحولين المهمين في التنمية المبكرة ، كانت هذه المستعمرات المحصورة قادره علي التنظيم الذاتي لأنماط قابله للتكرار من المواصفات لمصائر تمثل الطبقات الجرثومية الاوليه. وعلي الرغم من ان هذا يوفر نموذجا مفيدا لدراسة أليات التي يتم بها إنشاء طبقات الجرثومية الاوليه ، فان أنماط تحديد المصير لم تتطابق تماما مع التنظيم والنشاه التي لوحظت اثناء تولد الاجنه15. وقد تحققت خلاصه أكثر إخلاصا للتنمية الجنينية المبكرة من خلال تضمين الشهادات في مصفوفة ثلاثية الابعاد (ECM) من المصفوفة11، وتوفير اقوي الادله حتى الآن لقدره hescs علي التنظيم الذاتي والنموذج المراحل المبكرة من الاجنه الجسم السابق. ومع ذلك ، فان هذه الطريقة تسفر عن نتائج غير متسقة التالي فهي تتنافى مع عدد من المقايسات التي يمكن استخدامها للكشف عن أليات الاساسيه للتنظيم الذاتي ومواصفات المصير.
النظر إلى هذه الأساليب القائمة والقيود الخاصة بكل منها ، سعينا إلى تطوير طريقه للتكرار المستعمرات hESC من الهندسي المحددة في الظروف التي نموذج البيئة خارج الخلية من الجنين في وقت مبكر. لتحقيق ذلك ، استخدمنا polyالاكريلاميد هيدروجيل من مرونة انضباطي للسيطرة علي الخواص الميكانيكية للركيزة. باستخدام المجهر القوه الذرية علي أجنه الدجاج مرحله التذوق ، وجدنا ان مرونة العدسة تراوحت من مئات باسكال إلى عدد قليل من kilopascals. وهكذا ، ركزنا علي توليد الهلام المائي بولياكريلاميد مع مرونة في هذا النطاق لتكون بمثابه الركيزة لمستعمرات hESC. قمنا بتعديل طرقنا السابقة لزراعه الدهون علي بولياكرياميد هيدروجيل7،9 لتوفير السيطرة القوية علي هندسه المستعمرات. حققنا هذا من قبل الأول زخرفه ECM ligands ، وهي الأمومي ، علي الزجاج coverslips من خلال الاستنسل المجهرية ، كما ذكرت سابقا16. ثم قمنا بتصميم تقنيه جديده لنقل الاربطه المنقوشة إلى سطح الهلام المائي بولياكريلاميد خلال البلمره. الأسلوب الذي وصفناه هنا ينطوي علي استخدام التصوير الضوئي لصنع رقاقه السيليكون مع الأنماط الهندسية المطلوبة ، وخلق الطوابع من الميزات الهندسية مع polydimethylsiloxane (PDMS) ، واستخدام هذه الطوابع لتوليد الاستنسل التي تسمح في نهاية المطاف زخرفه من يجند علي سطح الشفتين الزجاجية ونقل إلى بولياكرياميد.
بالاضافه إلى تلخيص البيئة الميكانيكية للجنين في وقت مبكر ، وحصر المستعمرات hESC علي polyالاكريلاميد تمكن قياس القوات المتولدة من الخلايا مع المجهر قوه الجر (TFM) ، كما ذكر في الطريقة السابقة9لدينا. باختصار ، يمكن ان تكون جزءا لا يتجزا من حبات الفلورسنت في بولياكريلاميد وتستخدم كعلامات ايماني. وتحسب القوات المتولدة من الخلايا عن طريق تصوير أزاحه هذه الخرز بعد البذر hESCs علي الركيزة منقوشة. وعلاوة علي ذلك ، يمكن الجمع بين خرائط قوه الجر الناتجة مع المقايسات التقليدية ، مثل المناعة ، لدراسة كيف يمكن لتوزيع القوات المتولدة من الخلايا في مستعمرات التردد الضيق المحصورة ان ينظم أو يعدل الإشارات الاماميه. ونتوقع ان تكشف هذه الأساليب عن ان القوات الميكانيكية تلعب دورا حاسما في زخرفه مواصفات قدر الخلية خلال التنمية الجنينية المبكرة التي يتم تجاهلها حاليا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة علي جميع الطرق الموصوفة هنا المتعلقة باستخدام hESCs من قبل لجنه البحوث البشرية والاجنه والخلايا الجذعية (جسر) في جامعه كاليفورنيا سان فرانسيسكو.
1. اعداد رقاقه السيليكون مع ميزات هندسية
- إنشاء ضوئي مع الميزات الهندسية المطلوبة. استخدام برامج الصياغة بمساعده الكمبيوتر لتصميم الميزات. للاستخدام مع مقاومه الصور السلبية ، وجعل الميزات مبهمه والباقي من قناع شفافة.
ملاحظه: بالنسبة لزخرفه علي الشفتين الصغيرتين قطرها 18 مم ، ميزات المجموعة لكل حاله تجريبية في 10 × 10 ملم المناطق لضمان الاستنسل المتولدة في الخطوة 3 تناسب علي الشفتين. - تدور الطبقة السلبية المقاومة للضوء علي رقاقه السيليكون 100 مم. استخدام ورقه البيانات المقاومة للضوء لتحديد سرعه وطول تدور لتوليد سمك الفيلم من 100-250 μm.
ملاحظه: يجب تعديل سماكه الفيلم بحيث تكون نسبه العرض إلى الارتفاع للعرض من النقوش إلى ذروه الاستنسل قريبه من 1:1 قدر الإمكان. ومع ذلك ، فاننا نوصي سمك الحد الأدنى من 100 μm ، كما اي شيء اقل تنتج الاستنسل الحساسة التي تمزق بسهوله. - معالجه المقاومة الضوئية وفقا لورقه بيانات المنتج. وهذا ينطوي عاده علي خبز لينه ، والتعرض للاشعه فوق البنفسجية مع ضوئي في قناع المصفف ، بعد التعرض خبز ، والتنمية ، والخبز الصلب. وكمثال علي ذلك ، فان الاجراء المستخدم لمعالجه الرقاقات المستخدمة في هذا البروتوكول مبين في الجدول 1.
ملاحظه: توخي الحذر عند التعامل مع رقائق السيليكون كما انها هشه. بمجرد إنشائها ، يمكن استخدام الرقاقات بشكل متكرر طالما انها غير معطوبة.
2. اعداد الشفاه المختلطة
-
اعداد الشفاه المغسولة بالحمض "العلوي"
- ضع 18 ملم قطر #1 سماكه الشفتين في صحن بتري الزجاج. العدد المناسب من الشفتين يعتمد علي حجم الطبق. للحصول علي طبق 100 ملم ، أعد 50-100 الشفتين في وقت. حجم المبالغ المعطية من خلال الجزء المتبقي من هذا القسم يتوافق مع طبق 100 مم.
- أضف 20 مل من حمض الهيدروكلوريك 1 م إلى طبق بيتري وهز الطبق برفق لتفريق الشفتين. ضمان غمرت جميع الشفتين والإفراج عن فقاعات الهواء من بين الشفتين. احتضان بين عشيه وضحيها في درجه حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف.
تحذير: HCl حمضيه وقابله للتاكل. استخدام الحذر وارتداء معدات الوقاية الخاصة المناسبة اثناء العمل مع HCl. - Decant HCl من الطبق. أضيفي 20 مل من الماء الخفيف واغسليه بالاهتزاز اللطيف لمده 10 دقائق وتخلصي من الماء وكرريه لما مجموعه خمسه غسول.
- بعد التخلص من الغسيل النهائي ، أضف 20 مل من الايثانول 100% إلى الطبق. باستخدام ملقط ، وأزاله الشفتين بشكل فردي وترتيب بين قطعتين من ورقه فلتر لتجف.
- يخزن الشفتين المجففتين في حاويه مختومه. يمكن تحضير الشفاه المغسولة بالحمض مقدما وتخزينها لمده شهر أو أكثر في ظروف خاليه من الغبار.
-
اعداد الشفاه المنشطة من غلوتارالدهيد "السفلي"
ملاحظه: الرجوع إلى الطرق السابقة للحصول علي تفاصيل اضافيه7,9.- ضع 18 ملم قطر #1 سماكه الشفتين في طبق بيتري.
- أضافه 20 مل من 0.2 M HCl إلى طبق بتري ويهز بلطف الطبق لتفريق الشفتين. ضمان غمرت جميع الشفتين والإفراج عن فقاعات الهواء من بين الشفتين. احتضان بين عشيه وضحيها في درجه حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف.
- Decant HCl من الطبق. أضيفي 20 مل من الماء الخفيف واغسليه بالاهتزاز اللطيف لمده 10 دقائق وتخلصي من الماء وكرريه لما مجموعه خمسه غسول.
- بعد التخلص من الغسيل النهائي ، أضف 20 مل من 0.1 M NaOH وهز برفق لتفريق ودمج الشفتين. احتضان في درجه حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف لمده 1 ساعة.
- ديانت NaOH من الطبق. أضيفي 20 مل من الماء الخفيف واغسليه بالاهتزاز اللطيف لمده 10 دقائق وتخلصي من الماء وكرريه لما مجموعه خمسه غسول.
- بعد التخلص من الغسيل النهائي ، أضافه 20 مل من 1:200 التخفيف من 3-امينوبروبيل تريميثوكسيسيلان في الماء نقاء ويهز بلطف لتفريق ودمج الشفتين. احتضان في درجه حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف لمده 1 ساعة أو بين عشيه وضحيها.
تحذير: 3-امينوبروبيل تريميثوكسيسيلان هو قابل للاشتعال ويمكن ان يسبب تهيج الجلد. التعامل مع الرعاية ، وارتداء معدات الوقاية الخاصة المناسبة ، وتجاهل النفايات وفقا للوائح التخلص المحلية. - Decant المخفف 3-امينوبروبيل trimethoxysilane الحل من الطبق. أضيفي 20 مل من الماء الخفيف واغسليه بالاهتزاز اللطيف لمده 10 دقائق. تخلصي من الماء وكرري ما لا يقل عن خمسه غسول. فمن المهم لأزاله جميع 3-امينوبروبيل trimethoxysilane قبل المضي قدما.
- بعد التخلص من غسل النهائي ، أضافه 20 مل من 1:140 التخفيف من 70 ٪ غلوتارالديهيد في الفوسفات مخزنه المالحة (التلفزيونية الخاصة) ويهز بلطف لتفريق وغمر الشفتين. احتضان في درجه حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف لمده 1 ساعة أو بين عشيه وضحيها.
تحذير: 70% غلوتارالدهيد هو سام ويمكن ان يسبب تهيج الجلد. التعامل مع الرعاية ، وارتداء معدات الوقاية الخاصة المناسبة ، وتجاهل النفايات وفقا للوائح التخلص المحلية. - Decant محلول غلوتارالدهيد المخفف من الطبق. أضيفي 20 مل من الماء الخفيف واغسليه بالاهتزاز اللطيف لمده 10 دقائق وتخلصي من الماء وكرريه لما مجموعه خمسه غسول.
- بعد التخلص من الغسيل النهائي ، أضافه 20 مل من الايثانول 100 ٪. باستخدام ملقط ، وأزاله الشفتين بشكل فردي وترتيب بين قطعتين من ورقه فلتر لتجف.
- يخزن الشفتين المجففتين في حاويه مختومه. يمكن اعداد الشفاه المنشطة غلوتارالدهيد مسبقا وتخزينها لمده تصل إلى سته أشهر.
3. جيل من الاستنسل لزخرفه ECM يجند
- توليد الطوابع الوسيطة بوليديميثيلسيلاوكسان (PDMS)
- مزيج PDMS قاعده مع PDMS عامل العلاج في نسبه 10:1 ، من حيث الوزن. اخلط جيدا.
ملاحظه: بالنسبة للتطبيق الاولي لل PDMS ، واعداد حوالي 100 غرام من PDMS لملء 100 mm طبق. للتطبيقات اللاحقة ، أزاله PDMS من مركز الطبق فقط حيث تقع ملامح رقاقه السيليكون واعداد 20-30 g من PDMS الجديدة. - Degas الخليط PDMS في المجففة لمده 30-60 دقيقه أو حتى يتم أزاله جميع فقاعات الهواء.
- ضع رقاقه السيليكون المعدلة من الخطوة 1 في طبق من البلاستيك 100 مم. ببطء التساوي صب خليط PDMS علي سطح الرقاقة. اضغط علي الطبق علي سطح العمل لإطلاق اي فقاعات الهواء من سطح الرقاقة.
- سكب الخليط PDMS علي رقاقه لمده 10 دقيقه أو حتى يتم أزاله جميع فقاعات الهواء أو قد حان لسطح PDMS.
- اخبز PDMS في 70 درجه مئوية لمده 2 ح. السماح لتبرد إلى درجه حرارة الغرفة.
- باستخدام مشرط أو قطع مربع ، وقطع القسم من PDMS من مركز الطبق الذي يحتوي علي ميزات هندسية.
- قطع PDMS إلى ما يقرب من 10 × 10 ملم المربعات ، كل تحتوي علي ميزات لحاله تجريبية واحده. ويشار اليها باسم "الطوابع" في الخطوات اللاحقة من البروتوكول.
- مزيج PDMS قاعده مع PDMS عامل العلاج في نسبه 10:1 ، من حيث الوزن. اخلط جيدا.
- توليد ألواح مسطحه من PDMS
- مزيج PDMS قاعده مع PDMS عامل العلاج في نسبه 8:1 ، من حيث الوزن. اعداد حوالي 20 غراما لكل طبق 100 ملم لاستخدامها. اخلط جيدا.
- Degas الخليط PDMS في المجففة لمده 30-60 دقيقه أو حتى يتم أزاله جميع فقاعات الهواء.
- صب ببطء التساوي PDMS في طبق 100 mm نظيفه. اضغط علي الطبق علي سطح العمل لإطلاق اي فقاعات الهواء.
- اخبز PDMS في 70 درجه مئوية لمده 2 ح. السماح لتبرد إلى درجه حرارة الغرفة.
- أزاله PDMS من الطبق. عكس ذلك ان سطح PDMS التي كانت علي اتصال مع الجزء السفلي من الطبق هو مواجهه.
- لكل طابع تم إنشاؤه في الخطوة 3.1 ، قطع 15 × 15 مم مربع من PDMS. ويشار اليها بعبارة "ألواح مسطحه" في الخطوات اللاحقة من البروتوكول.
- إنشاء قوالب الاستنسل
- ترتيب ألواح مسطحه من PDMS علي غطاء طبق 150 مم ، أو سطح مستو آخر لسهوله المناولة. ضمان تباعد كاف بين ألواح (علي سبيل المثال ، لطبق 150 ملم ، وترتيب تسعه ألواح مسطحه مع تباعد حتى).
- عكس كل طابع تم إنشاؤه في الخطوة 3.1 علي بلاطه مسطحه من PDMS ، بحيث تكون الميزات علي الطابع علي اتصال مع بلاطه مسطحه من PDMS. اضغط برفق علي الجهة العلوية من الختم مع ملقط لضمان الاتصال حتى.
- دعم بعناية غطاء عقد PDMS الطوابع/لوح أزواج حتى علي قاعده الطبق ، بحيث يستريح الغطاء في زاوية. وهذا يساعد علي فتل البوليمر للاشعه فوق البنفسجية قابل للشفاء في الخطوة التالية.
- ضع قطره صغيره من البوليمر للاشعه فوق البنفسجية قابل للشفاء في الواجهة العلوية لكل زوج من الطوابع/البلاطات. وسوف يكون البوليمر الأشرار بين الاثنين عن طريق التوتر السطحي ، بمساعده من الجاذبية.
ملاحظه: العديد من البوليمرات المختلفة للاشعه فوق البنفسجية قابل للشفاء قد تعمل في هذا البروتوكول. اخترنا Norland لاصق البصرية 74 للخصائص التالية: ط) علاج سريع علي التعرض للاشعه فوق البنفسجية ، ii) أزاله سهله من الطوابع PDMS عند المعالجة ، iii) التصاق قويه للزجاج coverslips مع الضغط اليدوي. - مره واحده وكان البوليمر تماما من خلال الأشرار ، ووضع الغطاء مع أزواج الطوابع/لوح مسطحه علي سطح العمل. ضع قطره صغيره من البوليمر للاشعه فوق البنفسجية قابل للشفاء في كل من الجوانب الثلاثة المتبقية من كل واجهه الختم/بلاطه.
- باستخدام طرف ماصه 200 μL ، قم بتوصيل قطرات البوليمر حول حواف واجهه الختم/البلاطة. يؤدي هذا إلى إنشاء حدود التي سيتم عقد الحل في الخطوة 4.
ملاحظه: كن حذرا عند العمل البوليمر حول حواف الطابع. إذا تم تعطيل واجهه الختم/بلاطه ، فان البوليمر سوف الفتيل تحت الميزات وسوف الاستنسل لا تشكل بشكل صحيح. - وضع بعناية أزواج الطوابع/لوح في مربع التعقيم للاشعه فوق البنفسجية. استخدام المعقمة "Str" اعداد الطاقة وفضح لمده 10 دقيقه.
- أزاله أزواج الطوابع/لوح من مربع التعقيم للاشعه فوق البنفسجية. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط ، وأزاله بلطف ختم PDMS في حين عقد أسفل بلاطه مسطحه والاستنسل التي شكلت من البوليمر للاشعه فوق البنفسجية قابل للشفاء.
- باستخدام ملقط ، وأزاله الاستنسل بعناية وعكس ذلك ان السطح الذي كان علي اتصال مع بلاطه مسطحه من PDMS هو مواجهه.
ملاحظه: الاستنسل حساسة. كن حذرا في حين تسليمها ، وخصوصا في حين ازالتها في البداية من PDMS ، بحيث لا المسيل للدموع. - وضع الاستنسل المقلوب مره أخرى في مربع التعقيم للاشعه فوق البنفسجية. استخدام المعقمة "Str" اعداد الطاقة وفضح لمده 3 دقائق.
4. زخرفه ECM يجند علي الشفاه المختلطة
-
الضغط علي الاستنسل علي الشفاه المغسولة بالحمض
- ضعي شفه واحده مغسولة بالحامض لكل استنسل علي قطعه نظيفه من الفيلم المختبري.
- باستخدام ملقط ، وضع بعناية كل الاستنسل ، مسطحه من جانب إلى أسفل ، علي coverslip غسلها بالحمض. وضع مثل هذه الميزات تتركز علي الشفة.
- ضع قطعه صغيره من الفيلم المختبري علي راس كل استنسل. بحزم التساوي اضغط لأسفل علي الاستنسل لإنشاء اتصال قوي بين الاستنسل و coverslip.
ملاحظه: هذه خطوه هامه! اضغط بقوة وعبر سطح الاستنسل بأكمله. إذا لم يتم إنشاء اتصال كافيه ، سيتم تسرب الحل يجند بين الاستنسل والشفتين وسوف تفشل زخرفه. اختياري: لتاكيد الاتصال الكافي بين الاستنسل و coverslip ، ماصه 100 μL من المياه المعقمة فائقه النقاء علي سطح كل الاستنسل واحتضان في درجه حرارة الغرفة. بعد 1 ساعة ، والتحقق من تسرب. يستنشق الماء من الاستنسل المستعبدين بنجاح والمضي قدما.
-
البلازما تنظيف سطح الشفتين رسمت لزيادة الهيدروفيليسيتي
- ضع الشفتين مع الاستنسل في منظف البلازما. تطبيق البلازما عاليه الطاقة لمده 30 ثانيه.
-
اعداد الحل الأمثل لECM
ملاحظه: يجب إكمال كافة الخطوات اللاحقة في ظروف معقمه إذا كان ذلك ممكنا.- مكان معقم 100 mM HEPES ، 100 mM NaCl ، pH 8.0 حل علي الجليد. مره واحده الجليد الباردة, أضافه الحاكم والكولاجين لتحقيق تركيزات 225 ميكروغرام/مل و 25 ميكروغرام/مل, علي التوالي. اختياري: لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها أو للحصول علي التمثيل المرئي ، تضمين فلوريسسينتلي المفتاحية في الحل يجند.
- ملاحظه: يمكن استخدام يغاندس ECM مختلفه مع هذا الأسلوب. بالنسبة لمختلف الأنواع ، قد يتطلب الأمر تحسينا إضافيا لتحديد التركيز المثالي ، ووقت الحضانة ، ودرجه حرارة الحضانة. راجع قسم المناقشة للحصول علي مزيد من المعلومات.
- الماصة الحل علي سطح كل الاستنسل. بالنسبة لقوالب الاستنسل المصنوعة من 10 × 10 مم طوابع مربعه ، ضع 100 μL لكل استنسل.
- البحث عن فقاعات الهواء في ميزات الاستنسل. إذا لزم الأمر ، استخدم ملقط ذو رؤوس رقيقه أو طرف ماصه 2 μL لأزاله فقاعات الهواء من الميزات.
ملاحظه: هذه خطوه هامه! إذا بقيت فقاعات الهواء المحاصرين علي سطح الشفة ، واليجند سوف لا الممتب علي السطح وسوف يكون نمط الناتجة غير مكتملة. - ضع الشفاه الرسمته مع الاربطه في طبق ، والتفاف مع الفيلم المختبري ، واحتضان في 4 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
- مكان معقم 100 mM HEPES ، 100 mM NaCl ، pH 8.0 حل علي الجليد. مره واحده الجليد الباردة, أضافه الحاكم والكولاجين لتحقيق تركيزات 225 ميكروغرام/مل و 25 ميكروغرام/مل, علي التوالي. اختياري: لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها أو للحصول علي التمثيل المرئي ، تضمين فلوريسسينتلي المفتاحية في الحل يجند.
5. نقل يجند إلى هلام بولياكريلاميد
- أزاله الربط والحل الاستنسل من كل شفه المشارك
- يستنشق الحل يجند من سطح الاستنسل. ويمكن جمع الحل ligand وتخزينها في 4 درجه مئوية وأعاده استخدامها لمده تصل إلى شهر.
- باستخدام ملقط ، لفتره وجيزة الفرعية كوفيرسليب مع الاستنسل في صحن يحتوي علي العقيمة لغسل الصحون.
- بإيجاز [سوبدمج] ال [كوفرليب] مع استنسل داخل ثاني طبق من [ببس] معقمه ان يغسل.
- أزاله الاستنسل من سطح الشفة. كن حذرا لعدم كسر coverslip.
- لفتره وجيزة تحت دمج كوفيرسليب في طبق يحتوي علي المياه المعقمة نقاء لأزاله الأملاح من يغسل تلفزيوني. اضغط علي حافه كوفيرسليب لمسح مهمة حساسة إلى الفتيل بعيدا المياه الزائدة.
- تجفيف الشفة تحت غاز خامل ، مثل النيتروجين. وضع علامة علي الجهة السفلية من كوفيرسليب لتتبع التوجه من هذه النقطة إلى الامام. كن حذرا للحفاظ علي الجانب منقوشة مواجهه.
- كرر الخطوات 5.1.1 من خلال 5.1.6 لكل رسمت coverslip.
- صنع الهلام المائي بولياكريلاميد مع الشفتين منقوشة
ملاحظه: الرجوع إلى الأساليب السابقة للحصول علي تفاصيل اضافيه7،9 تعقيم جميع أصحاب كاب ، أنابيب ، والفواصل المستخدمة لجعل الهلام polyالاكريلاميد بالغسل مع 10 ٪ التبييض بين عشيه وضحيها ، والشطف مع الماء علي الأقل خمس مرات لأزاله التبييض ، ويغسل لفتره وجيزة في 70% ايثانول. ضع جميع القطع علي مناديل المهمة الحساسة في خزانه معقمه للسلامة البيولوجية لتجف قبل الاستخدام.- اعداد محلول بولياكريلاميد للحصول علي مرونة هيدروجيل المطلوب (الجدول 2). تخلط جميع المكونات معا باستثناء المجالات المجهرية الفلورية والبوتاسيوم البيروفات (PPS).
ملاحظه: اعداد 1 ٪ محلول بيروكبريتات البوتاسيوم الطازجة في كل مره. - Degas الحل بولياكريلاميد ، المجهرية ، و PPS في أنابيب منفصلة تحت فراغ لمده 30 دقيقه.
- بالنسبة لكل شفه منقوشة ، أعد المشبك المنشط "أسفل" غلوتارالدهيد مع فاصل (قطر خارجي 18 مم ، قطر داخلي 14 مم) وضع علي القمه.
- بعد التفريغ ، لفتره وجيزة المجهرية الدقيقة وأضافه حجم المناسبة إلى محلول بولياكريلاميد. مزيج من الأنابيب صعودا وهبوطا ، والحرص علي عدم إدخال فقاعات الهواء. باختصار.
- أضافه الحجم المناسب من PPS إلى محلول بولياكريلاميد. ماصه صعودا وهبوطا لخلط الحل ، والحرص علي عدم إدخال فقاعات الهواء.
ملاحظه: بعد أضافه PPS ، العمل بسرعة لإكمال الخطوات ال5.2.6ه من خلال 5.2.11 قبل بوليميريزيس بولياكرياميد. - ماصه 75-150 μL (اعتمادا علي سمك فاصل) إلى مركز كل المنشطات جلوتارالدهيد تنشيط.
- باستخدام الملقط ، ضعي الشفة المنقوشة علي كل من المشبك المنشط غلوتارالدهيد مع بولياكرياميد والمباعدة ، بحيث تواجه الاربطه المنقوشة محلول بولياكرياميد. إذا تم أضافه محلول بولياكريلاميد كافيه ، فان التوتر السطحي سوف الفتيل polyالاكريلاميد بين اثنين من الشفتين والهواء لا فقاعات ستكون موجودة.
- تلتقط كل من بولي اكريلاميد "ساندويتش" وتلمس بعناية الجانب لمسح مهمة حساسة إلى الفتيل بعيدا الزائدة محلول بولياكريلاميد.
- ضع بعناية كل بولي اكريلاميد "ساندويتش" في حامل غطاء مع المواضيع التي تتوافق مع 15 مل أنابيب مخروطيه القاع. يجب ان يكون التوجه بحيث يكون الجزء السفلي من الكوفيرسليب جلوتارالديهيد في اتصال مع الجزء السفلي من حامل الغطاء ، والمشبك منقوشة علي القمه.
- برغي 15 مل أنبوب مخروطي القاع في كل حامل غطاء لعقد polyالاكريلاميد "السندويشات" في مكان. يجب ان تكون الأنابيب ضيقه لمنع تسرب ، ولكن كن حذرا لعدم الإفراط في تشديد والكراك الشفتين.
- الطرد المركزي بولي اكريلاميد "السندويشات" في أنابيب في الجرافات الارجوحه في 200 x g لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. أزاله الأنابيب من الطرد المركزي ومكان في رفوف أنبوب للحفاظ علي التوجه لمده 50 اضافيه دقيقه لضمان البلمره الكامل. تبقي مغطاه إحباط لمنع تبييض المجهرية الفلورسنت.
ملاحظه: طرد الهامه عند استخدام هذا الأسلوب لتنفيذ TFM. قوه الطرد المركزي يتحرك كل المجالات المجهرية إلى طائره واحده ، والتي سوف تكون في نهاية المطاف فقط تحت سطح هيدروجيل. ويعد هذا الأمر مثاليا لتصوير عمليات الازاحه المجهرية التي تستخدم لحساب ضغوط الجر المتولدة من الخلايا. في حاله عدم تنفيذ TFM ، يمكن ترك المجالات المجهرية للخروج من محلول بولياكريلاميد ويمكن ان تحدث البلمره في السطح بدون طرد. - أزاله بلمره بولياكرياميد "السندويشات" من الأنابيب وتحت الدمج في الاذاعه التلفزيونية في صحن مم 100. التفاف في الفيلم المختبري واحتضان لمده 3 ساعات في درجه حرارة الغرفة أو بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
- اعداد محلول بولياكريلاميد للحصول علي مرونة هيدروجيل المطلوب (الجدول 2). تخلط جميع المكونات معا باستثناء المجالات المجهرية الفلورية والبوتاسيوم البيروفات (PPS).
- اعداد الهلام منقوشة لخلايا البذر
- استخدام مشرط وملقط لأزاله بعناية المشبك منقوشة والفاصل من بولي اكريلاميد "ساندويتش" في حين انها لا تزال مغمورة في الاذاعه التلفزيونية. ستكون الاربطه المنقوشة قد نقلت إلى البولياكرياميد خلال البلمره ستبقي بعد أزاله الشفة المختلطة. سيبقي هلام بولياكرياميد ملتصقا بالشفة المنشطة غلوتارالدهيد.
ملاحظه: هذه خطوه هامه! يجب ان تكون مغمورة بولياكرياميد في الاذاعه التلفزيونية في حين أزاله كوفيرسليب أو سيتم تدمير أنماط يجند. - ضعي كل شفه مع بولياكرياميد منقوشة في حامل الغطاء. وضع طوقا (18 ملم القطر الخارجي ، 14 مم القطر الداخلي) علي راس كوفيرسليب وحول بولياكرياميد ، حيث يقع الفاصل. برغي أنبوب مخروطي الشكل من عيار 15 ملم إلى حامل الغطاء ، والذي يشكل بئرا مع البولياكرياميد المنقوش في الأسفل. هذه التجمعات تنسجم مع ابار القياسية 12 بئر لوحه لسهوله التعامل معها.
- غسل كل هلام عن طريق أضافه 500 μL من تلفزيوني إلى التجمع جيدا. احتضان لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف. أزاله تلفزيوني وتكرار مرتين لما مجموعه ثلاثه يغسل.
- بعد غسل تلفزيوني النهائي ، أضافه 500 μL من وسائل الاعلام المغلوب-DMEM إلى الهلام واحتضان في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها. ويمكن الاحتفاظ الهلام في 37 درجه مئوية مع وسائل الاعلام لمده تصل إلى 5 أيام قبل الخلايا البذر.
- في اليوم السابق لبذر الخلايا ، واستبدال المغلوب-DMEM لوسائل الاعلام KSR كامله واحتضان في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها.
- استخدام مشرط وملقط لأزاله بعناية المشبك منقوشة والفاصل من بولي اكريلاميد "ساندويتش" في حين انها لا تزال مغمورة في الاذاعه التلفزيونية. ستكون الاربطه المنقوشة قد نقلت إلى البولياكرياميد خلال البلمره ستبقي بعد أزاله الشفة المختلطة. سيبقي هلام بولياكرياميد ملتصقا بالشفة المنشطة غلوتارالدهيد.
6. الذبح الhescs علي الهلام منقوشة
ملاحظه: إذا كان التخطيط لإصلاح عينات للمناعة بعد TFM ، والتقاط الصور من مواقف ميكروكروي غير المجهدة قبل الخلايا البذر. في هذه الحالة ، فلوريسسينتلي الموسومة يجند ينبغي ان تستخدم في الخطوة 4-3 بحيث المواقع النهائية من الخلايا سوف تكون معروفه قبل البذر والمجهرية يمكن ان تكون في هذه المناطق.
- الحفاظ علي المخزونات hesc الثقافات والثقافات الثانوية الخالية من المغذيات التي أعدت علي لوحات المغلفة المصفوفة في وسائل الاعلام ksr مكيفه قبل البذر علي الهلام بولي اكريلاميد منقوشة كما هو موضح سابقا9.
ملاحظه: توليد وسائل الاعلام KSR مكيفه عن طريق التنظير الإشعاعي الخلايا الليفية الجنينية الفئران في KSR وسائل الاعلام تستكمل مع 4 نانوغرام/مل عامل النمو الليفي الاساسيه (bFGF). جمع واستبدال وسائل الاعلام كل 24 ساعة. - شفط وسائل الاعلام من hESCs. يغسل بإيجاز مع وسائل الاعلام المغلوب-DMEM. أضافه 0.05 ٪ تريبسين-أدتا تستكمل مع 10 μM Y27632 (رو كيناز المثبط) واحتضان في 37 درجه مئوية ل 5-10 دقيقه.
- أضافه وسائل الاعلام مع المصل لمنع التريبسين. يستنشق الوسائط برفق والماصة فوق الطبق لأزاله الخلايا. استمر في السحب برفق لأزاله كافة الخلايا وفك تكتلات الخلايا إلى خلايا مفرده.
- جمع تعليق الخلية والطرد المركزي في 200 x g لمده 3 دقائق.
- يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في حجم مكافئ من وسائل الاعلام ksr لغسل. الطرد المركزي في 200 x g لمده 3 دقائق.
- يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق بيليه في وسائل الاعلام المكيفة ksr تستكمل مع 10 نانوغرام/مل bfgf و 10 μM Y27632.
- عد الخلايا مع مقياس الكريات الدموية وضبط تعليق الخلية إلى تركيز 300,000 خلايا لكل مل. ماصه 500 μL من تعليق الخلية علي كل هلام منقوشة (150,000 خلايا لكل هلام).
- 3 ح بعد البذر ، واستخدام ماصه ليستنشق بعناية وسائل الاعلام من كل هلام واستبدال مع وسائل الاعلام الطازجة KSR مكيفه تستكمل مع 10 نانوغرام/مل bFGF و 10 μM Y27632. وهذا يزيل الخلايا الزائدة التي لم تلتزم بالمناطق المنقوشة من بولياكرياميد.
ملاحظه: هذه خطوه هامه! في هذه المرحلة سيتم التمسك الخلايا فضفاضة إلى ligand منقوشة. كن حذرا جدا عند مبادله الوسائط بعدم فصل الخلايا. وينبغي الحرص علي المساواة مع كل من مبادلات وسائط الاعلام في الخطوات اللاحقة. - 24 ساعة بعد البذر ، واستخدام ماصه ليستنشق بعناية وسائل الاعلام وتبادل لوسائل الاعلام KSR مكيفه تستكمل مع 10 نانوغرام/مل bFGF و 5 μM Y27632.
- 48 h بعد البذر ، واستخدام ماصه ليستنشق بعناية وسائل الاعلام وتبادل لوسائل الاعلام مكيفه KSR تستكمل مع 10 نانوغرام/مل bFGF. وهذا يزيل مثبطات رو كيناز من وسائل الاعلام والتجارب يمكن ان تبدا في اليوم التالي, 72 h بعد البذر.
7. أداء TFM
- عند الرغبة ، تنفيذ TFM كما هو موضح سابقا9 تحت الظروف التجريبية المطلوبة.
- إذا كانت المواقف المجهرية غير المجهدة قد وضعت قبل الخلايا البذر ، وإصلاح الخلايا بعد اتخاذ مواقف المجالات الدقيقة المجهدة وأداء المناعي لتحديد توطين البروتينات ذات الفائدة بالنسبة للمناطق من قوي الجر العالية والمنخفضة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التحدي الرئيسي الذي يجب التغلب عليه في محاولة للثقافة hESCs في مستعمرات الهندسة الخاضعة للرقابة علي ركائز متوافقة هو توليد نمط متجانس من ECM-ligand علي سطح الركيزة. وتتضمن الاستراتيجية المقدمة في هذه الطريقة أولا توليد النمط المطلوب علي سطح الزجاج الزجاجي ثم بعد ذلك نقل هذا النمط إلى سطح هيدروجيل بولياكريلاميد خلال البلمره من هلام (الشكل 1 A). التالي ، فمن المهم لضمان يتم إنشاء نمط المرجوة بنجاح علي سطح الزجاج كوفيرسليب قبل الشروع في البلمره من هيدروجيل ونقل النمط (الشكل 1ب). علي أساس التصوير من الاربطه الفلورية المنقولة إلى بولياكريلاميد ، ويبدو ان الاربطه موجودة فقط في طائره واحده علي سطح بولياكرياميد ، علي الرغم من اننا لم تميز بدقه سمك هذه الطبقة. هناك نوعان من العيوب الشائعة التي لوحظت بعد جيل نمط علي coverslip الزجاج ، كل مع مصدر الخطا الخاصة به. الأول هو ظهور الاربطه الفلورية وتمتد إلى ما وراء هوامش النمط المطلوب (الشكل 1ج ، اعلي) ، والتي تنتج من تسريب الربط الفلوري والحل بسبب المسيل للدموع صغيره في الاستنسل أو عدم كفاية الختم من الاستنسل إلى الزجاج coverslip. والثاني هو ظهور نمط غير مكتمل (الشكل 1ج ، القاع) ، والذي عاده ما يكون بسبب فقاعه الهواء المحاصرين في واجهه كوفيرسليب التي تمنع الامتزاز من ligand الفلورسنت.
المقياس النهائي للنجاح لهذه الطريقة هو القدرة علي الثقافة hESCs في الهندسي المطلوبة علي الهلام المائي منقوشة (الشكل 2). [أين وردر تو] حققت هذا, زرعت [هبس] في كثافة عال نسبيا (300,000 خلايا/[مل]) في الوجود من [رو] [كيناز] صاد (Y27632) وحضنت ل 3 [ه] ان يسهل التصاق إلى الأنماط من [ليغو]. ثم يتم استبدال وسائل الاعلام لأزاله الخلايا غير الملتزم بها. علي مدي 72 h ، يتم تخفيف Y27632 تدريجيا من وسائل الاعلام من خلال سلسله من تبادل وسائل الاعلام في 24 و 48 h بعد البذر. عاده ، تتكاثر الhescs لإكمال الهندسي منقوشة بواسطة 48-72 h ، بحيث يمكن ان تبدا التجارب في 72 h بعد البذر ، بمجرد أزاله Y27632 تماما من وسائل الاعلام.
المستعمرات hESC في الهندسي المحصورة علي الهلام المائي polyالاكريلاميد يسمح قياس قوي الجر التي تولدها الخلية باستخدام TFM. يتم اجراء هذه القياسات عن طريق تضمين ميكرومينيون في هيدروجيل وتصوير مواقف هذه الخرز قبل وبعد البذر hESCs (الشكل 3ا). أزاحه الخرز التالية بذر الخلية هو وظيفة من القوات التي تولدها الخلية ومرونة هيدروجيل ، التالي فان الصور من المواقف حبه يمكن استخدامها لتوليد خرائط النزوح حبه وتستخدم فيما بعد لحساب الكامنة ضغوط الجر. في مستعمرات دائريه من hESCs ، يتم العثور علي أكبر ضغوط الجر بالقرب من الحافة الطرفية للمستعمرات ، في حين ان مركز المستعمرات عرض الضغوط الجر منخفضهبشكلموحد (الصورة 3ب). ومن المثير للاهتمام ، تم العثور علي اعلي الضغوط الجر في مجموعات بالقرب من حافه المستعمرات ، بدلا من تشكيل حلقه مستمرة من الإجهاد القصوى. وهذا يعني انه علي الرغم من ان الهندسة مستعمره تلعب دورا رئيسيا في تحديد توزيع الضغوط الجر ، والتنظيم أكثر محليه وردود الفعل يحدد المواقع الدقيقة للإجهاد القصوى. بالاضافه إلى ذلك ، ما دامت صوره مواقف ميكروكروي دون التمسك الخلايا يؤخذ قبل بذر الخلية ، يمكن ان تكون ثابته المستعمرات hESC للمناعة من البروتينات من الفائدة بعد قياسات قوه الجر. وعلي الرغم من التوزيعات غير الموحدة المرصودة لضغوط الجر ، فان hESCs مثقفه كدوائر منقوشة في ظروف الصيانة تعرض تعبيرا موحدا لعلامة تعدد ماركر Oct3/4 وجزيء التصاق الخلايا E-الملتصقين (الشكل 3ج ).
الطريقة المعروضة لاستخدام الاستنسل لتوليد أنماط من يجند متفوقة بشكل واضح علي التقنية المشتركة للطباعة microcontact لهندسي كبيره نسبيا المستخدمة في هذه الطريقة (اي ، لمستعمرات دائريه 1 ملم في القطر وكذلك مثلثات ومربعات من منطقه مكافئه). أنماط الطباعة microcontact من يجند في هذا المقياس الطول النتائج في نقل غير متجانسة علي حواف الأنماط ، مع القليل جدا من الاربطه المودعة في المناطق الوسطي من الأنماط (الشكل 4ا). ومن الواضح ان هذا غير كاف لإنتاج مستعمرات hESC باستمرار لهندسي محدده. ويؤدي الحد من كثافة بذر الخلايا أيضا إلى عدم الاتساق في تحقيق المستعمرات المكتملة. الخلايا المصنفة في 200,000 خلايا/مل ، بدلا من 300,000 خلايا/مل ، ليست قادره علي توليد اتصالات خليه خليه كافيه للبقاء علي قيد الحياة انخفاض تركيز Y27632 في 24 ساعة بعد البذر (الشكل 4ب). قد يكون من الممكن لتوليد أنماط كامله مع كثافة الخلايا السفلية من خلال تمديد فتره Y27632 التخفيف; ومع ذلك ، عموما هو أكثر كفاءه للبذور في اعلي 300,000 الخلايا/مل كثافة. أحيانا ، تصبح الأخطاء في إنشاء الأنماط التي لم يتم الكشف عنها مسبقا في البروتوكول واضحة عند بذر hESCs. واحد مثل هذا الخطا هو تسرب من يجند الحل تحت الاستنسل بسبب سوء الاتصال مع coverslip. وهذا يؤدي في نهاية المطاف إلى يجند يجري نقلها إلى مناطق بولياكريلاميد خارج الهندسي المطلوبة ، والنمو غير المحصور لل hescs عند البذر (الشكل 4ج).
الشكل 1: زخرفه الجسم علي الشفتين الحمضيتين المغسولتين والنقل إلى الهلام المائي بولياكرياميد. (ا) التمثيل التخطيطي للبروتوكول الخاص بالزخرفة الكترونيه لنظام ECM الشفتين الحمضيتين المغسولتين ونقل الاربطه المنقوشة إلى الهلام المائي البولياكرياميد. (ب) الصور المناعية للوح ECM المنقوش علي الشفتين المغسولتين بالحمض (يسار) وبعد نقله إلى هيدروجيل بولياكرياميد (يمين). وكانت منقوشة البيوتين-الموسومة المصفوفة علي كوفيرسليب ووصفت مع اليكسا فلور 555 سترافيدين قبل نقلها إلى بولياكرياميد. تظهر insets عرض التصغير للأنماط الكاملة التي تم إنشاؤها. (ج) الصور الفلورية التمثيلية التي تثبت عيوب زخرفه في الاربطه الزجاجية. هذه النتيجة من الأخطاء الشائعة في البروتوكول ، مثل تسرب من الحل يجند خارج الهندسة منقوشة (اعلي ، السهم يشير إلى موقع تسرب) ، ومحاصره فقاعات الهواء داخل الهندسي منقوشة من الاستنسل عند أضافه الحل ( أسفل ، يشير السهم إلى موقع فقاعه الهواء). جميع أشرطه مقياس = 500 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: بذر الhescs علي الهلام المائي البولياكرياميد المنقوش. صور تمثيليه ساطعه تظهر البذر الناجح لل hESCs علي الهلام المائي بولياكريلاميد مع الاربطه المنقوشة. يشير المخطط الزمني في الأعلى إلى سلسله من تغييرات الوسائط المستخدمة لأزاله الخلايا غير المرفقة وتمييع Y27632. لاحظ انه بعد البذر الاولي ، والخلايا التمسك بشكل ملحوظ إلى مختلف المناطق داخل الاربطه منقوشة ثم تتكاثر لملء المناطق منقوشة علي مدي 72 h. شريط مقياس = 500 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: التوطين الإقليمي لضغوط الجر وتحصين مستعمرات الحصن المحصورة. (ا) الصور الفلورية من المجالات المجهرية داخل هيدروجيل بولياكرياميد قبل وبعد البذر hescs. (ب) مؤامرة قياس سرعه الجسيمات التمثيلية (piv) تصور أزاحه المجالات المجهرية بسبب ضغوط الجر (يسار) والضغوط المناظرة التي أعيد بناؤها (يمين). (ج) تحصين مستعمرات الhesc المحصورة علي الهلام المائي البولياكرياميد المنقوش ، مما يدل علي القدرة علي مقارنه توطين البروتينات ذات الاهميه لإجهادات الجر. جميع أشرطه مقياس = 200 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: النتائج غير المثالية الناتجة عن طرق وأخطاء بديله. (ا) الصور الفلورية التمثيلية لل ECM والمنقوشة علي الشفتين الحمضيتين المغسولتين عن طريق الطباعة بالتلامس المجهري. (ب) الصور الساطعة لل hescs التي تفشل في تشكيل مستعمرات مكتملة بسبب عدم كفاية التزام بالخلايا. الفجوات الكبيرة المتبقية في المستعمرات في 24 ح بعد البذر (السهام) هي مؤشر مبكر لهذه المسالة. (ج) صور ساطعه لل hescs التي تفشل في تشكيل مستعمرات محصورة بسبب أخطاء في الزخرفة التي أدت إلى وجود يجند خارج الهندسي المطلوب. جميع أشرطه مقياس = 500 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
| مثال SU8 ويفر التصنيع | |
| 1. سبين معطف رقاقه مع SU8-3050 | تدور في 1,000 لفه في الدقيقة لمده 30 ثانيه |
| 2. لينه خبز رقاقه علي صفيحه ساخنه | ط. 3 دقيقه في 65 درجه مئوية |
| 2.45 دقيقه عند 95 درجه مئوية | |
| iii. 3 دقيقه عند 65 درجه مئوية | |
| 4. بارد إلى درجه حرارة الغرفة | |
| 3. فضح في القناع اليجنر | ط. محاذاة رقاقه و ضوئي في قناع اليجنر |
| الثاني. تعرض مع الطاقة من 250 مللي جول/سم2 | |
| • علي سبيل المثال لمصباح مع كثافة 11 ميغاواط/سم2، وفضح ل 23 ثانيه | |
| 4. بعد التعرض اخبز علي صفيحه ساخنه | 1 دقيقه في 65 درجه مئوية |
| ثانيا-15 دقيقه عند 95 درجه مئوية | |
| iii. 1 دقيقه عند 65 درجه مئوية | |
| رابعا. بارد إلى درجه حرارة الغرفة | |
| 5-تطوير | ط. اجتت في SU8 المطور ، 5-10 دقيقه تقريبا |
| الثاني. التحقق من التطوير مع الكحول الايزوبروبيل (IPA) | |
| • إذا كان دون المتقدمة ، وشطف IPA تنتج بقايا بيضاء | |
| 6. من الصعب خبز علي صفيحه ساخنه (اختياري) | 1-2 ح في 150 درجه مئوية |
الجدول 1: مثال SU8 بروتوكول تصنيع رقاقه. وكانت رقائق السيليكون المستخدمة لتوليد طوابع PDMS وقوالب الاستنسل اللاحقة ملفقه باستخدام الخطوات المبينة في هذا الجدول. تم إنشاء هذا البروتوكول باستخدام SU8 3000 ورقه البيانات بهدف خلق سماكه الفيلم من حوالي 100-250 μm.
| تركيبات جل بولياكرياميد | |||||||||
| وحدات تخزين لحل كامل 1 مل | |||||||||
| مرونة معامل (Pa) | النسبة النهائية الاكريلاميد | النهائي% Bis-اكريلاميد | ddH2O (μl) | 40 ٪ اكريلاميد (μL) | 2 ٪ مكرر-اكريلاميد (μL) | 10x تلفزيوني (μL) | 1% TEMED في ddH2O (μl) | ميكروميتس 0.5 ٪ المواد الصلبة في ddH2O (μl) | 1 ٪ PPS في ddH2O (μl) |
| 1050 | 3 | 0.1 | 565 | 75 | 50 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 2700 | 7.5 | 0.035 | 485 | 187.5 | 17.5 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 4000 | 7.5 | 0.05 | 477.5 | 187.5 | 25 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 6000 | 7.5 | 0.07 | 467.5 | 187.5 | 35 | 100 | 75 | 60 | 75 |
الجدول 2: تركيبات هلام بولياكرياميد. كميات من مكونات لتوليد بولياكريلاميد هيدروجيل من مختلف بلتيير مرنه مع المجالات الفلورية الفلورسنت ل tfm. يمكن تحجيم وحدات التخزين لاعلي أو لأسفل استنادا إلى مقدار محلول بولياكريلاميد المطلوب. جميع المكونات باستثناء المجهرية الفلورسنت و PPS مختلطة معا قبل التفريغ. [ببس] = فوسفات-مخزنه مالحه, [تيميد] = تيتراميثيليثيلينيدياميني, [PPS] = بوتاسيوم [بركبريتات].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لتبسيط بروتوكول طويل ومفصل ، وهذا الأسلوب يتكون من ثلاث مراحل حرجه: 1) توليد أنماط من الربط ECM وعلي الزجاج الشفتين ، 2) نقل أنماط إلى بولياكرياميد هيدروجيل خلال البلمره من هلام ، و 3) البذر hESCs علي منقوشة هيدروجيل. وهناك خطوات حاسمه يجب النظر فيها في كل من هذه المراحل الثلاث. من أجل توليد أنماط عاليه الدقة علي الشفتين الزجاج ، يجب ان يتم الضغط علي الاستنسل بشده علي coverslips لمنع تسرب من الحل يجند ويجب أزاله جميع فقاعات الهواء بعد أضافه يجند الحل إلى سطح الاستنسل ( الشكل 1(ج). إذا كان الحل اليجند تسرب من خلال الاستنسل بسبب سوء الاتصال مع coverslip ، سيتم نقل يجند إلى السطح بأكمله من هيدروجيل بولياكرياميد و hescs لن تقتصر علي هندسه مستعمره المطلوب (الشكل 4ج). الخطوة الأكثر اهميه في نقل الاربطه منقوشة إلى polyالاكريلاميد هو فصل بلطف اعلي كوفيرسليب من هيدروجيل في حين تبقي جميع المكونات المغمورة في الاذاعه التلفزيونية. وإذا لم يبق الهيدروجيل مغمورا اثناء الانفصال ، فان الأنماط قد تدمر تماما. وعلاوة علي ذلك ، إذا كان الانفصال يحدث بسرعة كبيره ، قد المسيل للدموع سطح هيدروجيل أو تكون معطوبة علي خلاف ذلك. ليونة هيدروجيل ، وأكثر من ذلك هو في خطر للضرر اثناء الانفصال. وأخيرا ، يجب علي المستخدم ماصه بعناية فائقه عند تبادل وسائل الاعلام خلال البذر وثقافة hESCs علي الهلام المائي منقوشة. ولا تزال المناطق التي يتم التقيد بها بشكل فضفاض في جميع انحاء البروتوكول والمستعمرات المنقوشة يمكن ان تتعطل بسهوله عن طريق الإهمال أو الاستعجال.
بالاضافه إلى الخطوات الهامه التي تمت مناقشتها أعلاه ، هناك عدد من الخطوات الأخرى التي قد تتطلب التعديل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها عند تكييف هذا البروتوكول للتطبيقات المختلفة. في حين ان الأنماط الموضحة هنا هي علي مقياس طول المئات من ميكرون إلى ملليمتر ، وتوليد ملامح منقوشة علي رقائق السيليكون مع الشفافية نباتات ومقاومه الصور السلبية يسمح لاحجام ميزه علي طول الطريق وصولا إلى 7-10 μm. التالي ، يمكن تكييف هذا البروتوكول لحصر هندسه الخلايا المفردة أو المستعمرات الصغيرة لعدد قليل من الخلايا علي ركائز متوافقة.
اثنين من المعلمات التي من المرجح ان تتطلب التحسين عند تكييف هذا البروتوكول لأنواع الخلايا المختلفة هي نوع من الربط ECM والمستخدمة وتركيز الحل اثناء الامتزاز إلى كوفيرسليب الزجاج من خلال الاستنسل. وكان التركيز الكلي ل250 ميكروغرام/مليلتر كافيا لإنتاج أنماط متجانسة من المصفوفات وتسهيل التعلق بالhescs (الشكل 1باء والشكل 2) ، علي الرغم من انه قد يكون من الممكن تحقيق نتائج مماثله مع انخفاض تركيزات. من ناحية أخرى ، قد يكون من الضروري زيادة تركيز الربط لأنواع الخلايا الأقل تمسكا أو للتطبيقات التي تتطلب أوقات حضانة أقصر. زيادة تركيز يجند قد تكون هناك حاجه أيضا لمختلفه ligands ECM, مثل الفيبروكتين أو الكولاجين, التي هي اقل مسعور من الاموميه ، التالي قد لا كثف إلى هيدروجيل كما بقوة. لان نقل يجند من كوفيرسليب إلى هيدروجيل يحدث خلال البلمره من هيدروجيل ، والتقنيات الشائعة الاستخدام للربط المتبادل بقوة لربط ECM والي سطح هيدروجيل (مثل العلاج سولفو-سانبا) من المستحيل. استخدام يغاندس ECM فلوريسسينتلي لتمكين التصور من أنماط في كل خطوه من البروتوكول مفيد للغاية عند تحسين واستكشاف الأخطاء وإصلاحها هذه المعلمات.
بالاضافه إلى ذلك ، قد يتطلب بروتوكول الخلايا البذر الأمثل اعتمادا علي نوع الخلية وشروط الوسائط المستخدمة. بالنسبة للخلايا التي تلتزم بشكل أسرع أو أكثر كفاءه ، قد تكون هناك حاجه إلى كثافة بذر اقل لمنع التصاقات الخلايا الخلوية التي تمتد بين الأنماط وتؤدي إلى مجاميع بدلا من مستعمرات أحاديه الطبقة المنقوشة. النسبة للخلايا التي تعرض مرفقا ضعيفا جدا ، قد تكون هناك حاجه إلى كثافة بذر أكبر أو فتره أطول من الوقت قبل مبادله الوسائط الاوليه لتسهيل التشكيل الكامل للمستوطنات المحصورة (الشكل 4ب).
والقيد الرئيسي لهذه الطريقة هو تعقيدها التقني ، الذي ينتج عنه نتائج منخفضه الانتاجيه نسبيا مقارنه بالطرق المماثلة التي تنطوي علي زراعه الخلايا علي ركائز زجاجيه منقوشة8. ومع ذلك, هذا العيب تفوق بكثير من الاهميه الفسيولوجية التي حققتها المستوطنات hESC محصورة علي ركائز متوافقة. من خلال تلخيص الخصائص الميكانيكية للجنين المبكر بشكل فعال ، فاننا قادرون علي تحسين النموذج وفهم العمليات التي تؤدي إلى التنظيم الذاتي للطبقات الجرثومية الاوليه.
فائده اضافيه لحصر المستعمرات hESC علي الهلام المائي polyالاكريلاميد هو انه يمكن استخدام TFM لفحص الصلة بين تنظيم مستعمره hESC ، كنموذج للجنين في وقت مبكر ، وتوزيع الخلايا المتولدة القوات التي قد تكمن وراء النشاه ومواصفات الخلية مصير. ويؤدي حصر المستعمرات التابعة لهذه القوات إلى توزيع الضغوط علي الجر التي تعتمد علي هندسه المستعمرات (الشكل 3(ب)). علي الرغم من عدم تماثل هذه الضغوط الجر, الخلايا في جميع انحاء المستعمرات لا تزال مستحث في ظروف الصيانة (الشكل 3ج). ومع ذلك ، افترضنا ان توزيعات الإجهاد الجر قد تكون متورطة في تنظيم أنماط من مواصفات مصير الخلية عن طريق ضبط الاستجابة للإشارات التعريفي ، مثل morphogens القابلة للذوبان. ونحن نتوقع ان تسمح لنا هذه الطريقة والمجموعات الأخرى بتحسين نموذج الجنين البشري المبكر باستخدام الhescs ، مما يؤدي إلى فهم أكثر اكتمالا للعمليات الاساسيه التي تكمن وراء تولد الاجنه البشرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
نود ان نعترف بالتمويل من منحه CIRM RB5-07409. J.M.M. يود ان يشكر FuiBoon كاي ، Dhruv ثازار ، وروجر اوريا للمناقشات المختلفة التي استرشدت الجيل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها من هذه الطريقة. كما يشكر J.M.M. الزمالة الاستكشافية لشركه UCSF للدعم المستمر لعمله.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
References
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
- Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).
- Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mace, K., Braun, K. 916, Humana Press. Totowa, NJ. 317-350 (2012).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
- Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
- Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).
