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Bioengineering

ऊतक-स्तरीय यांत्रिकी को नियंत्रित करने के लिए अनुपालन सबस्ट्राट्स पर मानव भ्रूण स्टेम सेल कालोनियों की ज्यामिति का पैटर्न

Published: September 28, 2019 doi: 10.3791/60334
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 1,3, 2,4,5,6
1Graduate Program in Bioengineering, University of California San Francisco and University of California Berkeley, 2Center for Bioengineering and Tissue Regeneration, Department of Surgery, University of California San Francisco, 3Department of Mechanical Engineering, University of California Berkeley, 4Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California San Francisco, 5UCSF Comprehensive Cancer Center, Helen Diller Family Cancer Research Center, University of California San Francisco, 6Department of Anatomy, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, and Department of Radiation Oncology, University of California San Francisco

Summary

बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स लिगन्ड्स को पॉलीऐक्रिलमाइड हाइड्रोजेल्स पर पैटर्न किया जा सकता है ताकि संगत उपस्ट्रियों पर सीमित कालोनियों में मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति को सक्षम किया जा सके। इस विधि कर्षण बल माइक्रोस्कोपी और जैव रासायनिक assays के साथ जोड़ा जा सकता है ऊतक ज्यामिति के बीच परस्पर क्रिया की जांच करने के लिए, सेल जनित बलों, और भाग्य विनिर्देश.

Abstract

मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं कोशिका भाग्य विनिर्देश है कि भ्रूणजनन के दौरान प्राथमिक रोगाणु परत गठन के अनुरूप स्वयं आयोजन पैटर्न द्वारा इनविट्रो में morphogens के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए एक अद्वितीय क्षमता का प्रदर्शन. इस प्रकार, इन कोशिकाओं के साथ जो तंत्र है कि जल्दी मानव विकास ड्राइव की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं. हम अनुरूप substrates पर सीमित कालोनियों में मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं संस्कृति के लिए एक विधि विकसित की है कि कालोनियों और उनके यांत्रिक पर्यावरण दोनों की ज्यामिति पर नियंत्रण प्रदान करता है ताकि शारीरिक मापदंडों recapitulate करने के लिए कि भ्रूणजनन को कम करना। इस विधि की प्रमुख विशेषता सेल लगाव को बढ़ावा देने के लिए सतह पर extracellular मैट्रिक्स ligand के परिभाषित पैटर्न के साथ polyacrylamide hydrogels उत्पन्न करने की क्षमता है. यह वांछित ज्यामितीय पैटर्न के साथ स्टेंसिल ों fabricating द्वारा हासिल की है, इन स्टेंसिल का उपयोग करने के लिए कांच coverslips पर extracellular मैट्रिक्स ligand के पैटर्न बनाने के लिए, और बहुलकीकरण के दौरान polyacrylamide hydrogels के लिए इन पैटर्न स्थानांतरित. इस विधि कर्षण बल माइक्रोस्कोपी के साथ भी संगत है, उपयोगकर्ता को मापने के लिए और सीमित कालोनियों के भीतर सेल जनित बलों के वितरण को मैप करने की अनुमति. मानक जैव रासायनिक परख के साथ संयोजन में, इन माप जल्दी मानव विकास के दौरान भाग्य विनिर्देश और morphogenesis में भूमिका यांत्रिक संकेतों खेलने की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) पुनर्योजी चिकित्सा और ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए महान वादा पकड़. इन कोशिकाओं की बहुरूपी प्रकृति उन्हें किसी भी वयस्क कोशिका प्रकार में अंतर करने की क्षमता प्रदान करता है। जबकि HESCs के भाग्य को विशेष कोशिका प्रकारों के लिए निर्देशित करने में काफी प्रगति की गई है , पूरे ऊतकों या अंगों को उत्पन्न करना बहुत मुश्किल रहा है ,2,3,4, 5. यह कारण है, बड़े हिस्से में, तंत्र है कि मानव विकास के दौरान इन ऊतकों के गठन ड्राइव की एक सीमित समझ के लिए. ज्ञान में इस अंतर को भरने के लिए, हाल के वर्षों में भ्रूण स्टेम कोशिकाओं6,7,8,9 के साथ प्रारंभिक भ्रूण और बाद के विकास के चरणों को मॉडल करने के लिए कई तरीके सामने आएहैं। ,10,11,12,13.

14की पहली एचईएससी लाइनों के व्युत्पत्ति के कुछ ही समय बाद यह प्रदर्शित किया गया कि एचईएससी से बने भ्रूणीय शरीर तीन प्राथमिक रोगाणु परतों6की कोशिकाओं को स्वत : उत्पन्न करने में सक्षम थे . हालांकि, भ्रूणीय निकायों के आकार और आकारिकी पर नियंत्रण की अंतर्निहित कमी के कारण, रोगाणु परतों के संगठन में काफी भिन्नता है और प्रारंभिक भ्रूण के संगठन से मेल खाने में विफल रहा है। हाल ही में, Warmflash एट अल एक विधि विकसित करने के लिए micropatterning के माध्यम से कांच substrates पर hESCs की कालोनियों को सीमित करने के लिए, नियंत्रण और कालोनियों के आकार और ज्यामिति पर स्थिरता प्रदान8. BMP4 की उपस्थिति में, प्रारंभिक विकास में एक महत्वपूर्ण morphogen, इन सीमित कालोनियों प्राथमिक रोगाणु परतों का प्रतिनिधित्व करने के लिए विनिर्देश के reproduible पैटर्न स्वयं व्यवस्थित करने में सक्षम थे. यद्यपि इसने उन तंत्रों का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रदान किया जिनके द्वारा प्राथमिक रोगाणु परतें स्थापित की जाती हैं, भाग्य विनिर्देश के पैटर्न भ्रूणजनन15के दौरान देखे गए संगठन और रूपजनन से सटीक रूप से मेल नहीं खाते थे। जल्दी भ्रूण विकास के एक अधिक वफादार recapitulation matricgel11के एक तीन आयामी extracellular मैट्रिक्स (ECM) में HESCs embedding द्वारा प्राप्त किया गया था , स्वयं को संगठित करने और मॉडल के लिए HESCs की क्षमता के लिए तारीख करने के लिए सबसे मजबूत सबूत प्रदान भ्रूणजनन पूर्व विवो की प्रारंभिक अवस्था. हालांकि, इस विधि असंगत परिणाम पैदावार और इस प्रकार assays कि स्वयं संगठन और भाग्य विनिर्देश के अंतर्निहित तंत्र प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक संख्या के साथ असंगत है.

इन मौजूदा तरीकों और उनके संबंधित सीमाओं को देखते हुए, हम परिस्थितियों में परिभाषित geometries के ESC कालोनियों reproducibly culturing के लिए एक विधि विकसित करने की मांग की है कि जल्दी भ्रूण के extracellular वातावरण मॉडल. इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, हमने सब्सट्रेट के यांत्रिक गुणों को नियंत्रित करने के लिए टूनाबल लोच के पॉलीऐक्रिलमाइड हाइड्रोजेल्स का उपयोग किया। गैस्ट्रेशन-स्टेज चिकन भ्रूणों पर परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए हमने पाया कि एपिब्लास्ट की लोच सैकड़ों पैस्कलों से लेकर कुछ किलोपैस्कल तक होती है। इस प्रकार, हम इस श्रेणी में लोच के साथ polyacrylamide hydrogels पैदा करने पर ध्यान केंद्रित करने के लिए ESC कालोनियों के लिए सब्सट्रेट के रूप में सेवा करते हैं. हमने कालोनियों की ज्यामिति पर मजबूत नियंत्रण प्रदान करने के लिए पॉलीऐक्रिलमाइड हाइड्रोगेल्स7,9 पर एचएसईएससी की गणना के लिए अपने पिछले तरीकों को संशोधित किया है। हम पहले पैटर्न ईसीएम ligands द्वारा यह हासिल की, अर्थात् matrigel, माइक्रोफेब्रिफेब्रिकेड स्टेंसिल के माध्यम से कांच coverslips पर, जैसा कि पहले16की सूचना दी. हम तो बहुलकीकरण के दौरान polyacrylamide hydrogels की सतह के लिए पैटर्न लिगन्ड हस्तांतरण करने के लिए एक उपन्यास तकनीक डिजाइन. विधि हम यहाँ का वर्णन photolithgraphy का उपयोग करने के लिए वांछित ज्यामितीय पैटर्न के साथ एक सिलिकॉन वेफर बनाना शामिल है, polydimethylsilxane (PDMS) के साथ इन ज्यामितीय सुविधाओं के टिकटों का निर्माण, और इन टिकटों का उपयोग करने के लिए स्टेंसिल उत्पन्न करते हैं कि अंततः कांच coverslips की सतह पर ligand के पैटर्न की अनुमति और polyacrylamide करने के लिए स्थानांतरण.

प्रारंभिक भ्रूण के यांत्रिक वातावरण को पुन: लागू करने के अलावा, पॉलीऐक्रिलमाइड पर हेसेक कालोनियों को सीमित करने से कर्षण बल माइक्रोस्कोपी (टीएफएम) के साथ सेल जनित बलों की माप सक्षम होती है, जैसा कि हमारी पिछली विधि9में बताया गया है। संक्षेप में, फ्लोरोसेंट मोती polyacrylamide में एम्बेडेड और fiducial मार्करों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. सेल जनित बलों पैटर्न सब्सट्रेट पर HESCs बोने के बाद इन मोती के विस्थापन इमेजिंग द्वारा गणना कर रहे हैं. इसके अलावा, जिसके परिणामस्वरूप कर्षण बल नक्शे पारंपरिक assays के साथ जोड़ा जा सकता है, इस तरह के इम्यूनोस्टेनिंग के रूप में, जांच करने के लिए कैसे सीमित HESC कालोनियों में सेल जनित बलों के वितरण को विनियमित या बहाव संकेतन modulate कर सकते हैं. हम इन तरीकों से पता चलता है कि यांत्रिक बलों जल्दी भ्रूण विकास है कि वर्तमान में अनदेखी की है के दौरान सेल भाग्य विनिर्देश के पैटर्न में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं उम्मीद है.

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Protocol

एचएसईसीसी के उपयोग से संबंधित सभी तरीकों को कैलिफोर्निया सैन फ्रांसिस्को विश्वविद्यालय में मानव गेमेट, भ्रूण और स्टेम सेल रिसर्च (जीईएससी) समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. ज्यामितीय सुविधाओं के साथ सिलिकॉन वेफर की तैयारी

  1. वांछित ज्यामितीय सुविधाओं के साथ एक photomask बनाएँ। सुविधाओं को डिज़ाइन करने के लिए कंप्यूटर-सहायता प्राप्त ड्राफ्टिंग सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें. नकारात्मक photoresist के साथ उपयोग के लिए, सुविधाओं अपारदर्शी और मुखौटा पारदर्शी के शेष बनाते हैं.
    नोट: 18 मिमी व्यास coverslips पर पैटर्न के लिए, 10 x 10 मिमी क्षेत्रों में प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए समूह सुविधाओं covers 3 coverslips पर फिट चरण में उत्पन्न stencils सुनिश्चित करने के लिए.
  2. स्पिन कोट नकारात्मक photoresist पर एक 100 मिमी सिलिकॉन वेफर. 100-250 डिग्री की फिल्म मोटाई उत्पन्न करने के लिए स्पिन की गति और लंबाई निर्धारित करने के लिए photoresist डेटा पत्रक का उपयोग करें।
    नोट: फिल्म मोटाई इस तरह समायोजित किया जाना चाहिए कि स्टेंसिल की ऊंचाई के लिए पैटर्न की चौड़ाई के पहलू अनुपात के रूप में संभव के रूप में 1:1 के करीब है। हालांकि, हम 100 डिग्री की एक न्यूनतम मोटाई की सिफारिश, के रूप में कुछ भी कम नाजुक stencils कि आसानी से आंसू पैदा करता है.
  3. उत्पाद डेटा पत्रक के अनुसार photoresist संसाधित करें। यह आम तौर पर एक नरम सेंकना शामिल है, एक मुखौटा aligner में photomask के साथ यूवी जोखिम, पोस्ट जोखिम सेंकना, विकास, और हार्ड सेंकना. एक उदाहरण के रूप में, इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त वेफर्स को संसाधित करने के लिए प्रयुक्त प्रक्रिया को सारणी 1में रेखांकित किया गया है।
    नोट: सिलिकॉन वेफर्स से निपटने के रूप में वे नाजुक हैं जब सावधान रहें। एक बार उत्पन्न, वेफर्स बार बार के रूप में लंबे समय के रूप में वे क्षतिग्रस्त नहीं कर रहे हैं इस्तेमाल किया जा सकता है.

2. कवरलिप्स की तैयारी

  1. एसिड धोया "शीर्ष" coverslips की तैयारी
    1. 18 मिमी व्यास #1 मोटाई एक गिलास पेट्री डिश में coverslips रखें. coverslips की उचित संख्या पकवान के आकार पर निर्भर करता है. एक 100 मिमी पकवान के लिए, एक समय में 50-100 coverslips तैयार करते हैं. मात्रा मात्रा इस खंड के शेष के माध्यम से दिया एक 100 मिमी पकवान के अनुरूप.
    2. पेट्री डिश में 1 एम एच सीएल का 20 एमएल जोड़ें और कवरलिप्स को फैलाने के लिए डिश को धीरे से हिलाएं। सुनिश्चित करें कि सभी कवरलिप जलमग्न हैं और कवरलिप्स के बीच से हवा के बुलबुले छोड़ें। कोमल मिलाते हुए के साथ कमरे के तापमान पर रात को इनक्यूबेट करें।
      चेतावनी: एचसीएल अम्लीय और संक्षारक है। एचसीएल के साथ काम करते समय सावधानी बरतें और उचित PPE पहनें।
    3. पकवान से Decant एचसीएल. 20 एमएल अल्ट्राप्योर पानी डालें और 10 मिनट तक हल्की मिलाते हुए धोएं। पानी छोड़ें और कुल पांच धोने के लिए दोहराएं।
    4. अंतिम धोने discarding के बाद, पकवान के लिए 100% इथेनॉल के 20 एमएल जोड़ें. संदंश का उपयोग करना, व्यक्तिगत रूप से कवरलिप्स को हटा दें और सूखने के लिए फिल्टर पेपर के दो टुकड़ों के बीच की व्यवस्था करें।
    5. एक सील कंटेनर में सूखे coverslips स्टोर. एसिड धोया coverslips अग्रिम में तैयार किया जा सकता है और धूल मुक्त स्थितियों में एक महीने या उससे अधिक समय के लिए संग्रहीत.
  2. glutaraldehyde-सक्रिय "नीचे" coverslips की तैयारी
    नोट: अतिरिक्त विवरण 7,9के लिए पिछले तरीकों को देखें.
    1. 18 मिमी व्यास #1 मोटाई एक पेट्री डिश में coverslips रखें.
    2. पेट्री डिश में 0.2 एम एच सीएल का 20 एमएल जोड़ें और कवरलिप्स को फैलाने के लिए डिश को धीरे से हिलाएं। सुनिश्चित करें कि सभी कवरलिप जलमग्न हैं और कवरलिप्स के बीच से हवा के बुलबुले छोड़ें। कोमल मिलाते हुए के साथ कमरे के तापमान पर रात को इनक्यूबेट करें।
    3. पकवान से Decant एचसीएल. 20 एमएल अल्ट्राप्योर पानी डालें और 10 मिनट तक हल्की मिलाते हुए धोएं। पानी छोड़ें और कुल पांच धोने के लिए दोहराएं।
    4. अंतिम धोने discarding के बाद, 0.1 M NaOH के 20 एमएल जोड़ें और धीरे से हिला को फैलाने और coverslips डूब. 1 एच के लिए कोमल मिलाते हुए के साथ कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    5. पकवान से Decant NaOH. 20 एमएल अल्ट्राप्योर पानी डालें और 10 मिनट तक हल्की मिलाते हुए धोएं। पानी छोड़ें और कुल पांच धोने के लिए दोहराएं।
    6. अंतिम धोना छोड़ने के बाद, अल्ट्राप्यूरे पानी में 3-एमिनोप्रोपाइलट्राइमेथॉक्सीसिलेन के 1:200 कमजोर पड़ने के 20 एमएल जोड़ें और आवरण को फैलाने और डूबने के लिए धीरे से हिलाएं। 1 एच या रात के लिए कोमल मिलाते हुए के साथ कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
      चेतावनी: 3-एमिनोप्रोपिलट्राइमेथॉक्सीलेन ज्वलनशील है और त्वचा की जलन पैदा कर सकता है। देखभाल के साथ संभाल, उचित PPE पहनते हैं, और स्थानीय निपटान नियमों के अनुसार कचरे को त्यागें।
    7. पकवान से पतला 3-एमिनोप्रोपिलट्राइमेथॉक्सीसिलेन घोल को हटा दें। 20 एमएल अल्ट्राप्योर पानी डालें और 10 मिनट के लिए हल्की झटकों के साथ धो लें। पानी को त्यागें और कम से कम पांच धोने के लिए दोहराएं। आगे बढ़ने से पहले सभी 3-एमिनोप्रोपिलट्राइमेथॉक्सीलेन को हटाना महत्वपूर्ण है।
    8. अंतिम धोना छोड़ने के बाद, फॉस्फेट बफर्ड नमकीन (पीबीएस) में 70% ग्लूटारैल्डिहाइड के 1:140 कमजोर पड़ने के 20 एमएल जोड़ें और धीरे से हिलाकर बिखरा हुआ ढक लें। 1 एच या रात के लिए कोमल मिलाते हुए के साथ कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
      चेतावनी: 70% glutaraldehyde विषाक्त है और त्वचा जलन पैदा कर सकता है. देखभाल के साथ संभाल, उचित PPE पहनते हैं, और स्थानीय निपटान नियमों के अनुसार कचरे को त्यागें।
    9. पकवान से पतला glutaraldehyde समाधान decant. 20 एमएल अल्ट्राप्योर पानी डालें और 10 मिनट तक हल्की मिलाते हुए धोएं। पानी छोड़ें और कुल पांच धोने के लिए दोहराएं।
    10. अंतिम धोने discarding के बाद, 100% इथेनॉल के 20 एमएल जोड़ें. संदंश का उपयोग करना, व्यक्तिगत रूप से कवरलिप्स को हटा दें और सूखने के लिए फिल्टर पेपर के दो टुकड़ों के बीच की व्यवस्था करें।
    11. एक सील कंटेनर में सूखे coverslips स्टोर. Glutaraldehyde-सक्रिय coversप्स अग्रिम में तैयार किया जा सकता है और अप करने के लिए छह महीने के लिए संग्रहीत.

3. ईसीएम लिगन्ड पैटर्न के लिए स्टेंसिल का उत्पादन

  1. उत्पन्न polydimethylsiloxane (PDMS) मध्यवर्ती टिकटों
    1. वजन से, एक 10:1 अनुपात में पीडीएमएस इलाज एजेंट के साथ PDMS आधार मिक्स। अच्छी तरह से मिलाएं.
      नोट: PDMS के प्रारंभिक आवेदन के लिए, एक 100 मिमी पकवान को भरने के लिए PDMS के लगभग 100 ग्राम तैयार करते हैं। बाद के अनुप्रयोगों के लिए, केवल पकवान जहां सिलिकॉन वेफर सुविधाओं स्थित हैं के केंद्र से PDMS निकालें और नए PDMS के 20-30 ग्राम तैयार करते हैं.
    2. 30-60 मिनट के लिए या सभी हवा बुलबुले हटा रहे हैं जब तक एक desicator में PDMS मिश्रण Degas.
    3. एक प्लास्टिक 100 मिमी पकवान में चरण 1 से संशोधित सिलिकॉन वेफर रखें। धीरे-धीरे और समान रूप से वेफर की सतह पर PDMS मिश्रण डालना. वेफर की सतह से किसी भी हवा के बुलबुले को छोड़ने के लिए काम की सतह पर पकवान टैप करें।
    4. Degas PDMS मिश्रण 10 मिनट के लिए वेफर पर डाला या जब तक सभी हवा बुलबुले हटा रहे हैं या PDMS की सतह पर आ गए हैं.
    5. 2 ज के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर पीडीएमएस सेंकना कमरे के तापमान को ठंडा करने की अनुमति दें।
    6. एक स्केलपेल या बॉक्स कटर का उपयोग करना, बाहर पकवान है कि ज्यामितीय सुविधाओं में शामिल है के केंद्र से PDMS के अनुभाग में कटौती.
    7. लगभग 10 x 10 मिमी वर्गों में PDMS कट, प्रत्येक एक एकल प्रयोगात्मक हालत के लिए सुविधाओं युक्त. प्रोटोकॉल के अनुवर्ती चरणों में इन्हें "स्टाम्प" के रूप में संदर्भित किया जाता है.
  2. पीडीएमएस के फ्लैट स्लैब का सृजन
    1. वजन से, एक 8:1 अनुपात में पीडीएमएस इलाज एजेंट के साथ PDMS आधार मिक्स। प्रत्येक 100 मिमी पकवान के लिए लगभग 20 ग्राम तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा. अच्छी तरह से मिलाएं.
    2. 30-60 मिनट के लिए या सभी हवा बुलबुले हटा रहे हैं जब तक एक desicator में PDMS मिश्रण Degas.
    3. धीरे धीरे और समान रूप से एक साफ 100 मिमी पकवान में PDMS डालना. किसी भी हवा बुलबुले जारी करने के लिए काम की सतह पर पकवान टैप करें।
    4. 2 ज के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर पीडीएमएस सेंकना कमरे के तापमान को ठंडा करने की अनुमति दें।
    5. पकवान से PDMS निकालें. इस तरह की है कि पकवान के नीचे के साथ संपर्क में था कि PDMS की सतह का सामना करना पड़ रहा है उलटें.
    6. चरण 3.1 में उत्पन्न प्रत्येक स्टाम्प के लिए, PDMS के एक 15 x 15 मिमी वर्ग में कटौती. प्रोटोकॉल के बाद के चरणों में इन्हें "फ्लैट स्लैब" के रूप में संदर्भित किया जाता है।
  3. स्टेंसिल ्सरेटिंग जनरेट कर रहा है
    1. आसान हैंडलिंग के लिए एक 150 मिमी डिश, या अन्य फ्लैट सतह के ढक्कन पर PDMS के फ्लैट स्लैब की व्यवस्था करें। स्लैब के बीच पर्याप्त रिक्ति सुनिश्चित करें (उदाहरण के लिए, 150 मिमी डिश के लिए, यहां तक कि रिक्ति के साथ नौ फ्लैट स्लैब की व्यवस्था करें)।
    2. पीडीएमएस के एक फ्लैट स्लैब पर चरण 3.1 में उत्पन्न प्रत्येक स्टाम्प को उलटें, जैसे कि स्टाम्प पर सुविधाएं पीडीएमएस के फ्लैट स्लैब के संपर्क में हैं। धीरे से भी संपर्क सुनिश्चित करने के लिए forceps के साथ टिकट के शीर्ष पर प्रेस.
    3. ध्यान से ढक्कन पकड़े PDMS टिकट / स्लैब जोड़े पकवान के आधार पर सहारा, इस तरह है कि ढक्कन एक कोण पर टिकी हुई है. यह अगले चरण में यूवी-करबल बहुलक के wicking सहायता करता है।
    4. प्रत्येक स्टाम्प/स्लैब युग्म के शीर्ष अंतराफलक पर यूवी-करबल बहुलक की एक छोटी सी बूंद रखें। बहुलक सतह तनाव से दोनों के बीच दुष्ट हो जाएगा, गुरुत्वाकर्षण द्वारा सहायता प्रदान की.
      नोट: कई अलग UV-curable पॉलिमर इस प्रोटोकॉल में काम कर सकते हैं। हमने निम्नलिखित गुणों के लिए नॉरलैंड ऑप्टिकल चिपकने वाला 74 का चयन किया है: i) यूवी प्रकाश के संपर्क में तेजी से इलाज, ii) इलाज पर पीडीएमएस टिकटों से आसान हटाने, iii) मैनुअल दबाव के साथ ग्लास कवरलिप्स के लिए मजबूत आसंजन।
    5. एक बार बहुलक पूरी तरह से दुष्ट हो गया है, काम की सतह पर स्टाम्प / स्लैब जोड़े के साथ फ्लैट ढक्कन जगह है। प्रत्येक स्टाम्प/स्लैब इंटरफ़ेस के शेष तीन पक्षों में से प्रत्येक पर यूवी-करबल बहुलक की एक छोटी सी बूंद रखें।
    6. एक 200 $L पिपेट टिप का उपयोग करना, टिकट के किनारों के आसपास बहुलक की बूंदों से कनेक्ट / यह चरण 4 में ligand समाधान धारण करेगा एक सीमा बनाता है।
      नोट: टिकट के किनारों के आसपास बहुलक काम करते समय सावधान रहें। यदि स्टाम्प/स्लैब इंटरफ़ेस बाधित होता है, तो बहुलक सुविधाओं के नीचे बात करेगा और स्टेंसिल ठीक से नहीं बनेगा।
    7. ध्यान से एक यूवी नसबंदी बॉक्स में टिकट / बाँझ "Str" शक्ति सेटिंग का प्रयोग करें और 10 मिनट के लिए बेनकाब.
    8. यूवी-स्टरिलाइजेशन बॉक्स से स्टाम्प/स्लैब जोड़े को निकालें। forceps के दो जोड़े का उपयोग करना, धीरे PDMS टिकट हटा जबकि फ्लैट स्लैब और स्टेंसिल है कि यूवी-curable बहुलक से गठन नीचे पकड़े.
    9. संदंश का उपयोग करके स्टेंसिल को सावधानीपूर्वक निकालें और इसे इस तरह से पलटें कि पीडीएमएस के सपाट स्लैब के संपर्क में आने वाली सतह का सामना करना पड़ रहा है।
      नोट: स्टेंसिल नाजुक हैं। उन्हें सौंपते समय सावधान रहें, खासकर शुरू में उन्हें पीडीएमएस से हटाते समय, ताकि वे आंसू न करें।
    10. उल्टे स्टेंसिलको यूवी-स्टरिलाइजेशन बॉक्स में वापस रखें। बाँझ "Str" बिजली की स्थापना का प्रयोग करें और 3 मिनट के लिए बेनकाब.

4. कवरलिप्स पर ईसीएम लिगन्ड पैटर्निंग

  1. एसिड धोया coverslips पर स्टेंसिल दबाने
    1. प्रयोगशाला फिल्म के एक साफ टुकड़े पर प्रत्येक स्टेंसिल के लिए एक एसिड धोया कवरस्लिप रखें।
    2. संदंश का उपयोग करना, ध्यान से प्रत्येक स्टेंसिल, फ्लैट साइड-डाउन, एक एसिड धोया कवरस्लिप पर रखें। ऐसी रखें कि सुविधाएँ कवरस्लिप पर केंद्रित हों.
    3. प्रत्येक स्टेंसिल के शीर्ष पर प्रयोगशाला फिल्म का एक छोटा सा टुकड़ा रखें। स्टेंसिल और कवरस्लिप के बीच मजबूत संपर्क बनाने के लिए स्टेंसिल पर दृढ़ता से और समान रूप से नीचे दबाएं।
      नोट: यह एक महत्वपूर्ण कदम है! स्टेंसिल की पूरी सतह पर मजबूती से और भर में दबाएं। पर्याप्त संपर्क नहीं बनाया जाता है, तो लिगन्ड समाधान स्टेंसिल और कवरलिप्स के बीच रिसाव होगा और पैटर्न विफल हो जाएगा। वैकल्पिक: स्टेंसिल और कवरस्लिप के बीच पर्याप्त संपर्क की पुष्टि करने के लिए, प्रत्येक स्टेंसिल की सतह पर अल्ट्राप्यूर बाँझ पानी के पिपेट 100 डिग्री सेल्सियस और कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। 1 ज के बाद, लीक के लिए जाँच करें। सफलतापूर्वक बंधुआ स्टेंसिल से Aspirate पानी और आगे बढ़ना.
  2. जलरागी को बढ़ाने के लिए स्टेंसिल्ड कवरलिप्स की सतह को साफ करने वाले प्लाज्मा
    1. एक प्लाज्मा क्लीनर में स्टेंसिल के साथ कवरलिप रखें। 30 एस के लिए उच्च शक्ति प्लाज्मा लागू करें.
  3. ईसीएम लिगन्ड समाधान की तैयारी
    नोट: सभी बाद के चरणों बाँझ शर्तों में पूरा किया जाना चाहिए, यदि संभव हो तो.
    1. बर्फ पर बाँझ 100 मीटर HEPES, 100 mM NaCl, पीएच 8.0 समाधान जगह है। एक बार बर्फ ठंड, matricgel और कोलेजन जोड़ने के लिए क्रमशः 225 ग्राम/एमएल और 25 g/mL की सांद्रता प्राप्त करने के लिए, क्रमशः. वैकल्पिक: समस्या निवारण के लिए या लिगन्ड दृश्यकेत के लिए, लिगन्ड समाधान में फ्लोरोसेंट टैग की गई लिगन्ड शामिल करें.
      1. नोट: विभिन्न ECM ligands इस विधि के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. विभिन्न ligands के लिए, अतिरिक्त अनुकूलन आदर्श एकाग्रता, ऊष्मायन समय, और ऊष्मायन तापमान निर्धारित करने के लिए आवश्यक हो सकता है। अधिक जानकारी के लिए चर्चा अनुभाग देखें.
    2. प्रत्येक स्टेंसिल की सतह पर लिगन्ड समाधान को पिपेट करें। 10 x 10 मिमी वर्ग टिकटों से बने स्टेंसिल के लिए, 100 डिग्री सेल्सियस प्रति स्टेंसिल लागू करें।
    3. स्टेंसिल सुविधाओं में हवा के बुलबुले के लिए जाँच करें। यदि आवश्यक हो, तो सुविधाओं से हवा के बुलबुले को हटाने के लिए ठीक-टिप किए गए सम्प्स या 2 जेडएल पिपेट टिप का उपयोग करें।
      नोट: यह एक महत्वपूर्ण कदम है! यदि वायु बुलबुले कवरस्लिप की सतह पर फंस जाते हैं, तो लिगन्ड सतह पर अधिशोचित नहीं होगा और परिणामस्वरूप पैटर्न अधूरा होगा।
    4. स्टिंसिलेड कवरलिप्स को लिगन्ड के साथ एक डिश में रखें, प्रयोगशाला फिल्म के साथ रैप करें, और रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

5. लिगंड का स्थानांतरण पॉलीऐक्रिलमाइड जेल में

  1. प्रत्येक कवरस्लिप से लिगन्ड समाधान और स्टेंसिल निकालना
    1. स्टेंसिल की सतह से लिगन्ड विलयन को प्रेरित करें। Ligand समाधान एकत्र किया जा सकता है और 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और एक महीने के लिए पुन: उपयोग.
    2. संदंश का उपयोग करके, स्टेंसिल के साथ कवरस्लिप को धोने के लिए बाँझ पीबीएस युक्त एक डिश में डूब जाता है।
    3. धोने के लिए बाँझ पीबीएस के एक दूसरे पकवान में स्टेंसिल के साथ कवरस्लिप को संक्षेप में डुबोएं।
    4. कवरस्लिप की सतह से स्टेंसिल निकालें। कवरस्लिप को न तोड़ने के लिए सावधान रहें।
    5. पीबीएस washes से नमक को हटाने के लिए अल्ट्रापुरे बाँझ पानी युक्त एक डिश में कवरलिप को संक्षेप में डुबोएं। अतिरिक्त पानी दूर बात करने के लिए एक नाजुक कार्य पोंछे के लिए कवरस्लिप के किनारे टैप करें।
    6. एक अक्रिय गैस के नीचे कवरस्लिप को सुखाएं, जैसे नाइट्रोजन। इस बिंदु से आगे अभिविन्यास का ट्रैक रखने के लिए कवरस्लिप के नीचे को चिह्नित करें। पैटर्न वाले पक्ष को सामना करने के लिए सावधान रहें।
    7. कदम 5.1.1 के माध्यम से दोहराएँ 5.1.6 प्रत्येक stenciled coverslip के लिए.
  2. पैटर्न वाले कवरलिप्स के साथ पॉलीऐक्रिलमाइड हाइड्रोजेल बनाना
    नोट: अतिरिक्त विवरण के लिए पिछले तरीकों को देखें7,9 सभी टोपी धारकों, ट्यूबों, और spacers के लिए इस्तेमाल किया polyacrylamide जैल बनाने के लिए इस्तेमाल किया 10% ब्लीच रात भर के साथ धोने, पानी के साथ rinsing कम से कम पांच बार ब्लीच को दूर करने के लिए, और 70% इथेनॉल में संक्षेप में धोने. उपयोग करने से पहले सूखने के लिए एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट में नाजुक कार्य पोंछे पर सभी टुकड़े रखें।
    1. वांछित हाइड्रोजेल लोच प्राप्त करने के लिए पॉलीऐक्रिलमाइड समाधान तैयार करें (सारणी 2)। फ्लोरोसेंट microspheres और पोटेशियम persulfate (पीपीएस) को छोड़कर सभी घटकों को एक साथ मिलाएं.
      नोट: 1% पोटेशियम persulfate समाधान ताजा हर बार तैयार करें।
    2. 30 मिनट के लिए वैक्यूम के तहत अलग ट्यूबों में polyacrylamide समाधान, microspheres, और पीपीएस Degas.
    3. प्रत्येक पैटर्न कवरस्लिप के लिए, एक स्पेसर (18 मिमी बाहरी व्यास, 14 मिमी आंतरिक व्यास) शीर्ष पर रखा के साथ एक glutaraldehyde सक्रिय "नीचे" कवरस्लिप तैयार करते हैं।
    4. degassing के बाद, संक्षेप में microspheres sonicate और polyacrylamide समाधान के लिए उपयुक्त मात्रा में जोड़ें। ऊपर और नीचे pipeting द्वारा मिक्स, हवा बुलबुले परिचय नहीं सावधान किया जा रहा है. संक्षेप में sonicate.
    5. polyacrylamide समाधान करने के लिए पी पी पी एस की उपयुक्त मात्रा जोड़ें। ऊपर और नीचे Pipette समाधान मिश्रण करने के लिए, हवा के बुलबुले शुरू करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है।
      नोट: पीपीएस जोड़ने के बाद, तेजी से काम करने के लिए कदम 5.2.6 के माध्यम से 5.2.11 polyacrylamide बहुलकीकरण से पहले पूरा करने के लिए.
    6. पिपेट 75-150 $एल (स्पेसर की मोटाई पर निर्भर करता है) प्रत्येक ग्लूटारैल्डिहाइड-सक्रिय कवरस्लिप के केंद्र में।
    7. संदंश का प्रयोग करके, पॉलीऐक्रिलमाइड और स्पेसर के साथ प्रत्येक ग्लूटारैलडिहाइड-सक्रिय कवरस्लिप पर एक पैटर्न्ड कवरस्लिप रखें, ताकि पैटर्न वाले लिगन्ड को पॉलीऐक्रिलमाइड समाधान का सामना करना पड़ सके। यदि पर्याप्त polyacrylamide समाधान जोड़ा गया था, सतह तनाव दो coverslips के बीच polyacrylamide बात करेंगे और कोई हवा बुलबुले मौजूद होंगे.
    8. प्रत्येक polyacrylamide "सैंडविच" उठाओ और ध्यान से एक नाजुक काम पोंछ करने के लिए पक्ष को छूने के लिए दूर बात अतिरिक्त polyacrylamide समाधान.
    9. ध्यान से 15 एमएल शंकु-नीचे ट्यूबों के साथ संगत कर रहे हैं कि धागे के साथ एक टोपी धारक में प्रत्येक polyacrylamide "सैंडविच" जगह है। अभिविन्यास ऐसा होना चाहिए कि glutaraldehyde कवरस्लिप का निचला हिस्सा कैप धारक के संपर्क में है, और पैटर्न्ड कवरस्लिप शीर्ष पर है।
    10. प्रत्येक टोपी धारक में एक 15 एमएल शंकु-नीचे ट्यूब पेंच करने के लिए जगह में polyacrylamide "सैंडविच" पकड़. ट्यूब लीक को रोकने के लिए तंग किया जाना चाहिए, लेकिन overtighten और coverslips दरार नहीं करने के लिए सावधान रहना चाहिए.
    11. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर स्विंग-बकेट में ट्यूबों में polyacrylamide "सैंडविच" सेंट्रीफ्यूज। पूर्ण बहुलकीकरण सुनिश्चित करने के लिए एक अतिरिक्त 50 मिनट के लिए अभिविन्यास बनाए रखने के लिए अपकेंद्रित्र और ट्यूब रैक में जगह से ट्यूब निकालें। फ्लोरोसेंट microspheres के विरंजन को रोकने के लिए पन्नी के साथ कवर रखें.
      नोट: Centrifugation TFM करने के लिए इस विधि का उपयोग करते समय महत्वपूर्ण है। केन्द्रापसारक बल सभी सूक्ष्मगोलों को एक ही तल पर ले जाता है, जो अंततः हाइड्रोजेल की सतह के ठीक नीचे होगा। यह इमेजिंग microsphere विस्थापन है कि सेल जनित कर्षण तनाव की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है के लिए आदर्श है. यदि TFM प्रदर्शन नहीं, microspheres polyacrylamide समाधान से बाहर छोड़ दिया जा सकता है और बहुलकीकरण centrifugation के बिना बेंचटॉप पर हो सकता है.
    12. ट्यूब ों से बहुलकीकृत पॉलीऐक्रिलमाइड "सैंडविच" निकालें और पीबीएस में 100 मिमी डिश में डूब जाएं। प्रयोगशाला फिल्म में लपेटें और कमरे के तापमान पर 3 एच के लिए या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  3. बीज कोशिकाओं के लिए पैटर्न जैल की तैयारी
    1. यह पीबीएस में जलमग्न रहता है, जबकि polyacrylamide "सैंडविच" से पैटर्न कवरस्लिप और स्पेसर को ध्यान से हटाने के लिए एक स्केलपेल और संदंश का उपयोग करें। पैटर्न वाले लिगन्ड को बहुलकीकरण के दौरान पॉलीऐक्रिलमाइड में स्थानांतरित कर दिया जाएगा और कवरस्लिप को हटाने के बाद रहेगा। polyacrylamide जेल glutaraldehyde-सक्रिय कवरस्लिप से जुड़ा रहेगा.
      नोट: यह एक महत्वपूर्ण कदम है! पोलाक्रिलमाइड को पीबीएस में जलमग्न किया जाना चाहिए, जबकि कवरस्लिप को हटाना चाहिए या लिगन्ड पैटर्न नष्ट हो जाएगा।
    2. एक टोपी धारक में पैटर्न polyacrylamide के साथ प्रत्येक कवरस्लिप रखें। कवरस्लिप के शीर्ष पर और पॉलीऐक्रिलमाइड के चारों ओर, जहां स्पेसर स्थित था, एक गैस्केट (18 मिमी बाहरी व्यास, 14 मिमी आंतरिक व्यास) रखें। एक आरी बंद 15 मिमी शंकु नीचे ट्यूब टोपी धारक में पेंच, तल पर पैटर्न polyacrylamide के साथ एक अच्छी तरह से बनाने. इन विधानसभाओं आसान से निपटने के लिए एक मानक 12 अच्छी तरह से थाली के कुओं में फिट.
    3. अच्छी तरह से विधानसभा के लिए पीबीएस के 500 $L जोड़कर प्रत्येक जेल धो लें. कोमल मिलाते हुए के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट। पीबीएस निकालें और कुल तीन washes के लिए दो बार दोहराएँ.
    4. अंतिम पीबीएस धोने के बाद, रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर जैल और इनक्यूबेट करने के लिए नॉकआउट-डीएमईएम मीडिया के 500 जेडएल जोड़ें। कोशिकाओं को बोने से पहले 5 दिनों तक मीडिया के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर जेल रखा जा सकता है।
    5. बीज बोने की कोशिकाओं से एक दिन पहले, पूर्ण केएसआर मीडिया के लिए नॉकआउट-डीएमईएम को बदलें और रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

6. पैटर्न वाले जैल पर हेस् क्स का निर्माण

नोट: यदि TFM के बाद इम्यूनोस्टेनिंग के लिए नमूने ठीक करने की योजना बना रहे हैं, तो बीज कोशिकाओं से पहले unstressed microsphere पदों की छवियों को ले. इस मामले में, फ्लोरोसेंट टैग लिगन्ड का उपयोग चरण 4.3.1 में किया जाना चाहिए ताकि कोशिकाओं के अंतिम स्थानों को बीज बोने से पहले जाना जा सके और उन क्षेत्रों में सूक्ष्म क्षेत्रों की छवि बनाई जा सके।

  1. वातानुकूलित केएसआर मीडिया में मैट्रिजेल लेपित प्लेटों पर तैयार स्टॉक एचईएससी संस्कृतियों और माध्यमिक फीडर-मुक्त संस्कृतियों को बनाए रखें, जैसा कि पहले वर्णित9पैटर्न पर बोने से पहले किया गया था।
    नोट: केएसआर मीडिया में विकिरणित माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट्स culturing द्वारा वातानुकूलित केएसआर मीडिया उत्पन्न 4 एनजी / एमएल बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (bFGF) के साथ पूरक। ले लीजिए और मीडिया की जगह हर 24 एच.
  2. HESCs से मीडिया को प्रेरित करें। नॉकआउट-डीएमईएम मीडिया के साथ संक्षेप में धोएं। जोड़ें 0.05% trypsin-EDTA 10 $M Y27632 (Rho kinase अवरोध करनेवाला) के साथ पूरक और 5-10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट.
  3. trypsin को बाधित करने के लिए सीरम के साथ मीडिया जोड़ें. कोशिकाओं को हटाने के लिए डिश पर धीरे से aspirate मीडिया और पिपेट. सभी कक्षों को निकालने और एकल कक्षों में कक्ष समूहों को अलग करने के लिए धीरे से पाइपिंग जारी रखें.
  4. 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेल निलंबन और अपकेंद्रित्र लीजिए।
  5. सुपरनेंट को प्रेरित करें और धोने के लिए केएसआर मीडिया के बराबर मात्रा में गोली को फिर से चालू करें। 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
  6. सुपरनेंट को प्रेरित करें और 10 एनजी/एमएल बीएफजीएफ और 10 डिग्री एम Y27632 के साथ पूरक वातानुकूलित केएसआर मीडिया में गोली को फिर से शुरू करें।
  7. एक हेमोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की गणना और प्रति एमएल 300,000 कोशिकाओं की एकाग्रता के लिए सेल निलंबन समायोजित करें। प्रत्येक पैटर्न जेल (150,000 कोशिकाओं प्रति जेल) पर सेल निलंबन के Pipette 500 $L.
  8. 3 ज बोने के बाद, ध्यान से प्रत्येक जेल से मीडिया aspirate और ताजा वातानुकूलित KSR मीडिया के साथ की जगह के लिए एक pippette का उपयोग करें 10 ng/mL bFGF और 10 $M Y27632 के साथ पूरक. यह अतिरिक्त कोशिकाओं है कि polyacrylamide के पैटर्न क्षेत्रों का पालन नहीं किया हटा.
    नोट: यह एक महत्वपूर्ण कदम है! इस स्तर पर कोशिकाओं को ढीला पैटर्न ligand का पालन किया जाएगा. कोशिकाओं को अलग नहीं करने के लिए मीडिया स्वैपिंग करते समय बहुत सावधान रहें। बाद के कदमों में प्रत्येक मीडिया स्वैप के साथ समान देखभाल की जानी चाहिए।
  9. 24 ज बोने के बाद, ध्यान से मीडिया और वातानुकूलित KSR मीडिया के लिए विनिमय aspirate करने के लिए एक pippette का उपयोग करें 10 ng/mL bFGF और 5 $M Y27632 के साथ पूरक.
  10. 48 ज बोने के बाद, ध्यान से मीडिया और वातानुकूलित KSR मीडिया के लिए विनिमय aspirate करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें 10 ng/mL bFGF के साथ पूरक. यह मीडिया से Rho kinase अवरोध करनेवाला को हटा और प्रयोगों अगले दिन शुरू कर सकते हैं, 72 ज बोने के बाद.

7. प्रदर्शन TFM

  1. जब वांछित, TFM प्रदर्शन के रूप में पहले से वर्णित9 वांछित प्रयोगात्मक शर्तों के तहत.
  2. यदि unstressed microsphere पदों बोने कोशिकाओं से पहले छवि थे, पर बल दिया microsphere पदों लेने के बाद कोशिकाओं को ठीक करने और उच्च और कम कर्षण बलों के क्षेत्रों के सापेक्ष ब्याज के प्रोटीन के स्थानीयकरण निर्धारित करने के लिए इम्यूनोस्टेनिंग प्रदर्शन.

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Representative Results

मुख्य चुनौती अनुरूप substrates पर नियंत्रित ज्यामिति की कालोनियों में संस्कृति के प्रयास में दूर करने के लिए सब्सट्रेट की सतह पर ECM-ligand की एक समरूप पैटर्न उत्पन्न करने के लिए है। इस विधि में प्रस्तुत रणनीति पहले एक गिलास coverslip की सतह पर वांछित पैटर्न पैदा करने और फिर बाद में जेल की बहुलकीकरण के दौरान एक polyacrylamide hydrogel की सतह के लिए उस पैटर्न को स्थानांतरित शामिल है (चित्र 1 इस प्रकार, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि हाइड्रोजेल के बहुलकीकरण और पैटर्न के हस्तांतरण (चित्र 1ठ)को आगे बढ़ने से पहले कांच की आवरण की सतह पर वांछित पैटर्न सफलतापूर्वक बनाया जाता है। फ्लोरोसेंट लिगन्ड पैटर्न के इमेजिंग के आधार पर पॉलीऐक्रिलमाइड में स्थानांतरित किया गया, लिगन्ड केवल पॉलीऐक्रिलमाइड की सतह पर एक ही विमान में मौजूद प्रतीत होता है, हालांकि हमने इस परत की मोटाई को ठीक से नहीं पहचाना। वहाँ दोष के दो आम प्रकार के कांच coverslip पर पैटर्न पीढ़ी के बाद मनाया, त्रुटि के अपने स्वयं के स्रोत के साथ प्रत्येक रहे हैं. पहला फ्लोरोसेंट लिगेंड की उपस्थिति है जो वांछित पैटर्न के मार्जिन से परे का विस्तार है (चित्र 1सी, शीर्ष),जो स्टेंसिल में एक छोटे आंसू या अपर्याप्त सील के कारण फ्लोरोसेंट लिगन्ड समाधान के लीक से परिणाम है कांच कवरस्लिप के लिए स्टेंसिल। दूसरा एक अधूरा पैटर्न की उपस्थिति है (चित्र 1ब्, नीचे),जो आम तौर पर एक हवा के बुलबुले के कारण है कवरस्लिप इंटरफ़ेस है कि फ्लोरोसेंट लिगेंड के अधिशोषण को रोकता है पर फंस गया है.

इस विधि के लिए सफलता का अंतिम उपाय पैटर्नेड हाइड्रोगेल्स पर वांछित भू-गणित में एचईएससी की संस्कृति की क्षमता है (चित्र 2)। इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, एचएसईएससी को एक रो काइनेज अवरोधक (Y27632) की उपस्थिति में अपेक्षाकृत उच्च घनत्व (300,000 कोशिकाओं/एमएल) पर बीज दिया जाता है और लिगंड के पैटर्न के लिए आसंजन को सुविधाजनक बनाने के लिए 3 एच के लिए इनक्यूबेट किया जाता है। मीडिया तब गैर-अनुकूल कक्षों को निकालने के लिए बदल दिया जाता है। 72 एच के दौरान, Y27632 धीरे-धीरे 24 और 48 एच के बाद बीज िंग में मीडिया एक्सचेंजों की एक श्रृंखला से मीडिया से बाहर पतला है. आमतौर पर, HESCs 48-72 h द्वारा पैटर्न्ड geometries को पूरा करने के लिए proliferate, इस तरह है कि प्रयोगों 72 एच पोस्ट-सीडिंग पर शुरू कर सकते हैं, एक बार Y27632 पूरी तरह से मीडिया से हटा दिया जाता है.

polyacrylamide hydrogels पर सीमित geometries में हेएससी कालोनियों Culturing टीएफएम का उपयोग कर सेल जनित कर्षण बलों की माप की अनुमति देता है। ये माप hydrogel में फ्लोरोसेंट microspheres embedding द्वारा किए जाते हैं और इन मोती की स्थिति को इमेजिंग से पहले और HESCs बीज बोने के बाद (चित्र 3ए) . सेल सीडिंग के बाद मोती के विस्थापन सेल जनित बलों और hydrogel की लोच का एक समारोह है, इस प्रकार मनका पदों के छवियों मनका विस्थापन के नक्शे उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और बाद में अंतर्निहित की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया कर्षण तनाव. एचएसईएससी की गोलाकार कालोनियों में सबसे बड़ा कर्षण तनाव कालोनियों के परिधीय किनारे के पास पाया जाता है, जबकि कालोनियों का केंद्र समान रूप से कम कर्षण तनाव प्रदर्शित करता है(चित्र 3ख)। दिलचस्प बात यह है कि सबसे अधिक कर्षण तनाव कॉलोनियों के किनारे के पास समूहों में पाए जाते हैं, न कि अधिक से अधिक तनाव की एक सतत अंगूठी बनाने के। इसका मतलब यह है कि हालांकि कॉलोनी ज्यामिति कर्षण तनाव के वितरण का निर्धारण करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, अधिक स्थानीयकृत विनियमन और प्रतिक्रिया अधिकतम तनाव के सटीक स्थानों को निर्धारित करता है. इसके अतिरिक्त, जब तक पालन कोशिकाओं के बिना microsphere पदों की छवि सेल बोने से पहले लिया जाता है, ESC कालोनियों कर्षण बल माप के बाद ब्याज के प्रोटीन के इम्यूनोस्टेनिंग के लिए तय किया जा सकता है. कर्षण तनावों के अनुपरूपित असमान वितरण के बावजूद, रखरखाव की स्थिति में पैटर्नित वृत्तों के रूप में सुसंस्कृत एचईएससी, pluripotency marker Oct3/4 और सेल आसंजन अणु ई-कैदरिन की एक समान अभिव्यक्ति प्रदर्शित करता है (चित्र 3C ).

लिगन्ड के पैटर्न उत्पन्न करने के लिए स्टेंसिल का उपयोग करने के लिए प्रस्तुत विधि इस विधि में प्रयुक्त अपेक्षाकृत बड़े geometries के लिए माइक्रो-संपर्क मुद्रण की सामान्य तकनीक से स्पष्ट रूप से बेहतर है (यानी, परिपत्र कालोनियों के लिए 1 मिमी व्यास के रूप में के रूप में अच्छी तरह से त्रिकोण और बराबर क्षेत्र के वर्गों). इस लंबाई पैमाने पर लिगन्ड के माइक्रोसंपर्क प्रिंटिंग पैटर्न का परिणाम पैटर्न के किनारों पर विषम अंतरण होता है, जिसमें पैटर्न के केंद्रीय क्षेत्रों में बहुत कम लिगन्ड जमा होता है (चित्र 4क)। यह स्पष्ट रूप से विशिष्ट geometries के HESC कालोनियों के उत्पादन के लिए स्पष्ट रूप से अपर्याप्त है. सेल सीडिंग घनत्व को कम करने से भी पूर्ण कालोनियों को प्राप्त करने में असंगति होती है। 200,000 कोशिकाओं/एमएल पर बीज वाले सेल, 300,000 कोशिकाओं/एमएल के बजाय, 24 एच पोस्ट-सीडिंग पर Y27632 की कम एकाग्रता जीवित रहने के लिए पर्याप्त सेल-सेल संपर्क उत्पन्न करने में सक्षम नहीं हैं (चित्र 4बी)। यह Y27632 कमजोर पड़ने की अवधि का विस्तार करके कम सेल घनत्व के साथ पूरा पैटर्न उत्पन्न करने के लिए संभव हो सकता है; तथापि, समग्र यह उच्च 300,000 कोशिकाओं/एमएल घनत्व पर बीज के लिए अधिक कुशल है। कभी कभी, पैटर्न पीढ़ी है कि प्रोटोकॉल में पहले का पता नहीं लगा रहे हैं में त्रुटियों hESCs के बोने पर स्पष्ट हो जाते हैं. ऐसी ही एक त्रुटि कवरस्लिप के साथ खराब संपर्क के कारण स्टेंसिल के नीचे लिगन्ड समाधान का रिसाव है। इसके परिणामस्वरूप लिगंड को वांछित भू-गणित के बाहर पॉलीऐक्रिलमाइड के क्षेत्रों में स्थानांतरित किया जा रहा है, और बीजबोने पर एचएसईएससी का अपरिसंबित विकास(चित्र 4ग)।

Figure 1
चित्र 1: एसिड धोया coverslips पर ईसीएम लिगन्ड की पैटर्निंग और polyacrylamide hydrogels के लिए स्थानांतरण. (क) एसिड-वाशकिए गए कवरलिपों पर ईसीएम लिगन्ड पैटर्न के लिए प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व और पैटर्नवाले लिगन्ड को पॉलीऐक्रिलमाइड हाइड्रोजेल्स में स्थानांतरित करना। (बी) एसिड-वाधे गए कवरलिप्स (बाएं) पर पैटर्नेड ईसीएम लिगन्ड की इम्यूनोफ्लोरेसेंट छवियों और पॉलीऐक्रिलमाइड हाइड्रोजेल (दाएं) को स्थानांतरित करने के बाद। Biotin-tagged matricgel कवरस्लिप पर पैटर्न किया गया था और polyacrylamide करने के लिए स्थानांतरण से पहले एलेक्सा फ्लोर 555 streptavidin के साथ लेबल. इनसेट से पता चलता है कि तैयार किए गए पूरे पैटर्न का दृश्य ज़ूम-आउट हो गया है। (सी) प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियों कांच coverslip पर लिगेंड के पैटर्न दोष का प्रदर्शन. प्रोटोकॉल में सामान्य त्रुटियों से ये परिणाम, जैसे पैटर्नेड ज्यामिति के बाहर लिगेंड समाधान का रिसाव (ऊपर, तीर रिसाव की साइट को इंगित करता है), और लिगेंड समाधान जोड़ने पर स्टेंसिल के पैटर्न वाले ज्यामिति के अंदर हवा के बुलबुले को फँसाना ( नीचे, तीर हवा बुलबुला की साइट को इंगित करता है). सभी स्केल बार्स $ 500 $m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: पैटर्न ेड पॉलीऐक्रिलमाइड हाइड्रोजेल्स पर हेस्क्रेस का सीडिंग। प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियों पैटर्न लिगंड के साथ polyacrylamide hydrogels पर HESCs के सफल बोने का प्रदर्शन. शीर्ष पर समय रेखा असंबद्ध कोशिकाओं को हटाने और Y27632 को पतला करने के लिए इस्तेमाल किया मीडिया परिवर्तन की श्रृंखला को इंगित करता है. ध्यान दें कि प्रारंभिक बीज बोने के बाद, कोशिकाएं पैटर्न वाले लिगन्ड के भीतर विभिन्न क्षेत्रों में stochastically का पालन करती हैं और फिर 72 h. स्केल बार के दौरान पैटर्न वाले क्षेत्रों को भरने के लिए प्रोलाइफेट करती हैं। कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: कर्षण तनाव और सीमित ईईएससी कालोनियों के इम्यूनोस्टेनिंग का क्षेत्रीय स्थानीयकरण। (क) ईईएससी बोने से पहले और बाद में पॉलीऐक्रिलमाइड हाइड्रोजेल के भीतर सूक्ष्म गोलों की फ्लोरोसेंट छवियों। (बी) प्रतिनिधि कण छवि वेलोसिमिट्री (पीआईवी) साजिश कर्षण तनाव (बाएं) और इसी पुनर्निर्माण कर्षण तनाव (दाएं) के कारण microspheres के विस्थापन का चित्रण। (ग) पैटर्नवाले पॉलीऐक्रिलमाइड हाइड्रोजेल्स पर सीमित ईईएससी कालोनियों का इम्यूनोस्टेनिंग, कर्षण तनावों के लिए ब्याज के प्रोटीन के स्थानीयकरण की तुलना करने की क्षमता का प्रदर्शन करता है। सभी स्केल बार्स $ 200 $m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: वैकल्पिक विधियों और त्रुटियों द्वारा प्राप्त गैर-आदर्श परिणाम। (क) ईसीएम लिगन्ड के प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट छवियों को माइक्रो-संपर्क प्रिंटिंग के माध्यम से एसिड-वाध कवरलिप्स पर पैटर्न किया गया। (ख) कक्षों के अपर्याप्त पालन के कारण पूर्ण कालोनियों का निर्माण न करने वाले ईईएससी के ब्राइटफील्ड चित्र। 24 एच पोस्ट-सीडिंग (एरो) पर कालोनियों में शेष बड़े अंतराल इस मुद्दे का प्रारंभिक संकेत हैं। (ग) ईईएससी के ब्राइटफील्ड छवियों, जो पैटर्निंग में त्रुटियों के कारण सीमित कालोनियों का निर्माण करने में विफल रहते हैं, जिसके कारण वांछित भू-गणित के बाहर लिगन्ड की उपस्थिति हुई। सभी स्केल बार्स $ 500 $m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

उदाहरण SU8 Wafer निर्माण
1. SU8-3050 के साथ स्पिन कोट वेफर 30 s के लिए 1,000 RPM पर स्पिन
2. गर्म प्लेट पर नरम सेंकना वेफर i. 65 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट
ii. 95 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट
iii. 65 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट
iv. कमरे के तापमान को शांत करें
3. मुखौटा aligner में उजागर i.Align वेफर और मास्क संरेखमेंसे फोटोमास्क
द्वितीय. 250 mJ/cm2 की ऊर्जा के साथ उजागर
• उदाहरण के लिए 11 mW/cm2की तीव्रता के साथ दीपक के लिए, 23 s के लिए बेनकाब
4. पोस्ट जोखिम गर्म थाली पर सेंकना i. 65 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट
ii.15 मिनट पर 95 डिग्री सेल्सियस
iii. 65 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट
Iv. कमरे के तापमान को शांत करें
5. विकास i. SU8 डेवलपर में आंदोलन, लगभग 5-10 मिनट
द्वितीय. आइसोप्रोपिल अल्कोहल (आईपीए) के साथ विकास की जांच करें
• अगर अल्प विकसित, आईपीए कुल्ला एक सफेद अवशेषों का उत्पादन होगा
6. गर्म थाली पर हार्ड सेंकना (वैकल्पिक) 150 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 ज

तालिका 1: उदाहरण SU8 वेफर निर्माण प्रोटोकॉल. सिलिकॉन वेफर्स PDMS टिकटों और बाद में stencils उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया इस तालिका में उल्लिखित चरणों का उपयोग कर गढ़े गए थे. इस प्रोटोकॉल लगभग 100-250 $m की एक फिल्म मोटाई बनाने के उद्देश्य से SU8 3000 डेटा शीट का उपयोग कर उत्पन्न किया गया था.

पॉलीऐक्रिलमाइड जेल फॉर्मूलेशन्स
1 एमएल पूर्ण समाधान के लिए वॉल्यूम
लोचदार मॉडुलस (पा) अंतिम % acrylamide अंतिम % बिस्-ऐक्रिलमाइड डी डी एच2हे (जेडएल) 40% ऐक्रिलमाइड (जेडएल) 2% बिस्-ऐक्रिलमाइड (जेडएल) 10x पीबीएस (जेडएल) 1% DDH2हे (जेडएल) में TEMED माइक्रोस्फीयर 0.5% ठोस ddH2हे (जेडएल) में डीडीएच2ओ (जेडएल) में 1% पीपीएस
1050 3 0.1 565 75 50 100 75 60 75
2700 7.5 0.035 485 187.5 17.5 100 75 60 75
4000 7.5 0.05 477.5 187.5 25 100 75 60 75
6000 7.5 0.07 467.5 187.5 35 100 75 60 75

तालिका 2: Polyacrylamide जेल योगों. TFM के लिए फ्लोरोसेंट microspheres के साथ विभिन्न लोचदार moduli के polyacrylamide hydrogels पैदा करने के लिए घटकों की मात्रा. वॉल्यूम को स्केल किया जा सकता है या नीचे की जरूरत polyacrylamide समाधान की राशि के आधार पर. फ्लोरोसेंट microspheres और पीपीएस को छोड़कर सभी घटकों degassing से पहले एक साथ मिश्रित कर रहे हैं. पीबीएस - फॉस्फेट-बफर नमकीन, TEMED ] tetramethylethylenediamine, पी पीएस - पोटेशियम persulfate.

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Discussion

एक लंबी और विस्तृत प्रोटोकॉल को सरल बनाने के लिए, इस विधि में तीन महत्वपूर्ण चरण होते हैं: 1) कांच के कवरलिप्स पर ईसीएम लिगन्ड के पैटर्न पैदा करना, 2) जेल की बहुलकीकरण के दौरान पॉलीऐक्रिलमाइड हाइड्रोगेल्स के पैटर्न को स्थानांतरित करना, और 3) हेज पर एचईएससी बोने पैटर्नेड हाइड्रोजेल। वहाँ महत्वपूर्ण कदम है कि इन तीन चरणों में से प्रत्येक पर विचार किया जाना चाहिए रहे हैं. कांच coverslips पर उच्च निष्ठा पैटर्न उत्पन्न करने के लिए, स्टेंसिल मजबूती से ligand समाधान के रिसाव को रोकने के लिए कवरस्लिप पर दबाया जाना चाहिए और सभी हवा बुलबुले स्टेंसिल की सतह के लिए लिगेंड समाधान जोड़ने के बाद हटाया जाना चाहिए ( चित्र 1C) . यदि लिगंड समाधान कवरस्लिप के साथ खराब संपर्क के कारण स्टेंसिल के माध्यम से रिसाव करता है, तो लिगन्ड को पॉलीऐक्रिलमाइड हाइड्रोजेल की पूरी सतह पर स्थानांतरित कर दिया जाएगा और एचएसईएससी वांछित उपनिवेश ज्यामिति तक ही सीमित नहीं होगा (चित्र 4ब्) । पैटर्न लिगन्ड को पॉलीऐक्रिलमाइड को स्थानांतरित करने में सबसे महत्वपूर्ण कदम धीरे से हाइड्रोजेल से शीर्ष कवरस्लिप को अलग कर रहा है, जबकि सभी घटक पीबीएस में डूबे हुए हैं। यदि हाइड्रोजेल जुदाई के दौरान जलमग्न नहीं रहता है, तो पैटर्न पूरी तरह से नष्ट हो सकता है। इसके अलावा, अगर जुदाई भी तेजी से होता है, hydrogel की सतह आंसू या अन्यथा क्षतिग्रस्त हो सकता है. नरम hydrogel, और यह जुदाई के दौरान नुकसान के लिए खतरा है. अंत में, उपयोगकर्ता बहुत ध्यान से pipette जब पैटर्न hydrogels पर GESCs के बीज और संस्कृति के दौरान मीडिया का आदान प्रदान करना चाहिए. हेएसएससी पूरे प्रोटोकॉल में ढीले ढंग से पालन करते रहते हैं और लापरवाह या त्वरित पाइपिंग द्वारा पैटर्न वाली कालोनियों को आसानी से बाधित किया जा सकता है।

ऊपर चर्चा किए गए महत्वपूर्ण चरणों के अतिरिक्त, ऐसे कई अन्य चरण हैं जिन्हें विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित करते समय संशोधन और समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है. जबकि यहाँ का प्रदर्शन पैटर्न एक मिलीमीटर के लिए microns के सैकड़ों की लंबाई पैमाने पर कर रहे हैं, पारदर्शिता photomasks और नकारात्मक photoresist के साथ सिलिकॉन वेफर्स पर पैटर्न सुविधाओं पैदा सुविधाओं की सुविधा के लिए सभी तरह से नीचे की अनुमति देता है 7-10 $m. इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल के अनुरूप substrates पर एकल कोशिकाओं या कुछ कोशिकाओं की छोटी कालोनियों की ज्यामिति सीमित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

दो पैरामीटर है कि संभावना अनुकूलन की आवश्यकता होगी जब विभिन्न सेल प्रकार के लिए इस प्रोटोकॉल अनुकूलन ECM ligand के प्रकार का इस्तेमाल किया और stencils के माध्यम से कांच coverslip के लिए अधिशोषण के दौरान समाधान में ligand की एकाग्रता कर रहे हैं. 250 ग्राम/एमएल की कुल लिगन्ड सांद्रता मैट्रिकल के समरूप पैटर्न ों के उत्पादन और एचएसईएससी के लगाव को सुविधाजनक बनाने के लिए पर्याप्त थी (चित्र 1ख और चित्र 2), हालांकि यह कम के साथ इसी तरह के परिणाम प्राप्त करने के लिए संभव हो सकता है सांद्रता. दूसरी ओर, यह आगे सेल प्रकार है कि कम अनुयायी हैं या अनुप्रयोगों है कि कम ऊष्मायन समय की आवश्यकता के लिए के लिए लिगेंड की एकाग्रता में वृद्धि करने के लिए आवश्यक हो सकता है. Ligand की बढ़ती एकाग्रता भी विभिन्न ECM ligands के लिए आवश्यक हो सकता है, इस तरह के फाइब्रोनेक्टिन या कोलेजन के रूप में, जो matricgel से कम हाइड्रोफोबिक हैं और इसलिए के रूप में दृढ़ता से hydrogel के लिए adsorb नहीं हो सकता है. क्योंकि hydrogel के लिए कवरस्लिप से लिगेंड का हस्तांतरण hydrogel के बहुलकीकरण के दौरान होता है, आमतौर पर मजबूत पार के लिए तकनीक का इस्तेमाल किया ECM ligand hydrogel सतह (जैसे sulfo-SANPAH उपचार के रूप में) को जोड़ने के लिए असंभव है. प्रोटोकॉल के प्रत्येक चरण पर पैटर्न के दृश्य को सक्षम करने के लिए फ्लोरोसेंट-लेबल ECM ligands का उपयोग करना अत्यंत उपयोगी है जब अनुकूलन और इन मापदंडों समस्या निवारण.

साथ ही, बीज बोने कक्षों के लिए प्रोटोकॉल कक्ष प्रकार और मीडिया का उपयोग किया शर्तों के आधार पर ऑप्टिमाइज़ेशन की आवश्यकता हो सकती है। कोशिकाओं है कि अधिक तेजी से या कुशलता से पालन के लिए, एक कम सीडिंग घनत्व सेल सेल आसंजन है कि पैटर्न और समुच्चय में परिणाम के बजाय पैटर्न मोनोलेयर कालोनियों के बीच अवधि को रोकने के लिए आवश्यक हो सकता है. उन कोशिकाओं के लिए जो बहुत ही खराब लगाव प्रदर्शित करते हैं, प्रारंभिक मीडिया स्वैप से पहले एक बड़ा सीडिंग घनत्व या लंबी लंबाई की आवश्यकता हो सकती है ताकि सीमित कालोनियों के पूर्ण गठन की सुविधा मिल सके (चित्र 4ठ)।

इस विधि की मुख्य सीमा इसकी तकनीकी जटिलता है, जिसके परिणामस्वरूप अपेक्षाकृत कम-थ्रूपुट परिणाम समान विधियों की तुलना में होते हैं जिनमें पैटर्न वाले कांच पर कोशिकाओं को शामिल किया जाताहै। हालांकि, यह कमी अनुरूप substrates पर सीमित हेएससी कालोनियों द्वारा हासिल की गई शारीरिक प्रासंगिकता से कहीं अधिक है। प्रभावी रूप से प्रारंभिक भ्रूण के यांत्रिक गुणों recapitulating द्वारा, हम बेहतर मॉडल और प्रक्रियाओं है कि प्राथमिक रोगाणु परतों के स्वयं संगठन के लिए नेतृत्व को समझने में सक्षम हैं.

polyacrylamide hydrogels पर हेएससी कालोनियों को सीमित करने का एक अतिरिक्त लाभ यह है कि यह TFM के उपयोग के लिए एक ESC कॉलोनी के संगठन के बीच लिंक की जांच करने में सक्षम बनाता है, जल्दी भ्रूण के एक मॉडल के रूप में, और सेल जनित बलों के वितरण कि हो सकता है कम ली मॉर्फोजेनेसिस और सेल भाग्य विनिर्देश। एचईएससी कालोनियों को सीमित करने से उन कर्षण ों का वितरण होता है जो उपनिवेश ज्यामिति पर निर्भर होते हैं (चित्र 3ठ)। इन कर्षण तनावों की एकरूपता न होने के बावजूद, सभी कालोनियों में कोशिकाएं रखरखाव की स्थिति में बहुगुणी बनी हुई हैं(चित्र 3ग)। हालांकि, हम hypothesize कि कर्षण तनाव वितरण सेल भाग्य विनिर्देश के पैटर्न को विनियमित करने में शामिल किया जा सकता है प्रेरण संकेतों के लिए प्रतिक्रिया ट्यूनिंग द्वारा, इस तरह घुलनशील morphogens के रूप में. हम आशा करते हैं कि इस विधि हमें और अन्य समूहों को बेहतर HESCs के साथ जल्दी मानव भ्रूण मॉडल की अनुमति होगी, मौलिक प्रक्रियाओं है कि मानव भ्रूणजनन underlie की एक और अधिक पूरी समझ के लिए अग्रणी.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम CIRM अनुदान RB5-07409 से धन स्वीकार करना चाहते हैं. J.M.M. FuiBoon काई, ध्रुव Thakar, और रोजर Oria विभिन्न विचार विमर्श है कि पीढ़ी और इस विधि की समस्या निवारण निर्देशित के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं. जे.एम.एम. भी अपने काम के चल रहे समर्थन के लिए UCSF डिस्कवरी फैलोशिप धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin Gibco 25300054
100 mm glass petri dish Fisher Scientific 08-747B
100 mm plastic petri dish Fisher Scientific FB0875712
15 mL conical-bottom tubes Corning 352095
150 mm plastic petri dish Fisher Scientific FB0875714
18 mm diameter #1 coverslips Thermo Scientific 18CIR-1
2% bisacrylamide Bio-Rad 161-0142
3-aminopropyltrimethoxysilane ACROS Organics 313251000
40% acrylamide Bio-Rad 161-0140
Aluminum foil Fisher Scientific 01-213-100
Basic fibroblast growth factor Sigma-Aldrich F0291
Bleach Clorox N/A
Centrifuge with swing-buckets Eppendorf 22623508 Model: 5804 R
Collagen Corning 354236
Dessicator Fisher Scientific 08-642-7
Ethanol Fisher Scientific AC615095000
Fetal bovine serum Gibco 16000044
Fluorescent microspheres Thermo Scientific F8821
Forceps (for coverslips) Fisher Scientific 16-100-122
Forceps (for wafers) Fisher Scientific 17-467-328
Gel holders N/A N/A Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request
Glutaraldehyde Fisher Scientific 50-261-94
HEPES Thermo Scientific J16926A1
Hot plate Fisher Scientific HP88854100
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144S-500
Isopropyl alcohol Fisher Scientific A416-500
Kimwipes (delicate task wipes) Kimberly-Clark Professional 34120
Knockout serum replacement Gibco 10828028
Knockout-DMEM Gibco 10829018
Mask aligner (for photolithography) Karl Suss America, Inc. Karl Suss MJB3 Mask Aligner
Matrigel Corning 354277
Microscope for traction force Nikon N/A Model: Eclipse TE200 U
Motorized positioning stage Prior Scientific N/A Model: HLD117
Nitrogen gas Airgas NI 250
Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) Norland Products NOA 74
Oven Thermo Scientific PR305225G
Parafilm (laboratory film) Fisher Scientific 13-374-12
PDMS (Sylgard 184) Fisher Scientific NC9285739
Photomask CAD/Art Services, Inc. N/A Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request
Plasma cleaner Fisher Scientific NC9332171
Plastic for gasket Marian Chicago HT6135
Plastic for spacer TAP Plastics N/A Polycarbonate sheet, .01 inch thickness
Potassium chloride (for making PBS) Fisher Scientific P217-500
Potassium phosphate monobasic (for making PBS) Fisher Scientific P285-500
Pottassium persulfate ACROS Organics 424185000
Scalpel Fisher Scientific 14-840-00
Silicon wafer Electron Microscopy Sciences 71893-06 Type P, 3 inch, silicon wafers
Sodium chloride (for making PBS) Fisher Scientific S271-1
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) Fisher Scientific S472-500
SU8-3050 Photoresist MicroChem SU8-3000
SU8-Developer MicroChem Y020100
TEMED Bio-Rad 161-0800
UV-sterilization box Bio-Rad N/A Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber
Y27632 (Rho kinase inhibitor) StemCell Technologies 72304

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 151 मानव भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी) polyacrylamide hydrogels कर्षण बल माइक्रोस्कोपी (टीएफएम) photolithgraphy सेल पैटर्न extracellular मैट्रिक्स (ईसीएम) ऊतक इंजीनियरिंग पुनर्योजी चिकित्सा
ऊतक-स्तरीय यांत्रिकी को नियंत्रित करने के लिए अनुपालन सबस्ट्राट्स पर मानव भ्रूण स्टेम सेल कालोनियों की ज्यामिति का पैटर्न
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Muncie, J. M., Falcón-Banchs,… More

Muncie, J. M., Falcón-Banchs, R., Lakins, J. N., Sohn, L. L., Weaver, V. M. Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics. J. Vis. Exp. (151), e60334, doi:10.3791/60334 (2019).

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