Summary
细胞外基质配体可以图案化在聚丙烯酰胺水凝胶上，使人类胚胎干细胞在符合要求的基质上的封闭菌落中培养。该方法可与牵引力显微镜和生化测定相结合，以检查组织几何、细胞生成力和命运规格之间的相互作用。
Abstract
人类胚胎干细胞通过细胞命运规范的自组织模式，在胚胎形成过程中与原发生殖层形成相对应，表现出独特的能力，对体外形态作出反应。因此，这些细胞是一个强大的工具，用以检查推动早期人类发展的机制。我们开发了一种方法，在符合要求的基质的密闭菌落体中培养人类胚胎干细胞，以控制菌落的几何及其机械环境，以便重新概括物理参数，胚胎发生的基础。该方法的主要特点是能够生成具有定义细胞外基质配体的形态的聚丙烯酰胺水凝胶，以促进细胞附着。这是通过制造具有所需几何图案的模具，使用这些模具在玻璃盖玻片上创建细胞外基质配体图案，并在聚合过程中将这些图案转移到聚丙烯酰胺水凝胶中来实现的。该方法还与牵引力显微镜兼容，允许用户测量和绘制在密闭菌落区内细胞生成力的分布图。结合标准生化测定，这些测量可用于检查机械线索在早期人类发展过程中的命运规范和形态形成中的作用。
Introduction
人类胚胎干细胞（hESCs）在再生医学和组织工程应用中具有很大的应用前景。这些细胞的多能性质使它们能够分化成任何成人细胞类型。虽然在将hESCs的命运引向特定细胞类型方面已经取得巨大进展，但仍然很难产生整个组织或器官，即第1、2、3、4， 5.这在很大程度上是由于对在人类发展期间推动这些组织形成的机制了解有限。为了填补这一知识空白，近年来出现了一些方法，用胚胎干细胞6、7、8、9对早期胚胎及其发育阶段进行建模。 ，10，11，12，13.
在第一个hESC线14的产生后不久，证明由hESC形成的胚胎体能够自发地产生三个初级生殖层6的细胞。然而，由于对胚胎体的大小和形态固有的缺乏控制，生殖层组织差异很大，无法与早期胚胎的组织相匹配。最近，Warmflash等人开发了一种通过微模式将hESC的菌落限制在玻璃基板上的方法，从而对菌落8的大小和几何体提供控制和一致性。在BMP4（早期发育中的重要形态原）的存在下，这些受限菌落能够自组织地对代表主要生殖层的命运进行可重复的规格模式。虽然这为研究原始生殖层的建立机制提供了一个有用的模型，但命运规范的模式与胚胎发生过程中观察到的组织和形态形成不完全匹配。通过将hESCs嵌入母体11的三维细胞外基质（ECM）实现对早期胚胎发育的更忠实的回顾，为hESC自我组织和建模的能力提供了迄今为止最有力的证据胚胎形成的早期外体。但是，此方法会产生不一致的结果，因此与可用于揭示自组织和命运规范的基本机制的一些检测不兼容。
鉴于这些现有方法和各自的局限性，我们寻求开发一种方法，在模拟早期胚胎细胞外环境的条件下，对已定义的几何体的hESC菌落进行可重复的培养。为此，我们使用可调弹性的聚丙烯酰胺水凝胶来控制基材的机械性能。利用原子力显微镜对胃化阶段的鸡胚胎，我们发现表粒的弹性范围从几百帕斯卡到几千帕斯卡不等。因此，我们专注于生产具有弹性的聚丙烯酰胺水凝胶，作为hESC菌落的基质。我们修改了我们以前在聚丙烯酰胺水凝胶7、9上培养hESCs的方法，以对菌落的几何结构进行强有力的控制。我们通过首先将ECM配体（即母体凝胶）图案通过微制模具在玻璃盖上实现，如之前报道的16。然后，我们设计了一种新技术，在聚合过程中将图案配体转移到聚丙烯酰胺水凝胶的表面。我们在这里描述的方法包括使用光刻法来制造具有所需几何图案的硅晶片，用聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 创建这些几何特征的图章，并使用这些图章生成模具，最终允许配体图案到玻璃盖玻片表面，并转移到聚丙烯酰胺。
除了重述早期胚胎的机械环境外，将hESC菌落限制在聚丙烯酰胺上，还能用牵引力显微镜（TFM）测量细胞产生的力，如我们之前的方法9所述。简而言之，荧光珠可以嵌入聚丙烯酰胺，并用作基准标记。通过将 hESCs 播种到图案基板上后，通过成像这些磁珠的位移来计算细胞生成的力。此外，生成的牵引力图可与传统测定（如免疫染色）相结合，以检查在密闭的 hESC 菌落中细胞生成力的分布如何调节或调节下游信号。我们期望这些方法将揭示，机械力在细胞命运规范的模式设计中起着关键作用，而目前这种发育是被忽视的。
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Protocol
此处描述的所有与使用 hESCs 相关的方法均已获得加州大学旧金山分校人类游戏、胚胎和干细胞研究 （GESCR） 委员会的批准。
1. 具有几何特征的硅晶圆的制备
- 创建具有所需几何特征的照片蒙版。使用计算机辅助绘图软件设计功能。对于负光刻，使特征不透明，蒙版的其余部分透明。
注：对于在 18 mm 直径盖玻片上进行图案化，将每个实验条件的特征组合到 10 x 10 mm 区域，以确保步骤 3 中生成的模具适合盖玻片。 - 在 100 mm 硅晶片上旋转涂层负光刻胶。使用光刻胶数据表确定旋转的速度和长度，以生成 100-250 μm 的胶片厚度。
注： 应调整胶片厚度，使图案宽度与模具高度的纵横比尽可能接近 1：1。但是，我们建议最小厚度为 100 μm，因为任何较少的模具都会产生易撕裂的精致模具。 - 根据产品数据表处理光刻胶。这通常涉及软烘烤、带光掩膜的外光照射、曝光后烘烤、发育和硬烘烤。例如，表1概述了用于处理该协议中使用的晶圆的过程。
注意：处理硅片时要小心，因为它们是脆弱的。一旦生成，晶圆可以重复使用，只要它们不损坏。
2. 准备盖玻片
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酸洗"顶"盖玻片的制备
- 将直径18毫米#1厚度盖片放入玻璃培养皿中。适当的盖玻片数量取决于菜的大小。对于 100 mm 的盘子，一次准备 50-100 个盖玻片。通过本节其余部分给出的体积量对应于 100 mm 的盘。
- 将 20 mL 的 1 M HCl 添加到培养皿中，轻轻摇动盘子以分散盖玻片。确保所有盖玻片都浸没，并从盖玻片之间释放气泡。在室温下孵育过夜，轻轻摇动。
注意：HCl 是酸性和腐蚀性的。使用 HCl 时，请小心谨慎并佩戴适当的个人防护装备。 - 从菜的德坎特HCl。加入20 mL的超纯水，轻轻摇动洗涤10分钟。弃水，重复5次洗涤。
- 丢弃最终洗涤后，向盘子中加入 20 mL 的 100% 乙醇。使用钳子，分别拆下盖玻片，并在两片滤纸之间排列以干燥。
- 将干燥的盖玻片存放在密封的容器中。酸洗盖玻片可以提前准备，并在无尘条件下储存一个月或更长时间。
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谷醛活性"底"盖玻片的制备
注：有关其他详细信息7，9，请参阅前面的方法。- 将直径为 18 mm #1厚度盖片放入培养皿中。
- 将 20 mL 的 0.2 M HCl 添加到培养皿中，轻轻摇动盘子以分散盖玻片。确保所有盖玻片都浸没，并从盖玻片之间释放气泡。在室温下孵育过夜，轻轻摇动。
- 从菜的德坎特HCl。加入20 mL的超纯水，轻轻摇动洗涤10分钟。弃水，重复5次洗涤。
- 丢弃最终洗涤后，加入 20 mL 的 0.1 M NaOH，轻轻摇动以分散和浸入盖玻片。在室温下孵育，轻轻摇动1小时。
- 从菜的德坦·纳奥。加入20 mL的超纯水，轻轻摇动洗涤10分钟。弃水，重复5次洗涤。
- 丢弃最后洗涤后，在超纯水中加入 20 mL 的 1：200 稀释 3-氨基丙烯氧氧烷，轻轻摇动以分散和浸没盖玻片。在室温下孵育，轻轻摇动1小时或过夜。
注意：3-氨基丙烯是易燃的，可能导致皮肤刺激。小心处理，穿戴适当的个人防护装备，并根据当地处置法规丢弃废物。 - 从盘中稀释的3-氨基丙烯氧硅溶液。加入20 mL的超纯水，轻轻摇动10分钟。弃水，重复至少5次洗涤。在继续之前，清除所有三氨基丙烯酸酯至关重要。
- 丢弃最后洗涤液后，在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中加入 1：140 稀释 70% 谷醛的 20 mL，轻轻摇动以分散和浸没盖玻片。在室温下孵育，轻轻摇动1小时或过夜。
注意：70%的谷醛是有毒的，可能导致皮肤刺激。小心处理，穿戴适当的个人防护装备，并根据当地处置法规丢弃废物。 - 从盘子里稀释的谷醛溶液中分出。加入20 mL的超纯水，轻轻摇动洗涤10分钟。弃水，重复5次洗涤。
- 丢弃最终洗涤液后，加入 20 mL 的 100% 乙醇。使用钳子，分别拆下盖玻片，并在两片滤纸之间排列以干燥。
- 将干燥的盖玻片存放在密封的容器中。谷醛活性覆盖唇可提前制备并储存长达六个月。
3. 生成用于图案的 ECM 配体模具
- 生成聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 中间图章
- 按重量将 PDMS 底座与 PDMS 固化剂以 10：1 的比例混合。彻底混合。
注：对于 PDMS 的初始应用，准备大约 100 克 PDMS 以填充 100 mm 的盘。对于后续应用，仅从硅片特征所在的盘中心取出 PDMS，并准备 20-30 克新的 PDMS。 - 将 PDMS 混合物在干燥器中脱气 30-60 分钟或直到所有气泡被去除。
- 将步骤 1 中的改性硅片放入塑料 100 mm 盘中。缓慢均匀地将 PDMS 混合物倒在晶圆表面。点击工作表面上的碟子，从晶圆表面释放任何气泡。
- 将 PDMS 混合物浇注在晶圆上 10 分钟或直到所有气泡被去除或进入 PDMS 表面。
- 在 70°C 烘烤 PDMS 2 小时，让其冷却至室温。
- 使用手术刀或盒式切刀，从包含几何特征的盘子中心切出 PDMS 部分。
- 将 PDMS 切成大约 10 x 10 mm 的正方形，每个方块都包含单个实验条件的特征。这些在协议的后续步骤中称为"标记"。
- 按重量将 PDMS 底座与 PDMS 固化剂以 10：1 的比例混合。彻底混合。
- 生成 PDMS 的平板
- 按重量将 PDMS 底座与 PDMS 固化剂以 8：1 的比例混合。准备约20克每100毫米菜使用。彻底混合。
- 将 PDMS 混合物在干燥器中脱气 30-60 分钟或直到所有气泡被去除。
- 缓慢均匀地将 PDMS 倒入干净的 100 mm 盘中。点击工作表面上的盘子以释放任何气泡。
- 在 70°C 烘烤 PDMS 2 小时，让其冷却至室温。
- 从盘中取出 PDMS。反转使与盘底接触的 PDMS 表面朝上。
- 对于步骤 3.1 中生成的每个图章，切割 15 x 15 mm 平方的 PDMS。这些在协议的后续步骤中称为"平板"。
- 生成模具
- 将 PDMS 的平板放在 150 mm 盘盖或其他平面上，以便于操作。确保板材之间的间距足够（例如，对于 150 mm 的盘，可排列 9 块均匀间距的平板）。
- 将步骤 3.1 中生成的每个图章反转到 PDMS 的平板上，以便图章上的要素与 PDMS 的平板接触。用钳子轻轻按压邮票顶部，以确保均匀接触。
- 小心地将 PDMS 邮票/板对固定在盘子底座上，使盖子以一定角度静止。这有助于在下一步中芯化UV固化聚合物。
- 在每个邮票/板对的顶部界面上放置一小滴UV固化聚合物。在重力的辅助下，聚合物在表面张力下会恶在两者之间。
注：本协议可能使用许多不同的UV固化聚合物。我们选择 Norland 光学胶粘剂 74 具有以下特性：i） 暴露于紫外线时快速固化;ii） 固化后从 PDMS 邮票中轻松去除，iii） 手动压力对玻璃盖玻片的牢固附着力。 - 一旦聚合物完全通过，将盖上邮票/板对平放在工作表面上。在每个印章/板界面的剩余三面放置一小滴UV固化聚合物。
- 使用 200 μL 移液器尖端，将聚合物滴连接在冲压/板界面边缘。这将创建一个边界，该边框将在步骤 4 中保存配体解决方案。
注意：在戳边周围加工聚合物时要小心。如果戳/板接口中断，聚合物将芯在特征下方，模具将无法正确形成。 - 小心地将邮票/板对放入紫外线灭菌盒中。使用无菌"Str"电源设置，并曝光 10 分钟。
- 从紫外线灭菌盒中取出冲压/板对。使用两对钳子，轻轻取下 PDMS 标记，同时按住 UV 固化聚合物形成的平板和模具。
- 使用钳子，小心地拆下模具并反转，使与 PDMS 平板接触的表面朝上。
注：模具很细腻。在交给它们时要小心，特别是最初将它们从 PDMS 中取出时，这样它们就不会撕裂。 - 将倒置的模具放回紫外线灭菌盒中。使用无菌"Str"电源设置，并曝光 3 分钟。
4. 在盖玻上图案 ECM 配体
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将模具压到酸洗盖玻片上
- 将每个模具的酸洗盖玻片放在干净的实验室薄膜上。
- 使用钳子，小心地将每个模具，平面向下，放在酸洗盖玻片上。放置使要素以中心放在盖玻上。
- 在每个模具的顶部放置一小块实验室薄膜。牢牢均匀地按下模具，在模具和盖玻片之间产生强烈的接触。
注：这是一个关键步骤！用力将压在模具的整个表面上。如果未创建足够的触点，配体溶液将在模具和盖玻片之间泄漏，并且图案将失败。可选：为了确认模具与盖玻片之间的充分接触，将100μL的超纯无菌水移液到每个模具表面，并在室温下孵育。1 小时后，检查泄漏。从成功粘结模具中吸水并继续进行。
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等离子体清洁模具盖玻片表面，以增加亲水性
- 将带有模具的盖玻片放入等离子清洁剂中。应用高功率等离子体 30 s。
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ECM 配体溶液的制备
注：如果可能，所有后续步骤都应在无菌条件下完成。- 将无菌 100 mM HEPES、100 mM NaCl、pH 8.0 溶液放在冰上。冰冷后，加入母蛋白和胶原蛋白，分别达到225微克/mL和25微克/mL的浓度。可选：对于故障排除或配体可视化，在配体溶液中包括荧光标记配体。
- 注： 与此方法一起使用不同的 ECM 配体。对于不同的配体，可能需要额外的优化来确定理想的浓度、孵育时间和孵育温度。有关详细信息，请参阅讨论部分。
- 将配体溶液移至每个模具的表面。对于由 10 x 10 mm 方形图章制成的模具，请为每个模具应用 100 μL。
- 检查模具特征中是否有气泡。如有必要，请使用细尖钳子或 2 μL 移液器尖端从特征中去除气泡。
注：这是一个关键步骤！如果气泡仍停留在盖玻片表面，配体不会吸附到表面，因此产生的图案不完整。 - 将带有配体的模版盖板放入盘中，用实验室薄膜包裹，并在4°C孵育过夜。
- 将无菌 100 mM HEPES、100 mM NaCl、pH 8.0 溶液放在冰上。冰冷后，加入母蛋白和胶原蛋白，分别达到225微克/mL和25微克/mL的浓度。可选：对于故障排除或配体可视化，在配体溶液中包括荧光标记配体。
5. 配体转移到聚丙烯酰胺凝胶
- 从每个盖玻片中去除配体溶液和模具
- 从模具表面吸出配体溶液。配体溶液可在4°C下收集和储存，并重复使用长达一个月。
- 使用钳子，用模具将盖玻片短暂地浸入含有无菌 PBS 的盘子中，以便清洗。
- 用模具将盖玻片短暂地浸入无菌 PBS 的第二道菜中，以便清洗。
- 从盖玻片表面拆下模具。小心不要弄破盖玻片。
- 将盖玻片短暂地浸入含有超纯无菌水的盘子中，以去除 PBS 洗洗的盐分。轻触盖玻片的边缘，进行精细的任务擦除，以清除多余的水。
- 在惰性气体（如氮气）下干燥盖玻片。标记盖玻片的底面，以便从此时向前跟踪方向。小心使图案的一侧朝上。
- 对每个模版盖玻片重复步骤 5.1.1 到 5.1.6。
- 制作具有图案盖玻片的聚丙烯酰胺水凝胶
注：参考之前的方法了解其他细节7，9消毒所有用于制造聚丙烯酰胺凝胶的盖、管和垫片，方法是用 10% 漂白剂清洗过夜，用水冲洗至少 5 次以去除漂白剂，用70%乙醇短暂清洗。将所有碎件放在精细的任务湿巾上，在使用前晾干。- 制备聚丙烯酰胺溶液以获得所需的水凝胶弹性（表2）。混合所有组件，除了荧光微球和硫酸钾 （PPS）。
注：每次准备1%的亚硫酸钾溶液新鲜。 - 在真空下将聚丙烯酰胺溶液、微球和PPS在单独的管中脱气30分钟。
- 对于每个图案盖玻片，准备一个谷醛激活的"底部"盖玻片，上面放置一个垫片（18 mm 外径18毫米，内径14毫米）。
- 脱气后，对微球进行短暂声波，并在聚丙烯酰胺溶液中加入适当的体积。混合通过移液向上和向下，小心不要引入气泡。简要的声波。
- 将适当的PPS体积添加到聚丙烯酰胺溶液中。上下移液混合溶液，小心不要引入气泡。
注：添加PPS后，在聚丙烯酰胺聚合之前，快速完成步骤5.2.6至5.2.11。 - 移液器 75-150 μL（取决于垫片的厚度）到每个谷醛激活盖玻片的中心。
- 使用钳子，将图案盖玻片放在每个谷氨酸活性覆盖滑片上，并用聚丙烯酰胺和垫片，使图案配体面对聚丙烯酰胺溶液。如果加入足够的聚丙烯酰胺溶液，表面张力将芯在两个盖玻片之间的聚丙烯酰胺，并且不存在气泡。
- 拿起每个聚丙烯酰胺"三明治"，并仔细触摸一侧的微妙任务擦拭，以清除多余的聚丙烯酰胺溶液。
- 小心地将每个聚丙烯酰胺"三明治"放入带有与 15 mL 锥形底管兼容的螺纹的盖架中。方向应使谷醛盖玻片的底部与盖架底部接触，并且图案盖玻片位于顶部。
- 将 15 mL 锥形底管拧入每个盖架，将聚丙烯酰胺"三明治"固定到位。管子应紧紧防止泄漏，但要小心不要过度拧紧和开裂盖玻片。
- 在室温下，在200 x g的回转桶中将聚丙烯酰胺"三明治"离心10分钟。从离心机中取出管子，并放置在管架中，以保持方向 50 分钟，以确保完全聚合。用箔片盖住，防止荧光微球漂白。
注： 使用此方法执行 TFM 时，离心至关重要。离心力将所有微球移动到单个平面上，该平面最终将位于水凝胶表面的正下方。这是成像微球位移的理想选择，用于计算单元生成的牵引应力。如果不执行TFM，微球可以被排除在聚丙烯酰胺溶液中，聚合可以在台面发生，无需离心。 - 从管中取出聚合的聚丙烯酰胺"三明治"，然后浸入 100 mm 的盘中。在实验室薄膜中包裹，在室温下孵育3小时，或在4°C下孵育3小时。
- 制备聚丙烯酰胺溶液以获得所需的水凝胶弹性（表2）。混合所有组件，除了荧光微球和硫酸钾 （PPS）。
- 用于播种细胞的图案凝胶的制备
- 使用手术刀和钳子小心地从聚丙烯酰胺"三明治"中取出图案盖玻片和垫片，同时它仍然淹没在 PBS 中。在聚合过程中，图案配体将转移到聚丙烯酰胺上，并在去除盖玻片后保持。聚丙烯酰胺凝胶将仍然附着在谷醛活性盖玻片上。
注：这是一个关键步骤！聚丙烯酰胺必须浸入PBS中，同时去除盖玻片，否则配体图案将被破坏。 - 将每个带有图案聚丙烯酰胺的盖玻片放入盖架中。在盖玻片顶部和垫片所在的聚丙烯酰胺周围放置垫片（外径 18 mm，内径 14 mm）。将锯掉的 15 mm 锥形底管拧入盖架，在底部形成带图案的聚丙烯酰胺的孔。这些组件适合标准 12 孔板的井，便于操作。
- 将 500 μL 的 PBS 添加到井组件中，清洗每个凝胶。在室温下孵育10分钟，轻轻摇动。取出 PBS 并重复两次，共进行三次。
- 完成PBS洗涤后，将500μL的敲除-DMEM培养基加入凝胶中，并在37°C孵育过夜。凝胶可在37°C下用介质保存长达5天，然后再播种细胞。
- 在播种细胞的前一天，更换除孔-DMEM，以进行完整的KSR培养，并在37°C孵育过夜。
- 使用手术刀和钳子小心地从聚丙烯酰胺"三明治"中取出图案盖玻片和垫片，同时它仍然淹没在 PBS 中。在聚合过程中，图案配体将转移到聚丙烯酰胺上，并在去除盖玻片后保持。聚丙烯酰胺凝胶将仍然附着在谷醛活性盖玻片上。
6. 在图案凝胶上培养 hESC
注：如果计划在TFM后修复免疫染色样本，在播种细胞之前拍摄无应力微球位置的图像。在这种情况下，应在步骤 4.3.1 中使用荧光标记配体，以便在播种和微球在这些区域成像之前知道细胞的最终位置。
- 在将图案聚丙烯酰胺凝胶播种之前，在条件性 KSR 介质中制备的母凝胶涂层板上制备的库存 hESC 培养物和二次无进料培养物，如前所述9。
注：通过在KSR培养基质培养辐照小鼠胚胎成纤维细胞，辅以4纳克/mL基本成纤维细胞生长因子（bFGF），生成条件KSR培养基。每 24 小时收集和更换一次介质。 - 从 hESC 中吸出介质。使用挖空-DMEM 介质短暂洗涤。加入0.05%胰蛋白酶-EDTA，辅以10μM Y27632（Rho激酶抑制剂），在37°C孵育5-10分钟。
- 加入与血清的培养因，以抑制胰蛋白酶。轻轻吸出培养液和移液器在盘子上，以去除细胞。继续轻轻移液，将所有细胞分离到单个细胞。
- 收集细胞悬浮液和离心机在200 x g3分钟。
- 吸出上清液，将颗粒重新悬浮在等效体积的KSR介质中进行清洗。在 200 x g下离心 3 分钟。
- 在条件化的KSR介质中吸附上清液并重新悬浮颗粒，辅以10纳克/mL bFGF和10μM Y27632。
- 使用血细胞计对细胞进行计数，并将细胞悬浮液调整到每mL300，000个细胞的浓度。移液器 500 μL 的细胞悬浮液到每个图案凝胶上（每个凝胶 150，000 个细胞）。
- 播种后3小时，使用移液器小心地从每个凝胶中吸出介质，并更换为新鲜的经过调节的KSR介质，辅以10纳克/mL bFGF和10μM Y27632。这将去除未粘附于聚丙烯酰胺的图案区域的多余细胞。
注：这是一个关键步骤！在此阶段，细胞将松散地附着在有图案的配体上。交换介质时要非常小心，不要分离单元格。在后续步骤中，每个介质交换都应同等小心。 - 播种后24小时，使用移液器小心吸气介质，并更换条件KSR介质，辅以10纳克/mL bFGF和5μM Y27632。
- 播种后48小时，使用移液器小心吸气介质，并更换条件KSR介质，辅以10纳克/mL bFGF。这将从介质中去除Rho激酶抑制剂，实验可以在播种后72小时的第二天开始。
7. 执行 TFM
- 如果需要，在所需的实验条件下执行 TFM，如前面描述的那样 9。
- 如果在播种细胞之前对无应力微球位置进行了成像，则在采取强调的微球位置后修复细胞，并执行免疫染色以确定相对于高牵引力和低牵引力区域感兴趣的蛋白质的定位。
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Representative Results
试图在符合要求的基材上培养受控几何体中的 hESC 时，需要克服的主要挑战是在基材表面生成同质的 ECM-配体图案。此方法中提出的策略是首先在玻璃盖玻片表面生成所需的图案，然后在凝胶聚合过程中将该图案转移到聚丙烯酰胺水凝胶表面（图1）因此，在进行水凝胶聚合和图案转移之前，必须确保在玻璃盖玻片表面成功创建所需的图案（图1B）。根据对转移到聚丙烯酰胺的荧光配体图案的成像，配体似乎只存在于聚丙烯酰胺表面的单个平面上，尽管我们没有精确描述该层的厚度。在玻璃盖玻片上观察到两种常见的缺陷类型，每种缺陷都有自己的误差源。第一种是荧光配体的外观，其范围超出所需图案的边缘（图1C，上图），由于模具中出现小撕裂或密封不足，荧光配体溶液泄漏。玻璃盖玻片的模具。第二种是出现不完整的图案（图1C，底部），这通常是由于气泡被困在盖玻片界面，防止荧光配体吸附。
此方法成功与否的最终衡量标准是在图案水凝胶上将 hESC 培养成所需几何图形的能力（图 2）。为了实现这一目标，在Rho激酶抑制剂（Y27632）存在的情况下，以相对较高的密度（300，000细胞/mL）播种hESCs，并孵育3小时，以促进附配体模式的粘附。然后更换介质以删除未粘附的单元格。在72小时的过程中，Y27632在播种后24小时和48小时通过一系列媒体交流逐渐从媒体中稀释出来。通常，hESC 增殖以在 48-72 h 前完成图案几何形状，因此，一旦 Y27632 从介质中完全移除，实验可以在播种后 72 小时开始。
在聚丙烯酰胺水凝胶上的密闭几何形状中培养hESC菌落，允许使用TFM测量细胞产生的牵引力。这些测量是通过在水凝胶中嵌入荧光微球，并在播种hESCs前后对这些珠子的位置进行成像（图3A）。细胞播种后珠子的位移是细胞生成力和水凝胶弹性的函数，因此珠子位置的图像可用于生成珠位图，随后用于计算底层牵引应力。在 hESC 的圆形聚落中，最大的牵引应力位于菌落的外围附近，而菌落的中心则均匀地显示低牵引力应力（图 3B）。有趣的是，最高的牵引应力存在于殖民地边缘的簇中，而不是形成连续的最大应力环。这意味着，虽然菌落几何在决定牵引应力的分布方面起着关键作用，但更局部的调节和反馈决定了最大应力的精确位置。此外，只要在细胞播种之前拍摄没有粘附细胞的微球位置图像，hESC菌落就可以在牵引力测量后固定为感兴趣的蛋白质的免疫染色。尽管观察到牵引应力分布不均匀，但在维护条件下以图案圈培养的hESCs显示多能标记Oct3/4和细胞粘附分子E-cadherin的统一表达（图3C).
提出的使用模具生成配体图案的方法明显优于这种方法中使用的相对较大的几何形状的微接触打印技术（即，对于直径为 1 mm 的圆形菌落以及等角形和平方）。配体在此长度尺度上的微接触印刷模式导致图案边缘的异质转移，在图案的中心区域沉积的配体很少（图4A）。这显然不足以持续生产特定几何形状的hESC菌落。降低细胞播种密度也会导致在实现已完成的菌落方面不一致。以200，000个细胞/mL播种的细胞，而不是300，000个细胞/mL，无法产生足够的细胞-细胞接触，以在播种后24小时24小时减少浓度的Y27632中存活下来（图4B）。通过延长Y27632稀释周期，可以生成细胞密度较低的完整模式;然而，总体而言，在更高的300，000个细胞/mL密度下播种效率更高。有时，在 hESC 的种子化时，在协议早期未检测到的模式生成错误变得明显。其中一个错误是，由于与盖玻片接触不良，模具下方的配体溶液泄漏。这最终导致配体被转移到所需的几何形状以外的聚丙烯酰胺区域，并在播种时hESCs不受限制地生长（图4C）。
图1：ECM配体在酸洗盖上图案，并转移到聚丙烯酰胺水凝胶中。（A）在酸洗盖上图案ECM配体和将花纹配体转移到聚丙烯酰胺水凝胶的协议的原理表示。（B）在酸洗盖玻片上（左）和转移到聚丙烯酰胺水凝胶（右）的图案ECM配体的免疫荧光图像。生物素标记的母体凝胶被图案在盖玻上，并在转移到聚丙烯酰胺之前贴上Alexa Fluor 555链球菌素的标签。内集显示生成的完整模式的缩小视图。（C）显示玻璃盖玻片上配体图案缺陷的代表性荧光图像。这些原因是协议中的常见错误，例如配体溶液泄漏在有图案的几何体之外（顶部，箭头表示泄漏位置），以及添加配体溶液时在模具的图案几何体内捕获气泡（底部，箭头表示气泡的站点）。所有刻度条 = 500 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：将hESCs播种到图案聚丙烯酰胺水凝胶上。具有代表性的亮场图像，展示了用图案配体成功地将hESCs播种到聚丙烯酰胺水凝胶上。顶部的时间线指示用于移除未连接的单元格和稀释 Y27632 的一系列介质更改。请注意，在初始播种后，细胞会粘附到花纹配体内的各个区域，然后在72小时中增殖以填充图案区域。
图3：收缩应力的区域定位和密闭hESC菌落的免疫染色。（A）在播种hESCs之前和之后，聚丙烯酰胺水凝胶内微球的荧光图像。（B）代表性粒子图像速度测量 （PIV） 图，描绘了微球因牵引应力（左）和相应的重建牵引应力（右）而位移的情况。（C）在图案聚丙烯酰胺水凝胶上对封闭hESC菌落进行免疫染色，证明能够将感兴趣的蛋白质的定位与牵引应力进行比较。所有刻度条 = 200 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：替代方法和错误产生的非理想结果。（A）通过微接触打印将ECM配体图案图案在酸洗盖玻片上的代表性荧光图像。（B）由于细胞的依从性不足而未能形成已完成的菌落的hESC的光明场图像。在播种后24小时（箭头）的菌落中仍然存在的巨大间隙是这一问题的早期指标。（C）由于图案错误导致在所需几何形状之外存在配体而未能形成受限菌落的 hESC 的明亮场图像。所有刻度条 = 500 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
| SU8 晶圆制造示例 | |
| 1. 带 SU8-3050 的旋转涂层晶圆 | 以 1，000 RPM 转速旋转 30 s |
| 2. 热板上的软烤片 | i. 3 分钟，在 65 °C |
| ii. 95 °C 时 45 分钟 | |
| iii. 3 分钟，在 65 °C 时 | |
| iv. 冷却至室温 | |
| 3. 在掩膜对齐器中暴露 | i.在蒙版对准器中对齐晶圆和光掩膜 |
| Ⅱ。以 250 mJ/cm2的能量进行曝光 | |
| • 例如，对于强度为 11 mW/cm2的灯，曝光 23 s | |
| 4. 在热板上进行曝光后烘烤 | i. 65 °C 时 1 分钟 |
| ii.15 分钟，95 °C | |
| iii. 65 °C 时 1 分钟 | |
| Ⅳ。冷却至室温 | |
| 5. 开发 | i. 在 SU8 开发人员中搅拌，约 5-10 分钟 |
| Ⅱ。检查同丙醇 （IPA） 的开发 | |
| • 如果开发不足，IPA 冲洗会产生白色残留物 | |
| 6. 热盘上硬烘烤（可选） | 1-2 小时，150 °C |
表1：SU8晶圆制造方案示例。用于生成 PDMS 图章和后续模具的硅晶圆是使用本表中概述的步骤制造的。该协议是使用SU8 3000数据表生成的，目的是创建约100-250μm的薄膜厚度。
| 聚丙烯酰胺凝胶配方 | |||||||||
| 1 mL 完整解决方案的容量 | |||||||||
| 弹性模组 （Pa） | 最终% 丙烯酰胺 | 最终 % 比氏烯酰胺 | ddH2O （μL） | 40% 丙烯酰胺 （μL） | 2% 二丙烯酰胺 （μL） | 10 x PBS （μL） | 1% TED ddH2O （μL） | 微球 0.5% 固体 ddH2O （μL） | 1% PPS（dh2O （μL） |
| 1050 | 3 | 0.1 | 565 | 75 | 50 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 2700 | 7.5 | 0.035 | 485 | 187.5 | 17.5 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 4000 | 7.5 | 0.05 | 477.5 | 187.5 | 25 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 6000 | 7.5 | 0.07 | 467.5 | 187.5 | 35 | 100 | 75 | 60 | 75 |
表2：聚丙烯酰胺凝胶配方。用于生成各种弹性莫杜拉利的聚丙烯酰胺水凝胶的组分量，荧光微球用于TFM。体积可根据所需的聚丙烯酰胺溶液量向上或向下缩放。除荧光微球和PPS外，所有成分在脱气前混合在一起。PBS = 磷酸盐缓冲盐水，TEMED = 四甲基二胺，PPS = 硫酸钾。
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Discussion
为了简化一个漫长而详细的协议，此方法包括三个关键阶段：1） 在玻璃盖玻片上生成 ECM 配体图案，2） 在凝胶聚合过程中将图案转移到聚丙烯酰胺水凝胶，以及 3） 在图案水凝胶。在这三个阶段中，每个阶段都必须考虑一些关键步骤。为了在玻璃盖玻上生成高保真图案，必须将模具牢固地压在盖玻片上，以防止配体溶液泄漏，并且必须在向模具表面添加配体溶液后清除所有气泡（图 1C.如果配体溶液由于与盖玻片接触不良而通过模具泄漏，配体将转移到聚丙烯酰胺水凝胶的整个表面，hESCs 将不局限于所需的菌体几何形状（图4C）。将图案配体转移到聚丙烯酰胺的最重要步骤是将顶盖滑从水凝胶中轻轻分离，同时所有组件仍淹没在 PBS 中。如果水凝胶在分离过程中没有被淹没，则图案可能完全被破坏。此外，如果分离发生得太快，水凝胶的表面可能会撕裂或损坏。水凝胶越软，在分离过程中就越有损坏的风险。最后，在模式水凝胶上的 hESC 种子和培养过程中，用户在交换介质时必须非常小心移液器。hESCs 在整个协议中保持松散地粘附，并且图案的菌落很容易被粗心或匆忙移液破坏。
除了上面讨论的关键步骤外，在针对不同的应用程序调整此协议时，还有许多其他步骤可能需要修改和故障排除。虽然这里展示的模式是数百微米到一毫米的长度尺度，但使用透明光掩膜和负光刻胶在硅晶圆上生成图案特征，允许特征尺寸一直下降到 7-10 μm。因此，该协议可以适用于限制在符合的基板上的单细胞或少数细胞的较小菌落的几何形状。
在针对不同细胞类型调整此协议时，可能需要优化的两个参数是所使用的 ECM 配体类型和通过模具吸附到玻璃盖玻片期间溶液中的配体浓度。总配体浓度为250μg/mL，足以产生母体凝胶的同质模式，促进hESCs的附着（图1B和图2），尽管有可能以较低的水平实现类似的结果浓度。另一方面，对于粘附性较低的细胞类型或需要缩短孵育时间的应用，可能需要进一步提高配体浓度。不同的ECM配体（如纤维蛋白或胶原蛋白）可能也需要增加配体浓度，它们比母蛋白低疏水性，因此可能不会像水凝胶那样强烈地吸附到水凝胶中。由于配体从盖玻片转移到水凝胶过程中发生，因此不可能将 ECM 配体牢固地交联到水凝胶表面（如磺酸-SANPAH 处理）。在优化和排除这些参数时，使用带有荧光标签的 ECM 配体实现协议每个步骤模式的可视化非常有用。
此外，根据所使用的细胞类型和介质条件，种子化细胞的协议可能需要优化。对于更快速或更高效的粘附细胞，可能需要较低的种子密度来防止细胞粘附在模式之间，导致聚集，而不是图案单层菌落。对于具有极差附着的细胞，可能需要在初始介质交换之前有更大的播种密度或较长的时间长度，以促进密闭菌群的完全形成（图4B）。
该方法的关键局限性是其技术复杂性，与在图案玻璃基板上培养细胞的类似方法8相比，其通量相对较低。然而，通过在合规基材上培育有限的hESC菌落所所实现的生理相关性，这一缺点远远大于这一缺点。通过有效地概括早期胚胎的机械特性，我们能够更好地建模和了解导致原始生殖层自我组织的过程。
将hESC菌落限制在聚丙烯酰胺水凝胶上的另一个好处是，它允许使用TFM来检查hESC菌群作为早期胚胎模型的组织与细胞生成力的分布之间的联系，这些细胞产生的力可能下形生成和细胞命运规范。限制 hESC 殖民地会导致依赖于菌落几何的牵引应力分布（图 3B）。尽管这些牵引应力不均匀，但整个菌落的细胞在维持条件下仍然多能（图3C）。然而，我们假设牵引应力分布可能参与调节细胞命运规范的模式，通过调整对诱导提示（如可溶性形态）的反应。我们预计，这种方法将使我们能够和其他群体更好地模拟早期人类胚胎与hESCs，导致更全面地了解人类胚胎产生的基本过程。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们想感谢CIRM赠款RB5-07409的资助。J.M.M.感谢FuiBoon Kai、DhruvThakar和RogerOria为指导这种方法的生成和故障排除进行的各种讨论。J.M.M.还感谢UCSF发现奖学金对他的工作的持续支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
References
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