Summary
Hücre dışı matriks ligandlar poliakrilamid hidrojeller üzerine uyumlu yüzeyler üzerinde sınırlı kolonilerde insan embriyonik kök hücrelerin kültürünü sağlamak için desenli olabilir. Bu yöntem, doku geometrisi, hücre tarafından oluşturulan kuvvetler ve kader özellikleri arasındaki etkileşimi incelemek için çekiş kuvveti mikroskobu ve biyokimyasal tahlillerle kombine edilebilir.
Abstract
İnsan embriyonik kök hücreleri, embriyogenez sırasında birincil mikrop tabakası oluşumuna karşılık gelen hücre kader özelliklerinin kendi kendini organize eden kalıpları ile morfojenlere in vitro yanıt verme yeteneğini gösterir. Böylece, bu hücreler ile erken insan gelişimini sürücü mekanizmaları incelemek için güçlü bir araç temsil eder. İnsan embriyonik kök hücrelerini, kolonilerin geometrisi ve mekanik çevreleri üzerinde kontrol sağlayan uyumlu yüzeyler üzerinde, sınırlı kolonilerde kültüre getirmek için bir yöntem geliştirdik. altında yatan embriyogenez. Bu yöntemin en önemli özelliği hücre eki teşvik etmek için yüzeyde ekstrasellüler matriks ligand tanımlanmış desenleri ile poliakrilamid hidrojeller oluşturmak için yeteneğidir. Bu, istenilen geometrik desenlerle şablonlar üreterek, bu şablonları kullanarak cam kapaklar üzerinde hücre dışı matris ligand desenleri oluşturarak ve polimerizasyon sırasında bu desenlerin poliakrilamid hidrojellere aktarılması yla elde edilir. Bu yöntem aynı zamanda çekiş kuvveti mikroskobu ile uyumludur, böylece kullanıcı hücre tarafından oluşturulan kuvvetlerin sınırlı koloniler içindeki dağılımını ölçer ve haritalayabilir. Standart biyokimyasal tahlillerle birlikte, bu ölçümler mekanik ipuçlarının erken insan gelişimi sırasında kader belirtimi ve morfogenezde oynadığı rolü incelemek için kullanılabilir.
Introduction
İnsan embriyonik kök hücreleri (hESCs) rejeneratif tıp ve doku mühendisliği uygulamalarında kullanılmak üzere büyük umut tutun. Bu hücrelerin pluripotent doğası onlara herhangi bir yetişkin hücre tipi ne kadar ayırt etme yeteneği verir. HESC'lerin kaderini belirli hücre tiplerine yönlendirmede büyük adımlar atılsa da, tüm doku veya organların oluşturulması çok zor kalmıştır de novo1,2,3,4, 5. Bunun nedeni, büyük ölçüde, insan gelişimi sırasında bu dokuların oluşumunu sürücü mekanizmaların sınırlı bir anlayış. Bilgideki bu boşluğu doldurmak için, embriyonik kök hücreler6,7,8,9 ile erken embriyo ve sonraki gelişim aşamalarını modellemek için son yıllarda bir dizi yöntem ortaya çıkmıştır ,10,11,12,13.
İlk hESC hatlarının türetilmesinden kısa bir süre sonra14, hESC'lerden oluşan embriyoid cisimlerin üç ana mikrop tabakasının hücrelerini kendiliğinden üretebildiği gösterilmiştir6. Ancak, embriyoid cisimlerin büyüklüğü ve morfolojisi üzerinde kontrol doğal eksikliği nedeniyle, mikrop katmanları nın organizasyonu önemli ölçüde çeşitli ve erken embriyo organizasyonu maç başarısız oldu. Daha yakın zamanlarda, Warmflash ve ark. mikro desenleme yoluyla cam yüzeyler üzerinde hESC kolonileri sınırlamak için bir yöntem geliştirdi, kolonilerin boyutu ve geometrisi üzerinde kontrol ve tutarlılık sağlayan8. Erken gelişimde önemli bir morfojen olan BMP4'ün varlığında, bu sınırlı koloniler birincil mikrop tabakalarını temsil eden kaderlere göre kendi kendini organize edebilen tekrarlanabilir örüntüler üretebilme yeteneğine sahiplerdi. Bu, birincil mikrop tabakalarının oluşturuldurulan mekanizmaların incelenmesi için yararlı bir model sunmasına rağmen, kader belirtiminin kalıpları embriyogenez 15 sırasında gözlenen organizasyon ve morfogenez ile tam olarak uyuşmadı15. Erken embriyonik gelişimin daha sadık bir recapitulation üç boyutlu ekstrasellüler matris (ECM) matrigel11hESCs gömme tarafından elde edildi , kendi kendini organize ve model hESCyeteneği için bugüne kadar en güçlü kanıt sağlayan embriyogenez ex vivo erken aşamalarında. Ancak, bu yöntem tutarsız sonuçlar verir ve bu nedenle öz-organizasyon ve kader belirtimi temel mekanizmaları ortaya çıkarmak için kullanılabilecek tahliller bir dizi ile uyumsuzdur.
Bu mevcut yöntemler ve bunların ilgili sınırlamaları göz önüne alındığında, erken embriyonun hücre dışı ortamını modelleyen koşullarda tanımlanmış geometrilerin hESC kolonilerini tekrartekrar örmek için bir yöntem geliştirmeye çalıştık. Bunu başarmak için, substrat mekanik özelliklerini kontrol etmek için ölçülabilir elastikiyet poliakrilamid hidrojeller kullanılır. Gastrulation aşamasındaki tavuk embriyolarında atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak epiblastın elastikiyetinin yüzlerce pascal'dan birkaç kilopascal'a kadar değiştiğine rastladık. Böylece, hESC kolonileri için substrat olarak hizmet vermek için bu aralıkta elastikiyeti ile poliakrilamid hidrojeller üretmeye odaklandık. Kolonilerin geometrisi üzerinde sağlam bir kontrol sağlamak için poliakrilamidhidrojeller 7,9 üzerinde hESCs kültür için önceki yöntemleri ni modifiye. Biz ilk desenleme ECM ligands, yani matrigel, cam kapakları üzerine mikrofabrikasi şablonlar aracılığıyla, daha önce rapor16ile elde etti. Daha sonra polimerizasyon sırasında poliakrilamid hidrojellerin yüzeyine desenli ligand aktarmak için yeni bir teknik tasarladık. Burada tanımladığımız yöntem, istenilen geometrik desenlerle silikon bir gofret üretmek için fotolitografi kullanmak, polidimethylsiloxane (PDMS) ile geometrik tezlerin pullarını oluşturmak ve bu pulları kullanarak şablonları oluşturmak için sonuçta cam kapakları yüzeyine ligand desenleme ve poliakrilamid transfer sağlar.
Erken embriyonun mekanik ortamının yeniden özetlenmesinin yanı sıra, hESC kolonilerinin poliakrilamid ile sınırlanması, önceki yöntemimizde bildirildiği gibi, çekiş kuvveti mikroskobu (TFM) ile hücre tarafından oluşturulan kuvvetlerin ölçülmesini sağlar9. Kısaca, floresan boncuk poliakrilamid gömülü ve fiducial belirteçleri olarak kullanılabilir. Hücre tarafından oluşturulan kuvvetler, bu boncukların desenli substrat üzerine hESC'ler tohumladıktan sonra yer değiştirmelerinin görüntülenmesiyle hesaplanır. Ayrıca, ortaya çıkan çekiş kuvveti haritaları, sınırlı hESC kolonilerinde hücre tarafından oluşturulan kuvvetlerin dağılımının aşağı sinyalizasyonu nasıl düzenleyebileceğini veya modüle edebileceğini incelemek için immünboyama gibi geleneksel tahlillerle birleştirilebilir. Bu yöntemlerin, mekanik kuvvetlerin şu anda gözden kaçan erken embriyonik gelişim sırasında hücre kaderi spesifikasyonunun desenlemesinde kritik bir rol oynadığını ortaya çıkarmasını bekliyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada HESC kullanımı ile ilgili açıklanan tüm yöntemler California San Francisco Üniversitesi İnsan Gamete, Embriyo ve Kök Hücre Araştırma (GESCR) Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Geometrik özelliklere sahip silikon gofret hazırlanması
- İstenilen geometrik özelliklere sahip bir fotomaske oluşturun. Özellikleri tasarlamak için bilgisayar destekli taslak yazılımını kullanın. Negatif photoresist ile kullanmak için, özellikleri opak ve maskenin geri kalanı şeffaf olun.
NOT: 18 mm çapındaki kapaklara desenleme için, Adım 3'te üretilen şablonların kapaklara sığmasını sağlamak için her deney koşulu için grup özellikleri 10 x 10 mm alana ayrılır. - Spin kat negatif photoresist üzerine 100 mm silikon gofret. 100-250 μm film kalınlığı oluşturmak için spin hızını ve uzunluğunu belirlemek için photoresist veri sayfasını kullanın.
NOT: Film kalınlığı, desenlerin genişliğinin şablon yüksekliğine en boy oranının mümkün olduğunca 1:1'e yakın olması için ayarlanmalıdır. Ancak, en az 100 μm kalınlık öneririz, çünkü daha az ıstıraba kolayca yırtılabilen hassas şablonlar üretir. - Ürün veri sayfasına göre fotodirenç işlemini tamamlayın. Bu genellikle yumuşak bir fırında içerir, bir maske hizalayıcı fotomaske ile UV pozlama, pozlama sonrası fırında, geliştirme, ve sert fırında. Örnek olarak, bu protokolde kullanılan gofretleri işlemek için kullanılan yordam Tablo 1'deözetlenmiştir.
NOT: Silikon gofretleri hassas oldukları için kullanırken dikkatli olun. Bir kez oluşturulduktan sonra, gofretler zarar görmedikleri sürece tekrar tekrar kullanılabilir.
2. Kapak ların hazırlanması
-
Asitle yıkanmış "üst" örtülerin hazırlanması
- 18 mm çapında #1 kalınlığında kapakları cam bir Petri kabına yerleştirin. Kapak kapaklarının uygun sayısı yemeğin boyutuna bağlıdır. 100 mm'lik bir yemek için, bir seferde 50-100 kapak hazırlayın. Bu bölümün geri kalanı boyunca verilen hacim miktarları 100 mm'lik bir tabağa karşılık gelir.
- Petri kabına 20 mL 1 M HCl ekleyin ve kapak dudaklarını dağıtmak için kabı hafifçe sallayın. Tüm kapakların batırılmış olduğundan emin olun ve kapaklar arasında hava kabarcıkları bırakın. Hafif sallayarak oda sıcaklığında gece boyunca kuluçka.
DİkKAT: HCl asidik ve aşındırıcıdır. HCl ile çalışırken dikkatli olun ve uygun PPE takın. - Decant HCl çanak. 20 mL ultra saf su ekleyin ve 10 dakika boyunca hafifçe sallayarak yıkayın.
- Son yıkama attıktan sonra, çanak% 100 etanol 20 mL ekleyin. Forceps kullanarak, kapakları tek tek çıkarın ve kuruması için iki parça filtre kağıdı arasında düzenleyin.
- Kurutulmuş kapakları kapalı bir kapta saklayın. Asitle yıkanmış kapaklar önceden hazırlanabilir ve tozsuz koşullarda bir ay veya daha uzun süre saklanabilir.
-
Glutaraldehit aktive edilmiş "alt" kapakların hazırlanması
NOT: Ek ayrıntılar için önceki yöntemlere bakın7,9.- 18 mm çapında #1 kalınlığında kapakları petri kabına yerleştirin.
- Petri kabına 0,2 M HCl'lik 20 mL ekleyin ve kapakları dağıtmak için kabı hafifçe sallayın. Tüm kapakların batırılmış olduğundan emin olun ve kapaklar arasında hava kabarcıkları bırakın. Hafif sallayarak oda sıcaklığında gece boyunca kuluçka.
- Decant HCl çanak. 20 mL ultra saf su ekleyin ve 10 dakika boyunca hafifçe sallayarak yıkayın.
- Son yıkamayı attıktan sonra, 0,1 M NaOH'un 20 mL'sini ekleyin ve kapakları dağıtmak ve batırmak için hafifçe sallayın. 1 saat boyunca hafif sallayarak oda sıcaklığında kuluçka.
- Decant NaOH çanaktan. 20 mL ultra saf su ekleyin ve 10 dakika boyunca hafifçe sallayarak yıkayın.
- Son yıkama attıktan sonra, ultra saf suda 3-aminopropyltritrithoxysilane 1:200 seyreltme 20 mL ekleyin ve yavaşça dağıtmak ve kapakları batırmak için sallayın. 1 saat veya bir gecede hafif sallayarak oda sıcaklığında kuluçka.
DİkKAT: 3-aminopropyltrimethoxysilane yanıcı ve cilt tahrişine neden olabilir. Yerel bertaraf yönetmeliklerine göre dikkatli bir şekilde işleyebilir, uygun PPE takın ve atıkları atın. - Tabaktan seyreltilmiş 3-aminopropyltritrithoxysilane çözeltisi decant. 20 mL ultrasaf su ekleyin ve 10 dakika boyunca hafifçe sallayarak yıkayın. Devam etmeden önce tüm 3-aminopropyltrimthoxysilane kaldırmak için önemlidir.
- Son yıkama attıktan sonra, fosfat tamponlu salin (PBS) bir 1:140 seyreltme 20 mL ekleyin ve yavaşça dağıtmak ve kapakları batırmak için sallayın. 1 saat veya bir gecede hafif sallayarak oda sıcaklığında kuluçka.
DİkKAT: %70 glutaraldehit toksiktir ve cilt tahrişine neden olabilir. Yerel bertaraf yönetmeliklerine göre dikkatli bir şekilde işleyebilir, uygun PPE takın ve atıkları atın. - Tabaktan seyreltilmiş glutaraldehit çözeltisi decant. 20 mL ultra saf su ekleyin ve 10 dakika boyunca hafifçe sallayarak yıkayın.
- Son yıkama attıktan sonra,% 100 etanol 20 mL ekleyin. Forceps kullanarak, kapakları tek tek çıkarın ve kuruması için iki parça filtre kağıdı arasında düzenleyin.
- Kurutulmuş kapakları kapalı bir kapta saklayın. Glutaraldehit aktive kapakları önceden hazırlanabilir ve altı aya kadar saklanabilir.
3. ECM ligand desenleme için şablonların üretimi
- Polidimethylsiloxane (PDMS) ara pulların üretilmesi
- PDMS tabanını, 10:1 oranında, ağırlık olarak PDMS kürleme maddesi ile karıştırın. Iyice karıştırın.
NOT: PDMS'nin ilk uygulaması için, 100 mm'lik bir kabı doldurmak için yaklaşık 100 g PDMS hazırlayın. Sonraki uygulamalar için, silikon gofret özelliklerinin bulunduğu yemeğin sadece merkezinden PDMS'yi çıkarın ve 20-30 g yeni PDMS hazırlayın. - PdMS karışımını 30-60 dk kurutucuda veya tüm hava kabarcıkları uzaklaştırılAna kadar degas edin.
- Adım 1'deki modifiye silikon gofret'i plastik 100 mm'lik bir tabağa yerleştirin. PDMS karışımını yavaş ve eşit bir şekilde gofret yüzeyine dökün. Gofret yüzeyinden herhangi bir hava kabarcıkları serbest bırakmak için çalışma yüzeyinde çanak dokunun.
- PdMS karışımı 10 dakika boyunca gofret üzerine dökülen veya tüm hava kabarcıkları kaldırılana veya PDMS yüzeyine gelene kadar gaz giderin.
- PDMS'yi 70 °C'de 2 saat pişirin.
- Neşter veya maket bıçağı kullanarak, geometrik özellikleri içeren yemeğin merkezinden PDMS bölümünü kesip.
- PDMS'yi her biri tek bir deneysel koşul için özellikler içeren yaklaşık 10 x 10 mm kareşeklinde kesin. Bunlar, protokolün sonraki adımlarında "pullar" olarak adlandırılır.
- PDMS tabanını, 10:1 oranında, ağırlık olarak PDMS kürleme maddesi ile karıştırın. Iyice karıştırın.
- PDMS'nin düz levhaları oluşturma
- PDMS tabanını, ağırlığına göre 8:1 oranında PDMS kürleme maddesi ile karıştırın. Kullanılacak her 100 mm çanak için yaklaşık 20 g hazırlayın. Iyice karıştırın.
- PdMS karışımını 30-60 dk kurutucuda veya tüm hava kabarcıkları uzaklaştırılAna kadar degas edin.
- PDMS'yi yavaş ve eşit bir şekilde temiz bir 100 mm'lik tabağa dökün. Herhangi bir hava kabarcıkları serbest bırakmak için çalışma yüzeyinde çanak dokunun.
- PDMS'yi 70 °C'de 2 saat pişirin.
- PDMS'yi çanaktan çıkarın. Yemeğin alt ile temas PDMS yüzeyi yukarı bakan olduğunu tersine çevirin.
- Adım 3.1'de oluşturulan her pul için 15 x 15 mm kare LIK PDMS kesin. Bunlar, protokolün sonraki adımlarında "düz levhalar" olarak adlandırılır.
- Şablon oluşturma
- Daha kolay kullanım için 150 mm'lik bir kabın kapağına veya diğer düz yüzeye pdms düz levhalar yerleştirin. Levhalar arasında yeterli boşluk sağlayın (örneğin, 150 mm'lik bir çanak için, dokuz düz levhayı eşit aralıklarla düzenleyin).
- Adım 3.1'de oluşturulan her damgayı, damgaüzerindeki özelliklerin PDMS'nin düz levhasıyla temas etmesi gibi düz bir PDMS levhasına ters çevirin. Hatta temas sağlamak için pullu larla pulun üstüne hafifçe bastırın.
- PDMS damgasını/levhayı çanak tabanına kadar tutan kapağı dikkatlice tutarak, kapağın bir açıda dinlendiği şekilde dikkatlice tutarak yerleştirin. Bu bir sonraki adımda UV-tedavi polimer wicking yardımcı olur.
- Her pul/levha çiftinin üst arayüzüne küçük bir damla UV-tedavi edilebilir polimer yerleştirin. Polimer, yer çekimi nin de yardımıyla yüzey gerilimi ile ikisi arasında kötü olacak.
NOT: Bu protokolde birçok farklı UV-kürlenebilir polimerler çalışabilir. Aşağıdaki özellikler için Norland Optik Yapıştırıcı 74'ü seçtik: i) UV ışığına maruz kaldıktan sonra hızlı kürleme, ii) KÜRleme üzerine PDMS pullarından kolay çıkarma, iii) Manuel basınçla cam kapaklara sağlam yapışma. - Polimer tamamen kötü bir hale gelmiştir sonra, çalışma yüzeyine damga / levha çiftleri düz kapağı yerleştirin. Her pul/levha arabiriminin kalan üç tarafına uv-kürlenebilir polimer küçük bir damla yerleştirin.
- 200 μL'lik pipet ucu kullanarak, pul/levha arabiriminin kenarlarındaki polimer damlalarını bağlayın. Bu, Adım 4'te ligand çözüm tutacak bir kenarlık oluşturur.
NOT: Damganın kenarlarındaki polimeri çalıştırırken dikkatli olun. Pul/levha arabirimi bozulursa, polimer özelliklerin altına fitil olur ve şablon düzgün oluşmaz. - Pul/levha çiftlerini uv sterilizasyon kutusuna dikkatlice yerleştirin. Steril "Str" güç ayarını kullanın ve 10 dakika boyunca açığa çıkarın.
- PUL/levha çiftlerini UV sterilizasyon kutusundan çıkarın. İki çift forsep kullanarak, UV-tedavi edilebilir polimerden oluşan düz levha ve şablonu basılı tutarken PDMS damgasını hafifçe çıkarın.
- Forceps kullanarak, şablonu dikkatlice çıkarın ve PDMS'nin düz levhasıyla temas eden yüzeyin yukarı bakacak şekilde tersine çevirin.
NOT: Şablonlar hassastır. Özellikle başlangıçta PDMS'den çıkarırken yırtılmamak için bunları teslim ederken dikkatli olun. - Ters kalıpları uv sterilizasyon kutusuna geri yerleştirin. Steril "Str" güç ayarını kullanın ve 3 dakika boyunca açığa çıkarın.
4. Coverdudaklarda ECM ligand desenleme
-
Asitle yıkanmış kapaklara şablonpresleme
- Her şablon için temiz bir laboratuvar filminin üzerine asitle yıkanmış bir kapak kaydırın.
- Forceps kullanarak, dikkatle bir asit yıkanmış coverslip üzerine, düz tarafı aşağı, her şablon yerleştirin. Bu özellikleri kapak üzerinde ortalanmış şekilde yerleştirin.
- Her şablonüstüne laboratuvar filmi küçük bir parça yerleştirin. Şablon ve kapak arasında güçlü bir temas oluşturmak için şablonu sıkıca ve eşit bir şekilde bastırın.
NOT: Bu kritik bir adımdır! Sıkıca ve şablonun tüm yüzeyi boyunca basın. Yeterli temas oluşturulmazsa, ligand çözeltisi şablon ile kapaklar arasında sızacak ve desenleme başarısız olur. İstEĞE BAĞLI: Şablon ile kapak kayması arasında yeterli teması doğrulamak için, pipet 100 μL ultra saf steril suyun her şablonun yüzeyine ve oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. 1 saat sonra sızıntı olup yok. Başarılı bir şekilde bağlanmış şablonlardan su aspire edin ve devam edin.
-
Hidrofililiği artırmak için şablonlu kapakların yüzeyinin plazma temizliği
- Şablonlu kapakları plazma temizleyicisine yerleştirin. 30 s için yüksek güçlü plazma uygulayın.
-
ECM ligand çözeltisinin hazırlanması
NOT: Sonraki tüm adımlar mümkünse steril koşullarda tamamlanmalıdır.- Buz üzerine steril 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8.0 çözeltisi yerleştirin. Buz soğuğundan sonra, sırasıyla 225 g/mL ve 25 g/mL konsantrasyonları elde etmek için matrigel ve kollajen ekleyin. İstEĞE BAĞLI: Sorun giderme veya ligand görselleştirme için, ligand çözeltisindeki floresan etiketli bir ligand ekleyin.
- NOT: Bu yöntemle farklı ECM ligandlar kullanılabilir. Farklı ligandlar için ideal konsantrasyonu, kuluçka süresini ve kuluçka sıcaklığını belirlemek için ek optimizasyon gerekebilir. Daha fazla bilgi için tartışma bölümüne bakın.
- Pipet her şablonun yüzeyine ligand çözeltisi. 10 x 10 mm kare pullardan yapılmış şablonlar için şablon başına 100 μL uygulayın.
- Şablon özellikleri hava kabarcıkları için kontrol edin. Gerekirse, hava kabarcıklarını özelliklerinden çıkarmak için ince uçlu forceps veya 2 μL pipet ucu kullanın.
NOT: Bu kritik bir adımdır! Eğer hava kabarcıkları kapak yüzeyinde sıkışıp kalırsa, ligand yüzeye adsorb olmaz ve ortaya çıkan desen eksik olacaktır. - Bir çanak içine ligand ile şablonlu kapakları yerleştirin, laboratuvar filmi ile sarın ve 4 ° C gecede kuluçka.
- Buz üzerine steril 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8.0 çözeltisi yerleştirin. Buz soğuğundan sonra, sırasıyla 225 g/mL ve 25 g/mL konsantrasyonları elde etmek için matrigel ve kollajen ekleyin. İstEĞE BAĞLI: Sorun giderme veya ligand görselleştirme için, ligand çözeltisindeki floresan etiketli bir ligand ekleyin.
5. Ligand'ın poliakrilamid jeline transferi
- Her coverslip'ten ligand çözeltisi ve şablon çıkarma
- Bir şablonun yüzeyinden ligand çözeltisi aspire. Ligand çözeltisi 4 °C'de toplanabilir ve saklanabilir ve bir aya kadar yeniden kullanılabilir.
- Forceps kullanarak, kısaca yıkamak için steril PBS içeren bir çanak içine şablon ile coverslip batırın.
- Kısaca yıkamak için steril PBS ikinci bir çanak içine şablon ile coverslip batırın.
- Şablonu kapak yüzeyinden çıkarın. Kapak kaymasını kırmamaya dikkat edin.
- PBS yıkama tuzlarını çıkarmak için kapak kapağını ultra saf steril su içeren bir tabağa kısaca batırın. Fazla suyu uzaklaştırmak için kapak kapağının kenarına dokunarak hassas bir görev silme ye dokunun.
- Coverslip'i azot gibi inert bir gazın altında kurulayın. Bu noktadan itibaren yönünü takip etmek için kapağın alt tarafını işaretleyin. Desenli tarafı yukarı bakacak şekilde tutmaya dikkat edin.
- Her şablonlu kapak fişi için 5.1.1 ile 5.1.6 adımlarını tekrarlayın.
- Desenli kapaklı poliakrilamid hidrojelyapımı
NOT: Ek ayrıntılar için önceki yöntemlere bakın7,9 Tüm kapak tutucuları sterilize, tüpler, ve boşlukbir gecede% 10 çamaşır suyu ile yıkayarak poliakrilamid jelleri yapmak için kullanılan, çamaşır suyu kaldırmak için en az beş kez su ile durulama, ve % 70 etanol kısa bir süre yıkama. Kullanmadan önce kuruması için tüm parçaları steril bir biyogüvenlik kabininde hassas görev mendilleri üzerine yerleştirin.- İstenilen hidrojel elastikiyeti elde etmek için poliakrilamid çözeltisi hazırlayın (Tablo 2). Floresan mikrosferler ve potasyum persülfat (PPS) hariç tüm bileşenleri karıştırın.
NOT: Her seferinde %1 potasyum persülfat çözeltisi taze hazırlayın. - Degas poliakrilamid çözeltisi, mikroküreler, ve PPS vakum altında ayrı tüpler degas 30 dakika.
- Her desenli kapak kayma için, bir spacer (18 mm dış çapı, 14 mm iç çapı) üzerine yerleştirilen bir glutaraldehit aktive "alt" coverslip hazırlayın.
- Gaz gidermeden sonra, kısaca mikrosferleri sonicate ve poliakrilamid çözeltisi için uygun hacim ekleyin. Yukarı ve aşağı borulama tarafından karıştırın, hava kabarcıkları tanıtmak için dikkatli olmak. Kısaca sonicate.
- Poliakrilamid çözeltisine uygun pps hacmiekleyin. Pipet yukarı ve aşağı solüsyon karıştırmak için, hava kabarcıkları tanıtmak için dikkatli olmak.
NOT: PPS ekledikten sonra, poliakrilamid polimerize olmadan önce 5.2.6 ile 5.2.11 adımlarını tamamlamak için hızlı bir şekilde çalışın. - Pipet 75-150 μL (spacer kalınlığına bağlı olarak) her glutaraldehit aktive coverslip merkezine.
- Forseps kullanarak, poliakrilamid ve spacer ile her glutaraldehit aktive coverslip üzerine desenli bir coverslip yerleştirin, böylece desenli ligand poliakrilamid çözeltisi karşı karşıya. Yeterli poliakrilamid çözeltisi eklenirse, yüzey gerilimi iki kapak arasında poliakrilamid fitil ve hiçbir hava kabarcıkları mevcut olacaktır.
- Her poliakrilamid "sandviç" almak ve dikkatle aşırı poliakrilamid çözeltisi wick için hassas bir görev silme tarafına dokunun.
- Dikkatle 15 mL konik alt tüpler ile uyumlu iplikleri ile bir kap tutucu içine her poliakrilamid "sandviç" yerleştirin. Oryantasyon, glutaraldehit kapak kapağının alt kapağının kapağının alt kısmıyla temas halinde, desenli kapak lı ise üstte olmalıdır.
- Poliakrilamid "sandviçleri" yerinde tutmak için her kapak tutucuya 15 mL konik alt tüp vidalayın. Tüpler sızıntıyı önlemek için sıkı olmalıdır, ancak örtüleri aşırı sıkılaştırmamaya ve kırmamaya dikkat edin.
- Oda sıcaklığında 10 dakika için 200 x g salıncak kovatüplerde poliakrilamid "sandviç" santrifüj. Tam polimerizasyon sağlamak için ek bir 50 dakika için yönünü korumak için santrifüj ve tüp raflar yerleştirin tüpler çıkarın. Floresan mikrosferlerin beyazlatma önlemek için folyo ile kaplı tutun.
NOT: TFM gerçekleştirmek için bu yöntemi kullanırken santrifüj çok önemlidir. Santrifüj kuvveti tüm mikroküreleri tek bir düzleme taşır, ki bu da hidrojel yüzeyinin hemen altında olacaktır. Bu, hücre tarafından oluşturulan çekiş gerilimlerini hesaplamak için kullanılan mikrosfer yer değiştirmelerini görüntülemek için idealdir. TFM yapılmazsa mikroküreler poliakrilamid çözeltisinin dışında bırakılabilir ve polimerizasyon santrifüj olmadan tezgah ında oluşabilir. - Polimerize poliakrilamid "sandviçleri" tüplerden çıkarın ve PBS'ye 100 mm'lik bir tabakta batırın. Laboratuvar filmini sarın ve oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 °C'de 3 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
- İstenilen hidrojel elastikiyeti elde etmek için poliakrilamid çözeltisi hazırlayın (Tablo 2). Floresan mikrosferler ve potasyum persülfat (PPS) hariç tüm bileşenleri karıştırın.
- Tohumlama hücreleri için desenli jellerin hazırlanması
- PBS'ye batırılmış halde kalırken desenli kapak kaymasını ve boşluk takibeni poliakrilamid "sandviç"ten dikkatlice çıkarmak için neşter ve terpler kullanın. Desenli ligand polimerizasyon sırasında poliakrilamid transfer edilmiş olacak ve coverslip çıkardıktan sonra kalacaktır. Poliakrilamid jel glutaraldehit aktive coverslip bağlı kalacaktır.
NOT: Bu kritik bir adımdır! Poliakrilamid, kapak kaymasını çıkarırken PBS'ye daldırılmalıdır veya ligand desenleri yok edilir. - Bir kapak tutucu içine desenli poliakrilamid ile her coverslip yerleştirin. Bir contayı (18 mm dış çapı, 14 mm iç çapı) kapak kaymasının üstüne ve spacer'In bulunduğu poliakrilamidin etrafına yerleştirin. Testereyle kesilmiş 15 mm konik alt tüpü kapak tutucuya vidalayın ve alttaki desenli poliakrilamid ile bir kuyu oluşturarak. Bu montajlar, kolay kullanım için standart 12 kuyulu bir plakanın kuyularına sığar.
- Kuyu montajına 500 μL PBS ekleyerek her jeli yıkayın. Hafif sallayarak oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka. PBS'yi çıkarın ve toplam üç yıkıntı için iki kez tekrarlayın.
- Son PBS yıkamadan sonra jellere 500 μL nakavt-DMEM ortamı ekleyin ve bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Jeller 37 °C'de, tohumlama hücrelerinden önce 5 gün kadar ortam la tutulabilir.
- Hücreleri tohumlamadan bir gün önce, tam KSR ortam için nakavt-DMEM'i değiştirin ve bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- PBS'ye batırılmış halde kalırken desenli kapak kaymasını ve boşluk takibeni poliakrilamid "sandviç"ten dikkatlice çıkarmak için neşter ve terpler kullanın. Desenli ligand polimerizasyon sırasında poliakrilamid transfer edilmiş olacak ve coverslip çıkardıktan sonra kalacaktır. Poliakrilamid jel glutaraldehit aktive coverslip bağlı kalacaktır.
6. Desenli jeller üzerinde culturing hESCs
NOT: TFM'den sonra immünboyama için numuneleri düzeltmeyi planlıyorsanız, tohumlama hücrelerinden önce stressiz mikrosfer pozisyonlarının görüntülerini alın. Bu durumda floresan etiketli ligand, tohumlamadan önce hücrelerin nihai konumlarının bilinmesi ve mikrokürelerin bu bölgelerde görüntülebilmesi için 4.3.1 numaralı adımda kullanılmalıdır.
- Daha önce açıklandığı gibi desenli poliakrilamid jeller üzerinde tohumlama önce klimalı KSR medyada matrigel kaplı plakalar üzerinde hazırlanan stok hESC kültürleri ve ikincil besleyicisiz kültürleri korumak9.
NOT: 4 ng/mL temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ile desteklenen KSR ortamlarında ışınlanmış fare embriyonik fibroblastları ekleyerek koşullu KSR ortam ını oluşturun. Her 24 saatte bir medya toplayın ve değiştirin. - Medyayı HESC'lerden aspire edin. Kısaca nakavt-DMEM medya ile yıkayın. 10 μM Y27632 (Rho kiinaz inhibitörü) ile birlikte %0,05 tripsin-EDTA ekleyin ve 37 °C'de 5-10 dakika kuluçkaya yatırın.
- Tripsinin inhibe etmek için serum ile medya ekleyin. Hücreleri çıkarmak için çanak üzerinde hafifçe ortam ve pipet aspire edin. Tüm hücreleri kaldırmak ve hücre kümelerini tek hücrelere ayırmak için pipetlemeye nazikçe devam edin.
- 3 dakika için 200 x g hücre süspansiyon ve santrifüj toplayın.
- Supernatant aspirate ve yıkamak için KSR medya eşdeğer bir hacimde pelet resuspend. Santrifüj 200 x g 3 dk.
- 10 ng/mL bFGF ve 10 μM Y27632 ile desteklenen klimalı KSR ortamlarında eksnatantı aspire edin ve peleti yeniden askıya alın.
- Hücreleri hemositometre ile sayın ve hücre süspansiyonunu mL başına 300.000 hücre konsantrasyonuna ayarlayın. Pipet 500 μL hücre süspansiyon her desenli jel üzerine (jel başına 150.000 hücre).
- Tohumlamadan sonra 3 saat, her jelden ortam azarazarlamak için bir pipet kullanın ve 10 ng/mL bFGF ve 10 μM Y27632 ile takviye edilmiş taze klimalı KSR ortamı ile değiştirin. Bu poliakrilamid desenli bölgelere uymadı aşırı hücreleri kaldırır.
NOT: Bu kritik bir adımdır! Bu aşamada hücreler gevşek desenli ligand yapıştırılır. Hücreleri ayırmamak için ortam değiştirirken çok dikkatli olun. Sonraki adımlarda medya takaslarının her birine eşit özen izlenmelidir. - Tohumlamadan 24 saat sonra, ortamı dikkatlice aspire etmek ve 10 ng/mL bFGF ve 5 μM Y27632 ile desteklenen koşullu KSR ortam değişimi için bir pipet kullanın.
- Tohumlamadan sonra 48 saat, ortamı dikkatlice aspire etmek ve 10 ng/mL bFGF ile desteklenen şartlı KSR ortam değişimi için bir pipet kullanın. Bu medya ve deneyler den Rho kigaz inhibitörü kaldırır ertesi gün başlayabilir, tohumlama sonra 72 saat.
7. TFM Yapma
- İstendiğinde, daha önce9'u istenilen deneysel koşullar altında açıklandığı gibi TFM gerçekleştirin.
- Eğer stresli mikrosfer pozisyonları tohumlama hücrelerinden önce görüntülenmişse, stresli mikrosfer konumlarını aldıktan sonra hücreleri düzeltin ve yüksek ve düşük çekiş kuvvetlerine göre ilgi çeken proteinlerin lokalizasyonunu belirlemek için immünboyama yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uyumlu yüzeylerüzerinde kontrollü geometri kolonilerinde hESC'lerin kültüre alınmasında aşılması gereken temel zorluk, substrat yüzeyinde homojen bir ECM-ligand deseni oluşturmaktır. Bu yöntemde sunulan strateji, önce cam bir kapak kayması yüzeyinde istenilen desenin üretilmesini ve daha sonra jelin polimerizasyonu sırasında bu desenin poliakrilamid hidrojel yüzeyine aktarılmasını içerir (Şekil 1 A). Bu nedenle, hidrojelin polimerizasyonuna ve desenin transferine geçmeden önce cam kapak yüzeyinde istenilen desenin başarılı bir şekilde oluşturulduğundan emin olmak önemlidir (Şekil 1B). Poliakrilamid'e aktarılan floresan ligand desenlerinin görüntülenmesi sonucunda, ligand poliakrilamidin yüzeyinde sadece tek bir düzlemde mevcut gibi görünmüştür, ancak bu tabakanın kalınlığını tam olarak tanımlamadık. Cam kapak kapağında desen oluşumunu takip eden iki yaygın kusur türü vardır, her biri kendi hata kaynağına sahiptir. Bunlardan ilki, floresan ligand'ın istenilen desenin kenarlarının ötesine uzanan görünümüdür(Şekil 1C, üst),şablondaki küçük bir yırtık veya yetersiz sızdırmazlık nedeniyle floresan ligand çözeltisinin sızdırılmasısonucu ortaya çıkan cam kapak kayma şablonu. İkincisi ise, genellikle floresan ligand'ın adsorpsiyonlanmasını önleyen kapaklı arabiriminde sıkışmış bir hava kabarcığı nedeniyle olan eksik bir desenin(Şekil 1C, alt)görünümüdür.
Bu yöntemiçin başarının nihai ölçüsü, desenli hidrojeller üzerinde istenilen geometrilerde hESC'leri kültüredebilme yeteneğidir(Şekil 2). Bunu başarmak için, hESC'ler nispeten yüksek yoğunlukta (300.000 hücre/mL) rho kigaz inhibitörü (Y27632) varlığında tohumlanır ve ligand desenlerine yapışmayı kolaylaştırmak için 3 saat kuluçkaya yatırılır. Daha sonra bağlı olmayan hücreleri kaldırmak için ortam değiştirilir. 72 saat boyunca, Y27632 yavaş yavaş 24 ve 48 saat sonrası tohumlama medya alışverişi bir dizi tarafından medya dışında seyreltilir. Tipik olarak, hESC'ler desenli geometrileri 48-72 h ile tamamlamak için çoğalır, bu nedenle deneyler y27632 ortamdan tamamen çıkarıldıktan sonra tohumlama dan 72 saat sonra başlayabilir.
Poliakrilamid hidrojellerde sınırlı geometrilerde hESC kolonilerinin kültüre edilmesi, TFM kullanılarak hücre tarafından üretilen çekiş kuvvetlerinin ölçülmelerine izin verir. Bu ölçümler floresan mikrosferlerin hidrojele yerlebir edilmesi ve bu boncukların hESC'lerden önce ve sonra konumlarının görüntülenmesi ile yapılır(Şekil 3A). Hücre tohumlama aşağıdaki boncuk deplasman hücre tarafından oluşturulan kuvvetlerin bir fonksiyonu ve hidrojel elastikiyeti, böylece boncuk pozisyonları görüntüleri boncuk yer değiştirmeharitaları oluşturmak için kullanılabilir ve daha sonra altta yatan hesaplamak için kullanılır çekiş gerilmeleri. HESC'lerin dairesel kolonilerinde, en büyük çekiş gerilmeleri kolonilerin çevre kenarına yakın bulunurken, kolonilerin merkezi düzgün bir şekilde düşük çekiş gerilimleri gösterir(Şekil 3B). İlginçtir, en yüksek çekiş gerilimleri kolonilerin kenarına yakın kümeler bulunur, yerine maksimal stres sürekli bir halka oluşturan. Bu, koloni geometrisinin çekiş gerilimlerinin dağılımının belirlenmesinde önemli bir rol oynamasına rağmen, daha lokalize düzenleme ve geri bildirimin maksimal gerilimin kesin konumlarını belirlediği anlamına gelir. Ayrıca, bağlı hücreler olmadan mikrosfer pozisyonları görüntü hücre tohumlama önce alınır sürece, hESC kolonileri çekiş kuvveti ölçümleri aşağıdaki ilgi proteinlerin immünboyama için sabit olabilir. Çekiş gerilimlerinin gözlenen tekdüze olmayan dağılımlarına rağmen, bakım koşullarında desenli daireler olarak kültürlenen HESC'ler pluripotency marker Oct3/4 ve hücre yapışma molekülü E-kadherinin tek tip ekspresyonu gösterirler (Şekil 3C ).
Ligand desenleri oluşturmak için şablonlar kullanmak için sunulan yöntem, bu yöntemde kullanılan nispeten büyük geometriler için mikrotemas baskının yaygın tekniğinden (örneğin, 1 mm çapında dairesel koloniler için) ve üçgenler ve eşdeğer alanın kareleri). Bu uzunluk ölçeğinde ligandın mikrotemas baskı desenleri desenlerin kenarlarında heterojen transferle sonuçlanır ve desenlerin orta bölgelerinde çok az ligand birikir (Şekil 4A). Bu açıkça belirli geometrilerin hESC kolonileri sürekli üretmek için yeterli değildir. Hücre tohumlama yoğunluğunu azaltmak da tamamlanmış koloniler elde tutarsızlık yol açar. 300.000 hücre/mL yerine 200.000 hücre/mL'de tohumlanan hücreler, 24 saat sonrası tohumlamada Y27632'nin azaltılmış konsantrasyonundan sağ çıkabilmek için yeterli hücre-hücre kontamı oluşturamamaktadır (Şekil 4B). Y27632 seyreltme süresini uzatarak daha düşük hücre yoğunluklarına sahip tam desenler oluşturmak mümkün olabilir; ancak, genel olarak daha yüksek 300.000 hücre/ mL yoğunluğunda tohum daha verimlidir. Bazen, protokolde daha önce algılanmayan desen oluşturma hataları, hESC'lerin tohumlanmasıyla belirginleşir. Bu hatalardan biri, örtü kayarak kötü temas nedeniyle şablonun altına ligand çözeltisinin sızdırılmasıdır. Bu da ligand'ın istenilen geometrilerin dışındaki poliakrilamid bölgelerine aktarılmasına ve tohumlama üzerine hESC'lerin sınırlandırılmamış büyümesine neden olur(Şekil 4C).
Şekil 1: ECM ligand desenleme asit yıkanmış kapakları üzerine ve poliakrilamid hidrojeller transfer. (A) Asitle yıkanmış kapaklarda ECM ligand desenleme ve desenli ligand'ın poliakrilamid hidrojellere aktarılması için protokolün şematik gösterimi. (B) Asitle yıkanmış kapaklarda desenli ECM ligandın immünfloresan görüntüleri (solda) ve poliakrilamid hidrojele (sağda) transferinden sonra. Biotin etiketli matrigel coverslip üzerine desenli ve polyakrilamid transfer önce Alexa Fluor 555 streptavidin ile etiketlenmiş. Insets oluşturulan tam desenlerin yakınlaştırılmış görünümünü gösterir. (C) Cam kapak üzerinde ligand desenleme kusurları gösteren temsili floresan görüntüler. Bu hatalar, ligand çözeltisinin desenli geometrinin dışına sızması (üst, ok sızıntı nın olduğu yeri gösterir) ve ligand çözeltisi eklendikten sonra şablonun desenli geometrileri içinde hava kabarcıklarının bindirmesi gibi yaygın hatalardan kaynaklanır ( alt, ok hava kabarcığı site gösterir). Tüm ölçek çubukları = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: HESC'lerin desenli poliakrilamid hidrojellere tohumlanması. Desenli ligand ile poliakrilamid hidrojeller üzerine hESCs başarılı tohumlama gösteren temsili brightfield görüntüleri. Üstteki zaman çizelgesi, eklenmemiş hücreleri kaldırmak ve Y27632'yi seyreltmek için kullanılan bir dizi ortam değişikliğini gösterir. İlk tohumlamadan sonra, hücrelerin desenli ligand içindeki çeşitli bölgelere bağlı kalarak 72 saat. Ölçek çubuğu = 500 m. boyunca desenli bölgeleri doldurmak için çoğaldığını unutmayın.
Şekil 3: Çekiş gerilimlerinin bölgesel lokalizasyonu ve sınırlı hESC kolonilerinin immünboyizasyonu. (A) Poliakrilamid hidrojel içindeki mikrosferlerin floresan görüntüleri hESC'lerden önce ve sonra. (B) Çekiş gerilmeleri (solda) ve buna karşılık gelen yeniden inşa edilmiş çekiş gerilmeleri (sağda) nedeniyle mikrokürelerin yer değiştirmesini gösteren temsili parçacık görüntü velocimetry (PIV) çizimi. (C) Desenili poliakrilamid hidrojeller üzerinde sınırlı hESC kolonilerinin immünboyboyama, çekiş gerilmeleri ilgi proteinlerin lokalizasyon karşılaştırmak için yeteneğini gösteren. Tüm ölçek çubukları = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Alternatif yöntemler ve hatalardan elde edilen ideal olmayan sonuçlar. (A) Mikrotemas baskı yoluyla asitle yıkanmış kapaklara desenli ECM ligand'ın temsili floresan görüntüleri. (B) Hücrelerin yetersiz yapışması nedeniyle tamamlanmış koloniler oluşturmak için başarısız hESCs Brightfield görüntüleri. Kolonilerde 24 saat sonrası tohumlama (oklar) kalan büyük boşluklar bu sorunun erken bir göstergesidir. (C) İstenilen geometrilerin dışında ligand varlığına yol açan desenleme deki hatalar nedeniyle sınırlı koloniler oluşturmayan HESC'lerin Brightfield görüntüleri. Tüm ölçek çubukları = 500 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Örnek SU8 Gofret İmalatı | |
| 1. SU8-3050 ile Spin ceket gofret | 30 s için 1.000 RPM spin |
| 2. Sıcak tabakta yumuşak fırında gofret | i. 65 °C'de 3 dk |
| ii. 95 °C'de 45 dk | |
| iii. 65 °C'de 3 dk | |
| iv. Oda sıcaklığına kadar serin | |
| 3. Maske hizalayıcıda pozlama | i.Align gofret ve fotomaske hizalayıcı |
| Ⅱ. 250 mJ/cm2 enerji ile pozlama | |
| • Örneğin 11 mW/cm2şiddetindeki lamba için, 23 s | |
| 4. Sıcak tabakta pozlama fırında sonrası | i. 65 °C'de 1 dk |
| ii.15 dk 95 °C'de | |
| iii. 65 °C'de 1 dk | |
| ıv. Oda sıcaklığına kadar serin | |
| 5. Geliştirin | i. SU8 Geliştirici, yaklaşık 5-10 dk çalkalama |
| Ⅱ. İzopropil alkol (IPA) ile geliştirmeyi kontrol edin | |
| • Az gelişmişse, IPA durulama beyaz bir kalıntı üretecek | |
| 6. Sıcak tabakta sert fırında (isteğe bağlı) | 150 °C'de 1-2 saat |
Tablo 1: Örnek SU8 gofret üretim protokolü. PDMS pulları ve sonraki şablonlar oluşturmak için kullanılan silikon gofretler bu tabloda belirtilen adımlar kullanılarak imal edildi. Bu protokol, yaklaşık 100-250 m film kalınlığı oluşturmak amacıyla SU8 3000 veri sayfası kullanılarak oluşturulmuştur.
| Poliakrilamid Jel Formülasyonları | |||||||||
| 1 mL komple çözüm için hacimler | |||||||||
| Elastik Modül (Pa) | Son % akrilamid | Son % Bis-akrilamid | ddH2O (3L) | %40 akrilamid (3L) | %2 Bis-akrilamid (3L) | 10x PBS (3L) | ddH2O 'da %1 TEMED (μL) | Mikroküreler ddH2O 'da %0,5 katı (μL) | ddH2O 'da %1 PPS (μL) |
| 1050 | 3 | 0.1 | 565 | 75 | 50 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 2700 | 7.5 | 0.035 | 485 | 187.5 | 17.5 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 4000 | 7.5 | 0.05 | 477.5 | 187.5 | 25 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 6000 | 7.5 | 0.07 | 467.5 | 187.5 | 35 | 100 | 75 | 60 | 75 |
Tablo 2: Poliakrilamid jel formülasyonları. TFM için floresan mikrosferler ile çeşitli elastik modüler poliakrilamid hidrojeller üretmek için bileşenlerin hacimleri. Hacimler, gerekli poliakrilamid çözeltisi miktarına göre yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir. Floresan mikroküreler ve PPS hariç tüm bileşenler gaz gidermeden önce birbirine karıştırılır. PBS = fosfat tamponlu salin, TEMED = tetrametiletilenedamin, PPS = potasyum persülfat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uzun ve ayrıntılı bir protokolü basitleştirmek için, bu yöntem üç kritik aşamadan oluşur: 1) cam kapaklar üzerinde ECM ligand desenleri üreten, 2) jel polimerizasyonu sırasında poliakrilamid hidrojeller için desenler transfer, ve 3) üzerinde tohumlama hESCs desenli hidrojel. Bu üç aşamanın her birinde göz önünde bulundurulması gereken kritik adımlar vardır. Cam kapaklarda yüksek doğruluk desenleri oluşturmak için, ligand çözeltisinin sızmasını önlemek için şablon kapak kapağına sıkıca bastırılmalı ve şablonun yüzeyine ligand çözeltisi ilave edilerek tüm hava kabarcıkları çıkarılmalıdır ( Şekil 1C). Eğer ligand çözeltisi kapak kaymaile kötü temas nedeniyle şablondan sızıyorsa, ligand poliakrilamid hidrojelin tüm yüzeyine transfer edilecek ve hESC'ler istenilen koloni geometrisi ile sınırlı olmayacaktır (Şekil 4C). Desenli ligand'ın poliakrilamid'e aktarılmasında en önemli adım, tüm bileşenler PBS'de batık kalırken üst kapağı hidrojelden yavaşça ayırmaktır. Hidrojel ayırma sırasında su altında kalmazsa, desenler tamamen tahrip olabilir. Ayrıca, ayırma çok hızlı gerçekleşirse, hidrojel yüzeyi yırtılabilir veya başka bir şekilde zarar görebilir. Hidrojel ne kadar yumuşaksa, ayırma sırasında hasar riski o kadar fazladır. Son olarak, kullanıcı desenli hidrojeller üzerinde hESC'lerin tohumlama ve kültür sırasında medya alışverişi yaparken çok dikkatli bir şekilde pipet gerekir. HESC'ler protokol boyunca gevşek bir şekilde yapışmış durumda dır ve desenli koloniler dikkatsiz veya aceleye gelmiş borulama ile kolayca bozulabilir.
Yukarıda tartışılan kritik adımlara ek olarak, bu protokolü farklı uygulamalar için uyarlarken değişiklik ve sorun giderme gerektirebilecek başka adımlar da vardır. Burada gösterilen desenler bir milimetre mikron yüzlerce uzunluk ölçeğinde iken, şeffaflık photomasks ve negatif photoresist ile silikon gofret üzerinde desenli özellikler üreten 7-10 μm kadar tüm yol özellikleri boyutları sağlar. Böylece, bu protokol uyumlu yüzeyler üzerinde tek hücre veya birkaç hücrenin daha küçük kolonilerin geometrisi sınırlı için uyarlanmış olabilir.
Bu protokolü farklı hücre tiplerine uyarlarken optimizasyon gerektirecek iki parametre, kullanılan ECM ligand tipi ve şablonlar aracılığıyla cam örtüye adsorpsiyon sırasında çözeltideki ligand konsantrasyonudur. Matrigelhomojen desenlerinin üretilmesi ve hESK'ların(Şekil 1B ve Şekil 2)kolaylaştırılması için toplam 250 g/mL ligand konsantrasyonu yeterliydi, ancak daha düşük sonuçlar elde etmek mümkün olabilir Konsantrasyon. Diğer taraftan, daha az yapışık hücre tipleri veya daha kısa kuluçka süreleri gerektiren uygulamalar için ligand konsantrasyonunu daha da artırmak gerekebilir. Daha fazla ligand konsantrasyonu da farklı ECM ligands için gerekli olabilir, fibronektin veya kollajen gibi, matrigel daha az hidrofobik ve bu nedenle güçlü olarak hidrojel adsorb olmayabilir. Ligand'ın kapak kaymadan hidrojel'e transferi hidrojelin polimerizasyonu sırasında meydana geldiğinden, ECM ligand'ı hidrojel yüzeyine (sulfo-SANPAH tedavisi gibi) sağlam bir şekilde çapraz bağlamak için yaygın olarak kullanılan teknikler mümkün değildir. Protokolün her adımında desenlerin görselleştirilmesini sağlamak için floresan etiketli ECM ligandların kullanılması, bu parametreleri optimize ederken ve sorun giderirken son derece yararlıdır.
Ayrıca, tohumlama hücreleri için protokol kullanılan hücre türü ve ortam koşullarına bağlı olarak optimizasyon gerektirebilir. Daha hızlı veya verimli bir şekilde yapışan hücreler için, desenler arasında yayılan ve desenli monokatmanlı koloniler yerine agregalarla sonuçlanan hücre-hücre yapışıklıklarını önlemek için daha düşük bir tohumlama yoğunluğu gerekebilir. Çok zayıf eki gösteren hücreler için, sınırlı kolonilerin tam oluşumunu kolaylaştırmak için ilk ortam takasından önce daha büyük bir tohumlama yoğunluğu veya daha uzun bir süre gerekebilir(Şekil 4B).
Bu yöntemin anahtar sınırlama sı, desenli cam yüzeylerde hücreleri toplama içeren benzer yöntemlerle karşılaştırıldığında nispeten düşük iş elde etme sonuçları ile sonuçlanan teknikkarmaşıklığıdır 8. Ancak, bu dezavantajı çok uyumlu yüzeyler üzerinde sınırlı hESC kolonileri kültürlenme tarafından elde edilen fizyolojik alaka tarafından ağır basmaktadır. Erken embriyonun mekanik özelliklerini etkili bir şekilde özetleyerek, birincil mikrop tabakalarının kendi kendini organizasyonuna yol açan süreçleri daha iyi modelleyip anlayabiliriz.
HESC kolonilerinin poliakrilamid hidrojellerle sınırlandırMalarının bir diğer yararı da, erken embriyonun bir modeli olarak hESC kolonisinin organizasyonu arasındaki bağlantıyı incelemek için TFM'nin kullanılmasına olanak sağlaması ve hücre tarafından oluşturulan kuvvetlerin dağılımını altında yatan morfogenez ve hücre kader özellikleri. HESC kolonilerinin sınırlanması, koloni geometrisine bağlı çekiş gerilimlerinin dağılımıyla sonuçlanır (Şekil 3B). Bu çekiş gerilimlerinin tekdüzeliğine rağmen, koloniler boyunca hücreler bakım koşullarında pluripotent kalır(Şekil 3C). Ancak, çekiş stres dağılımlarının çözünür morfojenler gibi indüksiyon ipuçlarına yanıtı alabora ederek hücre kader belirtimi nin düzenlenmesinde rol abileceğini varsayız. Bu yöntemin, bize ve diğer gruplara erken insan embriyolarını hESC'lerle daha iyi modelleme olanağı sağlayacağını ve insan embriyogenezinin altında yatan temel süreçlerin daha eksiksiz anlaşılmasını sağlayacağını öngörüyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Biz CIRM hibe RB5-07409 gelen finansman kabul etmek istiyorum. J.M.M. fuiBoon Kai, Dhruv Thakar ve Roger Oria'ya bu yöntemin neslini ve sorun gidermelerini yönlendiren çeşitli tartışmalar için teşekkür eder. J.M.M. ayrıca UCSF Discovery Bursu'na çalışmalarının sürekli desteği için teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
References
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
- Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).
- Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mace, K., Braun, K. 916, Humana Press. Totowa, NJ. 317-350 (2012).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
- Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
- Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).
