Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Mönster av geometrin hos humana embryonala stamcells kolonier på överensstämmande substrat för att kontrollera vävnadsnivå mekanik

doi: 10.3791/60334 Published: September 28, 2019

Summary

Extracellulära matrix ligander kan mönstra på polyakrylamidhydrogels för att möjliggöra kulturen av mänskliga embryonala stamceller i trånga kolonier på överensstämmande substrat. Denna metod kan kombineras med dragkraft mikroskopi och biokemiska analyser för att undersöka samspelet mellan vävnad geometri, cell-genererade krafter, och öde specifikation.

Abstract

Mänskliga embryonala stamceller visar en unik förmåga att reagera på morfogener in vitro genom självorganiserande mönster av cell öde specifikation som motsvarar primära köns skiktet bildas under embryogenes. Således, dessa celler utgör ett kraftfullt verktyg för att undersöka de mekanismer som driver tidig mänsklig utveckling. Vi har utvecklat en metod för att odla mänskliga embryonala stamceller i trånga kolonier på överensstämmande substrat som ger kontroll över både geometrin hos kolonierna och deras mekaniska omgivning för att rekapitulera de fysikaliska parametrar som ligger bakom embryogenes. Det viktigaste inslaget i denna metod är förmågan att generera polyakrylamidhydrogels med definierade mönster av extracellulära matrix ligand vid ytan för att främja cell infästning. Detta uppnås genom att tillverka stenciler med önskad geometriska mönster, med hjälp av dessa stenciler för att skapa mönster av extracellulära matrix ligand på glas täckband, och överföra dessa mönster till polyakrylamidhydrogels under polymerisation. Denna metod är också kompatibel med dragkraft mikroskopi, så att användaren kan mäta och kartlägga fördelningen av cell-genererade krafter inom de trånga kolonierna. I kombination med standard biokemiska analyser kan dessa mätningar användas för att undersöka den roll som mekaniska signaler spelar i ödet specifikation och morfogenes under tidig mänsklig utveckling.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mänskliga embryonala stamceller (hESCs) har ett stort löfte om användning inom regenerativ medicin och vävnadstekniska tillämpningar. Den pluripotenta karaktären av dessa celler ger dem möjlighet att differentiera till någon vuxen celltyp. Även om stora framsteg har gjorts för att styra ödet för hESCs till vissa celltyper, har det varit mycket svårt att generera hela vävnader eller organ de Novo1,2,3,4, 5. Detta beror till stor del på en begränsad förståelse av de mekanismer som driver bildandet av dessa vävnader under mänsklig utveckling. För att fylla denna kunskapsklyfta har ett antal metoder framkommit under de senaste åren för att modellera det tidiga embryot och senare utvecklingsstadier med embryonala stamceller6,7,8,9 ,10,11,12,13.

Kort efter härledningen av den första hESC-linjen14, visades det att embryoida kroppar bildade från hESCs kunde spontant producera celler av de tre primära bakterie lagren6. Men på grund av den inneboende bristen på kontroll över storleken och morfologin av embryoid organ, organisationen av köns lagren varierade betydligt och misslyckats med att matcha organisationen av det tidiga embryot. På senare tid, Warmflash et al. utvecklat en metod för att begränsa kolonier av hESCs på glas substrat via micropatterning, som ger kontroll och konsistens över storleken och geometri av kolonierna8. I närvaro av BMP4, en viktig morfogen i tidig utveckling, var dessa trånga kolonier kan självorganiserande reproducerbara mönster av specifikation till öden som representerar den primära bakterie lagren. Även om detta gav en användbar modell för att studera de mekanismer genom vilka primära bakterie skikt är etablerade, mönster av öde specifikation matchade inte exakt den organisation och morfogenes observerats under embryogenes15. En mer trogen rekapitulation av tidig embryonal utveckling uppnåddes genom inbäddning hESCs i en tredimensionell extracellulär matris (ECM) av matrigel11, vilket ger de starkaste bevisen hittills för förmåga hESCs att själv organisera och modell tidiga stadier av embryogenes ex vivo. Denna metod ger dock inkonsekventa resultat och är därmed oförenlig med ett antal analyser som kan användas för att avslöja de bakomliggande mekanismerna för självorganisering och öde specifikation.

Med tanke på dessa befintliga metoder och deras respektive begränsningar, vi försökte utveckla en metod för reproducerbart odling hESC kolonier av definierade geometrier under förhållanden som modellerar den extracellulära miljön i det tidiga embryot. För att uppnå detta använde vi polyakrylamidhydrogels av avstämbar elasticitet för att kontrollera de mekaniska egenskaperna hos underlaget. Med hjälp av atomkraft mikroskopi på gastrulation-steg kyckling embryon, fann vi att elasticiteten i epiblast varierade från hundratals Pascal till några kilopascal. Därför fokuserade vi på att generera polyakrylamidhydrogels med elasticitet i detta intervall för att fungera som substrat för hESC-kolonier. Vi ändrade våra tidigare metoder för odling av hESCs på polyakrylamidhydrogels7,9 för att ge robust kontroll över koloniernas geometri. Vi uppnådde detta genom att först mönka ECM ligands, nämligen matrigel, på glas täckband genom microfabricerade stenciler, som tidigare rapporterats16. Vi konstruerade sedan en ny teknik för att överföra den mönstrade ligand till ytan av polyakrylamidhydrogels under polymerisation. Den metod som vi beskriver här innebär att använda Photolithography att tillverka en kisel wafer med önskad geometriska mönster, skapa stämplar av avhandlingar geometriska egenskaper med Polydimetylsiloxan (PDMS), och använda dessa stämplar för att generera stenciler som Slutligen tillåta mönkning av ligand på ytan av glas täckband och överföring till polyakrylamid.

Förutom att sammanfatta den mekaniska miljön i det tidiga embryot, gör det möjligt att begränsa hESC-kolonierna på polyakrylamid för att mäta cellgenererade krafter med traktionskraftsmikroskopi (TFM), vilket rapporteras i vår tidigare metod9. I korthet kan fluorescerande pärlor bäddas in i polyakrylamid och användas som relaterat markörer. Cellgenererade krafter beräknas genom att avbilda förskjutningen av dessa pärlor efter sådd hESCs på det mönstrade underlaget. Dessutom kan de resulterande dragkrafts kartorna kombineras med traditionella analyser, såsom immunofärgning, för att undersöka hur distributionen av cellgenererade krafter i slutna hESC-kolonier kan reglera eller modulera nedströms signalering. Vi förväntar oss att dessa metoder kommer att avslöja att mekaniska krafter spelar en avgörande roll i mönkning av cell Fate specifikation under tidig embryonal utveckling som för närvarande förbises.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla metoder som beskrivs här avseende användningen av hESCs har godkänts av Human gamete, embryo och stamcellsforskning (GESCR) kommittén vid University of California San Francisco.

1. beredning av kisel wafer med geometriska egenskaper

  1. Skapa en photomasken med önskade geometriska egenskaper. Använd Datorstödd redaktionella programvara för att designa funktionerna. För användning med negativ photoresist, gör funktioner ogenomskinlig och resten av masken transparent.
    Anmärkning: för mönkning på täckglas med 18 mm diameter, grupp funktioner för varje försöks tillstånd i 10 x 10 mm områden för att säkerställa att stencilerna som genereras i steg 3 passar på täckglas.
  2. Spin Coat negativ fotoresist på en 100 mm kisel wafer. Använd fotoresist datablad för att bestämma hastighet och längd på spinn för att generera en filmtjocklek på 100-250 μm.
    Obs: filmtjockleken bör justeras så att proportionerna av bredden på mönstren till höjden av stencilen är så nära 1:1 som möjligt. Vi rekommenderar dock en minsta tjocklek på 100 μm, som något mindre producerar ömtåliga stenciler som lätt Riva.
  3. Bearbeta fotoresist enligt produktdatabladet. Detta innebär vanligtvis en mjuk baka, UV-exponering med photomasken i en mask Aligner, efter exponering baka, utveckling, och hårt baka. Som exempel beskrivs det förfarande som används för att behandla de rån som används i detta protokoll i tabell 1.
    Obs: var försiktig när du hanterar kiselskivor eftersom de är ömtåliga. När genereras, rån kan användas upprepade gånger så länge de inte är skadade.

2. beredning av täckglas

  1. Beredning av syra-tvättad "Top" täckglas
    1. Placera 18 mm diameter #1 tjocklek täckglas i en skål med petriskål. Lämpligt antal täckglas beror på storleken på skålen. För en 100 mm fat, Förbered 50-100 täckglas i taget. Volym belopp som ges genom återstoden av detta avsnitt motsvarar en 100 mm maträtt.
    2. Tillsätt 20 mL 1 M HCl till petriskål och skaka försiktigt skålen för att skingra täckglas. Se till att alla täckglas är nedsänkt och släpp luftbubblor från mellan täckglas. Inkubera över natten vid rumstemperatur med skonsam skakning.
      FÖRSIKTIGHET: HCl är sur och frätande. Var försiktig och Använd lämplig personlig skyddsutrustning när du arbetar med HCl.
    3. Decant HCl från skålen. Tillsätt 20 ml ultrarent vatten och tvätta med skonsam skakning i 10 min. Kassera vatten och upprepa för totalt fem tvättar.
    4. Tillsätt 20 mL 100% etanol till skålen efter att den sista tvätten har kastat. Med hjälp av tång, ta bort täckglas individuellt och ordna mellan två bitar av filterpapper för att torka.
    5. Förvara torkade täcklappar i en förseglad behållare. Syra-tvättade täckglas kan förberedas i förväg och lagras i en månad eller längre i dammfria förhållanden.
  2. Beredning av glutaraldehyd-aktiverade "bottom" täckglas
    Anmärkning: se tidigare metoder för ytterligare information7,9.
    1. Placera 18 mm diameter #1 tjocklek täckglas i en petriskål.
    2. Tillsätt 20 mL 0,2 M HCl till petriskål och skaka försiktigt skålen för att skingra täckglas. Se till att alla täckglas är nedsänkt och släpp luftbubblor från mellan täckglas. Inkubera över natten vid rumstemperatur med skonsam skakning.
    3. Decant HCl från skålen. Tillsätt 20 ml ultrarent vatten och tvätta med skonsam skakning i 10 min. Kassera vatten och upprepa för totalt fem tvättar.
    4. Efter kassering av den slutliga tvätten, tillsätt 20 mL 0,1 M NaOH och skaka försiktigt för att skingra och dränka täckglas. Inkubera i rumstemperatur med skonsam skakning i 1 h.
    5. Decant NaOH från skålen. Tillsätt 20 ml ultrarent vatten och tvätta med skonsam skakning i 10 min. Kassera vatten och upprepa för totalt fem tvättar.
    6. Tillsätt 20 ml av en 1:200 spädning av 3-aminopropyltrimethoxysilane i ultrarent vatten och skaka försiktigt för att skingra och dränka täckblad efter att den slutliga tvätten har kastat överbord. Inkubera i rumstemperatur med skonsam skakning under 1 h eller över natten.
      FÖRSIKTIGHET: 3-aminopropyltrimetoxysilane är brandfarlig och kan orsaka hudirritation. Hantera med försiktighet, Använd lämplig personlig skyddsutrustning och kassera avfall enligt lokala avfallsföreskrifter.
    7. Dekanera den utspädda 3-aminopropyltrimetoxysilanlösningen från skålen. Tillsätt 20 ml ultrarent vatten och tvätta med skonsam skakning i 10 min. Kassera vatten och upprepa för totalt minst fem tvättar. Det är viktigt att ta bort alla 3-aminopropyltrimethoxysilane innan du fortsätter.
    8. Efter kassering av den slutliga tvätten, tillsätt 20 mL av en 1:140 utspädning av 70% glutaraldehyd i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och skaka försiktigt för att skingra och dränka täckglas. Inkubera i rumstemperatur med skonsam skakning under 1 h eller över natten.
      Varning: 70% glutaraldehyd är giftig och kan orsaka hudirritation. Hantera med försiktighet, Använd lämplig personlig skyddsutrustning och kassera avfall enligt lokala avfallsföreskrifter.
    9. Dekanera den utspädda glutaraldehydlösningen från skålen. Tillsätt 20 ml ultrarent vatten och tvätta med skonsam skakning i 10 min. Kassera vatten och upprepa för totalt fem tvättar.
    10. Tillsätt 20 mL 100% etanol efter kassering av den slutliga tvätten. Med hjälp av tång, ta bort täckglas individuellt och ordna mellan två bitar av filterpapper för att torka.
    11. Förvara torkade täcklappar i en förseglad behållare. Glutaraldehydaktiverade täckglas kan förberedas i förväg och förvaras i upp till sex månader.

3. generering av stenciler för mönstring ECM ligand

  1. Generera Polydimetylsiloxan (PDMS) mellanliggande frimärken
    1. Blanda PDMS bas med PDMS härdning agent på en 10:1 förhållande, vikt. Blanda noga.
      Anmärkning: för den första tillämpningen av PDMS, förbereda cirka 100 g PDMS att fylla en 100 mm maträtt. För efterföljande program, ta bort PDMS från endast mitten av skålen där kisel wafer funktioner är placerade och förbereda 20-30 g nya PDMS.
    2. Degas PDMS-blandningen i en exsickator för 30-60 min eller tills alla luftbubblor har avlägsnats.
    3. Placera den modifierade kisel wafer från steg 1 i en plast 100 mm maträtt. Långsamt och jämnt Häll PDMS blandningen över ytan av Wafer. Knacka på skålen på arbetsytan för att frigöra eventuella luftbubblor från ytan av Wafer.
    4. Degas den PDMS blandningen hällde över wafer för 10 min eller tills alla luftbubblor avlägsnas eller har kommit till ytan av PDMS.
    5. Baka PDMS vid 70 ° c för 2 h. Låt svalna till rumstemperatur.
    6. Med hjälp av en skalpell eller Box Cutter, klippa ut avsnittet av PDMS från mitten av skålen som innehåller de geometriska funktionerna.
    7. Skär PDMS i ungefär 10 x 10 mm rutor, var och en innehåller funktioner för ett enda försöks tillstånd. Dessa kallas "stämplar" i efterföljande steg i protokollet.
  2. Generera platta plattor av PDMS
    1. Blanda PDMS Base med PDMS härdning agent på en 8:1 förhållande, vikt. Bered ca 20 g för varje 100 mm maträtt som ska användas. Blanda noga.
    2. Degas PDMS-blandningen i en exsickator för 30-60 min eller tills alla luftbubblor har avlägsnats.
    3. Häll långsamt och jämnt PDMS i en ren 100 mm skålen. Tryck på skålen på arbetsytan för att frigöra eventuella luftbubblor.
    4. Baka PDMS vid 70 ° c för 2 h. Låt svalna till rumstemperatur.
    5. Ta bort PDMS från skålen. Invertera så att ytan på PDMS som var i kontakt med botten av skålen är vänd uppåt.
    6. För varje stämpel som genereras i steg 3,1, skär en 15 x 15 mm kvadrat med PDMS. Dessa kallas "platta plattor" i efterföljande steg i protokollet.
  3. Generera stenciler
    1. Ordna platta plattor av PDMS på locket på en 150 mm maträtt, eller annan plan yta för enklare hantering. Säkerställ tillräckligt avstånd mellan plattor (t. ex. för en 150 mm maträtt, ordna nio platta plattor med jämna mellanrum).
    2. Invertera varje stämpel som genereras i steg 3,1 på en platt platta av PDMS, så att funktionerna på stämpeln är i kontakt med den platta plattan av PDMS. Tryck försiktigt på toppen av stämpeln med pinpeppar för att säkerställa jämn kontakt.
    3. Försiktigt stötta locket håller PDMS stämpel/Slab par upp på basen av skålen, så att locket vilar i en vinkel. Detta hjälper fuktspridande av UV-bobar polymer i nästa steg.
    4. Placera en liten droppe UV-bobar polymer på toppen gränssnitt för varje stämpel/Slab par. Polymeren kommer att vara ond mellan de två av ytspänningen, biträdd av tyngdkraften.
      Obs: många olika UV-Bobara polymerer kan fungera i detta protokoll. Vi valde Norland optisk lim 74 för följande egenskaper: i) snabb härdning vid exponering för UV-ljus, II) lätt att ta bort från PDMS frimärken vid härdning, III) robust vidhäftning till glas täckband med manuellt tryck.
    5. När polymeren har varit helt ond genom, placera locket med stämpel/platta par platt på arbetsytan. Placera en liten droppe UV-bobar polymer på var och en av de återstående tre sidorna av varje stämpel/platta gränssnitt.
    6. Använd en 200 μL pipett spetsen, Anslut droppar av polymer runt kanterna på stämpeln/plattan gränssnittet. Detta skapar en kantlinje som kommer att hålla ligand lösning i steg 4.
      Obs: var försiktig när du arbetar polymeren runt kanterna på stämpeln. Om stämpeln/plattan gränssnittet störs, kommer polymeren veke under funktionerna och stencilen kommer inte att bilda ordentligt.
    7. Placera försiktigt stämpeln/plattan par i en UV-sterilisering låda. Använd den sterila "Str" ström inställningen och exponera för 10 min.
    8. Ta bort stämpeln/plattan par från UV-sterilisering låda. Med hjälp av två par tång, försiktigt ta bort PDMS stämpel medan du håller ner platt platta och stencil som bildas från UV-bobar polymer.
    9. Med hjälp av pinpett tar du försiktigt bort stencilen och inverterar den så att ytan som var i kontakt med plattplattan i PDMS är vänd uppåt.
      Obs: stencilerna är ömtåliga. Var försiktig när du lämnar dem, särskilt när du först ta bort dem från PDMS, så att de inte riva.
    10. Placera de inverterade stencilerna tillbaka till en UV-sterilisering låda. Använd den sterila "Str" ström inställningen och exponera för 3 min.

4. Patterning ECM ligand på COVERSLIPS

  1. Pressning av schabloner på syrafintade täckglas
    1. Placera en syra-tvättad täckslip för varje stencil på en ren bit av laboratorie film.
    2. Med hjälp av tång, Placera försiktigt varje stencil, platt-Down, på en syra-tvättad täckslip. Placera sådana att funktioner är centrerade på täckslip.
    3. Placera en liten bit laboratorie film ovanpå varje stencil. Tryck fast och jämnt på stencilen för att skapa en stark kontakt mellan stencilen och täcksteget.
      Obs: Detta är ett kritiskt steg! Tryck hårt och tvärs över hela ytan på stencilen. Om tillräcklig kontakt inte skapas kommer ligand-lösningen att läcka mellan stencilen och täckglagen och mönstret kommer att misslyckas. Valfritt: för att bekräfta tillräcklig kontakt mellan stencilen och täckglasett, Pipettera 100 μl ultrarent sterilt vatten på ytan av varje stencil och inkubera i rumstemperatur. Efter 1 h, kontrollera om läckande. Aspirera vatten från framgångsrikt bundna stenciler och fortsätta.
  2. Plasma rengöring av ytan på de stencilade täckglas för att öka hydrofilicitet
    1. Placera täckglas med schabloner i en plasma renare. Applicera hög effekt plasma för 30 s.
  3. Beredning av ECM ligand lösning
    Anmärkning: alla efterföljande steg bör slutföras i sterila förhållanden, om möjligt.
    1. Placera sterila 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8,0 lösning på is. När isen är kall, tillsätt matrigel och kollagen för att uppnå koncentrationer på 225 μg/mL respektive 25 μg/mL. Valfritt: för felsökning eller för ligand-visualisering, inkludera en Fluorescent-märkt ligand i ligand-lösningen.
      1. Obs: olika ECM-ligander kan användas med denna metod. För olika ligander kan ytterligare optimering krävas för att bestämma ideal koncentration, inkubationstid och inkubations temperatur. Mer information finns i diskussionsavsnittet.
    2. Pipettera ligand-lösningen på ytan på varje stencil. För stenciler gjorda av 10 x 10 mm fyrkantiga frimärken, applicera 100 μL per stencil.
    3. Kontrollera om det finns luftbubblor i stencilens funktioner. Använd vid behov finspetsade pinpett eller en 2 μL pipettspets för att ta bort luftbubblor från funktioner.
      Obs: Detta är ett kritiskt steg! Om luftbubblor fastnar på täckslidytan kommer ligand inte att adsorberas till ytan och det resulterande mönstret kommer att vara ofullständigt.
    4. Placera stencilade täckglas med ligand i en skål, wrap med laboratorie film, och inkubera vid 4 ° c över natten.

5. överföring av ligand till polyakrylamidgel

  1. Ta bort ligand-lösning och stencil från varje täckslip
    1. Aspirera på ligand lösning från ytan av en stencil. Ligand lösning kan samlas in och förvaras vid 4 ° c och återanvändas i upp till en månad.
    2. Med hjälp av Pinkett, sänk kortfattat täckblad med stencil i en skål som innehåller steril PBS att tvätta.
    3. En kort stund dränka täckblad med stencil i en andra skålen med steril PBS att tvätta.
    4. Ta bort stencilen från ytan på täckslip. Var noga med att inte bryta täckslip.
    5. Kortfattat dränka täckglas i en skål som innehåller ultrarent sterilt vatten för att avlägsna salter från PBS tvättar. Knacka på kanten av täckslip till en delikat uppgift torka att veka bort överflödigt vatten.
    6. Torka täckslip under en inert gas, såsom kväve. Markera undersidan av täckbrickan för att hålla koll på orienteringen från denna punkt framåt. Var noga med att hålla den mönstrade sidan vänd uppåt.
    7. Upprepa steg 5.1.1 till 5.1.6 för varje stencilad täckslip.
  2. Tillverkning av polyakrylamidhydrogels med mönstrade täckband
    Anmärkning: se tidigare metoder för ytterligare detaljer7,9 sterilisera alla Cap hållare, rör och distanser som används för att göra polyakrylamidgeler genom tvättning med 10% blekmedel över natten, sköljning med vatten minst fem gånger för att avlägsna blekmedel, och tvätta en kort stund i 70% etanol. Placera alla bitar på delikat uppgift våtservetter i ett sterilt biosäkerhetsskåp att torka före användning.
    1. Bered polyakrylamidlösning för att uppnå önskad hydrogelelasticitet (tabell 2). Blanda ihop alla komponenter utom fluorescerande mikrosfärer och kaliumpersulfat (PPS).
      Anmärkning: Bered 1% kaliumpersulfatlösning fräsch varje gång.
    2. Degas polyakrylamidlösningen, mikrosfärer och PPS i separata rör under vakuum i 30 min.
    3. För varje mönstrad täckslip, Förbered en glutaraldehyd-aktiverad "botten" täckslip med en spacer (18 mm ytterdiameter, 14 mm innerdiameter) placerad ovanpå.
    4. Efter avgasning, kort Sonikera mikrosfärer och Tillsätt lämplig volym till polyakrylamid lösning. Blanda genom att Pipettera upp och ner, var noga med att inte införa luftbubblor. Kort sonicate.
    5. Tillsätt lämplig volym av PPS till polyakrylamidlösningen. Pipettera upp och ner för att blanda lösningen och var noga med att inte införa luftbubblor.
      Obs: efter att ha lagt PPS, arbeta snabbt för att slutföra steg 5.2.6 genom 5.2.11 innan polyakrylamid Polymeriserar.
    6. Pipettera över 75-150 μL (beroende på tjockleken på distansen) till mitten av varje glutaraldehydaktiverad täckslip.
    7. Med hjälp av tång, placera en mönstrad täckslip på varje glutaraldehyd-aktiverade täckslip med polyakrylamid och spacer, så att den mönstrade ligand ansikten polyakrylamidlösning. Om tillräcklig polyakrylamidlösning lades till, kommer ytspänningen att veka polyakrylamid mellan de två täckglas och inga luftbubblor kommer att förekomma.
    8. Plocka upp varje polyakrylamid "Sandwich" och försiktigt röra vid sidan till en delikat uppgift torka att veke bort överskott polyakrylamid lösning.
    9. Placera försiktigt varje polyakrylamidsmörgås i en Lockhållare med gängor som är kompatibla med 15 mL koniska botten rör. Orienteringen bör vara sådan att botten av glutaraldehyd täckslip är i kontakt med botten av locket innehavaren, och den mönstrade täckslip är ovanpå.
    10. Skruva fast ett 15 mL koniskt botten rör i varje Lockhållare för att hålla polyakrylamidsmörgåsarna på plats. Rören ska vara tätt för att förhindra läckage, men var noga med att inte dra åt och knäcka täckglas.
    11. Centrifugera polyakrylamid "smörgåsar" i rören i swing-skopor på 200 x g i 10 min vid rumstemperatur. Ta bort rören från centrifugen och placera i rör rack för att bibehålla orienteringen i ytterligare 50 min för att säkerställa full polymerisation. Håll täckt med folie för att förhindra blekning av fluorescerande mikrosfärer.
      Obs: centrifugering är kritisk när du använder denna metod för att utföra TFM. Centrifugalkraften flyttar alla mikrosfärer till ett enda plan, som i slutändan kommer att vara strax under ytan av hydrogel. Detta är idealiskt för avbildning Microsphere förskjutningar som används för att beräkna cell-genererade dragkraft spänningar. Om du inte utför TFM kan mikrosfärer lämnas utanför polyakrylamidlösningen och polymerisation kan förekomma vid bänkskiva utan centrifugering.
    12. Ta bort polymeriserad polyakrylamid "smörgåsar" från rören och dränera i PBS i en 100 mm maträtt. Wrap i laboratorie film och inkubera i 3 h vid rumstemperatur eller över natten vid 4 ° c.
  3. Beredning av mönstrade geler för sådd celler
    1. Använd en skalpell och tång för att försiktigt ta bort den mönstrade täckbrickan och distansen från polyakrylamid "Sandwich" medan den förblir nedsänkt i PBS. Den mönstrade ligand kommer att ha överförts till polyakrylamid under polymerisation och kommer att förbli efter avlägsnande täckslip. Polyakrylamidgelen kommer att förbli kopplad till den glutaraldehydaktiverade täcksteget.
      Obs: Detta är ett kritiskt steg! Polyakrylamid måste vara nedsänkt i PBS medan du tar bort täckslip eller ligand mönster kommer att förstöras.
    2. Placera varje täckslip med mönstrad polyakrylamid i en Lockhållare. Placera en packning (18 mm ytterdiameter, 14 mm innerdiameter) ovanpå täckbrickan och runt polyakrylamid, där distansen var placerad. Skruva ett sågat 15 mm koniskt botten rör i locket hållaren, bildar en brunn med den mönstrade polyakrylamid längst ner. Dessa aggregat passar in i brunnarna i en standard 12-brunn plattan för enkel hantering.
    3. Tvätta varje gel genom att tillsätta 500 μL PBS i brunn sammansättningen. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur med skonsam skakning. Ta bort PBS och upprepa två gånger för totalt tre tvättar.
    4. Efter den sista PBS tvätta, tillsätt 500 μL av knockout-DMEM media till geler och inkubera vid 37 ° c över natten. Geler kan förvaras vid 37 ° c med media i upp till 5 dagar före sådd celler.
    5. Dagen före seedning celler, ersätta knockout-DMEM för komplett KSR media och inkubera vid 37 ° c över natten.

6. culturing hESCs på mönstrade geler

Obs: om du planerar att åtgärda prover för immunofärgning efter TFM, ta bilder av obetonade mikrosfär positioner före seedning celler. I detta fall bör Fluorescent taggade ligand användas i steg 4.3.1 så att de eventuella platserna för celler kommer att vara kända innan sådd och mikrosfärer kan avbildas i dessa regioner.

  1. Underhålla Stock hESC kulturer och sekundära Feeder-fria kulturer beredda på matrigel-belagda plattor i konditionerat KSR Media före sådd på mönstrade polyakrylamidgeler som tidigare beskrivits9.
    Notera: generera konditionerade KSR Media genom odling bestrålade mus embryonala fibroblaster i KSR Media kompletteras med 4 ng/mL grundläggande fibroblast tillväxtfaktor (bFGF). Samla och ersätt Media varje 24 h.
  2. Aspirera medierna från hESCs. Kort tvätta med knockout-DMEM media. Tillsätt 0,05% trypsin-EDTA kompletterad med 10 μM Y27632 (RHO Kinas-hämmare) och inkubera vid 37 ° c i 5-10 min.
  3. Lägg till media med serum för att hämma trypsin. Försiktigt aspirera media och Pipettera över skålen för att ta bort celler. Fortsätt Pipettera försiktigt för att ta bort alla celler och separera cell kluster till enstaka celler.
  4. Samla cellsuspensionen och centrifugera vid 200 x g i 3 min.
  5. Aspirera på supernatanten och Omsuspendera pelleten i en motsvarande volym KSR media att tvätta. Centrifugera vid 200 x g i 3 min.
  6. Aspirera på supernatanten och Omsuspendera pelleten i konditionerade KSR-medier kompletterade med 10 ng/mL bFGF och 10 μM Y27632.
  7. Räkna cellerna med en hemocytometern och justera cellsuspensionen till en koncentration av 300 000 celler per mL. Pipettera 500 μL av cellsuspensionen på varje mönstrad gel (150 000 celler per gel).
  8. 3 h efter sådd, Använd en pipett för att försiktigt aspirera mediet från varje gel och Ersätt med färskt konditionerade KSR-Media kompletterat med 10 ng/mL bFGF och 10 μM Y27632. Detta tar bort överflödiga celler som inte följer mönstrade regioner i polyakrylamid.
    Obs: Detta är ett kritiskt steg! I detta skede celler kommer att vara löst följs den mönstrade ligand. Var mycket försiktig när du byter media för att inte lossa cellerna. Lika omsorg bör tas med var och en av medierna swappar i efterföljande steg.
  9. 24 h efter sådd, Använd en pipett för att försiktigt aspirera media och utbyte mot konditionerade KSR-Media kompletterade med 10 ng/mL bFGF och 5 μM Y27632.
  10. 48 h efter sådd, Använd en pipett för att försiktigt aspirera media och utbyte mot konditionerade KSR-Media kompletterade med 10 ng/mL bFGF. Detta tar bort Rho Kinas-hämmaren från media och experiment kan börja nästa dag, 72 h efter seeding.

7. utföra TFM

  1. När så önskas, utför TFM som tidigare beskrivits9 under önskade experimentella förhållanden.
  2. Om obetonade mikrosfär positioner var avbildas före seedning celler, fixa cellerna efter att ha tagit stressad Microsphere positioner och utföra immunofärgning att bestämma lokalisering av proteiner av intresse i förhållande till regioner med hög och låg dragkraft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den största utmaningen att övervinna i att försöka odla hESCs i kolonier av kontrollerad geometri på överensstämmande substrat är att generera ett homogent mönster av ECM-ligand på ytan av underlaget. Den strategi som presenteras i denna metod innebär att först generera önskat mönster på ytan av en glastäckslip och sedan överföra det mönstret till ytan av en polyakrylamidhydrogel under polymerisation av gelen (figur 1 A). således är det viktigt att se till att önskat mönster skapas framgångsrikt på ytan av glaset täckglas innan du fortsätter till polymerisation av hydrogel och överföring av mönstret (figur 1B). Baserat på avbildning av fluorescerande ligand mönster överförs till polyakrylamid verkar ligand vara närvarande endast i ett enda plan på ytan av polyakrylamid, även om vi inte exakt karakterisera tjockleken på detta skikt. Det finns två vanliga typer av defekter observerade efter mönster generation på glaset täckglas, var och en med sin egen källa till fel. Den första är utseendet på fluorescerande ligand sträcker sig bortom marginalerna i det önskade mönstret (figur 1C, topp), vilket resulterar från läckage av fluorescerande ligand lösning på grund av en liten tår i stencilen eller otillräcklig tätning av stencilen till glas täckglaset. Den andra är utseendet på ett ofullständigt mönster (figur 1C, botten), vilket vanligtvis beror på en luftbubbla Fångad vid täckslip gränssnitt som förhindrar adsorption av fluorescerande ligand.

Det ultimata måttet på framgång för denna metod är förmågan att odla hESCs i önskade geometrier på de mönstrade hydrogelerna (figur 2). För att uppnå detta, är hESCs seedade på en relativt hög densitet (300 000 celler/mL) i närvaro av en Rho kinashämmare (Y27632) och inkuberas för 3 h för att underlätta vidhäftning till mönstren i ligand. Media ersätts sedan för att ta bort icke-vidhäftat celler. Under loppet av 72 h, är Y27632 gradvis spädas ut ur medierna genom en serie Media utbyten på 24 och 48 h efter seedning. Typiskt, hESCs förökade för att slutföra de mönstrade geometrier med 48-72 h, så att experiment kan börja på 72 h post-seeding, när Y27632 är helt bort från media.

Odling av hESC-kolonier i trånga geometrier på polyakrylamidhydrogels möjliggör mätning av cellgenererade dragkrafter med hjälp av TFM. Dessa mätningar görs genom att bädda in fluorescerande mikrosfärer i hydrogel och avbilda positionerna för dessa pärlor före och efter seedning hESCs (figur 3A). Förskjutningen av pärlorna efter cell sådd är en funktion av cell-genererade krafter och elasticiteten i hydrogel, alltså bilder av granulum positioner kan användas för att generera kartor över pärla förskjutningar och därefter används för att beräkna den underliggande dragkraft spänningar. I cirkulära kolonier av hESCs finns de största dragkrafts påfrestningarna nära den perifera kanten av kolonierna, medan koloniernas centrum uppvisar jämnt låga dragkrafts spänningar (figur 3B). Intressant, den högsta dragkraft spänningar finns i kluster nära kanten av kolonierna, snarare än att bilda en kontinuerlig ring av maximal stress. Detta innebär att även om kolonin geometri spelar en viktig roll för att bestämma fördelningen av dragkraft spänningar, mer lokaliserad reglering och återkoppling avgör de exakta platserna för maximal stress. Dessutom, så länge bilden av Microsphere positioner utan anslutit celler tas före cell sådd, hESC kolonier kan fastställas för immunofärgning av proteiner av intresse efter dragning kraftmätningar. Trots de observerade icke-enhetliga fördelningarna av dragkrafts spänningar, odlade hESCs som mönstrade cirklar i underhållsförhållanden uppvisar enhetligt uttryck för pluripotens markör Oct3/4 och celladhesionmolekylen E-cadherin (figur 3C ).

Den presenterade metoden för att använda stenciler för att generera mönster av ligand är bevisligen överlägsen den gemensamma tekniken för microcontact utskrift för de relativt stora geometrier som används i denna metod (dvs. för cirkulära kolonier 1 mm i diameter samt triangel och kvadrater av motsvarande område). Microcontact tryck mönster av ligand i denna längdskala resulterar i heterogena överföring vid kanterna av mönster, med mycket lite ligand deponeras i de centrala delarna av mönstren (figur 4A). Detta är helt klart otillräckligt för att konsekvent producera hESC-kolonier av specifika geometrier. Att minska cell sådd tätheten leder också till inkonsekvens i att uppnå avslutade kolonier. Celler som seedas vid 200 000 celler/mL, snarare än 300 000 celler/mL, kan inte generera tillräckliga cell cells kontakter för att överleva den reducerade koncentrationen av Y27632 vid 24 h efter sådd (figur 4B). Det kan vara möjligt att generera kompletta mönster med lägre celltäthet genom att förlänga perioden av Y27632 utspädning; emellertid, övergripande det är mer effektivt att utsäde på den högre 300 000 celler/mL densitet. Ibland blir fel i mönstret generation som inte upptäcks tidigare i protokollet uppenbara vid sådd av hESCs. Ett sådant fel är läckage av ligand lösning under stencilen på grund av dålig kontakt med täckslip. Detta resulterar i slutändan i ligand överförs till regioner i polyakrylamid utanför de önskade geometrier, och oinskränkt tillväxt av hESCs vid sådd (figur 4C).

Figure 1
Figur 1: mönster av ECM ligand på syraftvättade täckband och överföring till polyakrylamidhydrogels. (A) schematisk representation av protokollet för MÖNSTRA ECM ligand på syra-tvättade täckglas och överföra den mönstrade ligand till polyakrylamidhydrogels. B) Immunofluorescerande bilder av mönstrad ECM-ligand på syratvättade täckband (till vänster) och efter överföring till polyakrylamidhydrogel (höger). Biotin-märkta matrigel var mönstrad på täckslip och märkta med Alexa fluor 555 konjugerat före överföring till polyakrylamid. Insets visar utzoomad vy över de fullständiga mönster som genereras. C) representativa fluorescerande bilder som visar mönskningsdefekter i ligand på glas täckglaset. Dessa beror på vanliga fel i protokollet, såsom läckage av ligand lösning utanför den mönstrade geometrin (överst, pilen indikerar platsen för läckage), och svällning av luftbubblor inuti de mönstrade geometrier av stencilen vid tillsats av ligand lösning ( nedre, pilen indikerar plats för luftbubbla). Alla skalstreck = 500 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: hESCs-sådd på mönstrade polyakrylamidhydrogels. Representativa brightfield bilder som visar framgångsrik sådd av hESCs på polyakrylamidhydrogels med mönstrad ligand. Tidslinjen högst upp anger den serie av medie ändringar som används för att ta bort okopplade celler och späda ut Y27632. Observera att efter inledande sådd, celler fäster stokastiskt till olika regioner inom den mönstrade ligand och sedan förgöra att fylla de mönstrade regionerna under loppet av 72 h. Scale bar = 500 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: regional lokalisering av dragkrafts spänningar och immunofärgning av slutna hESC-kolonier. A) fluorescerande bilder av mikrosfärer inom polyakrylamidhydrogel före och efter sådd av hESCs. (B) representativ partikel bild Velocimetri (PIV) Plot som skildrar förskjutning av mikrosfärer på grund av dragkraft spänningar (vänster) och motsvarande rekonstruerade dragkraft spänningar (höger). C immunofärgning av slutna hESC-kolonier på mönstrade polyakrylamidhydrogeler, som visar förmåga att jämföra lokalisering av proteiner av intresse för dragkrafts spänningar. Alla skalstreck = 200 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: icke-ideala resultat som genereras av alternativa metoder och fel. A) representativa fluorescerande bilder av ECM ligand som mönstrat på syraftvättade täckglas via mikrokontakttryckning. B) brightfield-bilder av hESCs som inte bildar färdigställda kolonier på grund av otillräcklig efterlevnad av cellerna. Stora luckor kvar i kolonierna vid 24 h efter sådd (pilar) är en tidig indikator på denna fråga. C) brightfield-bilder av hESCs som inte bildar slutna kolonier på grund av fel i mönster som ledde till närvaro av ligand utanför de önskade geometrier. Alla skalstreck = 500 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Exempel SU8 wafer Fabrication
1. spin Coat wafer med SU8-3050 Snurra på 1 000 RPM för 30 s
2. mjuk Grädda wafer på värmeplattan i. 3 min vid 65 ° c
II. 45 min vid 95 ° c
III. 3 min vid 65 ° c
IV. kyla till rumstemperatur
3. exponera i mask Aligner i. rikta in Wafer och photomasken i mask Aligner
Ii. Exponera med energi av 250 mJ/cm2
• T. ex. för lampa med en intensitet på 11 mW/cm2, exponera för 23 s
4. efter exponering baka på värmeplattan i. 1 min vid 65 ° c
II. 15 min vid 95 ° c
III. 1 min vid 65 ° c
Iv. Kyla till rumstemperatur
5. utveckla i. agitera i SU8 utvecklare, ca. 5-10 min
Ii. Kontrollera utvecklingen med isopropylalkohol (IPA)
• Om under-utvecklad, IPA skölj kommer att producera en vit rester
6. Hard baka på värmeplattan (tillval) 1-2 h vid 150 ° c

Tabell 1: exempel SU8 wafer Fabrication Protocol. Kisel rån som används för att generera PDMS frimärken och efterföljande stenciler var fabricerade med hjälp av de steg som beskrivs i denna tabell. Detta protokoll har genererats med hjälp av SU8 3000 datablad i syfte att skapa en filmtjocklek på cirka 100-250 μm.

Beredningar av polyakrylamidgel
Volymer för 1 mL komplett lösning
Elastisk modulus (PA) Slutlig% akrylamid Slutlig% BIS-akrylamid ddH2O (μl) 40% akrylamid (μL) 2% bis-akrylamid (μL) 10X PBS (μL) 1% TEMED i ddH2O (μl) Mikrosfärer 0,5% fasta ämnen i ddH2O (μl) 1% PPS i ddH2O (μl)
1050 3 0,1 565 75 50 100 75 60 75
2700 7,5 0,035 485 187,5 17,5 100 75 60 75
4000 7,5 0,05 477,5 187,5 25 100 75 60 75
6000 7,5 0,07 467,5 187,5 35 100 75 60 75

Tabell 2: beredningar av polyakrylamidgel. Volymer av komponenter för att generera polyakrylamidhydrogels av olika elastiska moduli med fluorescerande mikrosfärer för TFM. Volymer kan skalas upp eller ned baserat på mängden polyakrylamidlösning som behövs. Alla komponenter utom fluorescerande mikrosfärer och PPS blandas ihop före avgasning. PBS = fosfatbuffrad saltlösning, TEMED = tetrametylethylendiamamin, PPS = kaliumpersulfat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

För att förenkla ett långt och detaljerat protokoll består denna metod av tre kritiska steg: 1) generera mönster av ECM ligand på glas täckband, 2) överföra mönstren till polyakrylamidhydrogels under polymerisation av gelen och 3) seedning av hESCs på mönstrad hydrogel. Det finns kritiska steg som måste övervägas vid var och en av dessa tre stadier. För att generera High-Fidelity mönster på glaset täckband, måste stencilen pressas fast på täckglas för att förhindra läckage av ligand lösning och alla luftbubblor måste avlägsnas efter att ha lagt ligand lösning på ytan av stencilen ( Figur 1C). Om ligand-lösningen läcker ut genom stencilen på grund av dålig kontakt med täckslip, kommer ligand att överföras till hela ytan av polyakrylamidhydrogel och hESCs kommer inte att begränsas till den önskade kolongeometrin (figur 4C). Det viktigaste steget i att överföra den mönstrade ligand till polyakrylamid är försiktigt separera den övre täckslip från hydrogel medan alla komponenter förblir nedsänkt i PBS. Om Hydrogelen inte förblir nedsänkt under separationen kan mönstren förstöras helt. Dessutom, om separationen sker för snabbt, kan hydrogelens yta Riva eller skadas på annat sätt. Ju mjukare hydrogel, desto mer är det i riskzonen för skador under separation. Slutligen måste användaren Pipettera mycket noggrant vid utbyte av media under sådd och odling av hESCs på de mönstrade hydrogeler. HESCs förblir löst under hela protokollet och de mönstrade kolonierna kan lätt störas av slarvig eller rusade pipettering.

Förutom de kritiska stegen som diskuteras ovan finns det ett antal andra steg som kan kräva modifiering och felsökning när detta protokoll anpassas för olika tillämpningar. Medan de mönster som visas här är på längden skalan av hundratals mikrometer till en millimeter, genererar mönstrade funktioner på kisel rån med transparens photomfrågar och negativ fotoresist möjliggör funktions storlekar hela vägen ner till 7-10 μm. Detta protokoll kan därför anpassas för att begränsa geometrin hos enstaka celler eller mindre kolonier av några celler på överensstämmande substrat.

Två parametrar som sannolikt kommer att kräva optimering vid anpassning av detta protokoll för olika celltyper är den typ av ECM ligand som används och koncentrationen av ligand i lösning under adsorption till glaset täckglas genom stencilerna. En total ligand-koncentration på 250 μg/mL räckte för att framställa homogena mönster av matrigel och underlätta fastsättning av hESCs (figur 1B och figur 2), även om det kan vara möjligt att uppnå liknande resultat med lägre Koncentrationer. Å andra sidan kan det vara nödvändigt att ytterligare öka koncentrationen av ligand för celltyper som är mindre anhängare eller för tillämpningar som kräver kortare inkubationstider. Ökad koncentration av ligand kan också krävas för olika ECM-ligander, såsom Fibronektin eller kollagen, som är mindre hydrofoba än matrigel och därför inte kan adsorberas till hydrogel lika starkt. Eftersom överföringen av ligand från täckslip till hydrogel sker under polymerisation av hydrogel, används ofta tekniker för robust tvärbindning av ECM ligand till hydrogel ytan (såsom sulfo-sanpah behandling) är omöjliga. Att använda fluorescently-märkta ECM-ligander för att möjliggöra visualisering av mönstren vid varje steg i protokollet är mycket användbart när du optimerar och felsöker dessa parametrar.

Dessutom kan protokollet för seedning celler kräva optimering beroende på celltyp och media villkor som används. För celler som fäster snabbare eller effektivare, en lägre sådd densitet kan krävas för att förhindra cell-cell sammanväxningar som spänner mellan mönster och resultera i aggregat snarare än mönstrade enskiktslager kolonier. För celler som uppvisar mycket dålig infästning kan en större seeddensitet eller längre tid före den initiala medie växlingen krävas för att underlätta fullständig bildning av slutna kolonier (figur 4B).

Den viktigaste begränsningen av denna metod är dess tekniska komplexitet, vilket resulterar i relativt låga genomströmnings resultat jämfört med liknande metoder som involverar odling av celler på mönstrade glas substrat8. Denna nackdel är emellertid mycket större än den fysiologiska relevans som uppnås genom odling av slutna hESC-kolonier på överensstämmande substrat. Genom att effektivt rekapitulera de mekaniska egenskaperna hos det tidiga embryot, kan vi bättre modellera och förstå de processer som leder till självorganisering av de primära bakterie lagren.

En ytterligare fördel med att begränsa hESC-kolonierna på polyakrylamidhydrogels är att det möjliggör användning av TFM för att undersöka sambandet mellan organisationen av en hESC-koloni, som en förebild för det tidiga embryot, och distributionen av cellgenererade krafter som kan ligger bakom morfogenes och cell Fate specifikation. Att begränsa hESC-kolonier resulterar i fördelningar av dragkrafts spänningar som är beroende av kolonigeometri (figur 3B). Trots icke-enhetlighet i dessa dragkraft spänningar, celler i hela kolonier förbli pluripotenta i underhållsförhållanden (figur 3C). Men vi hypotes att Traction stress distributioner kan vara inblandade i regleringen mönster av cell öde specifikation genom att trimma svaret på induktion ledtrådar, såsom lösliga morfogener. Vi räknar med att denna metod kommer att göra det möjligt för oss och andra grupper att bättre modellera det tidiga mänskliga embryot med hESCs, vilket leder till en mer fullständig förståelse av de grundläggande processerna som ligger bakom människans embryogenes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill gärna bekräfta finansieringen från CIRM Grant RB5-07409. J.M.M. skulle vilja tacka FuiBoon Kai, Dhruv thakar, och Roger Oria för olika diskussioner som guidade generering och felsökning av denna metod. J.M.M. också tack UCSF Discovery Fellowship för det fortsatta stödet för sitt arbete.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin Gibco 25300054
100 mm glass petri dish Fisher Scientific 08-747B
100 mm plastic petri dish Fisher Scientific FB0875712
15 mL conical-bottom tubes Corning 352095
150 mm plastic petri dish Fisher Scientific FB0875714
18 mm diameter #1 coverslips Thermo Scientific 18CIR-1
2% bisacrylamide Bio-Rad 161-0142
3-aminopropyltrimethoxysilane ACROS Organics 313251000
40% acrylamide Bio-Rad 161-0140
Aluminum foil Fisher Scientific 01-213-100
Basic fibroblast growth factor Sigma-Aldrich F0291
Bleach Clorox N/A
Centrifuge with swing-buckets Eppendorf 22623508 Model: 5804 R
Collagen Corning 354236
Dessicator Fisher Scientific 08-642-7
Ethanol Fisher Scientific AC615095000
Fetal bovine serum Gibco 16000044
Fluorescent microspheres Thermo Scientific F8821
Forceps (for coverslips) Fisher Scientific 16-100-122
Forceps (for wafers) Fisher Scientific 17-467-328
Gel holders N/A N/A Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request
Glutaraldehyde Fisher Scientific 50-261-94
HEPES Thermo Scientific J16926A1
Hot plate Fisher Scientific HP88854100
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144S-500
Isopropyl alcohol Fisher Scientific A416-500
Kimwipes (delicate task wipes) Kimberly-Clark Professional 34120
Knockout serum replacement Gibco 10828028
Knockout-DMEM Gibco 10829018
Mask aligner (for photolithography) Karl Suss America, Inc. Karl Suss MJB3 Mask Aligner
Matrigel Corning 354277
Microscope for traction force Nikon N/A Model: Eclipse TE200 U
Motorized positioning stage Prior Scientific N/A Model: HLD117
Nitrogen gas Airgas NI 250
Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) Norland Products NOA 74
Oven Thermo Scientific PR305225G
Parafilm (laboratory film) Fisher Scientific 13-374-12
PDMS (Sylgard 184) Fisher Scientific NC9285739
Photomask CAD/Art Services, Inc. N/A Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request
Plasma cleaner Fisher Scientific NC9332171
Plastic for gasket Marian Chicago HT6135
Plastic for spacer TAP Plastics N/A Polycarbonate sheet, .01 inch thickness
Potassium chloride (for making PBS) Fisher Scientific P217-500
Potassium phosphate monobasic (for making PBS) Fisher Scientific P285-500
Pottassium persulfate ACROS Organics 424185000
Scalpel Fisher Scientific 14-840-00
Silicon wafer Electron Microscopy Sciences 71893-06 Type P, 3 inch, silicon wafers
Sodium chloride (for making PBS) Fisher Scientific S271-1
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) Fisher Scientific S472-500
SU8-3050 Photoresist MicroChem SU8-3000
SU8-Developer MicroChem Y020100
TEMED Bio-Rad 161-0800
UV-sterilization box Bio-Rad N/A Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber
Y27632 (Rho kinase inhibitor) StemCell Technologies 72304

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
  2. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
  3. Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
  4. Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9, (3), 032001 (2017).
  5. Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22, (3), 294-297 (2018).
  6. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6, (2), 88-95 (2000).
  7. Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mace, K., Braun, K. 916, Humana Press. Totowa, NJ. 317-350 (2012).
  8. Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11, (8), 847-854 (2014).
  9. Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
  10. Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19, (4), 462-475 (2016).
  11. Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
  12. Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8, (208), 1-15 (2017).
  13. Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
  14. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, (5391), 1145-1147 (1998).
  15. Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
  16. Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18, (3), 311-318 (2016).
Mönster av geometrin hos humana embryonala stamcells kolonier på överensstämmande substrat för att kontrollera vävnadsnivå mekanik
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Muncie, J. M., Falcón-Banchs, R., Lakins, J. N., Sohn, L. L., Weaver, V. M. Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics. J. Vis. Exp. (151), e60334, doi:10.3791/60334 (2019).More

Muncie, J. M., Falcón-Banchs, R., Lakins, J. N., Sohn, L. L., Weaver, V. M. Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics. J. Vis. Exp. (151), e60334, doi:10.3791/60334 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter