Summary
Ekstracellulære matrise ligander kan være mønstret på polyakrylamid hydrogeler å aktivere kulturen i menneskets embryonale stamceller i trange kolonier på kompatible underlag. Denne metoden kan kombineres med traction Force mikroskopi og biokjemiske analyser for å undersøke samspillet mellom vev geometri, celle-genererte krefter, og skjebne spesifikasjon.
Abstract
Human embryonale stamceller demonstrere en unik evne til å reagere på morphogens in vitro av selv-organisering mønstre av celle skjebne spesifikasjon som tilsvarer primære bakterie lag formasjon under embryogenesis. Dermed disse cellene representerer et kraftig verktøy som å undersøke mekanismer som driver tidlig menneskelig utvikling. Vi har utviklet en metode for å kultur menneskelige embryonale stamceller i trange kolonier på kompatible underlag som gir kontroll over både geometrien av koloniene og deres mekaniske miljø for å recapitulate de fysiske parametrene som ligger til grunn embryogenesis. Nøkkelen ansiktstrekk av denne metoden er evnen å utvikle polyakrylamid hydrogeler med definerte mønstre av ekstracellulære matrise ligand for overflaten å fremme cellen feste. Dette oppnås ved fabrikere sjablonger med ønsket geometriske mønstre, ved hjelp av disse sjablonger for å lage mønstre av ekstracellulære matrise ligand på glass coverslips, og overføre disse mønstrene til polyakrylamid hydrogeler under polymerisering. Denne metoden er også kompatibel med traction Force mikroskopi, slik at brukeren kan måle og kartlegge fordelingen av celle-genererte krefter innenfor trange kolonier. I kombinasjon med standard biokjemiske analyser, kan disse målingene brukes til å undersøke rollen mekaniske signaler spille i skjebne spesifikasjon og morphogenesis under tidlig menneskelig utvikling.
Introduction
Human embryonale stamceller (hESCs) holder store løftet for bruk i regenererende medisin og vev engineering applikasjoner. Den pluripotent natur disse cellene gir dem muligheten til å differensiere til enhver voksen celle type. Mens store fremskritt har blitt gjort i regi skjebnen til hESCs til bestemte celletyper, har det vært svært vanskelig å generere hele vev eller organer de Novo1,2,3,4, fempå. Dette skyldes, i stor grad, til en begrenset forståelse av mekanismene som driver dannelsen av disse vev under menneskelig utvikling. For å fylle dette gapet i kunnskap, en rekke metoder har dukket opp de siste årene for å modellere tidlig embryo og påfølgende stadier av utviklingen med embryonale stamceller6,7,8,9 ,10,11,12,13.
Kort tid etter avledning av de første hESC linjene14, ble det demonstrert at embryoid kropper dannet fra hESCs var i stand til spontant å produsere celler av de tre primære bakterie lag6. Men på grunn av iboende mangel på kontroll over størrelsen og morfologi av embryoid kropper, organisering av bakterie lag varierte betydelig og klarte ikke å matche organiseringen av tidlig embryo. Flere nylig, Warmflash et al. utviklet en metode for å begrense kolonier av hESCs på glass underlag via micropatterning, gi kontroll og konsistens over størrelsen og geometrien av koloniene8. I nærvær av BMP4, en viktig morphogen i tidlig utvikling, var disse trange kolonier i stand til selv-organisering reproduserbar mønstre av spesifikasjonen til skjebnen representerer den primære bakterie lag. Selv om dette ga en nyttig modell for å studere mekanismene som primære bakterie lag er etablert, mønstrene av skjebne spesifikasjonen ikke nøyaktig samsvarer med organisasjonen og morphogenesis observert under embryogenesis15. En mer trofast recapitulation av tidlig embryoutvikling ble oppnådd ved å innlemme hESCs i en tredimensjonal ekstracellulære matrise (ECM) av matrigel11, og gir den sterkeste bevis hittil for evnen til hESCs å selv-organisere og modell tidlige stadier av embryogenesis ex vivo. Imidlertid gir denne metoden inkonsekvente resultater og er dermed uforenlig med en rekke analyser som kan brukes til å avdekke de underliggende mekanismene for selv-organisering og skjebne spesifikasjon.
Gitt disse eksisterende metoder og deres respektive begrensninger, forsøkte vi å utvikle en metode for reproduserbar dyrking hESC kolonier av definert geometri i forhold som modell ekstracellulære miljøet på tidlig embryo. For å oppnå dette, brukte vi polyakrylamid hydrogeler av tunable elastisitet for å kontrollere de mekaniske egenskapene til underlaget. Ved hjelp av Atomic Force mikroskopi på gastrulation-scenen kylling embryo, fant vi ut at elastisiteten i epiblast varierte fra hundrevis av Pascal til noen kilopascal. Derfor fokuserte vi på å generere polyakrylamid hydrogeler med elastisitet i dette området for å tjene som underlaget for hESC kolonier. Vi endret våre tidligere metoder for dyrking hESCs påpolyakrylamid hydrogeler å gi robust kontroll over geometrien av koloniene. Vi oppnådde dette ved første mønster ECM ligander, nemlig matrigel, på glass coverslips gjennom microfabricated sjablonger, som tidligere rapportert16. Deretter utviklet vi en ny teknikk for å overføre den mønstrede ligand til overflaten av polyakrylamid hydrogeler under polymerisering. Metoden vi beskriver her innebærer å bruke foto litografi å dikte opp en silisium wafer med ønsket geometriske mønstre, lage frimerker av teser geometriske funksjoner med Polydimethylsiloxan (PDMS), og bruke disse stemplene til å generere sjablonger som til slutt tillate mønstre av ligand på overflaten av glass coverslips og overføre til polyakrylamid.
I tillegg til å recapitulating den mekaniske miljø av tidlig embryo, confining hESC kolonier på polyakrylamid muliggjør måling av celle-genererte krefter med traction Force mikroskopi (TFM), som rapportert i vår forrige metode9. I korte trekk kan fluorescerende perler bygges inn i polyakrylamid og brukes som fiducial markører. Celle-genererte krefter beregnes ved tenkelig forskyvning av disse perlene etter seeding hESCs på mønstret substrat. Videre kan de resulterende traction Force kart kombineres med tradisjonelle analyser, for eksempel immunostaining, for å undersøke hvordan fordelingen av celle-genererte styrker i trange hESC kolonier kan regulere eller modulere nedstrøms signalering. Vi forventer at disse metodene vil avdekke at mekaniske krefter spiller en avgjørende rolle i mønstre av celle skjebne spesifikasjon under tidlig embryoutvikling som er oversett.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder som er beskrevet her knyttet til bruk av hESCs har blitt godkjent av Human Kjønnscelle, embryo og Stem Cell Research (GESCR) Committee ved University of California San Francisco.
1. utarbeidelse av silisium wafer med geometriske funksjoner
- Lag en photomask med ønskede geometriske funksjoner. Bruk dataassistert tegning programvare for å designe funksjonene. Hvis du vil bruke negative photoresist, må du gjøre funksjonene ugjennomsiktige og resten av masken gjennomsiktige.
Merk: for mønstre på 18 mm diameter coverslips, kan gruppe funksjoner for hver eksperimentelle tilstand i områder på 10 x 10 mm sikre at sjablongene som genereres i trinn 3, passer på coverslips. - Spin coat negativ photoresist på en 100 mm silisium wafer. Bruk photoresist datablad for å bestemme hastigheten og lengden på spin for å generere en filmtykkelse på 100-250 μm.
Merk: filmtykkelsen bør justeres slik at størrelsesforholdet mellom bredden på mønstrene til høyden på sjablongen er så nær 1:1 som mulig. Men vi anbefaler en minimum tykkelse på 100 μm, som noe mindre produserer delikate sjablonger som lett rive. - Behandle photoresist i henhold til produktdata arket. Dette innebærer vanligvis en myk bake, UV eksponering med photomask i en maske aligner, post eksponering bake, utvikling, og hard bake. Som et eksempel er fremgangsmåten som brukes til å behandle wafere som brukes i denne protokollen, beskrevet i tabell 1.
Merk: Vær forsiktig når du håndterer silisium wafere som de er skjøre. Når wafere er generert, kan de brukes flere ganger, så lenge de ikke er skadet.
2. utarbeidelse av coverslips
-
Utarbeidelse av syre-vasket "topp" coverslips
- Plasser 18 mm diameter #1 tykkelse coverslips i et glass Petri parabolen. Det riktige antall coverslips avhenger av størrelsen på fatet. For en 100 mm rett, Forbered 50-100 coverslips om gangen. Volum beløpene gitt gjennom resten av denne delen tilsvarer en 100 mm parabol.
- Tilsett 20 mL av 1 M HCl til Petri fatet og rist parabolen for å spre coverslips. Sørg for at alle coverslips er neddykket og frigjør luftbobler fra mellom coverslips. Ruge over natten ved romtemperatur med lett risting.
FORSIKTIG: HCl er syrlig og etsende. Vær forsiktig og bruk egnet PPE mens du arbeider med HCl. - Dekanter HCl fra fatet. Tilsett 20 mL ultrarent vann og vask med skånsom risting i 10 min. kast vann og gjenta for totalt fem vasker.
- Etter å kaste den siste vask, tilsett 20 mL av 100% etanol til parabolen. Bruke tang, fjerne coverslips individuelt og ordne mellom to stykker av filter papir til tørk.
- Oppbevar tørket coverslips i en forseglet beholder. Syre-vasket coverslips kan tilberedes på forhånd og lagres i en måned eller lenger i støv-fri forhold.
-
Tilberedning av glutaraldehyde-aktivert "bunn" coverslips
Merk: se tidligere metoder for ytterligere detaljer7,9.- Plasser 18 mm diameter #1 tykkelse coverslips i en Petri parabolen.
- Tilsett 20 mL 0,2 M HCl til Petri fatet og rist parabolen for å spre coverslips. Sørg for at alle coverslips er neddykket og frigjør luftbobler fra mellom coverslips. Ruge over natten ved romtemperatur med lett risting.
- Dekanter HCl fra fatet. Tilsett 20 mL ultrarent vann og vask med skånsom risting i 10 min. kast vann og gjenta for totalt fem vasker.
- Etter å ha forkaster den siste vasken, tilsett 20 mL 0,1 M NaOH og rist forsiktig for å spre og senk coverslips. Ruge ved romtemperatur med lett risting i 1 time.
- Dekanter NaOH fra fatet. Tilsett 20 mL ultrarent vann og vask med skånsom risting i 10 min. kast vann og gjenta for totalt fem vasker.
- Etter å kaste den siste vask, tilsett 20 mL av en 1:200 fortynning av 3-aminopropyltrimethoxysilane i ultrarent vann og rist forsiktig for å spre og senke coverslips. Ruge ved romtemperatur med skånsom risting i 1 time eller over natten.
FORSIKTIG: 3-aminopropyltrimethoxysilane er brannfarlig og kan forårsake hudirritasjon. Håndter med forsiktighet, Bruk egnet PPE og kast avfallet i henhold til lokale forskrifter for avhending. - Dekanter den fortynnede 3-aminopropyltrimethoxysilane-løsningen fra fatet. Tilsett 20 mL ultrarent vann og vask med skånsom risting i 10 min. kast vann og gjenta for totalt minst fem vasker. Det er viktig å fjerne alle 3-aminopropyltrimethoxysilane før du fortsetter.
- Etter å ha forkaster den siste vasken, tilsett 20 mL av en 1:140 fortynning av 70% glutaraldehyde i fosfat bufret saltvann (PBS) og rist forsiktig for å spre og senke coverslips. Ruge ved romtemperatur med skånsom risting i 1 time eller over natten.
FORSIKTIG: 70% glutaraldehyde er giftig og kan forårsake hudirritasjon. Håndter med forsiktighet, Bruk egnet PPE og kast avfallet i henhold til lokale forskrifter for avhending. - Dekanter den fortynnede glutaraldehyde løsningen fra fatet. Tilsett 20 mL ultrarent vann og vask med skånsom risting i 10 min. kast vann og gjenta for totalt fem vasker.
- Etter å ha forkaster den siste vasken, tilsett 20 mL 100% etanol. Bruke tang, fjerne coverslips individuelt og ordne mellom to stykker av filter papir til tørk.
- Oppbevar tørket coverslips i en forseglet beholder. Glutaraldehyde-aktiverte coverslips kan tilberedes på forhånd og oppbevares i opptil seks måneder.
3. generering av sjablonger for mønster ECM ligand
- Generere Polydimethylsiloxan (PDMS) mellomliggende stempler
- Bland PDMS base med PDMS herding agent på et 10:1 forhold, etter vekt. Bland godt.
Merk: for den første anvendelsen av PDMS, forberede ca 100 g PDMS å fylle en 100 mm parabolen. For senere programmer, fjerne PDMS fra bare midten av fatet der silisium wafer funksjonene er plassert og forberede 20-30 g nye PDMS. - Degas den PDMS blandingen i en desikator for 30-60 min eller til alle luftbobler er fjernet.
- Plasser den modifiserte silisium wafer fra trinn 1 i en plast 100 mm rett. Hell sakte og jevnt PDMS-blandingen over overflaten på platen. Trykk på parabolen på arbeidsflaten for å løsne eventuelle luftbobler fra overflaten av platen.
- Degas den PDMS blandingen helles over platen i 10 min eller til alle luftbobler er fjernet eller har kommet til overflaten av PDMS.
- Bake PDMS ved 70 ° c for 2 h. la avkjøles til romtemperatur.
- Ved hjelp av en skalpell eller boks kutter, klippe ut den delen av PDMS fra midten av fatet som inneholder de geometriske funksjoner.
- Skjær PDMS i ca 10 x 10 mm firkanter, hver med funksjoner for en enkelt eksperimentell tilstand. Disse er referert til som "frimerker" i etterfølgende trinn av protokollen.
- Bland PDMS base med PDMS herding agent på et 10:1 forhold, etter vekt. Bland godt.
- Generere flate plater av PDMS
- Bland PDMS base med PDMS herding agent på et 8:1 forhold, etter vekt. Forbered ca 20 g for hver 100 mm rett som skal brukes. Bland godt.
- Degas den PDMS blandingen i en desikator for 30-60 min eller til alle luftbobler er fjernet.
- Hell PDMS langsomt og jevnt i en ren 100 mm rett. Trykk på parabolen på arbeidsflaten for å løsne eventuelle luftbobler.
- Bake PDMS ved 70 ° c for 2 h. la avkjøles til romtemperatur.
- Fjern PDMS fra fatet. Inverter slik at overflaten av PDMS som var i kontakt med bunnen av fatet vender opp.
- For hvert stempel som genereres i trinn 3,1, klipper du ut et 15 x 15 mm kvadrat av PDMS. Disse er referert til som "flat plater" i påfølgende trinn av protokollen.
- Generere sjablonger
- Ordne flate plater av PDMS på lokket på en 150 mm parabol, eller andre flatt underlag for enklere håndtering. Sørg for tilstrekkelig avstand mellom plater (f. eks, for en 150 mm parabol, arrangere ni flate plater med jevn avstand).
- Inverter hvert stempel generert i trinn 3,1 på en flat skive av PDMS, slik at funksjonene på stempelet er i kontakt med flatt plate av PDMS. Trykk forsiktig på toppen av stempelet med tang for å sikre jevn kontakt.
- Forsiktig prop lokket holder PDMS stempel/skive parene opp på bunnen av fatet, slik at lokket hviler i en vinkel. Dette hjelper til med å fukttransport av UV-kureres polymer i neste trinn.
- Plasser en liten dråpe UV-kureres polymer på toppen grensesnittet av hvert stempel/skive par. Den polymer vil være onde mellom de to ved overflaten spenning, assistert av tyngdekraften.
Merk: mange forskjellige UV-kureres polymerer kan fungere i denne protokollen. Vi valgte Norland optisk lim 74 for følgende egenskaper: i) rask herding ved eksponering for UV-lys, II) enkel fjerning fra PDMS frimerker ved herding, III) robust vedheft til glass coverslips med manuelt trykk. - Når polymer har vært helt ugudelige gjennom, plasserer lokket med stempel/skive parene flatt på arbeidsflaten. Plasser en liten dråpe UV-kureres polymer på hver av de resterende tre sider av hvert stempel/skive grensesnitt.
- Ved hjelp av en 200 μL pipette spissen, koble dråpene av polymer rundt kantene av stempel/skive grensesnitt. Dette oppretter en kantlinje som vil inneholde ligand løsning i trinn 4.
Merk: Vær forsiktig når du arbeider polymer rundt kantene av stempelet. Hvis stempel/skive grensesnittet er forstyrret, vil polymer Wick underfunksjonene og sjablongen vil ikke danne riktig. - Plasser stempel/plate parene forsiktig inn i en UV-sterilisering boks. Bruk den sterile strøminnstillingen "str" og utsett den i 10 minutter.
- Fjern parene for stempel/skive fra UV-steriliserings boksen. Ved hjelp av to par tang, forsiktig fjerne PDMS stempel mens du holder nede flatt plate og sjablong som dannes fra UV-kureres polymer.
- Ved hjelp av tang, forsiktig fjerne sjablongen og invertere det slik at overflaten som var i kontakt med flat skive av PDMS vender opp.
Merk: sjablongene er delikate. Vær forsiktig mens overlate dem, spesielt mens utgangspunktet fjerne dem fra PDMS, slik at de ikke rive. - Plasser de omvendte sjablongene tilbake i en UV-sterilisering boks. Bruk den sterile "str"-strøminnstillingen og utsett den i 3 min.
4. mønstre ECM ligand på coverslips
-
Trykke sjablonger på syre-vasket coverslips
- Plasser en syre-vasket dekkglass for hver sjablong på et rent stykke laboratorie film.
- Ved hjelp av tang, nøye plassere hver sjablong, flat-side-ned, på en syre-vasket dekkglass. Plasser slik at funksjoner er sentrert på dekkglass.
- Plasser et lite stykke laboratorie film på toppen av hver sjablong. Trykk fast og jevnt ned på sjablongen for å skape sterk kontakt mellom sjablongen og dekkglass.
Merk: Dette er et kritisk trinn! Trykk bestemt og på tvers av hele overflaten av sjablongen. Hvis det ikke opprettes tilstrekkelig kontakt, vil den ligand løsningen lekke mellom sjablongen og coverslips, og mønsteret vil mislykkes. Valgfritt: for å bekrefte tilstrekkelig kontakt mellom sjablongen og dekkglass, Pipetter 100 μL av ultrarent sterilt vann på overflaten av hver sjablong og ruge ved romtemperatur. Etter 1 time, sjekk for lekkasje. Aspirer vann fra vellykket limt sjablonger og fortsette.
-
Plasma rensing av stensilert coverslips overflate for å øke hydrofiliteten
- Plasser coverslips med sjablonger i en plasma renere. Påfør høy effekt plasma for 30 s.
-
Utarbeidelse av ECM-ligand løsning
Merk: alle påfølgende trinn skal utføres i sterile tilfeller hvis det er mulig.- Plasser steril 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8,0-løsning på is. Når isen er kald, tilsett matrigel og kollagen for å oppnå konsentrasjoner av henholdsvis 225 μg/mL og 25 μg/mL. Valgfritt: for feilsøking eller for ligand visualisering, Inkluder en fluorescensmerkete tagget ligand i den ligand løsningen.
- Merk: ulike ECM-ligander kan brukes med denne metoden. For ulike ligander kan det kreves ytterligere optimering for å bestemme ideell konsentrasjon, inkubasjonstid og inkubasjons temperatur. Se diskusjons delen for mer informasjon.
- Pipetter den ligand løsningen på overflaten av hver sjablong. For sjablonger laget av 10 x 10 mm firkantede frimerker, Påfør 100 μL per sjablong.
- Se etter luftbobler i sjablong funksjoner. Hvis det er nødvendig, bruk en fin spiss tang eller en 2 μL pipette tupp for å fjerne luftbobler fra funksjoner.
Merk: Dette er et kritisk trinn! Hvis luftbobler forblir fanget på overflaten av dekkglass, vil ligand ikke adsorbere til overflaten og det resulterende mønsteret vil være ufullstendig. - Plasser stensilert coverslips med ligand i en tallerken, Pakk med laboratorie film, og ruge ved 4 ° c over natten.
- Plasser steril 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8,0-løsning på is. Når isen er kald, tilsett matrigel og kollagen for å oppnå konsentrasjoner av henholdsvis 225 μg/mL og 25 μg/mL. Valgfritt: for feilsøking eller for ligand visualisering, Inkluder en fluorescensmerkete tagget ligand i den ligand løsningen.
5. overføring av ligand til polyakrylamid gel
- Fjerning av ligand oppløsning og sjablong fra hver dekkglass
- Aspirer den ligand løsningen fra overflaten av en sjablong. Ligand løsning kan samles og oppbevares ved 4 ° c og gjenbrukes i opptil en måned.
- Bruke tang, kort Senk dekkglass med sjablong inn i en tallerken som inneholder sterile PBS å vaske.
- Senk kort dekkglass med sjablong inn i en annen rett av steril PBS å vaske.
- Fjern sjablongen fra dekkglass overflate. Pass på å ikke bryte dekkglass.
- Senk kort dekkglass inn i en tallerken som inneholder ultrarent sterilt vann for å fjerne salter fra PBS-vasken. Trykk på kanten av dekkglass til en delikat oppgave tørke for å isolere bort overflødig vann.
- Tørk dekkglass under en inert gass, for eksempel nitrogen. Merk undersiden av dekkglass for å holde rede på orientering fra nå av. Pass på å holde mønstret side vendt opp.
- Gjenta trinn 5.1.1 gjennom 5.1.6 for hver stensilert dekkglass.
- Making polyakrylamid hydrogeler med mønstret coverslips
Merk: se tidligere metoder for ytterligere detaljer7,9 sterilisere alle cap holdere, rør og avstandsstykker brukes til å lage polyakrylamid gels ved å vaske med 10% blekemiddel over natten, skyll med vann minst fem ganger for å fjerne blekemiddel, og vask kort i 70% etanol. Plasser alle brikkene på delikat aktivitet kluter i et sterilt biosafety kabinett tørke før bruk.- Forbered polyakrylamid løsning for å oppnå ønsket hydrogel elastisitet (tabell 2). Bland sammen alle komponenter bortsett fra fluorescerende mikrosfærer og kalium persulfate (PPS).
Merk: Forbered 1% kalium persulfate løsning frisk hver gang. - Degas av polyakrylamid løsning, mikrosfærer, og PPS i separate rør under vakuum i 30 min.
- For hver mønstrede dekkglass, klargjør du en glutaraldehyde "Bottom" dekkglass med en spacer (18 mm ytre diameter, 14 mm indre diameter) plassert på toppen.
- Etter avgassing, kort sonikere mikrosfærer og legge passende volum til polyakrylamid løsning. Bland med pipettering opp og ned, å være forsiktig med å innføre luftbobler. Kort sonikere.
- Legg passende volum av PPS til polyakrylamid løsning. Pipetter opp og ned for å blande løsningen, og pass på at du ikke innfører luftbobler.
Merk: etter å ha lagt PPS, arbeide raskt for å fullføre trinn 5.2.6 gjennom 5.2.11 før polyakrylamid polymeriseres. - Pipetter 75-150 μL (avhengig av avstands tykkelse) til midten av hver glutaraldehyde-aktiverte dekkglass.
- Bruk pinsett til å plassere en mønstret dekkglass på hver glutaraldehyde-aktiverte dekkglass med polyakrylamid og spacer, slik at den mønstrede ligand vender mot polyakrylamid løsningen. Hvis det ble tilsatt tilstrekkelig polyakrylamid oppløsning, vil overflatespenningen transportere polyakrylamid mellom de to coverslips og ingen luftbobler vil være til stede.
- Plukk opp hver polyakrylamid "sandwich" og forsiktig berøre siden til en delikat oppgave tørk å isolere bort overflødig polyakrylamid løsning.
- Plasser hver polyakrylamid "sandwich" forsiktig inn i en cap holder med tråder som er kompatible med 15 mL konisk bunn rør. Orienteringen skal være slik at bunnen av glutaraldehyde dekkglass er i kontakt med bunnen av hetten holderen, og den mønstrede dekkglass er på toppen.
- Skru en 15 mL konisk bunn tube i hver cap holder for å holde polyakrylamid "smørbrød" på plass. Rørene skal være stramt for å hindre lekkasjer, men vær forsiktig så du ikke stram og knekke coverslips.
- Sentrifuger polyakrylamid "smørbrød" i rørene i sving-bøtter på 200 x g i 10 min ved romtemperatur. Fjern rørene fra sentrifuge og plasser i rør stativer for å opprettholde orientering for ytterligere 50 min for å sikre full polymerisering. Hold dekket med folie for å hindre bleking av fluorescerende mikrosfærer.
Merk: sentrifugering er kritisk når du bruker denne metoden til å utføre TFM. Sentrifugalkraften flytter alle mikrosfærer til et enkelt fly, som til slutt vil være like under overflaten av hydrogel. Dette er ideelt for Imaging mikrosfære forskyvninger som brukes til å beregne celle-genererte trekkraft påkjenninger. Hvis ikke utføre TFM, kan mikrosfærer bli utelatt av polyakrylamid løsning og polymerisering kan forekomme ved stasjonære uten sentrifugering. - Fjern polymerisert polyakrylamid "smørbrød" fra rørene og senk i PBS i en 100 mm rett. Wrap i laboratorie film og ruge i 3 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° c.
- Forbered polyakrylamid løsning for å oppnå ønsket hydrogel elastisitet (tabell 2). Bland sammen alle komponenter bortsett fra fluorescerende mikrosfærer og kalium persulfate (PPS).
- Utarbeidelse av mønstret gels for seeding celler
- Bruk en skalpell og tang for å forsiktig fjerne mønstrede dekkglass og avstandsstykket fra polyakrylamid "sandwich" mens det fortsatt er nedsenket i PBS. De mønstrede ligand vil ha blitt overført til polyakrylamid under polymerisering og vil forbli etter fjerning av dekkglass. Polyakrylamid gel vil forbli festet til den glutaraldehyde-aktiverte dekkglass.
Merk: Dette er et kritisk trinn! Polyakrylamid må være neddykket i PBS mens du fjerner dekkglass eller ligand mønstrene vil bli ødelagt. - Plasser hver dekkglass med mønstret polyakrylamid i en cap holder. Plasser en pakning (18 mm ytre diameter, 14 mm indre diameter) oppå dekkglass og rundt polyakrylamid, der avstandsstykket var plassert. Skru en saget-av 15 mm konisk bunn rør inn i hetten holderen, danner en brønn med mønstret polyakrylamid på bunnen. Disse samlingene passer inn i brønnene til en standard 12-brønn plate for enkel håndtering.
- Vask hver gel ved å legge 500 μL av PBS til brønnen forsamlingen. Ruge i 10 minutter ved romtemperatur med lett risting. Fjern PBS og gjenta to ganger for totalt tre vasker.
- Etter den siste PBS vask, tilsett 500 μL av knockout-DMEM medier til gels og ruge ved 37 ° c over natten. Gels kan oppbevares på 37 ° c med medier i opptil 5 dager før seeding celler.
- Dagen før seeding celler, erstatte knockout-DMEM for komplett KSR Media og ruge ved 37 ° c over natten.
- Bruk en skalpell og tang for å forsiktig fjerne mønstrede dekkglass og avstandsstykket fra polyakrylamid "sandwich" mens det fortsatt er nedsenket i PBS. De mønstrede ligand vil ha blitt overført til polyakrylamid under polymerisering og vil forbli etter fjerning av dekkglass. Polyakrylamid gel vil forbli festet til den glutaraldehyde-aktiverte dekkglass.
6. dyrking hESCs på mønstret gels
Merk: Hvis du planlegger å fikse prøver for immunostaining etter TFM, ta bilder av trykklette mikrosfære posisjoner før seeding celler. I dette tilfellet, fluorescensmerkete merket ligand burde bli brukt i takt 4.3.1 i den grad at det eventuelle plasseringene av celler ville være kjent tidligere seeding og mikrosfærer kan avbildet inne dem områder.
- Opprettholde lager hESC kulturer og sekundær mater-frie kulturer tilberedt på matrigel-belagte plater i conditioned KSR Media før seeding på mønstret polyakrylamid gels som tidligere beskrevet9.
Merk: Generer conditioned KSR Media ved dyrking bestrålt mus embryonale fibroblaster i KSR Media supplert med 4 ng/mL grunnleggende Fibroblast vekstfaktor (bFGF). Samle og erstatte Media hver 24 h. - Aspirer mediene fra hESCs. Vask en kort stund med knockout-DMEM-medier. Tilsett 0,05% Trypsin-EDTA supplert med 10 μM Y27632 (Rho kinase inhibitor) og ruge ved 37 ° c i 5-10 min.
- Legg til medier med serum for å hemme Trypsin. Forsiktig aspirer Media og pipette over fatet for å fjerne celler. Fortsett pipettering forsiktig for å fjerne alle celler og distansere celle klynger til enkeltceller.
- Samle celle fjæring og sentrifuger på 200 x g i 3 min.
- Aspirer supernatanten og resuspend pellet i et tilsvarende volum av KSR Media å vaske. Sentrifuger på 200 x g i 3 min.
- Aspirer supernatanten og resuspend pellet i conditioned KSR Media supplert med 10 ng/mL bFGF og 10 μM Y27632.
- Tell cellene med en hemocytometer og Juster celle fjæringen til en konsentrasjon på 300 000 celler per mL. Pipetter 500 μL av celle oppheng på hver mønstrede gel (150 000 celler per gel).
- 3 h etter såing, bruk en pipette for å nøye aspirer mediene fra hver gel og Erstatt med fersk conditioned KSR Media supplert med 10 ng/mL bFGF og 10 μM Y27632. Dette fjerner overflødige celler som ikke overholder mønstrede områder i polyakrylamid.
Merk: Dette er et kritisk trinn! På dette stadiet vil celler bli løst festet til den mønstrede ligand. Vær svært forsiktig når du bytter medium for å ikke koble fra cellene. Like forsiktighet bør tas med hver av Media bytteavtaler i de påfølgende trinnene. - 24 timer etter såing, bruk en pipette for å nøye aspirer mediene og bytte for conditioned KSR Media supplert med 10 ng/mL bFGF og 5 μM Y27632.
- 48 h etter såing, bruk en pipette for å nøye aspirer mediene og bytte for conditioned KSR Media supplert med 10 ng/mL bFGF. Dette fjerner Rho kinase inhibitor fra Media og eksperimenter kan begynne neste dag, 72 h etter seeding.
7. utføre TFM
- Når det er ønskelig, utføre TFM som tidligere beskrevet9 under ønskede eksperimentelle forhold.
- Hvis trykklette mikrosfære posisjoner ble avbildet før seeding celler, fikse cellene etter å ha tatt stresset mikrosfære posisjoner og utføre immunostaining å bestemme lokalisering av proteiner av interesse i forhold til områder med høy og lav trekkraft krefter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den største utfordringen å overvinne i forsøket på å kultur hESCs i kolonier av kontrollerte geometri på kompatible underlag er å generere et homogen mønster av ECM-ligand på overflaten av underlaget. Strategien som presenteres i denne metoden innebærer først å generere ønsket mønster på overflaten av et glass dekkglass og deretter senere overføre dette mønsteret til overflaten av en polyakrylamid hydrogel under polymerisering av gel (figur 1 A). således er det viktig å sikre at det ønskede mønsteret er opprettet på overflaten av glasset dekkglass før du fortsetter å polymerisering av hydrogel og overføring av mønsteret (figur 1B). Basert på Imaging av fluorescerende ligand mønstre overført til polyakrylamid, synes ligand å være til stede bare i et enkelt fly på overflaten av polyakrylamid, selv om vi ikke nøyaktig karakterisere tykkelsen på dette laget. Det er to vanlige typer defekter observert etter mønster generering på glass dekkglass, hver med sin egen feil kilde. Den første er utseendet av fluorescerende ligand strekker seg utover margene i ønsket mønster (figur 1C, topp), som skyldes lekkasjer av fluorescerende ligand løsning på grunn av en liten tåre i sjablongen eller utilstrekkelig tetting av sjablong til glasset dekkglass. Det andre er utseendet på en ufullstendig mønster (figur 1C, bunn), som vanligvis skyldes en luftboble fanget på dekkglass grensesnitt som hindrer absorpsjon av fluorescerende ligand.
Den ultimate mål på suksess for denne metoden er evnen til kultur hESCs i ønsket geometri på mønstrede hydrogeler (figur 2). For å oppnå dette, hESCs er sådd i en relativt høy tetthet (300 000 celler/mL) i nærvær av en Rho kinase inhibitor (Y27632) og inkubert for 3 h for å lette vedheft til mønstre av ligand. Media blir deretter erstattet for å fjerne celler som ikke er overholdt. I løpet av 72-h blir Y27632 gradvis utvannet av mediene av en serie medie utvekslinger ved 24 og 48 h post-seeding. Vanligvis hESCs sprer å fullføre mønstret geometri ved 48-72 h, slik at eksperimenter kan begynne på 72 h post-seeding, når Y27632 er helt fjernet fra Media.
Dyrking hESC kolonier i begrenset geometri på polyakrylamid hydrogeler tillater måling av celle-genererte trekkraft krefter ved hjelp av TFM. Disse målingene er gjort ved å bygge inn fluorescerende mikrosfærer i hydrogel og Imaging plasseringen av disse perlene før og etter seeding hESCs (Figur 3A). Forskyvning av perlene følgende celle seeding er en funksjon av celle-genererte krefter og elastisiteten av hydrogel, dermed bildene av perle posisjoner kan brukes til å generere kart av perle forskyvninger og senere brukes til å beregne den underliggende trekkraft påkjenninger. I sirkulære kolonier av hESCs, den største trekkraft påkjenninger er funnet i nærheten av perifere kanten av koloniene, mens sentrum av koloniene vise jevnt lav trekkraft påkjenninger (Figur 3B). Interessant, det høyeste trekkraft påkjenninger er funnet i klynger nær kanten av koloniene, i stedet for å danne en kontinuerlig ring av maksimal stress. Dette innebærer at selv om kolonien geometri spiller en nøkkelrolle i å bestemme fordelingen av trekkraft påkjenninger, mer lokaliserte regulering og tilbakemelding bestemmer nøyaktig plassering av maksimal stress. I tillegg, så lenge bildet av mikrosfære posisjoner uten overholdt celler er tatt før celle seeding, kan hESC kolonier festes for immunostaining av proteiner av interesse etter traction kraft målinger. Til tross for de observerte ikke-uniform distribusjoner av trekkraft påkjenninger, hESCs kultivert som mønstrede sirkler i vedlikeholds forhold viser ensartet uttrykk for pluripotency markør Oct3/4 og celle vedheft molekyl E-cadherin (Figur 3C ).
Den presenterte metoden for bruk av sjablonger for å generere mønstre av ligand er påviselig overlegen den vanlige teknikken for microcontact utskrift for den relativt store geometri som brukes i denne metoden (dvs. for sirkulære kolonier 1 mm i diameter, samt trekanter og kvadrater av tilsvarende område). Microcontact utskrift mønstre av ligand på denne lengden skalaen resulterer i heterogen overføring på kantene av mønstre, med svært lite ligand avsatt i de sentrale regionene av mønstrene (Figur 4A). Dette er klart utilstrekkelig for konsekvent å produsere hESC kolonier av spesifikk geometri. Redusere celle seeding tettheten fører også til inkonsekvens i å oppnå fullførte kolonier. Celler seeded på 200 000 celler/mL, i stedet for 300 000 celler/mL, er ikke i stand til å generere tilstrekkelig celle-celle kontakter for å overleve den reduserte konsentrasjonen av Y27632 ved 24 h post-seeding (Figur 4B). Det kan være mulig å generere komplette mønstre med lavere celle tetthet ved å forlenge perioden på Y27632 fortynning; men generelt er det mer effektivt å frø på høyere 300 000 celler/mL tetthet. Av og til blir feil i mønster generering som ikke oppdages tidligere i protokollen, tydelige ved såing av hESCs. En slik feil er lekkasje av ligand løsning under sjablongen på grunn av dårlig kontakt med dekkglass. Dette fører til slutt i ligand blir overført til regioner av polyakrylamid utenfor ønsket geometri, og unconfined vekst av hESCs upon seeding (Figur 4C).
Figur 1: mønstre av ECM-ligand på syre-vasket coverslips og Overfør til polyakrylamid hydrogeler. (A) skjematisk fremstilling av protokollen for mønster ECM-ligand på syre-vasket coverslips og overføring av mønstrede ligand til polyakrylamid hydrogeler. (B) Immunofluorescent bilder av mønstret ECM-ligand på syre-vasket coverslips (venstre) og etter overføring til polyakrylamid hydrogel (høyre). Biotin-merket matrigel ble mønstret på dekkglass og merket med Alexa fluor 555 streptavidin før overføring til polyakrylamid. Inn data viser zoomet ut av hele mønstrene som genereres. (C) representative fluorescerende bilder som viser mønster defekter i ligand på glass dekkglass. Dette skyldes vanlige feil i protokollen, for eksempel lekkasjer av den ligand løsningen utenfor den mønstrede geometrien (øverst, pilen angir lekkasje området), og overlapping av luftbobler inne i den mønstrede geometrien til sjablongen ved å legge til den ligand løsningen ( nederst, indikerer pilen stedet for luftboble). Alle skala bars = 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: seeding av hESCs på mønstret polyakrylamid hydrogeler. Representative brightfield bilder demonstrere vellykkede seeding av hESCs på polyakrylamid hydrogeler med mønstret ligand. Tidslinjen øverst angir serien av Media endringer som brukes til å fjerne ledige celler og fortynne ut Y27632. Legg merke til at etter innledende seeding, celler overholder stochastically til ulike regioner innenfor mønstrede ligand og sprer seg til å fylle de mønstrede regionene i løpet av 72 h. Scale bar = 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Regional lokalisering av trekkraft påkjenninger og immunostaining av trange hESC kolonier. (A) fluorescerende bilder av mikrosfærer i polyakrylamid hydrogel før og etter seeding hESCs. (B) representative partikkel bilde VELOCIMETRY (PIV) plot som viser forskyvning av mikrosfærer på grunn av trekkraft påkjenninger (venstre) og tilsvarende rekonstruert trekkraft påkjenninger (høyre). (C) Immunostaining av trange hESC kolonier på mønstret polyakrylamid hydrogeler, demonstrere evnen til å sammenligne lokalisering av proteiner av interesse for trekkraft påkjenninger. Alle skala bars = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: ikke-ideelle resultater gitt av alternative metoder og feil. (A) representative fluorescerende bilder av ECM-ligand mønstret på syre-vasket coverslips via microcontact utskrift. (B) Brightfield bilder av hESCs som ikke klarer å danne fullførte kolonier på grunn av utilstrekkelig overholdelse av celler. Store hull igjen i koloniene ved 24 h post-seeding (piler) er en tidlig indikator på dette problemet. (C) Brightfield bilder av hESCs som ikke danner trange kolonier på grunn av feil i mønstre som førte til tilstedeværelsen av ligand utenfor ønsket geometri. Alle skala bars = 500 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Eksempel SU8 wafer fabrikasjon | |
| 1. spin coat wafer med SU8-3050 | Spin ved 1 000 RPM for 30 s |
| 2. Soft bake wafer på varm plate | i. 3 min ved 65 ° c |
| II. 45 min ved 95 ° c | |
| III. 3 min ved 65 ° c | |
| IV. avkjøles til romtemperatur | |
| 3. utsett i maske aligner | i. Juster wafer og photomask i maske aligner |
| Ii. Utsett med energi fra 250 mJ/cm2 | |
| • F.eks. for lyskilde med intensitet på 11 mW/cm2, utsett for 23 s | |
| 4. post eksponering bake på varm plate | i. 1 min ved 65 ° c |
| II. 15 min ved 95 ° c | |
| III. 1 min ved 65 ° c | |
| Iv. Avkjøles til romtemperatur | |
| 5. utvikle | i. agitere i SU8 Developer, ca. 5-10 min |
| Ii. Sjekk utviklingen med isopropylalkohol alkohol (IPA) | |
| • Hvis under-utviklet, IPA skyll vil produsere en hvit rester | |
| 6. hard stek på varm plate (valgfritt) | 1-2 h ved 150 ° c |
Tabell 1: eksempel SU8 wafer fabrikasjon protokollen. Silicon wafere brukes til å generere PDMS frimerker og påfølgende sjablonger ble fabrikkert ved hjelp av fremgangsmåten som er beskrevet i denne tabellen. Denne protokollen ble generert ved hjelp av SU8 3000 datablad med sikte på å skape en filmtykkelse på ca 100-250 μm.
| Polyakrylamid gel formuleringer | |||||||||
| Volumer for 1 mL komplett løsning | |||||||||
| Elastisk modul (PA) | Endelig% akrylamid | Endelig% BIS-akrylamid | ddH2O (μL) | 40% akrylamid (μL) | 2% BIS-akrylamid (μL) | 10x PBS (μL) | 1% TEMED i ddH2O (μL) | Mikrosfærer 0,5% tørrstoff i ddH2O (μL) | 1% PPS i ddH2O (μL) |
| 1050 | 3 | 0,1 | 565 | 75 | 50 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 2700 | 7,5 | 0,035 | 485 | 187,5 | 17,5 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 4000 | 7,5 | 0,05 | 477,5 | 187,5 | 25 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 6000 | 7,5 | 0,07 | 467,5 | 187,5 | 35 | 100 | 75 | 60 | 75 |
Tabell 2: polyakrylamid gel formuleringer. Volumer av komponenter for generering polyakrylamid hydrogeler av ulike elastiske moduli med fluorescerende mikrosfærer for TFM. Volumer kan skaleres opp eller ned basert på mengden polyakrylamid løsning som er nødvendig. Alle komponenter unntatt fluorescerende mikrosfærer og PPS blandes sammen før avgassing. PBS = fosfat-bufret saltvann, TEMED = tetrametyletylendiamin, PPS = kalium persulfate.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å forenkle en lang og detaljert protokoll, består denne metoden av tre kritiske stadier: 1) genererer mønstre av ECM ligand på glass coverslips, 2) overføre mønstrene til polyakrylamid hydrogeler under polymerisering av gel, og 3) seeding hESCs på mønstret hydrogel. Det er viktige trinn som må vurderes på hver av disse tre stadiene. For å generere High-Fidelity mønstre på glasset coverslips, må sjablongen være fast presset på dekkglass for å hindre lekkasje av ligand løsning og alle luftbobler må fjernes etter å ha lagt ligand løsning på overflaten av sjablongen ( Figur 1C). Hvis ligand løsning ikke lekke gjennom sjablongen på grunn av dårlig kontakt med dekkglass, ligand vil bli overført til hele overflaten av polyakrylamid hydrogel og hESCs vil ikke være begrenset til ønsket koloni geometri (Figur 4C). Det viktigste steget i overføring av mønstrede ligand til polyakrylamid er å skille den øverste dekkglass fra hydrogel mens alle komponentene forblir neddykket i PBS. Hvis hydrogel ikke forblir neddykket under separasjon, kan mønstrene bli fullstendig ødelagt. Videre, hvis separasjon skjer for raskt, kan overflaten av hydrogel rive eller på annen måte skadet. Jo mykere hydrogel, jo mer er det i fare for skader under separasjon. Til slutt må brukeren Pipetter svært nøye når utveksle medier under seeding og kulturen i hESCs på mønstrede hydrogeler. Den hESCs forblir løst overholdt gjennom protokollen og mønstrede kolonier kan lett forstyrres av uforsiktig eller rushed pipettering.
I tillegg til de kritiske trinnene som er omtalt ovenfor, finnes det en rekke andre trinn som kan kreve endring og feilsøking når du tilpasser denne protokollen for ulike programmer. Mens mønstrene demonstrert her er på lengden omfanget av hundrevis av mikron til en millimeter, genererer mønstrede funksjoner på silisium wafere med åpenhet photomasks og negative photoresist gir mulighet for funksjonen størrelser hele veien ned til 7-10 μm. Dermed kan denne protokollen være tilpasset for confining geometrien av enkeltceller eller mindre kolonier av noen få celler på kompatible underlag.
To parametere som sannsynligvis vil kreve optimalisering når du tilpasser denne protokollen for forskjellige celletyper, er typen ECM-ligand som brukes, og konsentrasjonen av ligand i løsningen under absorpsjon til glasset dekkglass gjennom sjablongene. En total ligand konsentrasjon på 250 μg/mL var tilstrekkelig til å produsere homogene mønstre av matrigel og tilrettelegge for festing av hESCs (figur 1B og figur 2), selv om det kan være mulig å oppnå lignende resultater med lavere Konsentrasjoner. På den andre side, den kanskje være på krevd å fremme forhøye konsentrasjonen av ligand for cellen typer det er færre tilhenger eller for søknadene det forlange kortere vei inkubasjons timene. Økt konsentrasjon av ligand kan også være nødvendig for ulike ECM-ligander, for eksempel fibronektin eller kollagen, som er mindre hydrofobe enn matrigel, og kan derfor ikke adsorbere til hydrogel som sterkt. Fordi overføring av ligand fra dekkglass til hydrogel oppstår under polymerisering av hydrogel, brukte teknikker for robust kryss-linking av ECM-ligand til hydrogel overflaten (for eksempel sulfo-SANPAH behandling) er umulig. Bruk av fluorescensmerkete ECM-ligander for å muliggjøre visualisering av mønstrene på hvert trinn i protokollen er svært nyttig når du optimaliserer og feilsøker disse parametrene.
I tillegg kan protokollen for seeding celler krever optimalisering avhengig av celletypen og medie betingelser som brukes. For celler som overholder raskere eller mer effektivt, kan det kreves en lavere seeding tetthet for å hindre celle celle adhesjon som spenner mellom mønstre og resultere i aggregater i stedet for mønstrede monolag kolonier. For celler som viser svært dårlig vedlegg, en større seeding tetthet eller lengre lang tid før den første Media swap kan være nødvendig for å lette fullstendig dannelse av trange kolonier (Figur 4B).
Nøkkelen begrensningen av denne metoden er dens teknisk innviklet beskaffenhet, hvilke resultater inne relativt lav-produksjon resultater sammenlignet med lignende metoder det innvolvere dyrking celler opp på mønstret barometer underlag8. Imidlertid er denne ulempen langt oppveies av fysiologiske relevans oppnås ved dyrking trange hESC kolonier på kompatible underlag. Ved effektivt å recapitulating de mekaniske egenskapene til tidlig embryo, er vi i stand til å bedre modellere og forstå prosessene som fører til selv-organisering av den primære bakterie lag.
En ekstra fordel med confining hESC kolonier på polyakrylamid hydrogeler er at det muliggjør bruk av TFM å undersøke sammenhengen mellom organiseringen av en hESC koloni, som en modell av tidlig embryo, og fordelingen av celle-genererte styrker som kan ligger til grunn morphogenesis og celle skjebne spesifikasjon. Confining hESC kolonier resulterer i distribusjoner av trekkraft påkjenninger som er avhengige av koloni geometri (Figur 3B). Til tross for den ikke-ensartethet av disse trekkraft påkjenninger, celler i hele koloniene fortsatt pluripotent i vedlikeholds forhold (Figur 3C). Men vi hypothesize at trekkraft stress distribusjoner kan være involvert i å regulere mønstre av celle skjebne spesifikasjon ved tuning responsen til induksjon signaler, slik som løselig morphogens. Vi forventer at denne metoden vil tillate oss og andre grupper for å bedre modellere den tidlige menneskelige embryo med hESCs, som fører til en mer fullstendig forståelse av de grunnleggende prosessene som ligger til grunn menneskelig embryogenesis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne erkjenne finansiering fra CIRM stipend RB5-07409. J.M.M. ønsker å takke FuiBoon Kai, Dhruv thakar, og Roger Oria for ulike diskusjoner som guidet generering og feilsøking av denne metoden. J.M.M. også takket UCSF Discovery Fellowship for den pågående støtte av sitt arbeid.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
References
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
- Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).
- Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mace, K., Braun, K. 916, Humana Press. Totowa, NJ. 317-350 (2012).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
- Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
- Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).
