Summary
Extrazelluläre Matrixliganden können auf Polyacrylamid-Hydrogele gemustert werden, um die Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen in geschlossenen Kolonien auf konformen Substraten zu ermöglichen. Diese Methode kann mit Traktionskraftmikroskopie und biochemischen Assays kombiniert werden, um das Zusammenspiel zwischen Gewebegeometrie, zellgenerierten Kräften und Schicksalsspezifikation zu untersuchen.
Abstract
Menschliche embryonale Stammzellen zeigen eine einzigartige Fähigkeit, auf Morphogene in vitro zu reagieren, indem sie selbstorganisierende Muster der Zellschicksalsspezifikation, die der primären Keimschichtbildung während der Embryogenese entsprechen. Somit stellen diese Zellen ein mächtiges Werkzeug dar, mit dem die Mechanismen untersucht werden können, die die frühe menschliche Entwicklung vorantreiben. Wir haben eine Methode entwickelt, um menschliche embryonale Stammzellen in geschlossenen Kolonien auf konformen Substraten zu kultivieren, die sowohl die Geometrie der Kolonien als auch ihre mechanische Umgebung kontrolliert, um die physikalischen Parameter zu rekapitulieren, die embryogenese. Das Hauptmerkmal dieser Methode ist die Fähigkeit, Polyacrylamid-Hydrogele mit definierten Mustern von extrazellulärem Matrixliganden an der Oberfläche zu erzeugen, um die Zellanhaftung zu fördern. Dies wird erreicht, indem Schablonen mit den gewünschten geometrischen Mustern hergestellt, diese Schablonen verwendet werden, um Muster aus extrazellulärem Matrixliganden auf Glasabdeckungen zu erzeugen, und diese Muster während der Polymerisation auf Polyacrylamid-Hydrogele übertragen werden. Diese Methode ist auch mit der Traktionskraftmikroskopie kompatibel, so dass der Benutzer die Verteilung der zellgenerierten Kräfte innerhalb der begrenzten Kolonien messen und abbilden kann. In Kombination mit biochemischen Standardtests können diese Messungen verwendet werden, um die Rolle zu untersuchen, die mechanische Hinweise bei der Schicksalsspezifikation und Morphogenese bei der frühen menschlichen Entwicklung spielen.
Introduction
Menschliche embryonale Stammzellen (hESCs) versprechen den Einsatz in der regenerativen Medizin und in der Gewebetechnik. Die pluripotente Natur dieser Zellen gibt ihnen die Möglichkeit, in jeden adulten Zelltyp zu differenzieren. Während große Fortschritte bei der Leitung des Schicksals von hESCs auf bestimmte Zelltypen gemacht wurden, ist es sehr schwierig geblieben, ganze Gewebe oder Organe de novo1,2,3,4, 5. Dies ist zu einem großen Teil auf ein begrenztes Verständnis der Mechanismen zurückzuführen, die die Bildung dieser Gewebe während der menschlichen Entwicklung vorantreiben. Um diese Wissenslücke zu schließen, sind in den letzten Jahren eine Reihe von Methoden zur Modellierung des frühen Embryos und der nachfolgenden Entwicklungsstadien mit embryonalen Stammzellen6,7,8,9 ,10,11,12,13.
Kurz nach der Ableitung der ersten hESC-Linien14wurde nachgewiesen, dass embryoide Körper aus hESCs in der Lage waren, spontan Zellen der drei primären Keimschichten6zu produzieren. Aufgrund der inhärenten mangelnden Kontrolle über die Größe und Morphologie von embryoiden Körpern variierte die Organisation der Keimschichten jedoch erheblich und entsprach nicht der Organisation des frühen Embryos. In jüngerer Zeit entwickelten Warmflash et al. eine Methode, um Kolonien von hESCs auf Glassubstraten mittels Mikromusterung einzugrenzen, die Kontrolle und Konsistenz über die Größe und Geometrie derKolonien8 . In Gegenwart von BMP4, einem wichtigen Morphogen in der frühen Entwicklung, waren diese begrenzten Kolonien in der Lage, sich selbst reproduzierbare Spezifisierungsmuster an Schicksale zu organisieren, die die primären Keimschichten darstellen. Obwohl dies ein nützliches Modell für die Untersuchung der Mechanismen darstellte, mit denen primäre Keimschichten hergestellt werden, entsprachen die Muster der Schicksalsspezifikation nicht genau der Organisation und Morphogenese, die während der Embryogenese15beobachtet wurden. Eine getreuere Rekapitulation der frühen embryonalen Entwicklung wurde erreicht, indem hESCs in eine dreidimensionale extrazelluläre Matrix (ECM) von Matrigel11eingebettet wurden, was den bisher stärksten Beweis für die Fähigkeit von hESCs zur Selbstorganisation und Modellierung lieferte. die frühen Stadien der Embryogenese ex vivo. Diese Methode führt jedoch zu inkonsistenten Ergebnissen und ist daher unvereinbar mit einer Reihe von Assays, die verwendet werden könnten, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Selbstorganisation und Schicksalsspezifikation aufzudecken.
Angesichts dieser bestehenden Methoden und ihrer jeweiligen Grenzen versuchten wir, eine Methode zur reproduzierbaren Kultivierung von hESC-Kolonien definierter Geometrien unter Bedingungen zu entwickeln, die die extrazelluläre Umgebung des frühen Embryos modellieren. Um dies zu erreichen, verwendeten wir Polyacrylamid-Hydrogele mit abstimmbarer Elastizität, um die mechanischen Eigenschaften des Substrats zu steuern. Mit Hilfe der Atomkraftmikroskopie an Hühnerembryonen im Gastrulationsstadium fanden wir heraus, dass die Elastizität des Epiblasts von Hunderten von Pascal bis zu einigen Kilopascal reichte. So konzentrierten wir uns auf die Erzeugung von Polyacrylamid-Hydrogelen mit Elastizität in diesem Bereich, um als Substrat für hESC-Kolonien zu dienen. Wir haben unsere bisherigen Methoden zur Kultivierung von hESCs auf Polyacrylamid-Hydrogelen7,9 modifiziert, um eine robuste Kontrolle über die Geometrie der Kolonien zu ermöglichen. Dies gelang uns durch das erste Mustern von ECM-Liganden, nämlich Matrigel, auf Glashüllen durch mikrofabrizierte Schablonen, wie bereits berichtet16. Wir haben dann eine neuartige Technik entwickelt, um den gemusterten Liganden während der Polymerisation auf die Oberfläche von Polyacrylamid-Hydrogelen zu übertragen. Die Methode, die wir hier beschreiben, besteht darin, die Photolithographie zu verwenden, um einen Siliziumwafer mit den gewünschten geometrischen Mustern herzustellen, Stempel dieser geometrischen Merkmale mit Polydimethylsiloxan (PDMS) zu erstellen und diese Stempel zu verwenden, um die Schablonen zu erzeugen, die schließlich erlauben, Denligand auf die Oberfläche von Glasabdeckungen zu mustern und zu Polyacrylamid zu übertragen.
Neben der Rekapitulation der mechanischen Umgebung des frühen Embryos ermöglicht die Beschränkung von hESC-Kolonien auf Polyacrylamid die Messung zellgenerierter Kräfte mit Traktionskraftmikroskopie (TFM), wie in unserer vorherigen Methode9berichtet. Kurz gesagt, fluoreszierende Perlen können in das Polyacrylamid eingebettet und als Treuhandmarker verwendet werden. Zellgenerierte Kräfte werden berechnet, indem die Verschiebung dieser Perlen nach dem Aussaat von hESCs auf das gemusterte Substrat abgebildt wird. Darüber hinaus können die resultierenden Traktionskraftkarten mit traditionellen Assays wie Derimmunfärbung kombiniert werden, um zu untersuchen, wie die Verteilung zellgenerierter Kräfte in begrenzten hESC-Kolonien die nachgeschaltete Signalisierung regulieren oder modulieren kann. Wir erwarten, dass diese Methoden zeigen werden, dass mechanische Kräfte eine entscheidende Rolle bei der Musterung der Zellschicksalsspezifikation während der frühen embryonalen Entwicklung spielen, die derzeit übersehen wird.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden zur Verwendung von hESCs wurden vom Human Gamete, Embryo and Stem Cell Research (GESCR) Committee der University of California San Francisco zugelassen.
1. Herstellung von Siliziumwafer n. B. mit geometrischen Merkmalen
- Erstellen Sie eine Fotomaske mit den gewünschten geometrischen Features. Verwenden Sie computergestützte Entwurfssoftware, um die Funktionen zu entwerfen. Für die Verwendung mit negativem Photoresist, machen Features undurchsichtig und der Rest der Maske transparent.
HINWEIS: Zum Mustern auf Abdeckungen mit einem Durchmesser von 18 mm gruppieren Sie die Merkmale für jede Versuchsbedingung in 10 x 10 mm Bereiche, um sicherzustellen, dass die in Schritt 3 erzeugten Schablonen auf die Abdeckungen passen. - Spin Mantel negativer Photoresist auf einen 100 mm Siliziumwafer. Verwenden Sie das Photoresist-Datenblatt, um die Geschwindigkeit und Länge der Drehung zu bestimmen, um eine Filmdicke von 100-250 m zu erzeugen.
HINWEIS: Die Foliendicke sollte so eingestellt werden, dass das Seitenverhältnis der Breite der Muster zur Höhe der Schablone so nahe wie möglich bei 1:1 liegt. Wir empfehlen jedoch eine Mindestdicke von 100 m, da alles andere zarte Schablonen produziert, die leicht reißen. - Verarbeiten Sie den Photoresist gemäß dem Produktdatenblatt. Dies beinhaltet in der Regel eine weiche Backen, UV-Belichtung mit Fotomaske in einer Maske Aligner, Post-Belichtung backen, Entwicklung, und harte stolbacken. Als Beispiel wird die Prozedur zur Verarbeitung der in diesem Protokoll verwendeten Wafer in Tabelle 1beschrieben.
HINWEIS: Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit Siliziumwafern, da sie zerbrechlich sind. Einmal erzeugt, können Wafer wiederholt verwendet werden, solange sie nicht beschädigt werden.
2. Herstellung von Deckellipsen
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Zubereitung von säuregewaschenen "Top"-Abdeckungen
- Legen Sie 18 mm Durchmesser #1 Dicke Abdeckungeninteilen in eine Glas Petrischale. Die entsprechende Anzahl der Abdeckungen hängt von der Größe der Schale ab. Für eine 100-mm-Schale 50-100 Abdeckungen gleichzeitig zubereiten. Die Volumenmengen, die durch den Rest dieses Abschnitts angegeben werden, entsprechen einer 100 mm Schale.
- Fügen Sie 20 ml 1 M HCl in die Petrischale und schütteln Sie die Schale vorsichtig, um die Abdeckungen zu zerstreuen. Stellen Sie sicher, dass alle Abdeckungen untergetaucht sind und lassen Sie Luftblasen zwischen den Abdeckungen ab. Übernacht bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln inkubieren.
VORSICHT: HCl ist sauer und ätzend. Seien Sie vorsichtig und tragen Sie geeignete PSA während der Arbeit mit HCl. - Dekant HCl von der Schale. Fügen Sie 20 ml Reinstwasser hinzu und waschen Sie mit sanftem Schütteln für 10 min. Wasser entsorgen und für insgesamt fünf Wäschen wiederholen.
- Nach dem Wegwerfen der Endwäsche 20 ml 100% Ethanol in die Schale geben. Mit Zangen die Abdeckungen einzeln entfernen und zwischen zwei Stück Filterpapier zum Trocknen anordnen.
- Trockene Deckellipsen in einem verschlossenen Behälter aufbewahren. Säuregewaschene Deckelkönnen im Voraus zubereitet und unter staubfreien Bedingungen einen Monat oder länger gelagert werden.
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Herstellung von Glutaraldehyd-aktivierten "Boden"-Abdeckungen
HINWEIS: Weitere Informationen finden Sie in den vorherigen Methoden7,9.- Legen Sie 18 mm Durchmesser #1 Dicke Abdeckungeninlips in eine Petrischale.
- 20 ml 0,2 M HCl in die Petrischale geben und die Schale vorsichtig schütteln, um die Abdeckungen zu zerstreuen. Stellen Sie sicher, dass alle Abdeckungen untergetaucht sind und lassen Sie Luftblasen zwischen den Abdeckungen ab. Übernacht bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln inkubieren.
- Dekant HCl von der Schale. Fügen Sie 20 ml Reinstwasser hinzu und waschen Sie mit sanftem Schütteln für 10 min. Wasser entsorgen und für insgesamt fünf Wäschen wiederholen.
- Nach dem Wegwerfen der letzten Wäsche 20 ml 0,1 M NaOH hinzufügen und vorsichtig schütteln, um Abdeckungen zu zerstreuen und zu tauchen. Bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln für 1 h bebrüten.
- Dekant NaOH von der Schale. Fügen Sie 20 ml Reinstwasser hinzu und waschen Sie mit sanftem Schütteln für 10 min. Wasser entsorgen und für insgesamt fünf Wäschen wiederholen.
- Nach dem Wegwerfen der endigen Wäsche 20 ml einer 1:200 Verdünnung von 3-Aminopropyltrimethoxysilan in reinstes Wasser hinzufügen und sanft schütteln, um Dielips zu dispergieren und zu untertauchen. Bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln für 1 h oder über Nacht bebrüten.
VORSICHT: 3-Aminopropyltrimethoxysilan ist entzündlich und kann Hautreizungen verursachen. Behandeln Sie mit Sorgfalt, tragen Sie geeignete PSA und entsorgen Sie Abfälle gemäß den örtlichen Entsorgungsvorschriften. - Dekantiert die verdünnte 3-Aminopropyltrimethoxysilan-Lösung aus der Schale. Fügen Sie 20 ml Reinstwasser hinzu und waschen Sie mit sanftem Schütteln für 10 min. Wasser entsorgen und für insgesamt mindestens fünf Wäschen wiederholen. Es ist wichtig, alle 3-Aminopropyltrimethoxysilan zu entfernen, bevor Sie fortfahren.
- Nach dem Wegwerfen der Endwäsche 20 ml einer 1:140 Verdünnung von 70% Glutaraldehyd in Phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) hinzufügen und vorsichtig schütteln, um Deckellipsen zu dispergieren und zu untertauchen. Bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln für 1 h oder über Nacht bebrüten.
VORSICHT: 70% Glutaraldehyd ist giftig und kann Hautreizungen verursachen. Behandeln Sie mit Sorgfalt, tragen Sie geeignete PSA und entsorgen Sie Abfälle gemäß den örtlichen Entsorgungsvorschriften. - Dekantiert die verdünnte Glutaraldehydlösung aus der Schale. Fügen Sie 20 ml Reinstwasser hinzu und waschen Sie mit sanftem Schütteln für 10 min. Wasser entsorgen und für insgesamt fünf Wäschen wiederholen.
- Nach dem Entsorgen der Endwäsche 20 ml 100% Ethanol hinzufügen. Mit Zangen die Abdeckungen einzeln entfernen und zwischen zwei Stück Filterpapier zum Trocknen anordnen.
- Trockene Deckellipsen in einem verschlossenen Behälter aufbewahren. Glutaraldehyd-aktivierte Abdeckungen können im Voraus hergestellt und bis zu sechs Monate gelagert werden.
3. Erzeugung von Schablonen zum Mustern von ECM Ligand
- Erzeugung von Polydimethylsiloxan (PDMS) Zwischenstempeln
- Mischen Sie PDMS-Basis mit PDMS-Härtungsmittel im Verhältnis 10:1 nach Gewicht. Mischen Sie gründlich.
HINWEIS: Für die Erstanwendung von PDMS bereiten Sie ca. 100 g PDMS vor, um eine 100-mm-Schale zu füllen. Für nachfolgende Anwendungen entfernen Sie PDMS nur aus der Mitte der Schale, in der sich die Siliziumwafer-Features befinden, und bereiten 20-30 g neues PDMS vor. - Entgasen Sie das PDMS-Gemisch in einem Trockenmittel für 30-60 min oder bis alle Luftblasen entfernt sind.
- Den modifizierten Siliziumwafer aus Schritt 1 in eine 100-mm-Kunststoffschale geben. Gießen Sie die PDMS-Mischung langsam und gleichmäßig über die Oberfläche des Wafers. Tippen Sie auf die Schale auf der Arbeitsfläche, um Luftblasen von der Oberfläche des Wafers zu lösen.
- Entgasen Sie das PDMS-Gemisch 10 min über den Wafer oder bis alle Luftblasen entfernt sind oder an die Oberfläche des PDMS gekommen sind.
- Das PDMS bei 70 °C für 2 h backen. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
- Schneiden Sie mit einem Skalpell oder Einem Kastenschneider den Bereich von PDMS aus der Mitte der Schale aus, die die geometrischen Merkmale enthält.
- Schneiden Sie das PDMS in ca. 10 x 10 mm Quadrate, die jeweils die Eigenschaften für einen einzigen Versuchszustand enthalten. Diese werden in den nachfolgenden Schritten des Protokolls als "Stempel" bezeichnet.
- Mischen Sie PDMS-Basis mit PDMS-Härtungsmittel im Verhältnis 10:1 nach Gewicht. Mischen Sie gründlich.
- Erzeugung von Flachplatten von PDMS
- Mischen Sie PDMS-Basis mit PDMS-Härtungsmittel im Verhältnis 8:1 nach Gewicht. Bereiten Sie ca. 20 g für jede zu verwendende 100-mm-Schale vor. Mischen Sie gründlich.
- Entgasen Sie das PDMS-Gemisch in einem Trockenmittel für 30-60 min oder bis alle Luftblasen entfernt sind.
- Gießen Sie das PDMS langsam und gleichmäßig in eine saubere 100 mm Schale. Tippen Sie auf die Schale auf der Arbeitsfläche, um Luftblasen zu lösen.
- Das PDMS bei 70 °C für 2 h backen. Auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
- Entfernen Sie das PDMS aus der Schale. Invertieren, so dass die Oberfläche des PDMS, die in Kontakt mit dem Boden der Schale war nach oben.
- Schneiden Sie für jeden in Schritt 3.1 erzeugten Stempel ein Quadrat von 15 x 15 mm PDMS. Diese werden in den nachfolgenden Schritten des Protokolls als "flache Platten" bezeichnet.
- Generieren von Schablonen
- Ordnen Sie flache Platten von PDMS auf dem Deckel einer 150 mm Schale oder einer anderen flachen Oberfläche an, um die Handhabung zu erleichtern. Achten Sie auf einen ausreichenden Abstand zwischen den Platten (z.B. für eine 150-mm-Schale, ordnen Sie neun flache Platten mit gleichmäßigem Abstand an).
- Invertieren Sie jeden Stempel, der in Schritt 3.1 erzeugt wird, auf eine flache Platte von PDMS, so dass die Merkmale auf dem Stempel mit der flachen Platte von PDMS in Kontakt stehen. Drücken Sie vorsichtig auf die Oberseite des Stempels mit Zangen, um einen gleichmäßigen Kontakt zu gewährleisten.
- Stützen Sie vorsichtig den Deckel mit PDMS-Stempel/Platte paart sich auf der Basis der Schale, so dass der Deckel in einem Winkel ruht. Dies unterstützt den Abtransport des UV-härtenden Polymers im nächsten Schritt.
- Legen Sie einen kleinen Tropfen UV-härtendes Polymer an die obere Schnittstelle jedes Stempel-/Plattenpaares. Das Polymer wird zwischen den beiden durch Oberflächenspannung, unterstützt durch die Schwerkraft, böse sein.
HINWEIS: Viele verschiedene UV-härtende Polymere können in diesem Protokoll funktionieren. Wir haben Norland Optical Adhesive 74 für die folgenden Eigenschaften ausgewählt: i) Schnelle Aushärtung bei Uv-Licht, ii) Einfache Entfernung von PDMS-Stempeln bei Aushärtung, iii) Robuste Haftung auf Glasabdeckungen mit manuellem Druck. - Sobald das Polymer vollständig durchgeäuft wurde, legen Sie den Deckel mit Stempel-/Plattenpaaren flach auf die Arbeitsfläche. Legen Sie einen kleinen Tropfen UV-härtendes Polymer an jede der verbleibenden drei Seiten jeder Stempel-/Plattenschnittstelle.
- Verbinden Sie die Polymertropfen mit einer 200-L-Pipettenspitze an den Rändern der Stempel-/Plattenschnittstelle. Dadurch wird ein Rahmen erstellt, der die Ligandenlösung in Schritt 4 hält.
HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie das Polymer um die Ränder des Stempels arbeiten. Wenn die Stempel-/Plattenschnittstelle unterbrochen ist, wird das Polymer unter den Features abtreten und die Schablone wird sich nicht richtig bilden. - Legen Sie die Stempel-/Plattenpaare vorsichtig in eine UV-Sterilisationsbox. Verwenden Sie die sterile "Str" Leistungseinstellung und belichten Sie für 10 min.
- Entfernen Sie die Stempel-/Plattenpaare aus der UV-Sterilisationsbox. Entfernen Sie mit zwei Zangenpaaren vorsichtig den PDMS-Stempel, während Sie die flache Platte und Schablone halten, die sich aus dem UV-härtenden Polymer gebildet haben.
- Entfernen Sie die Schablone mit Zangen vorsichtig und invertieren Sie sie so, dass die Oberfläche, die mit der flachen Platte von PDMS in Berührung kam, nach oben gerichtet ist.
HINWEIS: Die Schablonen sind zart. Seien Sie vorsichtig, während Sie sie geben, vor allem beim Entfernen von ihnen aus dem PDMS, damit sie nicht reißen. - Legen Sie die invertierten Schablonen wieder in eine UV-Sterilisationsbox. Verwenden Sie die sterile "Str" Leistungseinstellung und belichten Sie für 3 min.
4. Musterung ECM Liganden auf Deckellips
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Schablonen auf säuregewaschene Deckellipsen pressen
- Legen Sie einen säuregewaschenen Deckelfürstück für jede Schablone auf ein sauberes Stück Laborfolie.
- Mit Zangen jede Schablone flach seit unten auf einen säuregewaschenen Deckelschlupf legen. Platzieren Sie so, dass Features auf dem Deckzettel zentriert sind.
- Legen Sie ein kleines Stück Laborfolie auf jede Schablone. Drücken Sie fest und gleichmäßig auf die Schablone, um einen starken Kontakt zwischen der Schablone und dem Coverslip herzustellen.
HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt! Drücken Sie fest und über die gesamte Oberfläche der Schablone. Wenn kein ausreichender Kontakt erstellt wird, tritt die Ligandenlösung zwischen der Schablone und den Abdeckungen auf, und die Musterung schlägt fehl. OPTIONAL: Um einen ausreichenden Kontakt zwischen der Schablone und dem Deckelschlupf zu bestätigen, wird die Pipette 100 l ultrareines steriles Wasser auf die Oberfläche jeder Schablone gebracht und bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 1 h auf Leckage prüfen. Wasser aus erfolgreich verklebenden Schablonen ansaugen und fortfahren.
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Plasmareinigung der Oberfläche der Schablonen-Abdeckungen zur Erhöhung der Hydrophilie
- Legen Sie die Abdeckungen mit Schablonen in einen Plasmareiniger. Tragen Sie Hochleistungsplasma für 30 s auf.
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Vorbereitung der ECM-Ligandlösung
HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte sollten, wenn möglich, unter sterilen Bedingungen abgeschlossen werden.- Sterile 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8.0 Lösung auf Eis legen. Nach eiskalter Form Matrigel und Kollagen hinzufügen, um Konzentrationen von 225 g/ml bzw. 25 g/ml zu erreichen. OPTIONAL: Zur Fehlerbehebung oder zur Ligandenvisualisierung, fügen Sie einen fluoreszierend markierten Liganden in die Ligandenlösung ein.
- HINWEIS: Mit dieser Methode können verschiedene ECM-Liganden verwendet werden. Für verschiedene Liganden kann eine zusätzliche Optimierung erforderlich sein, um die ideale Konzentration, Inkubationszeit und Inkubationstemperatur zu bestimmen. Weitere Informationen finden Sie im Diskussionsabschnitt.
- Pipette die Ligandenlösung auf die Oberfläche jeder Schablone. Für Schablonen aus 10 x 10 mm quadratischen Stempeln, tragen Sie 100 l pro Schablone auf.
- Überprüfen Sie, ob Luftblasen in Schablonenfunktionen angezeigt werden. Verwenden Sie bei Bedarf feingekippte Zangen oder eine 2-L-Pipettenspitze, um Luftblasen von Features zu entfernen.
HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt! Wenn Luftblasen an der Oberfläche des Deckels gefangen bleiben, wird der Liganden nicht an die Oberfläche adsorbieren und das resultierende Muster wird unvollständig sein. - Die Schablonen-Coverlips mit Ligand in eine Schüssel geben, mit Laborfolie umwickeln und über Nacht bei 4 °C brüten.
- Sterile 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8.0 Lösung auf Eis legen. Nach eiskalter Form Matrigel und Kollagen hinzufügen, um Konzentrationen von 225 g/ml bzw. 25 g/ml zu erreichen. OPTIONAL: Zur Fehlerbehebung oder zur Ligandenvisualisierung, fügen Sie einen fluoreszierend markierten Liganden in die Ligandenlösung ein.
5. Übertragung von Ligand auf Polyacrylamid-Gel
- Entfernen von Ligandenlösung und Schablone aus jedem Coverslip
- Die Ligandenlösung von der Oberfläche einer Schablone absaugen. Ligand-Lösung kann gesammelt und bei 4 °C gelagert und bis zu einem Monat wiederverwendet werden.
- Mit Zangen den Deckelrutsch kurz mit Schablone in eine Schüssel mit sterilem PBS zum Waschen untertauchen.
- Untertauchen Sie den Deckelmit Schablone kurz in eine zweite Schale mit sterilem PBS zum Waschen.
- Entfernen Sie die Schablone von der Oberfläche des Deckelzettels. Achten Sie darauf, den Coverslip nicht zu brechen.
- Untertauchen Sie den Deckel in eine Schüssel mit ultrareinem sterilem Wasser, um Salze aus den PBS-Wäschen zu entfernen. Tippen Sie auf den Rand des Deckelslipzurutsche zu einem empfindlichen Aufgabenwisch, um überschüssiges Wasser abzuleiten.
- Trocknen Sie den Deckelunterrutschunter unter einem Inertgas, wie Stickstoff. Markieren Sie die Unterseite des Coverslips, um die Orientierung von diesem Punkt nach vorne zu verfolgen. Achten Sie darauf, die gemusterte Seite nach oben zu halten.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.1.1 bis 5.1.6 für jeden Schablonen-Coverslip.
- Herstellung von Polyacrylamid-Hydrogelen mit gemusterten Coverlips
ANMERKUNG: Siehe frühere Methoden für zusätzliche Angaben7,9 Sterilisieren Sie alle Kappenhalter, Rohre und Abstandshalter, die zur Herstellung von Polyacrylamidgelen verwendet werden, indem Sie über Nacht mit 10 % Bleichmittel waschen und mindestens fünfmal mit Wasser abspülen, um Bleichmittel zu entfernen, und kurz in 70% Ethanol waschen. Legen Sie alle Stücke auf empfindliche Aufgabentücher in einem sterilen Biosicherheitsschrank zum Trocknen vor Gebrauch.- Bereiten Sie Polyacrylamid-Lösung vor, um die gewünschte Hydrogelelastizität zu erhalten (Tabelle 2). Mischen Sie alle Komponenten außer den fluoreszierenden Mikrosphären und dem Kaliumpersulfat (PPS).
HINWEIS: Bereiten Sie 1% Kaliumpersulfatlösung jedes Mal frisch vor. - Entgasen Sie die Polyacrylamidlösung, Mikrosphären und PPS in separaten Rohren unter Vakuum für 30 min.
- Für jeden gemusterten Abdeckslip einen glutaraldehydaktivierten "Boden"-Deckelschlupf mit einem Abstandsabstand (18 mm Außendurchmesser, 14 mm Innendurchmesser) auf die Oberseite zubereiten.
- Nach der Entgasung Mikrosphären kurz beschallen und der Polyacrylamidlösung entsprechendes Volumen hinzufügen. Mischen Sie durch Pipettieren nach oben und unten, achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen. Kurz beschallen.
- Fügen Sie der Polyacrylamidlösung ein entsprechendes Volumen von PPS hinzu. Pipette nach oben und unten, um die Lösung zu mischen, achten Sie darauf, keine Luftblasen einzuführen.
HINWEIS: Nach dem Hinzufügen von PPS, schnell arbeiten, um die Schritte 5.2.6 bis 5.2.11 abzuschließen, bevor Polyacrylamid polymerisiert. - Pipette 75-150 l (je nach Dicke des Abstandsraums) in die Mitte jedes Glutaraldehyd-aktivierten Deckelrutsches.
- Mit Zangen einen gemusterten Deckelschlupf auf jeden Glutaraldehyd-aktivierten Deckelrutsch mit Polyacrylamid und Spacer legen, so dass der gemusterte Liganden der Polyacrylamidlösung gegenübersteht. Wenn eine ausreichende Polyacrylamidlösung zugegeben wurde, wird die Oberflächenspannung das Polyacrylamid zwischen den beiden Abdeckungen ableiten und es werden keine Luftblasen vorhanden sein.
- Nehmen Sie jedes Polyacrylamid "Sandwich" auf und berühren Sie vorsichtig die Seite zu einem empfindlichen Aufgabenwisch, um überschüssige Polyacrylamidlösung abzuleiten.
- Legen Sie jedes Polyacrylamid-"Sandwich" vorsichtig in einen Kappenhalter mit Gewinden, die mit 15 ml konischen Bodenrohren kompatibel sind. Die Ausrichtung sollte so sein, dass der Boden des Glutaraldehyd-Abdeckungsrutsches in Kontakt mit der Unterseite des Kappenhalters ist und der gemusterte Deckelschlupf oben ist.
- Schrauben Sie ein 15 ml kegelförmiges Unterrohr in jeden Kappenhalter, um die Polyacrylamid-"Sandwiches" an Ort und Stelle zu halten. Die Rohre sollten fest sein, um Leckagen zu verhindern, aber achten Sie darauf, nicht zu verengen und die Abdeckungen zu knacken.
- Zentrifugieren Sie das Polyacrylamid "Sandwiches" in den Rohren in Schwenkschaufeln bei 200 x g für 10 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Rohre aus der Zentrifuge und legen Sie sie in Rohrregale, um die Orientierung für weitere 50 min beizubehalten, um eine vollständige Polymerisation zu gewährleisten. Mit Folie bedeckt halten, um das Bleichen fluoreszierender Mikrosphären zu verhindern.
HINWEIS: Zentrifugation ist entscheidend, wenn diese Methode verwendet wird, um TFM auszuführen. Die Fliehkraft verschiebt alle Mikrosphären auf eine einzige Ebene, die sich letztlich knapp unter der Oberfläche des Hydrogels befinden wird. Dies ist ideal für die Abbildung von Mikrosphärenverschiebungen, die zur Berechnung zellgenerierter Traktionsspannungen verwendet werden. Wenn TFM nicht durchgeführt wird, können Mikrosphären aus der Polyacrylamidlösung herausgelassen werden und die Polymerisation kann an der Tischplatte ohne Zentrifugation auftreten. - Entfernen Sie polymerisierte Polyacrylamid "Sandwiches" aus den Rohren und tauchen Sie in PBS in einer 100 mm Schale ein. In Laborfolie einwickeln und 3 h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Bereiten Sie Polyacrylamid-Lösung vor, um die gewünschte Hydrogelelastizität zu erhalten (Tabelle 2). Mischen Sie alle Komponenten außer den fluoreszierenden Mikrosphären und dem Kaliumpersulfat (PPS).
- Herstellung von gemusterten Gelen für Säzellen
- Verwenden Sie ein Skalpell und Zange, um sorgfältig den gemusterten Coverslip und den Abstandsabstand aus dem Polyacrylamid "Sandwich" zu entfernen, während es in PBS versunken bleibt. Der gemusterte Ligand wird während der Polymerisation auf das Polyacrylamid übertragen und bleibt nach dem Entfernen des Deckellipses erhalten. Das Polyacrylamid-Gel bleibt am Glutaraldehyd-aktivierten Deckelbeschlag befestigt.
HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt! Das Polyacrylamid muss in PBS getaucht werden, während der Deckelrutsch entfernt wird oder die Ligandenmuster zerstört werden. - Platzieren Sie jeden Deckelrutsch mit gemusterten Polyacrylamid in einen Kappenhalter. Legen Sie eine Dichtung (18 mm Außendurchmesser, 14 mm Innendurchmesser) auf den Deckelund und um das Polyacrylamid, wo sich der Abstandser befand. Schrauben Sie ein abgesästes 15 mm konisches Bodenrohr in den Kappenhalter und bilden sie mit dem gemusterten Polyacrylamid unten. Diese Baugruppen passen für eine einfache Handhabung in die Bohrungen einer Standard 12-Well-Platte.
- Waschen Sie jedes Gel, indem Sie der Bohrgutbaugruppe 500 l PBS hinzufügen. 10 min bei Raumtemperatur mit sanftem Schütteln bebrüten. Entfernen Sie PBS und wiederholen Sie zweimal für insgesamt drei Wähbe.
- Nach der letzten PBS-Wäsche 500 L Knockout-DMEM-Medien zu Gelen geben und bei 37 °C über Nacht inkubieren. Gele können bis zu 5 Tage vor der Aussaat von Zellen bei 37 °C mit Medien aufbewahrt werden.
- Ersetzen Sie am Tag vor dem Aussaat der Zellen knockout-DMEM für komplette KSR-Medien und brüten Sie bei 37 °C über Nacht.
- Verwenden Sie ein Skalpell und Zange, um sorgfältig den gemusterten Coverslip und den Abstandsabstand aus dem Polyacrylamid "Sandwich" zu entfernen, während es in PBS versunken bleibt. Der gemusterte Ligand wird während der Polymerisation auf das Polyacrylamid übertragen und bleibt nach dem Entfernen des Deckellipses erhalten. Das Polyacrylamid-Gel bleibt am Glutaraldehyd-aktivierten Deckelbeschlag befestigt.
6. Culturing hESCs auf gemusterten Gelen
HINWEIS: Wenn Sie planen, Proben für die Immunfärbung nach TFM zu fixieren, nehmen Sie Bilder von unbelasteten Mikrosphärenpositionen vor der Aussaat von Zellen auf. In diesem Fall sollte fluoreszierend markierter Ligand in Schritt 4.3.1 verwendet werden, damit die eventuellen Positionen von Zellen bekannt sind, bevor die Aussaat erfolgt und Mikrosphären in diesen Regionen abgebildet werden können.
- BestandhEsC-Kulturen und sekundäre feederfreie Kulturen auf matrigelbeschichteten Platten in konditionierten KSR-Medien vor der Aussaat auf gemusterten Polyacrylamidgelen wie zuvor beschrieben9erhalten.
HINWEIS: Generieren Sie konditionierte KSR-Medien, indem Sie bestrahlte Maus-embryonale Fibroblasten in KSR-Medien kultivieren, die mit 4 ng/ml Basis-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) ergänzt werden. Sammeln und ersetzen Sie Medien alle 24 h. - Aspirieren Sie die Medien von hESCs. Kurz mit Knockout-DMEM-Medien waschen. Fügen Sie 0,05% Trypsin-EDTA hinzu, ergänzt mit 10 'M Y27632 (Rho Kinase-Hemmer) und inkubieren bei 37 °C für 5-10 min.
- Fügen Sie Medien mit Serum hinzu, um Trypsin zu hemmen. Besaugen Sie Medien und Pipetten vorsichtig über die Schale, um Zellen zu entfernen. Führen Sie die sanfte Pipettierung fort, um alle Zellen zu entfernen und Zellcluster mit einzelnen Zellen zu trennen.
- Sammeln Sie die Zellsuspension und Zentrifuge bei 200 x g für 3 min.
- Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem entsprechenden Volumen von KSR-Medien zum Waschen wieder aus. Zentrifuge bei 200 x g für 3 min.
- Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in konditionierten KSR-Medien wieder auf, ergänzt durch 10 ng/mL bFGF und 10 M Y27632.
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und passen Sie die Zellsuspension auf eine Konzentration von 300.000 Zellen pro ml an. Pipette 500 l der Zellsuspension auf jedes gemusterte Gel (150.000 Zellen pro Gel).
- 3 h nach der Aussaat verwenden Sie eine Pipette, um die Medien von jedem Gel sorgfältig zu saugen und durch frisch konditionierte KSR-Medien zu ersetzen, die mit 10 ng/mL bFGF und 10 'M Y27632 ergänzt werden. Dadurch werden überschüssige Zellen entfernt, die nicht an gemusterten Regionen des Polyacrylamids hafteten.
HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt! In diesem Stadium werden die Zellen lose an den gemusterten Liganden haften. Seien Sie beim Medienwechsel sehr vorsichtig, um die Zellen nicht zu lösen. Bei jedem Medienswap sollte in den folgenden Schritten die gleiche Sorgfalt geboten sein. - 24 h nach der Aussaat verwenden Sie eine Pipette, um die Medien sorgfältig zu saugen und konditionierte KSR-Medien zu tauschen, die mit 10 ng/mL bFGF und 5 'M Y27632 ergänzt werden.
- 48 h nach der Aussaat, verwenden Sie eine Pipette, um die Medien sorgfältig zu saugen und austauschen für konditionierte KSR-Medien mit 10 ng/mL bFGF ergänzt. Dies entfernt den Rho-Kinase-Inhibitor aus den Medien und Experimente können am nächsten Tag beginnen, 72 h nach der Aussaat.
7. Durchführung von TFM
- Führen Sie auf Wunsch TFM wie zuvor beschrieben9 unter den gewünschten experimentellen Bedingungen durch.
- Wenn unbelastete Mikrosphärenpositionen vor der Aussaat von Zellen abgebildet wurden, fixieren Sie die Zellen nach der Einnahme von gestressten Mikrosphärenpositionen und führen Sie eine Immunfärbung durch, um die Lokalisierung von Proteinen von Interesse relativ zu Regionen mit hohen und niedrigen Zugkraftkräften zu bestimmen.
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Representative Results
Die größte Herausforderung, die es zu bewältigen gilt, hESCs in Kolonien kontrollierter Geometrie auf konformen Substraten zu kultizieren, besteht darin, ein homogenes Muster von ECM-Ligand auf der Oberfläche des Substrats zu erzeugen. Die bei dieser Methode vorgestellte Strategie besteht darin, zunächst das gewünschte Muster auf der Oberfläche eines Glasdeckels zu erzeugen und dieses Muster anschließend während der Polymerisation des Gels auf die Oberfläche eines Polyacrylamidhydrogels zu übertragen(Abbildung 1 A). Daher ist es wichtig, sicherzustellen, dass das gewünschte Muster erfolgreich auf der Oberfläche des Glasdeckels erstellt wird, bevor die Polymerisation des Hydrogels und die Übertragung des Musters fortgesetzt werden (Abbildung 1B). Basierend auf der Abbildung fluoreszierender Ligandenmuster, die auf Polyacrylamid übertragen wurden, scheint der Ligand nur in einer einzigen Ebene an der Oberfläche des Polyacrylamids vorhanden zu sein, obwohl wir die Dicke dieser Schicht nicht genau charakterisiert haben. Es gibt zwei häufige Arten von Defekten, die nach der Mustererzeugung auf dem Glasdeckel beobachtet werden, jeder mit seiner eigenen Fehlerquelle. Die erste ist das Auftreten von fluoreszierendem Liganden, der sich über die Ränder des gewünschten Musters erstreckt (Abbildung 1C, oben), das sich aus dem Auslaufen der fluoreszierenden Ligandenlösung aufgrund eines kleinen Risses in der Schablone oder einer unzureichenden Abdichtung der Schablone auf den Glasdeckel. Das zweite ist das Auftreten eines unvollständigen Musters (Abbildung 1C, unten), das typischerweise auf eine Luftblase zurückzuführen ist, die an der Deckspinat-Schnittstelle gefangen ist, die die Adsorption des fluoreszierenden Liganden verhindert.
Das ultimative Erfolgsmaß für diese Methode ist die Fähigkeit, hESCs in gewünschten Geometrien auf den gemusterten Hydrogelen zu kultitonischen (Abbildung 2). Um dies zu erreichen, werden hESCs mit einer relativ hohen Dichte (300.000 Zellen/ml) in Gegenwart eines Rho-Kinase-Inhibitors (Y27632) ausgesät und für 3 h inkubiert, um die Haftung an den Ligandenmustern zu erleichtern. Das Medium wird dann ersetzt, um nicht haftete Zellen zu entfernen. Im Laufe von 72 h wird der Y27632 durch eine Reihe von Medienaustauschen um 24 und 48 h nach der Aussaat allmählich aus den Medien verwässert. Typischerweise vermehren sich die hESCs, um die gemusterten Geometrien um 48-72 h zu vervollständigen, so dass Experimente bei 72 h Nachsaat beginnen können, sobald der Y27632 vollständig aus dem Medium entfernt wird.
Die Kultivierung von hESC-Kolonien in begrenzten Geometrien auf Polyacrylamid-Hydrogelen ermöglicht die Messung zellgenerierter Traktionskräfte mit TFM. Diese Messungen werden durch Einbetten von fluoreszierenden Mikrosphären in das Hydrogel und Durchmalung der Positionen dieser Perlen vor und nach der Aussaat von hESCs (Abbildung 3A) durchgeführt. Die Verschiebung der Perlen nach der Zellaussaat ist eine Funktion von zellgenerierten Kräften und der Elastizität des Hydrogels, so dass die Bilder der Perlenpositionen verwendet werden können, um Karten von Perlenverschiebungen zu erzeugen und anschließend zur Berechnung der zugrunde liegenden Traktionsspannungen. In kreisförmigen Kolonien von hESCs finden sich die größten Traktionsspannungen in der Nähe des randnahen Rands der Kolonien, während das Zentrum der Kolonien gleichmäßig niedrige Zugspannungen aufweisen (Abbildung 3B). Interessanterweise finden sich die höchsten Traktionsspannungen in Clustern in der Nähe des Rands der Kolonien, anstatt einen kontinuierlichen Ring mit maximaler Spannung zu bilden. Dies bedeutet, dass, obwohl die Koloniegeometrie eine Schlüsselrolle bei der Bestimmung der Verteilung der Zugspannungen spielt, eine stärker lokalisierte Regulierung und Rückkopplung die genauen Positionen der maximalen Spannung bestimmt. Solange das Bild von Mikrosphärenpositionen ohne haftende Zellen vor der Zellaussaat aufgenommen wird, können hESC-Kolonien nach Traktionskraftmessungen für die Immunfärbung von Proteinen von Interesse fixiert werden. Trotz der beobachteten ungleichmäßigen Verteilungen von Traktionsspannungen zeigen hESCs, die als gemusterte Kreise unter Wartungsbedingungen kultiviert werden, eine gleichmäßige Expression des Pluripotenzmarkers Oct3/4 und des Zelladhäsionsmoleküls E-Cadherin (Abbildung 3C ).
Das vorgestellte Verfahren zur Verwendung von Schablonen zur Erzeugung von Ligandenmustern ist nachweislich der gängigen Technik des Mikrokontaktdrucks für die relativ großen Geometrien, die bei dieser Methode verwendet werden (d. h. bei kreisförmigen Kolonien mit einem Durchmesser von 1 mm sowie Dreiecke und Quadrate äquivalenter Fläche). Mikrokontaktdruckmuster von Liganden in dieser Längenskala führen zu einer heterogenen Übertragung an den Rändern von Mustern, wobei sich in den zentralen Bereichen der Muster nur sehr wenig Liganden ablagern (Abbildung 4A). Dies reicht eindeutig nicht aus, um hESC-Kolonien mit spezifischen Geometrien konsequent zu produzieren. Die Verringerung der Zellsädichte führt auch zu Inkonsistenzen bei der Erreichung abgeschlossener Kolonien. Zellen, die mit 200.000 Zellen/ml statt 300.000 Zellen/ml ausgesät sind, sind nicht in der Lage, ausreichende Zell-Zell-Kontakte zu erzeugen, um die reduzierte Konzentration von Y27632 bei 24 h Nachsaat zu überleben (Abbildung 4B). Es kann möglich sein, vollständige Muster mit niedrigeren Zelldichten zu erzeugen, indem die Periode der Y27632-Verdünnung verlängert wird; Insgesamt ist es jedoch effizienter, bei der höheren Dichte von 300.000 Zellen/ml auszusäen. Gelegentlich werden Fehler bei der Mustergenerierung, die nicht früher im Protokoll erkannt werden, beim Seeding von hESCs sichtbar. Ein solcher Fehler ist das Auslaufen der Ligandenlösung unter der Schablone aufgrund des schlechten Kontakts mit dem Coverslip. Dies führt letztlich dazu, dass Ligand in Regionen des Polyacrylamids außerhalb der gewünschten Geometrien übertragen wird und das ungehinderte Wachstum von hESCs bei der Aussaat (Abbildung 4C).
Abbildung 1: Musterung von ECM-Ligand auf säuregewaschene Deckellipsen und Übertragung auf Polyacrylamid-Hydrogele. (A) Schematische Darstellung des Protokolls zur Musterung von ECM-Ligand auf säuregewaschenen Deckellipsen und überträgt den gemusterten Ligand auf Polyacrylamid-Hydrogele. (B) Immunfluoreszenzbilder von gemustertem ECM-Ligand auf säuregewaschenen Deckellipsen (links) und anschließender Übertragung auf Polyacrylamidhydrogel (rechts). Biotin-getaggtes Matrigel wurde auf den Deckzettel gemustert und vor der Übertragung auf Polyacrylamid mit Alexa Fluor 555 Streptavidin beschriftet. Eintsets zeigen eine verkleinerte Ansicht der generierten vollständigen Muster an. (C) Repräsentative fluoreszierende Bilder, die Musterdefekte von Liganden auf dem Glasdeckel zeigen. Diese resultieren aus häufigen Fehlern im Protokoll, wie z. B. dem Auslaufen der Ligandenlösung außerhalb der gemusterten Geometrie (oben, Pfeil zeigt Die Stelle des Lecks) und dem Einfangen von Luftblasen innerhalb der gemusterten Geometrien der Schablone beim Hinzufügen der Ligandenlösung ( unten, Pfeil zeigt Stelle der Luftblase). Alle Skalenbalken = 500 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Aussaat von hESCs auf gemusterte Polyacrylamidhydrogele. Repräsentative Hellfeldbilder, die eine erfolgreiche Aussaat von hESCs auf Polyacrylamid-Hydrogelen mit gemusterter Liganden belegen. Die Zeitleiste oben zeigt die Reihe von Medienänderungen an, die zum Entfernen nicht angefügter Zellen und zum Verdünnen des Y27632 verwendet werden. Beachten Sie, dass nach der ersten Aussaat Zellen stochastisch an verschiedenen Regionen innerhalb des gemusterten Liganden haften und sich dann vermehren, um die gemusterten Bereiche im Laufe von 72 h zu füllen. Skalenbalken = 500 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Regionale Lokalisierung von Traktionsspannungen und Immunfärbung von geschlossenen hESC-Kolonien. (A) Fluoreszierende Bilder von Mikrosphären innerhalb des Polyacrylamidhydrogels vor und nach der Aussaat von hESCs. (B) Repräsentative Partikelbild-Velocimetrie (PIV) Darstellung der Verschiebung von Mikrosphären durch Traktionsspannungen (links) und entsprechende rekonstruierte Traktionsspannungen (rechts). (C) Immunostainierung von geschlossenen hESC-Kolonien auf gemusterten Polyacrylamid-Hydrogelen, die die Fähigkeit nachweisen, die Lokalisierung von proteinen von Interesse mit Traktionsspannungen zu vergleichen. Alle Skalenbalken = 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Nicht ideale Ergebnisse, die durch alternative Methoden und Fehler erzielt werden. (A) Repräsentative fluoreszierende Bilder von ECM-Ligand, gemustert auf säuregewaschenen Abdeckungen durch Mikrokontaktdruck. (B) Hellfeldbilder von hESCs, die aufgrund unzureichender Zellhaftung keine ausgefüllten Kolonien bilden. Große Lücken, die in den Kolonien bei 24 h Nachsaat (Pfeile) verbleiben, sind ein Frühindikator für dieses Problem. (C) Hellfeldbilder von hESCs, die aufgrund von Musterfehlern, die zum Vorhandensein von Liganden außerhalb der gewünschten Geometrien führten, keine begrenzten Kolonien bilden. Alle Skalenbalken = 500 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Beispiel SU8 Wafer Fabrication | |
| 1. Spin Coat Wafer mit SU8-3050 | Drehen bei 1.000 U/min für 30 s |
| 2. Soft back wafer auf Hot Plate | i. 3 min bei 65 °C |
| ii. 45 min bei 95 °C | |
| iii. 3 min bei 65 °C | |
| iv. Auf Raumtemperatur abkühlen | |
| 3. Expose in Maske Aligner | i.Align Wafer und Fotomaske in Maske Aligner |
| Ⅱ. Belichten mit Energie von 250 mJ/cm2 | |
| • z.B. für Lampe mit einer Intensität von 11 mW/cm2,belichten für 23 s | |
| 4. Post-Exposition backen auf heißer Platte | i. 1 min bei 65 °C |
| ii.15 min bei 95 °C | |
| iii. 1 min bei 65 °C | |
| Iv. Kühl auf Raumtemperatur | |
| 5. Entwickeln | i. Rührung in SU8 Entwickler, ca. 5-10 min |
| Ⅱ. Prüfen Sie die Entwicklung mit Isopropylalkohol (IPA) | |
| • Wenn die IPA-Spülung unterentwickelt ist, | |
| 6. Hartes Backen auf Kochplatte (optional) | 1-2 h bei 150 °C |
Tabelle 1: Beispiel SU8 Wafer Fertigungsprotokoll. Siliziumwafer, die zum Generieren von PDMS-Stempeln verwendet werden, und nachfolgende Schablonen wurden mit den in dieser Tabelle beschriebenen Schritten hergestellt. Dieses Protokoll wurde mit dem Datenblatt SU8 3000 mit dem Ziel erstellt, eine Foliendicke von ca. 100-250 m zu erzeugen.
| Polyacrylamid-Gel-Formulierungen | |||||||||
| Volumen für 1 ml Komplettlösung | |||||||||
| Elastischer Modul (Pa) | End % Acrylamid | End % Bis-Acrylamid | ddH2O (L) | 40% Acrylamid (l) | 2% Bis-Acrylamid (l) | 10x PBS (L) | 1% TEMED in ddH2O (l) | Mikrosphären 0,5% Feststoffe in ddH2O (l) | 1% PPS in ddH2O (l) |
| 1050 | 3 | 0.1 | 565 | 75 | 50 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 2700 | 7.5 | 0.035 | 485 | 187.5 | 17.5 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 4000 | 7.5 | 0.05 | 477.5 | 187.5 | 25 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 6000 | 7.5 | 0.07 | 467.5 | 187.5 | 35 | 100 | 75 | 60 | 75 |
Tabelle 2: Polyacrylamid-Gel-Formulierungen. Volumen von Komponenten zur Erzeugung von Polyacrylamid-Hydrogelen verschiedener elastischer Moduli mit fluoreszierenden Mikrosphären für TFM. Die Volumina können je nach benötigter Polyacrylamidlösung nach oben oder unten skaliert werden. Alle Komponenten mit Ausnahme der fluoreszierenden Mikrosphären und PPS werden vor der Entgasung miteinander vermischt. PBS = phosphatgepufferte Saline, TEMED = Tetramethylethylendiamin, PPS = Kaliumpersulfat.
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Discussion
Um ein langes und detailliertes Protokoll zu vereinfachen, besteht diese Methode aus drei kritischen Stufen: 1) Erzeugung von ECM-Ligand auf Glasabdeckungen, 2) Übertragung der Muster auf Polyacrylamid-Hydrogele während der Polymerisation des Gels und 3) Saat-HESCs auf der gemusterten Hydrogel. Es gibt kritische Schritte, die in jeder dieser drei Phasen berücksichtigt werden müssen. Um auf den Glasabdeckungen Hochtreuemuster zu erzeugen, muss die Schablone fest auf den Deckelbeschlag gedrückt werden, um ein Auslaufen der Ligandenlösung zu verhindern, und alle Luftblasen müssen nach Zugabe einer Ligandenlösung an der Oberfläche der Schablone ( Abbildung 1C). Wenn Die Ligandlösung durch die Schablone durch einen schlechten Kontakt mit dem Deckelschliff austritt, wird Ligand auf die gesamte Oberfläche des Polyacrylamidhydrogels übertragen und hESCs werden nicht auf die gewünschte Koloniegeometrie beschränkt (Abbildung 4C). Der wichtigste Schritt bei der Übertragung des gemusterten Ligands auf Polyacrylamid besteht darin, den oberen Deckelrutsch sanft vom Hydrogel zu trennen, während alle Komponenten in PBS versinken. Bleibt das Hydrogel während der Trennung nicht unter Wasser, können die Muster vollständig zerstört werden. Wenn die Trennung zu schnell erfolgt, kann die Oberfläche des Hydrogels zerreißen oder anderweitig beschädigt werden. Je weicher das Hydrogel, desto mehr ist es für Schäden während der Trennung gefährdet. Schließlich muss der Benutzer beim Medienaustausch während der Aussaat und Kultur von hESCs auf den gemusterten Hydrogelen sehr sorgfältig Pipette. Die hESCs bleiben während des gesamten Protokolls lose eingehalten und die gemusterten Kolonien können leicht durch nachlässiges oder überstürztes Pipettieren gestört werden.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen kritischen Schritten gibt es eine Reihe weiterer Schritte, die änderungen und beheben müssen, wenn dieses Protokoll für verschiedene Anwendungen angepasst wird. Während die hier gezeigten Muster auf der Längenskala von Hunderten von Mikrometern bis zu einem Millimeter liegen, ermöglicht die Erzeugung gemusterter Features auf Siliziumwafern mit Transparenz-Photomasken und negativem Photoresist Feature-Größen bis zu 7-10 m. Somit könnte dieses Protokoll angepasst werden, um die Geometrie einzelner Zellen oder kleinerer Kolonien einiger Zellen auf konforme Substrate zu beschränken.
Zwei Parameter, die bei der Anpassung dieses Protokolls für verschiedene Zelltypen wahrscheinlich optimiert werden müssen, sind die Art des verwendeten ECM-Ligands und die Konzentration des Liganden in Lösung während der Adsorption an die Glasabdeckung, die durch die Schablonen rutscht. Eine Gesamtligadenkonzentration von 250 g/ml reichte aus, um homogene Matrigelmuster zu erzeugen und die Anhaftung von hESCs zu erleichtern (Abbildung 1B und Abbildung 2), obwohl es möglich sein kann, ähnliche Ergebnisse mit niedrigeren Konzentrationen. Andererseits kann es notwendig sein, die Ligandenkonzentration für Zelltypen, die weniger haftende sind, oder für Anwendungen, die kürzere Inkubationszeiten erfordern, weiter zu erhöhen. Erhöhte Konzentration von Liganden kann auch für verschiedene ECM Liganden erforderlich sein, wie Fibronectin oder Kollagen, die weniger hydrophob als Matrigel sind und daher nicht so stark an das Hydrogel adsorbieren dürfen. Da die Übertragung von Liganden von Deckelrutsch zu Hydrogel während der Polymerisation des Hydrogels erfolgt, sind gängige Techniken zur robusten Vernetzung des ECM-Ligands mit der Hydrogeloberfläche (z. B. Sulfo-SANPAH-Behandlung) nicht möglich. Die Verwendung von fluoreszierend gekennzeichneten ECM-Liganden zur Visualisierung der Muster bei jedem Schritt des Protokolls ist äußerst hilfreich bei der Optimierung und Fehlerbehebung dieser Parameter.
Darüber hinaus kann das Protokoll zum Aussäen von Zellen je nach Zelltyp und verwendeten Medienbedingungen optimiert werden. Für Zellen, die schneller oder effizienter haften, kann eine geringere Saatdichte erforderlich sein, um Zellzellverklebungen zu verhindern, die sich zwischen Mustern erstrecken und zu Aggregaten und nicht zu gemusterten Monolayer-Kolonien führen. Für Zellen, die eine sehr schlechte Anhaftung aufweisen, kann eine größere Aussaatdichte oder eine längere Zeitvorlaufzeit vor dem anfänglichen Medienaustausch erforderlich sein, um die vollständige Bildung von begrenzten Kolonien zu erleichtern (Abbildung 4B).
Die Hauptbeschränkung dieser Methode ist ihre technische Komplexität, die im Vergleich zu ähnlichen Methoden, bei denen Zellen auf gemusterten Glassubstraten zerstückt sind, relativ wenig Durchsatzergebnisse. Dieser Nachteil wird jedoch durch die physiologische Relevanz, die durch die Kultivierung begrenzter hESC-Kolonien auf konformen Substraten erreicht wird, bei weitem aufgewogen. Durch die effektive Rekapitulation der mechanischen Eigenschaften des frühen Embryos sind wir in der Lage, die Prozesse, die zur Selbstorganisation der primären Keimschichten führen, besser zu modellieren und zu verstehen.
Ein weiterer Vorteil der Beschränkung von hESC-Kolonien auf Polyacrylamid-Hydrogele besteht darin, dass es den Einsatz von TFM ermöglicht, um den Zusammenhang zwischen der Organisation einer hESC-Kolonie als Modell des frühen Embryos und der Verteilung zellgenerierter Kräfte zu untersuchen, die Morphogenese und Zellschicksalsspezifikation. Die Einziehung von hESC-Kolonien führt zu Verteilungen von Traktionsspannungen, die von der Koloniegeometrie abhängig sind (Abbildung 3B). Trotz der Ungleichmäßigkeit dieser Traktionsspannungen bleiben Zellen in den Kolonien unter Wartungsbedingungen pluripotent (Abbildung 3C). Wir gehen jedoch davon aus, dass die Traktionsspannungsverteilungen an der Regulierung von Mustern der Zellschicksalsspezifikation beteiligt sein können, indem die Reaktion auf Induktionshinweise, wie lösliche Morphogene, abgestimmt wird. Wir gehen davon aus, dass diese Methode es uns und anderen Gruppen ermöglichen wird, den frühen menschlichen Embryo mit hESCs besser zu modellieren, was zu einem umfassenderen Verständnis der grundlegenden Prozesse führt, die der menschlichen Embryogenese zugrunde liegen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir möchten die Finanzierung aus dem CIRM-Zuschuss RB5-07409 bestätigen. J.M.M. dankt FuiBoon Kai, Dhruv Thakar und Roger Oria für verschiedene Diskussionen, die die Generierung und Fehlerbehebung dieser Methode geleitet haben. J.M.M. dankt auch dem UCSF Discovery Fellowship für die kontinuierliche Unterstützung seiner Arbeit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
References
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