Summary
Os ligantes da matriz extracellular podem ser modelados em hidrogéis do poliacrilamida para permitir a cultura de pilhas de haste embrionário humanas em colônias confinadas em carcaças complacentes. Este método pode ser combinado com a microscopia da força da tração e os ensaios bioquímicos para examinar o interação entre a geometria do tecido, as forças pilha-geradas, e a especificação do Fate.
Abstract
As células-tronco embrionárias humanas demonstram uma capacidade única de responder a morfogênios in vitro por padrões de autoorganização da especificação de destino celular que correspondem à formação de camada germinativa primária durante a embriogênese. Assim, essas células representam uma ferramenta poderosa com a qual examinar os mecanismos que impulsionam o desenvolvimento humano precoce. Desenvolvemos um método para cultura de células-tronco embrionárias humanas em colônias confinadas em substratos complacentes que fornecem controle sobre a geometria das colônias e seu ambiente mecânico, a fim de recapitular os parâmetros físicos que embriogênese fundamentam. A característica chave deste método é a habilidade de gerar hidrogéis do poliacrilamida com testes padrões definidos do ligante extracelular da matriz na superfície para promover o acessório da pilha. Isto é conseguido fabricando stencils com os padrões geométricos desejados, usando esses estênceis para criar padrões de ligante de matriz extracelular em coberturas de vidro, e Transferindo esses padrões para hidrogéis de poliacrilamida durante a polimerização. Este método também é compatível com a microscopia de força de tração, permitindo ao usuário medir e mapear a distribuição de forças geradas por células dentro das colônias confinadas. Em combinação com ensaios bioquímicos padrão, essas medições podem ser usadas para examinar o papel que as pistas mecânicas desempenham na especificação do destino e na morfogênese durante o desenvolvimento humano precoce.
Introduction
Células-tronco embrionárias humanas (hESCs) possuem grande promessa para uso em aplicações de medicina regenerativa e de engenharia de tecidos. A natureza pluripotente destas células dá-lhes a capacidade de se diferenciar em qualquer tipo de célula adulta. Enquanto grandes avanços foram feitos na direção do destino de hESCs a tipos de células particulares, manteve-se muito difícil de gerar tecidos inteiros ou órgãos de novo1,2,3,4, a 5. Isto é devido, em grande parte, a uma compreensão limitada dos mecanismos que impulsionam a formação destes tecidos durante o desenvolvimento humano. A fim de preencher essa lacuna no conhecimento, vários métodos surgiram nos últimos anos para modelar o embrião precoce e estágios subsequentes de desenvolvimento com células-tronco embrionárias6,7,8,9 ,10,11,12,13.
Logo após a derivação das primeiras linhagens de hESC14, foi demonstrado que corpos embrióides formados a partir de hESCs eram capazes de produzir espontaneamente células das três camadas germinativas primárias6. No entanto, devido à inerente falta de controle sobre o tamanho e a morfologia dos corpos embrióides, a organização das camadas germinativas variou significativamente e não combinou com a organização do embrião precoce. Mais recentemente, Warmflash et al. desenvolveram um método para confinar colônias de hESCs em substratos de vidro via micropadronização, proporcionando controle e consistência sobre o tamanho e a geometria das colônias8. Na presença de BMP4, um What importante no desenvolvimento adiantado, estas colônias confinadas eram capazes de testes padrões reprodutíveis Self-organizando da especificação aos destinos que representam as camadas de germe preliminares. Embora isso tenha proporcionado um modelo útil para estudar os mecanismos pelos quais se estabelecem as camadas germinativas primárias, os padrões de especificação do destino não correspondem precisamente à organização e à morfogênese observadas durante a embriogênese15. Uma recapitulação mais fiel do desenvolvimento embrionário precoce foi conseguida através da incorporação de hESCs em uma matriz extracelular tridimensional (ECM) do matrigel11, proporcionando a evidência mais forte até à data para a capacidade de hESCs se AutoOrganizar e modelar estágios iniciais da embriogênese ex vivo. No entanto, esse método produz resultados inconsistentes e, portanto, é incompatível com um número de ensaios que poderiam ser usados para revelar os mecanismos subjacentes de autoorganização e especificação de destino.
Diante desses métodos existentes e suas respectivas limitações, buscou-se desenvolver um método de cultivo reacional de colônias de hESC de geometrias definidas em condições que modelem o ambiente extracelular do embrião precoce. Para isso, utilizamos hidrogéis de poliacrilamida de elasticidade ajustável para controlar as propriedades mecânicas do substrato. Usando microscopia de força atômica em embriões de frango em estágio de gastrulação, descobrimos que a elasticidade do epiblasto variou de centenas de pascals a alguns kilopascals. Assim, concentramos-nos na geração de hidrogéis de poliacrilamida com elasticidade nesta faixa para servir como substrato para colônias de hESC. Nós modificamos nossos métodos anteriores para a cultura de hESCs em hidrogéis de poliacrilamida7,9 para fornecer um controle robusto sobre a geometria das colônias. Nós conseguimos este pela primeira padronização ligands ECM, ou seja, matrigel, em coberturas de vidro através de stencils microfabricados, como relatado anteriormente16. Nós projetamos então uma técnica nova para transferir o ligante modelado à superfície de hidrogéis do poliacrilamida durante a polimerização. O método que descrevemos aqui envolve o uso de fotolitografia para fabricar uma bolacha de silício com os padrões geométricos desejados, criando selos de teses características geométricas com polidimetilsiloxano (PDMS), e usando esses selos para gerar os estênceis que em última análise, permitir a padronização de ligante na superfície de coberturas de vidro e transferência para poliacrilamida.
Além de recapitular o ambiente mecânico do embrião precoce, confinando colônias de hESC em poliacrilamida possibilita a mensuração de forças geradas por células com microscopia de força de tração (TFM), conforme relatado em nosso método anterior9. Em resumo, os grânulos fluorescentes podem ser encaixados no poliacrilamida e ser usados como marcadores de a. As forças geradas por células são calculadas por imagem do deslocamento dessas esferas após a semeadura de hESCs no substrato padronizado. Além disso, os mapas de força de tração resultantes podem ser combinados com ensaios tradicionais, como imunocoloração, para examinar como a distribuição de forças geradas por células em colônias de hESC confinadas pode regular ou modular a sinalização a jusante. Nós esperamos que estes métodos revelarão que as forças mecânicas jogam um papel crítico no padronização da especificação do Fate da pilha durante o desenvolvimento embrionário adiantado que é negligenciado atualmente.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui relativos ao uso de hESCs foram aprovados pelo Comitê humano do Gamete, do embrião e da pesquisa da pilha de haste (GESCR) na Universidade de Califórnia San Francisco.
1. preparação de wafer de silício com características geométricas
- Crie uma máscara fotográfica com recursos geométricos desejados. Use o software de desenho assistido por computador para projetar os recursos. Para o uso com photoresist negativo, faça as características opacas e o restante da máscara transparente.
Nota: para a padronização em coberturas de 18 mm de diâmetro, as feições de grupo para cada condição experimental em áreas de 10 x 10 mm para garantir que os estênceis gerados na etapa 3 caiam sobre as coberturas. - Spin Coat fotoresistente negativo para uma bolacha de silício de 100 mm. Use a folha de dados fotororesista para determinar a velocidade e o comprimento da rotação para gerar uma espessura de filme de 100-250 μm.
Nota: a espessura do filme deve ser ajustada de tal forma que a proporção da largura dos padrões para a altura do estêncil é o mais próximo de 1:1 possível. No entanto, recomendamos uma espessura mínima de 100 μm, pois nada menos produz estênceis delicados que facilmente rasgam. - Processe o fotororesista de acordo com a folha de dados do produto. Isto envolve tipicamente um cozer macio, exposição UV com Fotomáscara em um alinhador da máscara, cozer da exposição do borne, desenvolvimento, e cozer duro. Como exemplo, o procedimento usado para processar os wafers usados neste protocolo é esboçado na tabela 1.
Nota: ser cauteloso ao manusear bolachas de silício como eles são frágeis. Uma vez gerados, as bolachas podem ser usadas repetidamente, desde que não sejam danificadas.
2. preparação de coberturas
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Preparação de coberturas "Top" lavadas a ácido
- Coloc 18 milímetros de diâmetro #1 COVERSLIP da espessura em um prato de Petri de vidro. O número apropriado de coberturas depende do tamanho do prato. Para um prato de 100 mm, prepare 50-100 COVERSLIP de cada vez. As quantidades de volume dadas através do restante desta seção correspondem a um prato de 100 mm.
- Adicione 20 mL de HCl de 1 M à placa de Petri e agite delicadamente o prato para dispersar os COVERSLIP. Assegure-se de que todas as coberturas estejam submersas e libertem bolhas de ar entre as lamínulas. Incubar durante a noite à temperatura ambiente com agitação suave.
Cuidado: o HCl é ácido e corrosivo. Tenha cuidado e use EPI apropriados ao trabalhar com HCl. - Decant HCl do prato. Adicione 20 mL de água ultrapura e lave com agitação suave durante 10 min. descarte a água e repita para um total de cinco lavagens.
- Depois de descartar a lavagem final, adicione 20 mL de etanol a 100% ao prato. Usando fórceps, retire as lamínulas individualmente e arranje entre dois pedaços de papel de filtro para secar.
- Armazene coberturas secas em um recipiente selado. As coberturas com lavagem ácida podem ser preparadas com antecedência e armazenadas por um mês ou mais em condições livres de poeira.
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Preparação de COVERSLIP "Bottom" ativado por glutaraldeído
Nota: refira métodos precedentes para detalhes adicionais7,9.- Coloque 18 mm de diâmetro #1 COVERSLIP de espessura em uma placa de Petri.
- Adicionar 20 mL de 0,2 M HCl para a placa de Petri e agitar suavemente o prato para dispersar os lamínulas. Assegure-se de que todas as coberturas estejam submersas e libertem bolhas de ar entre as lamínulas. Incubar durante a noite à temperatura ambiente com agitação suave.
- Decant HCl do prato. Adicione 20 mL de água ultrapura e lave com agitação suave durante 10 min. descarte a água e repita para um total de cinco lavagens.
- Depois de descartar a lavagem final, adicione 20 mL de NaOH de 0,1 M e agite suavemente para dispersar e submergir as coberturas. Incubar à temperatura ambiente com agitação suave durante 1 h.
- Decant NaOH do prato. Adicione 20 mL de água ultrapura e lave com agitação suave durante 10 min. descarte a água e repita para um total de cinco lavagens.
- Após descartar a lavagem final, acrescente 20 mL de uma diluição de 1:200 de 3-aminopropiltrimetoxisilano em água ultrapura e agite suavemente para dispersar e submergir as coberturas. Incubar à temperatura ambiente com agitação suave durante 1 h ou durante a noite.
PRECAUÇÃO: 3-aminopropiltrimetoxisilano é inflamável e pode provocar irritação cutânea. Manuseie com cuidado, use EPI apropriados e descarte os resíduos de acordo com os regulamentos de descarte local. - Decantar a solução diluída de 3-aminopropyltrimethoxysilane do prato. Adicione 20 mL de água ultrapura e lave com agitação suave durante 10 min. descarte a água e repita para um total de pelo menos cinco lavagens. É crítico remover todo o 3-aminopropyltrimethoxysilane antes de prosseguir.
- Após descartar a lavagem final, adicione 20 mL de uma diluição de 1:140 de glutaraldeído a 70% em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) e agite suavemente para dispersar e submergir os lamínulas. Incubar à temperatura ambiente com agitação suave durante 1 h ou durante a noite.
Cuidado: 70% glutaraldeído é tóxico e pode causar irritação da pele. Manuseie com cuidado, use EPI apropriados e descarte os resíduos de acordo com os regulamentos de descarte local. - Decantar a solução de glutaraldeído diluído do prato. Adicione 20 mL de água ultrapura e lave com agitação suave durante 10 min. descarte a água e repita para um total de cinco lavagens.
- Depois de descartar a lavagem final, adicione 20 mL de etanol a 100%. Usando fórceps, retire as lamínulas individualmente e arranje entre dois pedaços de papel de filtro para secar.
- Armazene coberturas secas em um recipiente selado. As coberturas ativadas por glutaraldeído podem ser preparadas com antecedência e armazenadas por até seis meses.
3. geração de stencils para padronização de ligante ECM
- Gerando selos intermediários de polidimetilsiloxano (PDMS)
- Misture a base de PDMS com o agente de cura de PDMS em uma relação 10:1, pelo peso. Homogeneizar.
Nota: para a aplicação inicial de PDMS, prepare aproximadamente 100 g de PDMS para encher um prato de 100 mm. Para aplicações subsequentes, remova o PDMS apenas do centro do prato onde as características da bolacha de silício estão localizadas e prepare 20-30 g de novos PDMS. - Degas a mistura PDMS em um dessecador para 30-60 min ou até que todas as bolhas de ar são removidas.
- Coloque a bolacha de silício modificada da etapa 1 em um prato de plástico de 100 mm. Lentamente e uniformemente despeje a mistura PDMS sobre a superfície do wafer. Bata o prato na superfície de trabalho para liberar quaisquer bolhas de ar da superfície do wafer.
- Degas a mistura PDMS derramado sobre a bolacha por 10 min ou até que todas as bolhas de ar são removidos ou ter chegado à superfície do PDMS.
- Asse o PDMS a 70 ° c por 2 h. deixe esfriar a temperatura ambiente.
- Usando um bisturi ou cortador de caixa, recorte a seção de PDMS do centro do prato que contém as características geométricas.
- Corte o PDMS em cerca de 10 x 10 mm quadrados, cada um contendo os recursos para uma única condição experimental. Estes são referidos como "selos" nas etapas subseqüentes do protocolo.
- Misture a base de PDMS com o agente de cura de PDMS em uma relação 10:1, pelo peso. Homogeneizar.
- Gerando lajes planas de PDMS
- Misture a base de PDMS com o agente de cura de PDMS em uma relação 8:1, pelo peso. Prepare aproximadamente 20 g para cada prato de 100 mm a ser usado. Homogeneizar.
- Degas a mistura PDMS em um dessecador para 30-60 min ou até que todas as bolhas de ar são removidas.
- Lentamente e uniformemente despeje o PDMS em um limpo 100 mm prato. Bata o prato na superfície de trabalho para liberar quaisquer bolhas de ar.
- Asse o PDMS a 70 ° c por 2 h. deixe esfriar a temperatura ambiente.
- Retire o PDMS do prato. Inverta de tal forma que a superfície do PDMS que estava em contato com a parte inferior do prato está voltada para cima.
- Para cada carimbo gerado na etapa 3,1, corte um quadrado de 15 x 15 mm de PDMS. Estes são referidos como "lajes lisas" em etapas subseqüentes do protocolo.
- Gerando stencils
- Organize lajes planas de PDMS na tampa de um prato de 150 mm, ou outra superfície plana para facilitar a manipulação. Assegure espaçamento suficiente entre lajes (por exemplo, para um prato de 150 mm, organize nove lajes planas com espaçamento mesmo).
- Inverta cada selo gerado na etapa 3,1 em uma laje Lisa de PDMS, tais que as características no selo estão em contacto com a laje Lisa de PDMS. Pressione suavemente na parte superior do carimbo com fórceps para garantir mesmo o contato.
- Cuidadosamente prop a tampa segurando PDMS carimbo/laje pares na base do prato, de tal forma que a tampa repousa em um ângulo. Isto ajuda a wicking do polímero UV-curable na etapa seguinte.
- Coloc uma gota pequena do polímero UV-curable na relação superior de cada par do selo/laje. O polímero será perverso entre os dois por tensão superficial, assistido pela gravidade.
Nota: muitos polímeros UV-curáveis diferentes podem trabalhar neste protocolo. Nós selecionamos o adesivo ótico 74 de Norland para as seguintes propriedades: i) cura rápida em cima da exposição à luz UV, II) remoção fácil dos selos de PDMS em cima da cura, III) adesão robusta aos COVERSLIP de vidro com pressão manual. - Uma vez que o polímero foi completamente iníquo através, coloc a tampa com pares do selo/laje horizontalmente na superfície de trabalho. Coloc uma gota pequena do polímero UV-curable em cada um dos três lados restantes de cada relação do selo/laje.
- Usando uma ponta de pipeta de 200 μL, conecte as gotas do polímero em torno das bordas da relação do selo/laje. Isso cria uma borda que irá armazenar a solução de ligante na etapa 4.
Nota: tenha cuidado ao trabalhar o polímero em torno das bordas do carimbo. Se a relação do selo/laje é interrompida, o polímero pavio as características e o estêncil não formarão corretamente. - Coloc com cuidado os pares do selo/laje em uma caixa da UV-esterilização. Use a configuração de energia estéril "Str" e expor por 10 min.
- Retire os pares de carimbo/laje da caixa de esterilização por UV. Usando dois pares de fórceps, remova delicadamente o selo de PDMS ao segurar a laje Lisa e o estêncil que deram forma do polímero UV-curable.
- Usando fórceps, Retire cuidadosamente o estêncil e inverta-o de tal forma que a superfície que estava em contato com a laje plana do PDMS está voltada para cima.
Nota: os estênceis são delicados. Tenha cuidado ao entregá-los, especialmente enquanto inicialmente removê-los do PDMS, de modo que eles não rasgar. - Coloc os stencils invertidos de volta em uma caixa da UV-esterilização. Use a configuração de energia estéril "Str" e expor por 3 min.
4. padronização de ligante ECM em COVERSLIP
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Prensagem de estênceis em coberturas com lavagem ácida
- Coloc um lamela ácido-lavado para cada estêncil em uma parte limpa de película do laboratório.
- Usando o fórceps, coloc com cuidado cada estêncil, liso-lado-para baixo, em um COVERSLIP ácido-lavado. Coloque de tal forma que os recursos estão centralizados na lamínula.
- Coloque um pequeno pedaço de filme de laboratório em cima de cada estêncil. Pressione firmemente e uniformente para baixo no estêncil para criar o contato forte entre o estêncil e o COVERSLIP.
Nota: este é um passo crítico! Pressione firmemente e em toda a superfície do estêncil. Se o contato suficiente não é criado, a solução do ligante vazará entre o estêncil e os COVERSLIP e o padronização falhará. OPCIONAL: para confirmar o contato suficiente entre o estêncil e a lamínula, Pipetar 100 μL de água estéril ultrapura sobre a superfície de cada estêncil e incubar à temperatura ambiente. Depois de 1 h, verifique se há vazamento. Aspirar a água de stencils com sucesso ligado e proceder.
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Plasma que limpa a superfície dos COVERSLIP stenciled para aumentar o Hidrofilia
- Coloc os COVERSLIP com os stencils em um líquido de limpeza do plasma. Aplique plasma de alta potência por 30 s.
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Preparação da solução de ligantes ECM
Nota: todas as etapas subsequentes devem ser concluídas em condições estéreis, se possível.- Coloque estéril 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8,0 solução no gelo. Uma vez gelada, adicione matrigel e colágeno para atingir concentrações de 225 μg/mL e 25 μg/mL, respectivamente. Opcional: para a solução de problemas ou para a visualização do ligante, inclua um ligante cDNAs etiquetado na solução do ligante.
- Nota: os ligantes diferentes do ECM podem ser usados com este método. Para diferentes ligantes, pode ser necessária uma otimização adicional para determinar a concentração ideal, o tempo de incubação e a temperatura de incubação. Consulte a seção de discussão para obter mais informações.
- Pipeta a solução do ligante na superfície de cada estêncil. Para stencils feitos de 10 x 10 mm quadrados selos, aplique 100 μL por estêncil.
- Verifique se há bolhas de ar em recursos de estêncil. Se necessário, use fórceps com ponta fina ou uma ponteira de pipeta de 2 μL para remover as bolhas de ar das feições.
Nota: este é um passo crítico! Se as bolhas de ar permanecerem presas na superfície da lamínula, o ligante não adsorverá a superfície e o padrão resultante será incompleto. - Coloc os COVERSLIP stenciled com o ligante em um prato, enrole com película do laboratório, e incubar em 4 ° c durante a noite.
- Coloque estéril 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8,0 solução no gelo. Uma vez gelada, adicione matrigel e colágeno para atingir concentrações de 225 μg/mL e 25 μg/mL, respectivamente. Opcional: para a solução de problemas ou para a visualização do ligante, inclua um ligante cDNAs etiquetado na solução do ligante.
5. transferência de ligante para gel de poliacrilamida
- Removendo a solução de ligante e o estêncil de cada lamínula
- Aspirar a solução de ligantes da superfície de um estêncil. A solução de ligand pode ser coletada e armazenada a 4 ° c e reutilizada por até um mês.
- Usando o fórceps, submergir momentaneamente o lamela com o estêncil em um prato que contem PBS estéril para lavar.
- Submergir momentaneamente o lamela com o estêncil em um segundo prato do PBS estéril para lavar.
- Remova o estêncil da superfície da lamínula. Tenha cuidado para não quebrar a lamínula.
- Submergir momentaneamente o lamela em um prato que contem a água estéril do ultrapura para remover os sais das lavas de PBS. Bata a borda do lamela a uma tarefa delicada limpe para pavio afastado o excesso de água.
- Seque a lamínula um gás inerte, como o nitrogênio. Marque a parte inferior da lamínula para manter o controle da orientação a partir deste ponto para a frente. Tenha cuidado para manter o lado estampado virado para cima.
- Repita as etapas 5.1.1 através de 5.1.6 para cada COVERSLIP stenciled.
- Fazer hidrogéis de poliacrilamida com coberturas estampadas
Nota: consulte os métodos anteriores para obter mais detalhes7,9 esterilizar todos os suportes de tampa, tubos, e espaçadores utilizados para fazer géis de poliacrilamida por lavagem com 10% lixívia durante a noite, enxaguar com água pelo menos cinco vezes para remover lixívia, e lavar brevemente em 70% etanol. Coloc todas as partes em limpezas delicadas da tarefa em um armário estéril do biossegurança para secar antes de usar.- Prepare a solução de poliacrilamida para obter a elasticidade do hidrogel desejada (tabela 2). Misture todos os componentes, exceto as microesferas fluorescentes e o persulfato de potássio (PPS).
Nota: Prepare 1% de solução de persulfato de potássio fresca cada vez. - Degas a solução de poliacrilamida, microesferas e PPS em tubos separados vácuo por 30 min.
- Para cada lamínula estampada, prepare uma lamínula de "fundo" ativada por glutaraldeído com um espaçador (diâmetro externo de 18 mm, diâmetro interno de 14 mm) colocado na parte superior.
- Após a desgaseificação, rapidamente proceda microesferas e adicionar o volume apropriado para a solução de poliacrilamida. Misture com pipetagem para cima e para baixo, tendo cuidado para não introduzir bolhas de ar. Brevemente SONICATE.
- Adicione o volume adequado de PPS à solução de poliacrilamida. Pipeta para cima e para baixo para misturar a solução, tendo o cuidado de não introduzir bolhas de ar.
Nota: após ter adicionado o PPS, trabalhe ràpida para terminar etapas 5.2.6 com 5.2.11 antes que o poliacrilamida polimerize. - Pipetar 75-150 μL (dependendo da espessura do espaçador) para o centro de cada lamínula ativada por glutaraldeído.
- Usando fórceps, coloc um lamela modelado em cada lamela glutaraldehyde-ativado com poliacrilamida e espaçador, tais que o ligante modelado enfrenta a solução do poliacrilamida. Se a solução de poliacrilamida suficiente foi adicionada, a tensão superficial vai pavio a poliacrilamida entre as duas coberturas e não bolhas de ar estarão presentes.
- Pick up cada poliacrilamida "sanduíche" e cuidadosamente tocar o lado a uma tarefa delicada Limpe a pavio afastado excesso de solução de poliacrilamida.
- Coloc com cuidado cada "sanduíche" do poliacrilamida em um suporte do tampão com as linhas que são compatíveis com os tubos cónicos-inferiores de 15 ml. A orientação deve ser tal que a parte inferior da lamínula de glutaraldeído esteja em contacto com a parte inferior do suporte do tampão, e a lamínula estampada esteja no topo.
- Aparafuse um tubo de fundo cônico de 15 mL em cada suporte de tampa para segurar a poliacrilamida "sanduíches" no lugar. Os tubos devem ser apertados para evitar vazamento, mas tenha cuidado para não apertar demais e quebrar as lamínulas.
- Centrifugue os "sanduíches" do poliacrilamida nos tubos em balanç-baldes em 200 x g por 10 minutos na temperatura ambiente. Retire os tubos da centrífuga e coloque em racks de tubos para manter a orientação para um adicional de 50 min para garantir a polimerização completa. Mantenha coberto com a folha para impedir o branqueamento de microesferas fluorescentes.
Nota: a centrifugação é crítica ao usar este método para executar o TFM. A força centrífuga move todas as microesferas para um único plano, que acabará por ser logo abaixo da superfície do hidrogel. Isto é ideal para os deslocamentos da microesfera da imagem latente que são usados para calcular tensões pilha-geradas da tração. Se não estiver realizando TFM, microesferas podem ser deixadas de fora da solução de poliacrilamida e a polimerização pode ocorrer no de bancada sem centrifugação. - Remover poliacrilamida polimerizada "sanduíches" dos tubos e submergir em PBS em um prato de 100 mm. Enrole em filme de laboratório e incubar por 3 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° c.
- Prepare a solução de poliacrilamida para obter a elasticidade do hidrogel desejada (tabela 2). Misture todos os componentes, exceto as microesferas fluorescentes e o persulfato de potássio (PPS).
- Preparação de géis estampados para células de semeadura
- Use um bisturi e fórceps para remover cuidadosamente a lamínula estampada e o espaçador do "sanduíche" de poliacrilamida enquanto ele permanece submerso em PBS. O ligante estampado terá sido transferido para a poliacrilamida durante a polimerização e permanecerá após a remoção da lamínula. O gel do poliacrilamida permanecerá Unido ao COVERSLIP glutaraldehyde-ativado.
Nota: este é um passo crítico! O poliacrilamida deve ser submergido em PBS ao remover o lamela ou os testes padrões do ligante serão destruídos. - Coloque cada lamínula com poliacrilamida estampada em um suporte de tampa. Coloque uma junta (diâmetro externo de 18 mm, diâmetro interno de 14 mm) em cima da lamínula e em torno da poliacrilamida, onde o espaçador foi localizado. Aparafuse um tubo de fundo cônico de 15 mm no suporte da tampa, formando um poço com a poliacrilamida padronizada na parte inferior. Esses conjuntos se encaixam nos poços de uma placa padrão de 12 poços para fácil manuseio.
- Lave cada gel adicionando 500 μL de PBS à montagem do poço. Incubar durante 10 min à temperatura ambiente com agitação suave. Retire o PBS e repita duas vezes para um total de três lavas.
- Após a lavagem final de PBS, adicione 500 μL de mídia Knockout-DMEM a géis e incubar a 37 ° c durante a noite. Os géis podem ser mantidos a 37 ° c com mídia por até 5 dias antes da semeadura das células.
- O dia antes de semear as células, substitua Knockout-DMEM para a mídia completa KSR e incubar a 37 ° c durante a noite.
- Use um bisturi e fórceps para remover cuidadosamente a lamínula estampada e o espaçador do "sanduíche" de poliacrilamida enquanto ele permanece submerso em PBS. O ligante estampado terá sido transferido para a poliacrilamida durante a polimerização e permanecerá após a remoção da lamínula. O gel do poliacrilamida permanecerá Unido ao COVERSLIP glutaraldehyde-ativado.
6. culturing hESCs em géis modelados
Nota: se planear fixar amostras para a imunocoloração após o TFM, tome imagens de posições não estressadas da microfera antes das pilhas de semeadura. Neste caso, o ligante cDNAs etiquetado deve ser usado na etapa 4.3.1 de modo que as posições eventuais das pilhas sejam conhecidas antes que a semeadura e as microesferas possam ser imaged naquelas regiões.
- Mantenha culturas de hESC do estoque e culturas alimentador-livres secundárias preparadas em placas matrigel-revestidas em meios condicionados de KSR antes de semear em géis modelados do poliacrilamida como descrito previamente9.
Nota: gere a mídia KSR condicionada, cultivando fibroblastos embrionários do camundongo irradiado em meios KSR suplementados com 4 ng/mL de fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF). Coletar e substituir mídia a cada 24 h. - Aspirar a mídia de hESCs. Lave brevemente com a mídia Knockout-DMEM. Adicionar 0, 5% de Trypsin-EDTA suplementado com 10 μM Y27632 (inibidor da quinase de Rho) e incubar a 37 ° c por 5-10 min.
- Adicionar mídia com soro para inibir a tripsina. Aspirar delicadamente meios e pipeta sobre o prato para remover pilhas. Continue a pipetagem suavemente para remover todas as células e dissociar os clusters de células para uma única célula.
- Colete a suspensão celular e Centrifugue a 200 x g por 3 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuscite a pelota em um volume equivalente de mídia KSR para lavar. Centrifugador a 200 x g durante 3 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuscite o pellet em meio de KSR condicionado suplementado com 10 ng/mL de bFGF e 10 μM Y27632.
- Conte as células com um hemociômetro e ajuste a suspensão da célula para uma concentração de 300.000 células por mL. Pipete 500 μL da suspensão celular para cada gel modelado (150.000 células por gel).
- 3 h após a semeadura, use uma pipeta para aspirar cuidadosamente os meios de cada gel e substitua com os meios KSR condicionados frescos suplementados com 10 ng/mL bFGF e 10 μM Y27632. Isso remove as células em excesso que não aderiram às regiões padronizadas da poliacrilamida.
Nota: este é um passo crítico! Neste estágio as células serão frouxamente aderiram ao ligand padronizado. Tenha muito cuidado ao trocar mídia para não separar as células. A igualdade de cuidados deve ser tomada com cada um dos swaps de mídia nas etapas subsequentes. - 24 h após a semeadura, use uma pipeta para aspirar cuidadosamente a mídia e troca por meio de KSR condicionado suplementado com 10 ng/mL bFGF e 5 μM Y27632.
- 48 h após a semeadura, use uma pipeta para aspirar com cuidado os meios e a troca para meios condicionados de KSR suplementados com 10 ng/mL bFGF. Isto remove o inibidor da quinase de Rho da mídia e experimentos podem começar no dia seguinte, 72 h após a semeadura.
7. realizando TFM
- Quando desejado, execute TFM como descrito anteriormente9 em condições experimentais desejadas.
- Se as posições de microesfera não estressados foram fotografadas antes da semeadura das células, fixar as células após a tomada de posições de microesfera estressada e realizar imunocoloração para determinar a localização de proteínas de interesse em relação a regiões de forças de tração de alta e baixa.
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Representative Results
O principal desafio a ser superado na tentativa de cultura de hESCs em colônias de geometria controlada em substratos compatíveis é gerar um padrão homogêneo de ECM-ligand na superfície do substrato. A estratégia apresentada neste método envolve a primeira geração do padrão desejado na superfície de uma lamínula de vidro e, posteriormente, a transferência desse padrão para a superfície de um hidrogel de poliacrilamida durante a polimerização do gel (Figura 1 A).assim, é importante garantir que o padrão desejado é criado com sucesso na superfície da lamínula de vidro antes de proceder à polimerização do hidrogel e transferência do padrão (Figura 1B). Baseado na imagem latente de testes padrões fluorescentes do ligante transferidos ao polyacrylamide, o ligante parece estar atual somente em um único plano na superfície do polyacrylamide, embora nós não caracterizamos precisamente a espessura desta camada. Há dois tipos comuns de defeitos observados após a geração do padrão na lamínula de vidro, cada um com sua própria fonte de erro. O primeiro é o aparecimento de ligantes fluorescentes que se estende para além das margens do padrão desejado (Figura 1C, Top), que resulta do vazamento da solução de ligantes fluorescentes devido a uma pequena lágrima no estêncil ou vedação insuficiente do estêncil para a lamínula de vidro. O segundo é a aparência de um padrão incompleto (Figura 1C, Bottom), que é tipicamente devido a uma bolha de ar presa na interface de lamínula que impede a adsorção do ligante fluorescente.
A medida final de sucesso para este método é a capacidade de cultura de hESCs em geometrias desejadas nos hidrogéis estampados (Figura 2). A fim de conseguir isso, os hESCs são semeados em uma densidade relativamente alta (300.000 células/mL) na presença de um inibidor da quinase Rho (Y27632) e incubadas por 3 h para facilitar a adesão aos padrões de ligantes. A mídia é então substituída para remover células não aderidas. Ao longo do 72 h, o Y27632 é gradualmente diluído fora da mídia por uma série de trocas de mídia em 24 e 48 h pós-semeadura. Normalmente, os hESCs proliferam para completar as geometrias padronizadas por 48-72 h, de tal forma que os experimentos podem começar em 72 h após a semeadura, uma vez que o Y27632 é completamente removido da mídia.
A cultura de colônias de hESC em geometrias confinadas em hidrogéis de poliacrilamida permite a mensuração das forças de tração geradas por células usando TFM. Estas medições são feitas através da incorporação de microesferas fluorescentes no hidrogel e imagem das posições destes grânulos antes e após a semeadura hESCs (Figura 3A). O deslocamento dos grânulos que seguem a semeadura da pilha é uma função das forças pilha-geradas e da elasticidade do Hydrogel, assim as imagens das posições do grânulo podem ser usadas para gerar mapas de deslocamentos do grânulo e usados subseqüentemente para calcular o subjacente tensões de tração. Nas colônias circulares de hESCs, as tensões as maiores da tração são encontradas perto da borda periférica das colônias, quando o centro das colônias indicar uniformemente baixas tensões da tração (Figura 3B). Curiosamente, as tensões de tração mais elevadas são encontradas em clusters perto da borda das colônias, em vez de formar um anel contínuo de estresse máximo. Isso implica que, embora a geometria da colônia desempenhe um papel fundamental na determinação da distribuição de tensões de tração, a regulação mais localizada e o feedback determinam os locais precisos de estresse máximo. Adicionalmente, contanto que a imagem de posições da microfera sem pilhas aderidas for tomada antes da semeadura da pilha, as colônias de hESC podem ser fixadas para a imunomarcação das proteínas do interesse que seguem medidas da força da tração. Apesar das distribuições não uniformes observadas das tensões de tração, os hESCs cultivados como círculos padronizados em condições de manutenção exibem expressão uniforme do marcador de pluripotência Oct3/4 e da molécula de adesão celular e-caderina (Figura 3C ).
O método apresentado para o uso de estênceis para gerar padrões de ligantes é comprovadamente superior à técnica comum de impressão de microcontato para as geometrias relativamente grandes utilizadas neste método (i.e., para colônias circulares de 1 mm de diâmetro, bem como triângulos e praças de área equivalente). Os padrões de impressão de ligantes de microcontato nessa escala de comprimento resultam em transferência heterogênea nas bordas dos padrões, com muito pouco ligantes depositados nas regiões centrais dos padrões (Figura 4a). Isto é claramente insuficiente para produzir consistentemente colônias de hESC de geometrias específicas. Reduzir a densidade de semeadura celular também leva à inconsistência na obtenção de colônias concluídas. As células semeadas em 200.000 células/mL, em vez de 300.000 células/mL, não conseguem gerar contatos de células celulares suficientes para sobreviver à concentração reduzida de Y27632 a 24 h após a semeadura (Figura 4B). Pode ser possível gerar padrões completos com densidades de células inferiores, estendendo o período de diluição de Y27632; no entanto, em geral, é mais eficiente para semente na maior 300.000 células/mL densidade. Ocasionalmente, os erros na geração do teste padrão que não são detectados mais cedo no protocolo tornam-se aparentes em cima da semeadura de hESCs. Um tal erro é o vazamento de solução de ligante embaixo do estêncil devido ao contato pobre com a lamínula. Isto conduz finalmente ao ligante que está sendo transferido às regiões do poliacrilamida fora das geometrias desejadas, e ao crescimento não confinado de hESCs em cima da semeadura (Figura 4C).
Figura 1: padronização do LIGANTE ECM em coberturas com lavagem ácida e transferência para hidrogéis de poliacrilamida. (A) representação esquemática do protocolo para padronização do LIGANTE ECM em coberturas lavadas a ácido e transferência do ligante padronizado para os hidrogéis de poliacrilamida. (B) imagens imunofluorescentes de ligante com padrão ECM em coberturas lavadas a ácido (esquerda) e após transferência para hidrogel de poliacrilamida (direita). Biotina-Tagged matrigel foi modelado na lamínula e rotulada com Alexa fluor 555 estreptavidina antes da transferência para poliacrilamida. Os Insets mostram a visão ampliada dos padrões completos gerados. (C) imagens fluorescentes representativas demonstrando defeitos de padronização do ligante na lamínula de vidro. Estes resultam de erros comuns no protocolo, como vazamento da solução de ligantes fora da geometria padronizada (superior, seta indica local de vazamento), e trapping de bolhas de ar dentro das geometrias padronizadas do estêncil ao adicionar a solução de ligantes ( inferior, seta indica o local da bolha de ar). Todas as barras de escala = 500 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: semeadura de hESCs em hidrogéis de poliacrilamida padronizada. Imagens representativas do brightfield que demonstram a semeadura bem sucedida de hESCs em hidrogéis do poliacrilamida com ligand modelado. A linha do tempo na parte superior indica a série de alterações de mídia usadas para remover células não anexadas e diluir o Y27632. Observe que, após a semeadura inicial, as células aderiram estocàtica a várias regiões dentro do ligante padronizado e, em seguida, proliferam para preencher as regiões padronizadas ao longo de 72 h. barra de escala = 500 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: localização regional de tensões de tração e imunocoloração de colônias de hESC confinadas. (A) imagens fluorescentes de microesferas dentro do hidrogel do poliacrilamida antes e depois de semear hESCs. (B) parcela de Velocimetria de imagem de partícula representativa (PIV) representando o deslocamento de microesferas devido a tensões de tração (esquerda) e tensões de tração reconstruídas correspondentes (direita). (C) imunocoloração de colônias de hESC confinadas em hidrogéis modelados de poliacrilamida, demonstrando a capacidade de comparar a localização de proteínas de interesse para tensões de tração. Todas as barras de escala = 200 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: resultados não ideais gerados por métodos e erros alternativos. (A) as imagens fluorescentes representativas do ligante do ECM modelaram em COVERSLIP ácido-lavado através da impressão do microcontact. (B) imagens de brightfield de hESCs que não formam colônias concluídas devido à insuficiente aderência das células. Grandes lacunas remanescentes nas colônias a 24 h após a semeadura (setas) são um indicador precoce desta questão. (C) imagens de brightfield de hESCs que não conseguem formar colônias confinadas devido a erros na padronização que levaram à presença de ligante fora das geometrias desejadas. Todas as barras de escala = 500 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Exemplo SU8 fabricação de Wafer | |
| 1. Spin casaco Wafer com SU8-3050 | Girar a 1.000 RPM por 30 s |
| 2. Soft assar Wafer na placa quente | i. 3 min a 65 ° c |
| II. 45 min a 95 ° c | |
| III. 3 min a 65 ° c | |
| IV. arrefecer até à temperatura ambiente | |
| 3. expor no alinhador da máscara | i. alinhar Wafer e máscara fotográfica em alinhador máscara |
| Ii. Expor com energia de 250 mJ/cm2 | |
| • Por exemplo, para lâmpada com intensidade de 11 mW/cm2, expor para 23 s | |
| 4. pós exposição assar na placa quente | i. 1 min a 65 ° c |
| II. 15 min a 95 ° c | |
| III. 1 min a 65 ° c | |
| Iv. Esfrie à temperatura ambiente | |
| 5. desenvolver | i. agitar em SU8 Developer, aprox. 5-10 min |
| Ii. Verificar o desenvolvimento com álcool isopropílico (IPA) | |
| • Se sob-desenvolvido, a enxaguadura IPA produzirá um resíduo branco | |
| 6. duro cozer na placa quente (opcional) | 1-2 h a 150 ° c |
Tabela 1: exemplo SU8 protocolo de fabricação de Wafer. Os wafers do silicone usados para gerar selos de PDMS e os stencils subseqüentes foram fabricados usando as etapas esboçadas nesta tabela. Este protocolo foi gerado usando a folha de dados SU8 3000 com o objetivo de criar uma espessura de filme de aproximadamente 100-250 μm.
| Formulações de gel de poliacrilamida | |||||||||
| Volumes para 1 mL de solução completa | |||||||||
| Módulo elástico (PA) | Final% acrilamida | Final% bis-acrilamida | ddH2O (μL) | 40% acrilamida (μL) | 2% bis-acrilamida (μL) | PBS 10x (μL) | 1% TEMED em ddH2O (μL) | Microesferas 0,5% sólidos em ddH2O (μL) | 1% PPS em ddH2O (μL) |
| 1050 | 3 | 0,1 | 565 | 75 | 50 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 2700 | 7,5 | 0, 35 | 485 | 187,5 | 17,5 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 4000 | 7,5 | 0, 5 | 477,5 | 187,5 | 25 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 6000 | 7,5 | 0, 7 | 467,5 | 187,5 | 35 | 100 | 75 | 60 | 75 |
Tabela 2: formulações de gel de poliacrilamida. Volumes de componentes para a geração de hidrogéis de poliacrilamida de vários moduli elástico com microesferas fluorescentes para TFM. Os volumes podem ser dimensionados para cima ou para baixo com base na quantidade de solução de poliacrilamida necessária. Todos os componentes, exceto as microesferas fluorescentes e PPS são misturados antes da desgaseificação. PBS = soro fisiológico tamponado com fosfato, TEMED = tetrametilethylenediamina, PPS = persulfato de potássio.
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Discussion
Para simplificar um protocolo longo e detalhado, este método consiste em três estágios críticos: 1) gerando testes padrões do ligante do ECM em COVERSLIP de vidro, 2) transferindo os testes padrões aos hidrogéis do poliacrilamida durante a polimerização do gel, e 3) semeando hESCs no hidrogel modelado. Há etapas críticas que devem ser consideradas em cada uma dessas três etapas. A fim de gerar padrões de alta fidelidade nas coberturas de vidro, o estêncil deve ser firmemente pressionado na lamínula para evitar vazamento da solução ligante e todas as bolhas de ar devem ser removidas após a adição de solução de ligante para a superfície do estêncil ( Figura 1C). Se a solução de ligante vazar através do estêncil devido ao contato deficiente com a lamínula, o ligante será transferido para toda a superfície do hidrogel de poliacrilamida e os hESCs não serão confinados à geometria desejada da colônia (Figura 4C). A etapa a mais importante em transferir o ligante modelado ao poliacrilamida está separando delicadamente o lamela superior do hidrogel quando todos os componentes permanecerem submergidos em PBS. Se o hidrogel não permanecer submerso durante a separação, os padrões podem ser completamente destruídos. Além disso, se a separação ocorre demasiado ràpida, a superfície do hidrogel pode rasgar ou ser danificada de outra maneira. Quanto mais suave o hidrogel, mais ele está em risco de danos durante a separação. Finalmente, o usuário deve pipeta muito com cuidado ao trocar meios durante a semeadura e a cultura de hESCs nos hydrogels modelados. Os hESCs permanecem frouxamente aderidos durante todo o protocolo e as colônias modeladas podem facilmente ser interrompidas pela pipetagem descuidado ou apressada.
Além das etapas críticas discutidas acima, há uma série de outras etapas que podem exigir modificação e solução de problemas ao adaptar este protocolo para diferentes aplicativos. Enquanto os padrões demonstrados aqui estão na escala de comprimento de centenas de mícrons a um milímetro, gerando características padronizadas em bolachas de silício com fotomáscaras de transparência e fotoresistente negativo permite tamanhos de recurso todo o caminho até 7-10 μm. Assim, este protocolo poderia ser adaptado para confinar a geometria de únicas pilhas ou colônias menores de algumas pilhas em carcaças complacentes.
Dois parâmetros que provavelmente exigirão otimização ao adaptar este protocolo para diferentes tipos de células são o tipo de ligante ECM usado e a concentração do ligante em solução durante a adsorção para a lamínula de vidro através dos estênceis. A concentração total de ligantes de 250 μg/mL foi suficiente para produzir padrões homogêneos de matrigel e facilitar a fixação de hESCs (Figura 1B e Figura 2), embora possa ser possível alcançar resultados semelhantes com menor Concentrações. Por outro lado, pode ser necessário aumentar ainda mais a concentração de ligante para os tipos de células que são menos aderentes ou para aplicações que necessitam de tempos de incubação mais curtos. A concentração aumentada de ligante pode igualmente ser exigida para os ligands diferentes do ECM, tais como o fibronectina ou o colagénio, que são menos hydrofóbicos do que o matrigel e conseqüentemente não pode adsorver ao hidrogel como fortemente. Como a transferência de ligante da lamínula para o hidrogel ocorre durante a polimerização do hidrogel, as técnicas comumente usadas para ligar de forma robusta o ligante ECM à superfície do hidrogel (como o tratamento com sulfo-SANPAH) são impossíveis. O uso de ligantes de ECM rotulados com fluorescently para permitir a visualização dos padrões em cada etapa do protocolo é extremamente útil ao otimizar e solucionar esses parâmetros.
Além disso, o protocolo para as células de propagação pode exigir otimização dependendo do tipo de célula e as condições de mídia usadas. Para as células que aderem mais rapidamente ou eficientemente, uma menor densidade de semeadura pode ser necessária para evitar aderências de células celulares que se estendem entre padrões e resultam em agregados em vez de colônias de monocamada padronizadas. Para as células que exibem um apego muito pobre, uma maior densidade de semeadura ou mais tempo antes da troca de mídia inicial pode ser necessária para facilitar a formação completa de colônias confinadas (Figura 4B).
A principal limitação deste método é a sua complexidade técnica, o que resulta em resultados relativamente baixos de throughput em comparação com métodos semelhantes que envolvem a cultura de células em substratos de vidro modelados8. No entanto, esse inconveniente é muito compensado pela relevância fisiológica alcançada pela cultura de colônias confinadas de hESC em substratos compatíveis. Ao recapitular efetivamente as propriedades mecânicas do embrião precoce, somos capazes de melhor modelar e entender os processos que levam à autoorganização das camadas germinativas primárias.
Um benefício adicional de confinar colônias de hESC em hidrogéis do poliacrilamida é que permite o uso de TFM examinar a ligação entre a organização de uma colônia de hESC, como um modelo do embrião adiantado, e a distribuição de forças pilha-geradas que podem fundamentam morfogênese e célula destino especificação. Confinar colônias de hESC resulta em distribuições de tensões de tração que dependem da geometria da colônia (Figura 3B). Apesar da não uniformidade dessas tensões de tração, as células em todas as colônias permanecem pluripotentes em condições de manutenção (Figura 3C). Entretanto, nós supor que as distribuições do esforço da tração podem ser envolvidas em padrões de regulamento da especificação do destino da pilha ajustando a resposta às sugestões da indução, tais como morphogens solúveis. Prevemos que este método permitirá que nós e outros grupos para melhor modelar o embrião humano precoce com hESCs, levando a uma compreensão mais completa dos processos fundamentais que sustentam a embriogênese humana.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de reconhecer o financiamento do CIRM Grant RB5-07409. J.M.M. gostaria de agradecer a FuiBoon Kai, Dhruv Thakar, e Roger Oria para várias discussões que orientaram a geração e solução de problemas deste método. J.M.M. também agradece a UCSF Discovery Fellowship para o apoio contínuo de seu trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
References
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