Summary
ליגתאי מטריקס ניתן להיות בתבנית על הידרואקרילאמיד הידרו כדי לאפשר את התרבות של תאים גזע האדם העובריים במושבות מוגבלים על מצעים תואמי. שיטה זו יכולה להיות משולבת עם מיקרוסקופ כוח המתיחה ביוכימיה ביוכימית לבחון את הגומלין בין הגיאומטריה רקמה, כוחות שנוצר התא, ואת מפרט הגורל.
Abstract
תאי גזע עובריים האדם להפגין יכולת ייחודית להגיב מורפולגנים בחוץ גופית על ידי דפוסי ארגון עצמי של מפרט הגורל התא המתאימות היווצרות שכבת הנבט העיקרי במהלך embryogenesis. לפיכך, תאים אלה מייצגים כלי רב-עוצמה שעליו לבחון את המנגנונים שנוהגים בהתפתחות האנושית המוקדמת. פיתחנו שיטה לתרבות האדם תאים גזע עובריים במושבות מוגבלים על מצעים תואמי המספק שליטה על הגיאומטריה של המושבות הסביבה המכנית שלהם כדי ללכוד את הפרמטרים הפיזיים ש embryogenesis. התכונה המפתח של שיטה זו היא היכולת לייצר הידרואקרילאמיד polyג'לים עם דפוסים מוגדרים של מטריקס ליגתאי מטריצות על פני השטח כדי לקדם את הקובץ המצורף לתא. זה מושגת על ידי בדיית סטנסילים עם דפוסים גיאומטריים הרצוי, באמצעות סטנסילים אלה כדי ליצור דפוסים של מטריקס ליגתאי מטריצה על שמיכות זכוכית, והעברת דפוסים אלה להידרואקרילאמיד הידרוג'לים במהלך הפלוניזציה. שיטה זו תואמת גם עם מיקרוסקופ כוח המתיחה, המאפשר למשתמש למדוד ולמפות את התפלגות הכוחות המופקים התא בתוך המושבות הסגורים. בשילוב עם מידות ביוכימיות סטנדרטיות, ניתן להשתמש במידות אלה כדי לבחון את מספר הסימנים המכאניים במפרט הגורל ומורפולגנזה במהלך התפתחות האדם הקדומה.
Introduction
האדם תאים גזע עובריים (hESCs) להחזיק הבטחה גדולה לשימוש ברפואה משובי ויישומים הנדסה רקמות. האופי הפלוריאני של התאים האלה נותן להם את היכולת להבדיל לכל סוג של תא מבוגר. בעוד צעדים גדולים נעשו בבימוי גורלם של hESCs לסוגי תאים מסוימים, זה נשאר קשה מאוד לייצר רקמות שלמות או איברים דה נובו1,2,3,4, 5. המשך הדבר נובע, במידה רבה, להבנה מוגבלת של המנגנונים הנוהגים ביצירת רקמות אלה במהלך התפתחות האדם. כדי למלא את הפער הזה בידע, מספר שיטות הופיעו בשנים האחרונות כדי לדגמן את העובר המוקדם ובשלבים הבאים של פיתוח עם תאי גזע עובריים6,7,8,9 ,10,11,12,13.
זמן קצר לאחר הנגזרת של קווי hESC הראשון14, זה הוכח כי גופים embryoid נוצר מ hESCs היו מסוגלים לייצר באופן ספונטני תאים של שלוש שכבות הנבט הראשי6. עם זאת, בשל חוסר השליטה הטבועה בגודל ומורפולוגיה של גופים embryoid, הארגון של שכבות הנבט מגוונות באופן משמעותי ונכשל להתאים את הארגון של העובר המוקדם. לאחרונה, חימום פלאש et al. פיתחה שיטה להגבלת מושבות של hESCs על מצעים זכוכית באמצעות מיקרופיקנינג, מתן שליטה ועקביות על הגודל והגיאומטריה של המושבות8. בנוכחות BMP4, מורפוגן חשוב בהתפתחות מוקדמת, אלה מושבות מוגבלים היו מסוגלים לארגון העצמי דפוסים מסוימים של מפרט לגורלות המייצגים את שכבות הנבט העיקרי. למרות שזה סיפק מודל שימושי ללמוד את המנגנונים שבהם שכבות הנבט העיקרי מבוססים, דפוסי מפרט הגורל לא התאימו בדיוק את הארגון ואת מורפולגנזה נצפתה במהלך embryogenesis15. לכידה נאמנה יותר של התפתחות עובריים מוקדם הושגה על ידי הטבעת hESCs במטריצה תלת ממדית החילוץ (ECM) של מטריקס11, מתן הראיות החזק ביותר עד כה על היכולת של hESCs לארגן ולדגמן מודל השלבים המוקדמים של embryogenesis ex vivo. עם זאת, שיטה זו מפיקה תוצאות לא עקביות ולכן היא אינה תואמת למספר דרישות שניתן להשתמש בה כדי לחשוף את המנגנונים הבסיסיים של הארגון העצמי ומפרט הגורל.
בהינתן אלה השיטות הקיימות ואת המגבלות המתאימות שלהם, חיפשנו לפתח שיטה המתספשות culturing מושבות hESC של גיאומטריות מוגדר בתנאים המודל את הסביבה החילוץ של העובר המוקדם. כדי להשיג את זה, השתמשנו אלקטרופורזה הידרוג'לים של אלסטיות מסוגל לשלוט על תכונות מכניות של המצע. בעזרת מיקרוסקופ כוח אטומי על עוברי העוף הבמה-שלב, מצאנו כי האלסטיות של אפיהפיצוץ נע בין מאות משתמשים בעלי משקפיים לכמה קילו-מיימת. לכן, אנו מתמקדים ביצירת הידרואקרילאמיד polyג'לים עם אלסטיות בטווח הזה כדי לשמש את המצע עבור המושבות hESC. שנינו את השיטות הקודמות שלנו עבור culturing hESCs על אלקטרופורזה הידרוג'ל7,9 כדי לספק שליטה איתנה על הגיאומטריה של המושבות. השגנו זאת על ידי הראשון המכונה ECM ליגנדס, כלומר מטריצות, על שמיכות זכוכית באמצעות סטנסילים מיקרו מפוברק, כפי שדווח בעבר16. לאחר מכן עיצבנו טכניקה מקורית כדי להעביר את הליגלים ולמשטח ההידרואקרילאמיד בזמן הפילמור. השיטה שאנו מתארים כאן כרוכה בשימוש פוטוגרפיה כדי לייצר וופל סיליקון עם דפוסים גיאומטריים הרצוי, יצירת בולים של תכונות גיאומטריות של תזות עם polydiמתיל siloxane (pdms), ושימוש בולים אלה כדי ליצור את הסטנסילים ש בסופו של דבר לאפשר מתקן של ליגנד על פני השטח של כיסוי זכוכית העברה polyacrylamide.
בנוסף על הפיכת הסביבה המכנית של העובר המוקדם, הקמת מושבות hesc על אלקטרופורזה מאפשר את המדידה של כוחות שנוצרו בתא עם מיקרוסקופ כוח המתיחה (tfm), כפי שדווח בשיטה הקודמת שלנו9. בקצרה, חרוזי פלורסנט יכול להיות מוטבע פוליאקרילמיד ומשמש סמנים fiducial. הכוחות שנוצר התא מחושבים על ידי הדמיה העקירה של חרוזים אלה לאחר זריעת hESCs על מצע בדוגמת. יתר על כן, כתוצאה מכך מפות כוח המתיחה יכול להיות משולב עם assays מסורתי, כגון מכתים, כדי לבחון כיצד התפלגות של כוחות התא שנוצר מושבות hESC המוגבלת עשוי לווסת או לווסת איתות במורד הזרם. אנו מצפים שיטות אלה יחשפו כי כוחות מכניים לשחק תפקיד קריטי בתוך המפרט של מפרט הגורל התא במהלך הפיתוח העובריים המוקדמים, כי הוא התעלמו כעת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן בנוגע לשימוש hESCs אושרו על ידי האדם Gamete, העובר ומחקר תא גזע (GESCR) ועדת האוניברסיטה של קליפורניה בסן פרנסיסקו.
1. הכנת וופל סיליקון עם תכונות גיאומטריות
- צור פושאול עם תכונות גיאומטריות רצויות. השתמש בתוכנת שרטוט בעזרת מחשב כדי לעצב את התכונות. לשימוש עם photoresist שלילית, הפוך את התכונות לאטומות ושארית המסיכה שקופה.
הערה: לצורך הקפדה על שמיכות בקוטר 18 מ"מ, תכונות הקבוצה עבור כל תנאי ניסיוני לתוך 10 x 10 מילימטר אזורים כדי להבטיח את הסטנסילים שנוצרו בשלב 3 להתאים על הכיסויים. - מעיל ספין שלילי photoresist על הסיליקון 100 מ"מ וופל. השתמש בגליון הנתונים photoresist כדי לקבוע את המהירות והאורך של ספין כדי ליצור עובי סרט של 100-250 μm.
הערה: יש לכוונן את עובי הסרט כך שיחס הגובה-רוחב של רוחב הדפוסים לגובה הסטנסיל יהיה קרוב ל1:1 ככל האפשר. עם זאת, אנו ממליצים על עובי מינימלי של 100 μm, כמו כל דבר פחות מייצרת סטנסילים עדינים בקלות דמעה. - עבד את הphotoresist בהתאם לגליון הנתונים של המוצר. זה בדרך כלל כרוך אפייה רכה, חשיפה UV עם פושאול במסכה מסכה, לאחר לאפות החשיפה, פיתוח, ולאפות קשה. כדוגמה, ההליך המשמש לעיבוד המופלים המשמשים בפרוטוקול זה מתואר בטבלה 1.
הערה: להיות זהירים בעת טיפול וופלים סיליקון כפי שהם שבירים. לאחר שנוצר, ניתן להשתמש בוייפרים שוב ושוב כל עוד הם אינם פגומים.
2. הכנת שמיכות
-
הכנת כיסוי שטוף חומצה "טופ"
- במקום 18 קוטר מ"מ #1 שמיכות בעובי זכוכית צלחת פטרי. המספר המתאים של שמיכות תלוי בגודל של המנה. עבור מנה 100 מ"מ, הכינו 50-100 שמיכות בכל פעם. סכומי הנפח שניתנו בשאר הסעיף מתאימים לצלחת 100 מ"מ.
- הוסף 20 מ ל של הHCl 1 מ ' לצלחת פטרי בעדינות לנער את הצלחת לפזר את הכיסויים. לוודא שכל הכיסויים הם שקועים ולשחרר בועות אוויר בין הכיסויים. המלון מעמיד לילה בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין.
התראה: הHCl חומצית ומאכל. שימוש בזהירות וללבוש PPE מתאים בזמן העבודה עם HCl. - . הHCl הדטית ממנה הוסף 20 מ ל של מים באולטרסאונד ולשטוף עם טלטול עדין עבור 10 דקות. להשליך מים ולחזור על סך של 5 שוטף.
- לאחר להשליך את הכביסה האחרונה, להוסיף 20 מ ל של 100% אתנול למנה. באמצעות מלקחיים, להסיר את הכיסויים בנפרד ולסדר בין שתי פיסות נייר סינון להתייבש.
- אחסן שמיכות מיובשות במיכל אטום. שמיכות חומצה שנשטפו ניתן להכין מראש ומאוחסן במשך חודש או יותר בתנאים ללא אבק.
-
הכנת כיסוי גלוטאלדהיד מופעל "תחתון"
הערה: עיין בשיטות קודמות לקבלת פרטים נוספים7,9.- במקום 18 קוטר מ"מ #1 שמיכות עובי לצלחת פטרי.
- הוסף 20 מ ל של 0.2 M HCl לצלחת פטרי בעדינות לנער את הצלחת לפזר את הכיסויים. לוודא שכל הכיסויים הם שקועים ולשחרר בועות אוויר בין הכיסויים. המלון מעמיד לילה בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין.
- . הHCl הדטית ממנה הוסף 20 מ ל של מים באולטרסאונד ולשטוף עם טלטול עדין עבור 10 דקות. להשליך מים ולחזור על סך של 5 שוטף.
- לאחר מחיקת השטיפה הסופי, להוסיף 20 מ ל של 0.1 M NaOH ולטלטל בעדינות כדי לפזר ולטבול שמיכות. דגירה בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין עבור 1 h.
- . כן. הוסף 20 מ ל של מים באולטרסאונד ולשטוף עם טלטול עדין עבור 10 דקות. להשליך מים ולחזור על סך של 5 שוטף.
- לאחר מחיקת השטיפה הסופית, להוסיף 20 מ ל של 1:200 דילול של 3-aminopropyltrimethoxysilane במים באולטרטהורים לרעוד בעדינות כדי לפזר ולטבול שמיכות. דגירה בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין עבור 1 h או לילה.
התראה: 3-aminopropyltrimethoxysilane דליק ועלול לגרום לגירוי בעור. לטפל בזהירות, ללבוש PPE מתאים, ולהשליך פסולת על פי תקנות הרשות המקומית. - Decant הפתרון 3-aminopropyltrimethoxysilane מדולל ממנה. הוסף 20 מ ל של מים באולטרסאונד ולשטוף עם טלטול עדין עבור 10 דקות. להשליך מים ולחזור על סך של לפחות 5 שוטף. זה קריטי להסיר את כל 3-aminopropyltrimethoxysilane לפני שתמשיך.
- לאחר להשליך את השטיפה הסופית, להוסיף 20 מ ל של 1:140 דילול של 70% גלוטאלדהיד ב מלוחים באגירה פוספט (PBS) ולטלטל בעדינות כדי לפזר ולטבול שמיכות. דגירה בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין עבור 1 h או לילה.
התראה: 70% גלוטארלדהיד הוא רעיל ועלול לגרום לגירוי בעור. לטפל בזהירות, ללבוש PPE מתאים, ולהשליך פסולת על פי תקנות הרשות המקומית. - Decant הפתרון הדבקי מדולל ממנה. הוסף 20 מ ל של מים באולטרסאונד ולשטוף עם טלטול עדין עבור 10 דקות. להשליך מים ולחזור על סך של 5 שוטף.
- לאחר מחיקת השטיפה הסופי, להוסיף 20 מ ל של 100% אתנול. באמצעות מלקחיים, להסיר את הכיסויים בנפרד ולסדר בין שתי פיסות נייר סינון להתייבש.
- אחסן שמיכות מיובשות במיכל אטום. גלוטראלדהיד-מופעל כיסוי ניתן להכין מראש ומאוחסן עד שישה חודשים.
3. הדור של סטנסילים לצורך הפקה של ECM ליגאנד
- יצירת חותמות ביניים פולימתיתיל (PDMS)
- מערבבים בסיס PDMS עם הסוכן לריפוי PDMS ביחס 10:1, לפי משקל. מערבבים ביסודיות.
הערה: עבור היישום הראשוני של PDMS, להכין כ 100 g של PDMS למלא צלחת 100 מ"מ. עבור יישומים הבאים, הסר PDMS רק ממרכז המנה שבה תכונות סיליקון וופל ממוקמים ולהכין 20-30 g של PDMS חדש. - דגה את התערובת PDMS ב desiccator עבור 30-60 דקות או עד כל בועות האוויר יוסרו.
- מניחים את וופל סיליקון שונה משלב 1 לתוך הצלחת 100 mm פלסטיק. שופכים לאט ובאופן שווה את תערובת PDMS על פני השטח של וופל. הקש על המנה על משטח העבודה כדי לשחרר בועות אוויר מהמשטח של הפרוסת.
- דגה תערובת PDMS נשפך על וופל עבור 10 דקות או עד כל בועות האוויר יוסרו או הגיעו אל פני השטח של PDMS.
- אופים PDMS ב 70 ° c עבור 2 h. אפשר להתקרר לטמפרטורת החדר.
- באמצעות אזמל או חותך תיבות, גזור את הקטע של PDMS ממרכז המנה המכילה את התכונות הגיאומטריות.
- חותכים את PDMS לתוך בערך 10 x 10 מ"מ ריבועים, כל המכיל את התכונות עבור תנאי אחד ניסיוני. אלה מכונים "חותמות" בשלבים הבאים של הפרוטוקול.
- מערבבים בסיס PDMS עם הסוכן לריפוי PDMS ביחס 10:1, לפי משקל. מערבבים ביסודיות.
- יצירת לוחות שטוחים של PDMS
- מערבבים בסיס PDMS עם הסוכן לריפוי PDMS ביחס 8:1, לפי משקל. להכין כ 20 g עבור כל 100 mm צלחת לשמש. מערבבים ביסודיות.
- דגה את התערובת PDMS ב desiccator עבור 30-60 דקות או עד כל בועות האוויר יוסרו.
- באיטיות ובאופן שווה לשפוך את PDMS לתוך צלחת 100 mm נקי. הקש על המנה על משטח העבודה כדי לשחרר בועות אוויר.
- אופים PDMS ב 70 ° c עבור 2 h. אפשר להתקרר לטמפרטורת החדר.
- הסר את ה-PDMS ממנה. היפוך כזה שמשטח ה-PDMS שהיה במגע עם החלק התחתון של המנה פונה כלפי מעלה.
- עבור כל חותמת שנוצרה בשלב 3.1, לחתוך ריבוע 15 x 15 מ"מ של PDMS. אלה נקראים "לוחות שטוחים" בשלבים הבאים של הפרוטוקול.
- יצירת סטנסילים
- ארגון לוחות שטוחים של PDMS על המכסה של צלחת 150 מ"מ, או משטח שטוח אחר לטיפול קל יותר. להבטיח מרווח מספיק בין לוחות (למשל, עבור צלחת 150 מ"מ, לסדר תשעה לוחות שטוחים עם מרווח אפילו).
- היפוך כל חותמת שנוצרת בשלב 3.1 אל לוח שטוח של PDMS, כך שהתכונות על החותמת נמצאות במגע עם הלוח השטוח של PDMS. לחץ בעדינות על החלק העליון של החותמת עם מלקחיים כדי להבטיח אפילו קשר.
- בזהירות האביזר המכסה מחזיק PDMS חותמת/לוח זוגות על בסיס של המנה, כך המכסה נח בזווית. זה מסייע החירור של פולימר לריפוי UV בשלב הבא.
- מניחים טיפה קטנה של פולימר לריפוי UV בממשק העליון של כל זוג חותמת/לוח. הפולימר יהיה מרושע בין שני על ידי מתח פני השטח, בסיוע כוח הכבידה.
הערה: פולימרים שונים לריפוי UV עשויים לעבוד בפרוטוקול זה. בחרנו Norland אופטי 74 עבור המאפיינים הבאים: i) מהיר ריפוי על החשיפה לאור UV, ii) הסרה קלה מ-PDMS חותמות על ריפוי, iii) הדבקה חזקה שמיכות זכוכית עם לחץ ידני. - לאחר הפולימר כבר מרושע לחלוטין דרך, למקם את המכסה עם חותמת/לוח זוגות שטוח על משטח העבודה. מניחים טיפה קטנה של פולימר בריפוי UV בכל אחד משלושת הצדדים הנותרים של כל חותמת/לוח ממשק.
- באמצעות טיפ 200 μL הצינורות, לחבר את טיפות של פולימר סביב הקצוות של הממשק חותמת/לוח. פעולה זו יוצרת גבול שיחזיק את הפתרונות והפתרון בשלב 4.
הערה: להיזהר כאשר עובדים את הפולימר סביב קצות החותמת. אם הממשק חותמת/לוח מופרת, הפולימר יהיה הפתיל מתחת לתכונות והסטנסיל לא טופס כראוי. - מניחים בזהירות את צמדי החותמות/הלוח לתוך תיבת העיקור של UV. השתמש בהגדרת צריכת החשמל הסטרילית "Str" והתחשוף אותה למשך 10 דקות.
- הסר את צמדי החותמות/לוח מתוך תיבת העיקור של UV. באמצעות שני זוגות של מלקחיים, להסיר בעדינות את החותמת PDMS תוך החזקת את הלוח שטוח ואת הסטנסיל שנוצרו מפולימר לריפוי UV.
- באמצעות מלקחיים, בזהירות להסיר את הסטנסיל ולהפוך אותו כך את פני השטח שהיה במגע עם הלוח השטוח של PDMS הוא פונה כלפי מעלה.
הערה: הסטנסילים עדינים. היזהר בעת מתן אותם, במיוחד בעת הסרתם הראשונית של PDMS, כך שהם לא לקרוע. - מניחים את הסטנסילים הפוכים בחזרה לתוך תיבת עיקור-UV. השתמש בהגדרת צריכת החשמל הסטרילית "Str" והחשיפת המשך 3 דקות.
4. המשך התנועה של ECM ליגאנד על שמיכות
-
הקשה סטנסילים על שטיפת חומצה שנשטפו
- מקום אחד שטוף חומצה שטופים עבור כל סטנסיל על פיסת נקי של סרט מעבדה.
- באמצעות מלקחיים, בזהירות למקם כל סטנסיל, שטוח בצד-למטה, על שטיפת חומצה שטוף שמיכות. מקום כזה תכונות ממורכזים על הכיסויים.
- מניחים פיסת סרט מעבדה קטנה על גבי כל סטנסיל. לחץ בחוזקה ובאופן שווה על הסטנסיל כדי ליצור קשר חזק בין הסטנסיל לבין הכיסויים.
הערה: זהו צעד קריטי! לחץ בחוזקה על פני השטח כולו של הסטנסיל. אם לא נוצר קשר מספיק, הפתרון ידלוף בין הסטנסיל לבין הכיסויים והמפנג ייכשל. אופציונלי: כדי לאשר את הקשר מספיק בין הסטנסיל לבין שמיכות, פיפטה 100 μL של מים סטרילי באולטרסאונד על פני השטח של כל סטנסיל ו הדגירה בטמפרטורת החדר. . אחרי השעה 1, תבדקו אם יש דליפה מתיף מים מסטנסילים מוצלחים וממשיכים.
-
פלזמה ניקוי המשטח של הכיסויים שמיכות כדי להגדיל את hydrophilicity
- מניחים את הכיסויים עם סטנסילים לתוך מנקה פלזמה. החלת פלזמה בעוצמה גבוהה עבור 30 s.
-
הכנת תמיסת ECM
הערה: יש להשלים את כל השלבים הבאים בתנאים סטריליים, במידת האפשר.- המקום סטרילי 100 mM HEPES, 100 mM הנאקל, pH 8.0 פתרון על קרח. פעם קרה קרח, להוסיף מטריצות ו קולגן כדי להשיג ריכוזים של 225 μg/mL ו 25 μg/mL, בהתאמה. אופציונלי: לפתרון בעיות או לליגיון ויזואליזציה, כוללים ליגולי מתויג בתמיסה מתוייגת.
- הערה: ליגנדס שונים של ECM ניתן להשתמש בשיטה זו. עבור ליגניות שונות, אופטימיזציה נוספת עשויה להיות נדרשת כדי לקבוע ריכוז אידיאלי, זמן דגירה, וטמפרטורת דגירה. לקבלת מידע נוסף, עיין בסעיף הדיונים.
- הפיפטה והתמיסה על פני השטח של כל סטנסיל. עבור סטנסילים שנעשו מ 10 x 10 מילימטר בולים מרובעים, להחיל 100 μL לכל סטנסיל.
- בדוק אם יש בועות אוויר בתכונות סטנסיל. במקרה הצורך, השתמשו בעזרת מלקחיים משובחים או בתשר 2 μL כדי להסיר בועות אוויר מהתכונות.
הערה: זהו צעד קריטי! אם בועות אוויר נשארים לכודים על פני השטח של שמיכות, ליגאל לא ספוח על פני השטח ואת הדפוס שנוצר יהיה לא שלם. - מניחים את הכיסויים שמיכות עם ליגנד לתוך תבשיל, לעטוף עם סרט מעבדה, ו דגירה ב 4 ° c בלילה.
- המקום סטרילי 100 mM HEPES, 100 mM הנאקל, pH 8.0 פתרון על קרח. פעם קרה קרח, להוסיף מטריצות ו קולגן כדי להשיג ריכוזים של 225 μg/mL ו 25 μg/mL, בהתאמה. אופציונלי: לפתרון בעיות או לליגיון ויזואליזציה, כוללים ליגולי מתויג בתמיסה מתוייגת.
5. העברת ליגל ג'ל פוליאקרילמיד
- הסרת פתרונות וסטנסיל מכל שמיכות
- מנושף את התמיסה מפני השטח של סטנסיל. ניתן לאסוף ולאחסן פתרון לligand במהלך 4 ° c ולהשתמש בו במשך עד חודש.
- באמצעות מלקחיים, בקצרה להטביע את שמיכות עם סטנסיל לתוך מנה המכילה PBS סטרילי לשטוף.
- בקצרה לטבול את שמיכות עם סטנסיל למנה השנייה של ה-PBS סטרילי לשטוף.
- הסר את הסטנסיל מהמשטח של הכיסויים. . תיזהר לא לשבור את הסרבל
- בקצרה לטבול את שמיכות לתוך תבשיל המכיל מים סטרילי באולטרסאונד כדי להסיר מלחים משטף PBS. הקש על קצה הכיסויים כדי למחוק משימה עדינה כדי לנקות את המים העודפים.
- , תייבש את הסרבל תחת גז אדיש. כמו חנקן סמן את החלק התחתון של הכיסויים כדי לעקוב אחר האוריינטציה מנקודה זו והלאה. להיזהר לשמור על הצד בצד כלפי מעלה.
- חזור על הצעדים ה5.1.1 דרך 5.1.6 עבור כל שמיכות.
- הפיכת פוליאקרילאמיד הידרוג'לים עם שמיכות מקושטות
הערה: עיין בשיטות קודמות עבור פרטים נוספים7,9 לעקר את כל מחזיקי כובע, צינורות, מרווחים המשמשים כדי ליצור ג'לים אלקטרופורזה על ידי שטיפת עם 10% אקונומיקה לילה, שטיפה עם מים לפחות חמש פעמים כדי להסיר אקונומיקה, ולשטוף לזמן קצר ב-70% אתנול. מניחים את כל החלקים על מגבונים משימה עדינה בארון ביולוגי סטרילי להתייבש לפני השימוש.- הכינו פתרון פוליאקרילמיד להשגת אלסטיות הידרוג'ל רצויה (שולחן 2). מערבבים יחד את כל הרכיבים למעט מיקרואואונטים של הפלורסנט ופרסולפט האשלגן (PPS).
הערה: הכינו פתרון של 1% אשלגן פרסולפט טרי בכל פעם. - דגה פתרון פוליאקרילאמיד, מיקרוספירות, ו-PPS בצינורות נפרדים תחת ואקום עבור 30 דקות.
- עבור כל שמיכות בדוגמת מילוי, הכינו שמיכות "תחתון" המופעל עם מרווח (בקוטר 18 מ"מ, קוטר 14 מ"מ) הממוקם על גבי.
- לאחר הsonicate, בקצרה ומוסיפים את הנפח המתאים לפתרון פוליאקרילאמיד. מערבבים על ידי ליטוף למעלה ולמטה, להיות זהירים לא להציג בועות אוויר. . Sonicate בקצרה
- הוסף נפח מתאים של PPS לפתרון הפוליאקרילמיד. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את הפתרון, להיות זהירים לא להציג בועות אוויר.
הערה: לאחר הוספת PPS, עבוד במהירות כדי להשלים את הצעדים 5.2.6 דרך 5.2.11 לפני פוליאקרילאמיד פילמור. - פיפטה 75-150 μL (בהתאם לעובי של מרווח) למרכז של כל מחליק גלוטאלדהיד מופעל.
- באמצעות מלקחיים, מקום שמיכות בדוגמת על כל glutarאלדהיד מופעל coverslip עם פוליאקרילאמיד ומרווח, כך בדוגמת ליגאט הפנים את הפתרון אלקטרופורזה. אם התווסף פתרון פוליאקרילמיד, מתח פני השטח יהיה לפתיל אלקטרופורזה בין שתי שמיכות ולא בועות אוויר יהיה נוכח.
- להרים כל אלקטרופורזה "סנדוויץ" ובזהירות לגעת בצד כדי משימה עדינה לנגב כדי הפתיל החוצה פתרון אלקטרופורזה העודפים.
- בזהירות המקום כל אלקטרופורזה "סנדוויץ" לתוך מחזיק כובע עם חוטים התואמים 15 mL בצינורות התחתון חרוי. הכיוון צריך להיות כזה כי החלק התחתון של שמיכות glutarאלדהיד היא במגע עם החלק התחתון של מחזיק כובע, ואת שמיכות בדוגמת הוא על גבי.
- בורג 15 מ"ל בתחתית הצינור לתוך כל מחזיק כובע להחזיק את" סנדוויצ'ים "פוליאקרילאמיד במקום. הצינורות צריכים להיות צמודים כדי למנוע דולף, אבל להיזהר לא להדק ולפצח את הכיסויים.
- צנטריפוגה את "סנדוויצ'ים" פוליאקרילאמיד בצינורות הסווינג ב-200 x g במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסירו את הצינורות מהצנטריפוגה והניחו בארונות הצינורות כדי לשמור על אוריינטציה של 50 דקות נוספות על מנת להבטיח את מלוא הפילמור. לשמור מכוסה נייר כסף כדי למנוע הלבנת של מיקרוספירות פלורסנט.
הערה: צנטריפוגה הוא קריטי בעת שימוש בשיטה זו לביצוע TFM. הכוח הצנטריפוגלי מזיז את כל המיקרוספירות למישור אחד, שבסופו של דבר יהיה ממש מתחת לפני המים של ההידרוג'ל. הדבר אידיאלי עבור הדמיה ננו-ספירה displacements מיקרוספירה המשמשים לחישוב מדגיש המתיחה התא שנוצר. אם לא ביצוע TFM, ניתן להשאיר את המיקרוספירות מחוץ לתמיסה הפוליאקרילמיד, והפלוניזציה יכולים להופיע בראש הספסל ללא צנטריפוגה. - להסיר את "סנדוויצ'ים פוליאקרילאמיד" מצינורות ולטבול ב-PBS בצלחת 100 מ"מ. לעטוף את הסרט מעבדה הדגירה עבור 3 h בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° c.
- הכינו פתרון פוליאקרילמיד להשגת אלסטיות הידרוג'ל רצויה (שולחן 2). מערבבים יחד את כל הרכיבים למעט מיקרואואונטים של הפלורסנט ופרסולפט האשלגן (PPS).
- הכנת ג'לים מקושטות לזריעת תאים
- השתמש אזמל מלקחיים כדי להסיר בזהירות את שמיכות בדוגמת ואת מרווח מן הסנדוויץ ' אלקטרופורזה "כאשר הוא נשאר מתחת לשמש ב-PBS. הדוגמאות הללו יועברו לפוליאקרילאמיד בזמן הפילמור ויישארו לאחר הסרת הכיסויים. ג'ל הפוליאקרילמיד יישאר מחובר. לכיסויים של הגלואלדהיד
הערה: זהו צעד קריטי! הפוליאקרילאמיד חייב להיות מתחת לערוץ הPBS בזמן הסרת הכיסויים או הליגודפוסי יושמדו. - מניחים כל שמיכות עם פוליאקרילאמיד בדוגמת מחזיק כובע. מניחים אטם (בקוטר 18 מ"מ החיצוני, 14 מ"מ קוטר פנימי) על גבי coverslip וסביב פוליאקרילאמיד, שם החלל היה ממוקם. בורג הצינור 15 מ"מ מתחת למכסה הכיפה, ויוצרים באר עם פוליאקרילמיד בתחתית. ההרכבות הללו מתאימות לבארות של צלחת 12-באר סטנדרטית לטיפול קל.
- לשטוף כל ג'ל על ידי הוספת 500 μL של PBS להרכבה היטב. דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר עם טלטול עדין. הסר את PBS וחזור פעמיים על סך של שלוש שטיפות.
- לאחר שטיפת PBS הסופי, להוסיף 500 μL של מדיית נוקאאוט-DMEM דיה ל ג'לים ו-דגירה ב 37 ° c לילה. ג ' לים ניתן לשמור ב 37 ° צ' עם מדיה עד 5 ימים לפני זריעת תאים.
- יום לפני זריעת תאים, החלף את נוקאאוט-DMEM עבור התקשורת המלאה KSR ו-דגירה ב 37 ° c לילה.
- השתמש אזמל מלקחיים כדי להסיר בזהירות את שמיכות בדוגמת ואת מרווח מן הסנדוויץ ' אלקטרופורזה "כאשר הוא נשאר מתחת לשמש ב-PBS. הדוגמאות הללו יועברו לפוליאקרילאמיד בזמן הפילמור ויישארו לאחר הסרת הכיסויים. ג'ל הפוליאקרילמיד יישאר מחובר. לכיסויים של הגלואלדהיד
6. culturing hESCs על בדוגמת ג'ל
הערה: אם אתה מתכנן לתקן דגימות עבור מכתים לאחר TFM, לקחת תמונות של תנוחות מיקרוספירה לא הדגיש לפני זריעת תאים. במקרה זה, מתויג ליגולי יש להשתמש בשלב 4.3.1 כך שמיקומי התאים בסופו של דבר יהיו ידועים לפני זריעה ומיקרוספירות ניתן לדימות באזורים אלה.
- שמירה על תרבויות hESC מניות ותרבויות ללא מאכיל משני הכין לוחות מצופים מטריצות ב-KSR מדיה ממוזג לפני זריעה על ג'ל פוליאקרילאמיד בדוגמת כמתואר בעבר9.
הערה: ליצור מדיה KSR ממוזג על ידי העכבר הקרינה מעובריים מתחלקים בכלי התקשורת KSR מדיה בתוספת 4 ng/mL בסיסי הצמיחה פיברופיצוץ גורם (bFGF). לאסוף ולהחליף מדיה כל 24 שעות. - . מרוב התקשורת מhESCs שטוף בקצרה עם מדיית נוק-דאמ. הוסף 0.05% טריפסין-EDTA שיושלם עם 10 μM Y27632 (Rho קינאז מעכבי) ו דגירה ב 37 ° צ' עבור 5-10 דקות.
- הוסיפו מדיה עם סרום למניעת טריפסין. מתיף בעדינות את המדיה ואת הפיפטה מעל הצלחת כדי להסיר תאים. המשך ללטף בעדינות כדי להסיר את כל התאים ולנתק אשכולות תאים לתאים בודדים.
- לאסוף את ההשעיה התא ואת צנטריפוגה ב 200 x g עבור 3 דקות.
- ולהקפיא את הגלולה בנפח שווה ערך של מדיית KSR כדי לשטוף. צנטריפוגה ב 200 x g עבור 3 דקות.
- מריף את הסופרנטאנט ומשהה מחדש את הגלולה במדיית KSR ממוזגת בתוספת 10 ng/mL bFGF ו -10 μM Y27632.
- לספור את התאים עם הומוציטוטומטר ולהתאים את ההשעיה התא לריכוז של 300,000 תאים לכל mL. פיפטה 500 μL של התא הבולם על כל ג'ל בדוגמת מילוי (150,000 תאים לכל ג'ל).
- 3 שעות לאחר זריעה, להשתמש בפיפטה כדי להפיח בקפידה את המדיה מכל ג'ל ולהחליף עם מדיה ממוזג KSR טריים בתוספת 10 ng/mL bFGF ו 10 μM Y27632. פעולה זו מסירה את התאים העודפים שאינם דבקים באזורים בדוגמת הפוליאקרילאמיד.
הערה: זהו צעד קריטי! בתאים אלה בשלב זה יהיה באופן רופף לגמתבנית. היזהר מאוד בעת החלפת מדיה כדי לא לנתק את התאים. יש לקחת טיפול שווה עם כל אחד מחילופי המדיה בצעדים הבאים. - 24 שעות לאחר זריעה, השתמש בפיפטה כדי להפיח בזהירות את התקשורת ולהחליף מדיה ממוזג KSR בתוספת 10 ng/mL bFGF ו 5 μM Y27632.
- 48 h לאחר זריעת, השתמש בפיפטה כדי להפיח בזהירות את התקשורת ולהחליף מדיה KSR ממוזג בתוספת 10 ng/mL bFGF. דבר זה מסיר את מעכבי Rho קינאז מהתקשורת ומהניסיונות להתחיל ביום הבא, 72 h לאחר זריעה.
7. ביצוע TFM
- כאשר תרצה, בצע TFM כפי שתואר בעבר9 תחת התנאים הניסיוניים הרצוי.
- אם משרות מיקרוספירה לא הדגיש את התמונה לפני זריעת תאים, לתקן את התאים לאחר נטילת עמדות מיקרוספירה הדגיש ולבצע כתמים כדי לקבוע לוקליזציה של חלבונים הריבית ביחס אזורים של כוחות המתיחה גבוה ונמוך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
האתגר העיקרי להתגבר בניסיון hESCs תרבות במושבות של גיאומטריה מבוקרת על מצעים תואמי הוא ליצור דפוס הומוגנית של ECM-ligand על פני השטח של המצע. האסטרטגיה המוצגת בשיטה זו כרוכה תחילה ביצירת התבנית הרצויה על פני השטח של שמיכות זכוכית ולאחר מכן מעבירים את הדפוס למשטח של הידרואקרילאמיד במהלך פולימוניזציה של ג'ל (איור 1 A). לכן, חשוב לוודא שהתבנית הרצויה נוצרת בהצלחה על פני השטח של שמיכות הזכוכית לפני שממשיכים לנוע בעזרת ההידרוג'ל והעברת התבנית (איור 1ב). מבוסס על הדמיה של ליגולי פלורסנט הועברו לפוליאקרילאמיד, הליגנראה להיות נוכח רק במישור אחד על פני השטח של פוליאקרילאמיד, למרות שאנחנו לא בדיוק לאפיין את העובי של שכבה זו. ישנם שני סוגים נפוצים של פגמים נצפתה לאחר יצירת דפוס על שמיכות זכוכית, כל אחד עם מקור השגיאה שלו. הראשון הוא המראה של ליגולי פלורסנט הארכת מעבר לשולי התבנית הרצויה (איור 1ג, למעלה), אשר נובע דולף של התמיסה פלורסנט והפתרון בשל קרע קטן בסטנסיל או אטימות מספקת של ה סטנסיל. לכיסויים של הזכוכית השני הוא המראה של דפוס לא שלם (איור 1ג, למטה), אשר בדרך כלל בשל בועת אוויר לכוד בממשק שמיכות המונע ספיחה של ליגנט פלורסנט.
המדד האולטימטיבי של הצלחה עבור שיטה זו היא היכולת לhESCs תרבות בגיאומטריות הרצוי על ההידרוג'לים בדוגמת (איור 2). על מנת להשיג את זה, hESCs הם הזרע בצפיפות גבוהה יחסית (300,000 תאים/mL) בנוכחות של מעכבי Rho קינאז (Y27632) ו הדגירה עבור 3 h כדי להקל על דפוסי הדבקה של ligand. לאחר מכן, מדיה מוחלפת כדי להסיר תאים שאינם בסדר. במהלך 72 h, Y27632 מדולל בהדרגה מתוך התקשורת על ידי סדרה של חילופי מדיה ב 24 ו 48 h לאחר זריעה. בדרך כלל, hESCs מתרבים כדי להשלים את הגיאומטריות בדוגמת 48-72 h, כגון ניסויים יכולים להתחיל ב 72 h לאחר זריעה, ברגע Y27632 מוסר לחלוטין מן המדיה.
המושבות החקולקות הללו בעלי גיאומטריות מושפות בהידרואקרילאמיד, מאפשרת את המדידה של כוחות המתיחה שהופקו בתא באמצעות TFM. מדידות אלה נעשים על ידי הטבעת מיקרואודורים פלורסנט ב הידרוג'ל והדמיה העמדות של חרוזים אלה לפני ואחרי זריעת hESCs (איור 3A). העקירה של החרוזים לאחר הזריעה התא הוא פונקציה של כוחות שנוצר התא ואת האלסטיות של ההידרוג'ל, ולכן את התמונות של תנוחות חרוז ניתן להשתמש כדי ליצור מפות של displacements חרוז ולאחר מכן משמש לחישוב הבסיס מדגיש המתיחה. במושבות מעגליות של hESCs, מדגיש המתיחה הגדול ביותר נמצאים ליד הקצה ההיקפי של המושבות, בעוד מרכז המושבות להציג מדגיש המתיחה נמוכה אחידה (איור 3ב). מעניין, המתיחה הגבוהה ביותר מצויים באשכולות ליד קצה המושבות, במקום ליצור טבעת רציפה של לחץ מקסימאלי. הדבר מרמז על כך שלמרות שהגאומטריה של המושבה ממלאת תפקיד מרכזי בקביעת הפצת המתיחה, הרגולציה והמשוב המותאמות יותר לשפות אחרות קובעת את המיקומים המדויקים של הלחץ המקסימלי. בנוסף, כל עוד התמונה של מיקומי מיקרוספירה ללא התאים נלקח לפני זריעת תאים, המושבות hESC יכול להיות קבוע עבור כתמים חיסוני של חלבונים של עניין בעקבות מדידות כוח המתיחה. למרות הפצות הלא אחיד ההפצות של מדגיש המתיחה, hESCs תרבותי כמו עיגולים בדוגמת בתנאי תחזוקה להציג ביטוי אחיד של סמן הפלאואון Oct3/4 ואת המולקולה התא E-קדהרין (איור 3ג ).
השיטה המוצגת לשימוש סטנסילים כדי ליצור דפוסים של ליגנד הוא הדגמה מעולה לטכניקה המשותפת של הדפסה microcontact עבור הגיאומטריות הגדולות יחסית בשימוש בשיטה זו (כלומר, עבור מושבות מעגליות 1 מ"מ בקוטר, כמו גם משולשים וריבועים של אזור שווה ערך). דפוסי הדפסה של ליגאט בקנה מידה זה מביא להעברה הטרוגנית בקצות הדפוסים, ומופקד מעט מאוד באזורים המרכזיים של הדפוסים (איור 4א). זה בבירור לא מספיק לייצר בעקביות מושבות hESC של גיאומטריות ספציפיות. הפחתת צפיפות התא מובילה גם לחוסר עקביות בהשגת מושבות שהושלמו. תאים שנזרע ב 200,000 תאים/mL, במקום 300,000 תאים/mL, אינם מסוגלים לייצר מספיק תא תאים הקשרים כדי לשרוד את הריכוז הופחת של Y27632 ב 24 h לאחר זריעה (איור 4ב). ייתכן שניתן יהיה ליצור תבניות מלאות עם צפיפויות תאים נמוכות יותר על-ידי הרחבת התקופה של דילול Y27632; עם זאת, הכולל הוא יעיל יותר לזרעים בצפיפות 300,000 תאים/mL גבוהה יותר. לעתים, שגיאות ביצירת תבנית שאינן מזוהות קודם לכן בפרוטוקול הופכות לגלויים לעין על זריעה של hESCs. שגיאה אחת כזו היא דליפה של ליגנד פתרון מתחת לסטנסיל עקב מגע עניים עם שמיכות. בסופו של דבר, התוצאה היא העברת מעבר לאזורים של פוליאקרילאמיד מחוץ לגיאומטריות הרצויות, והצמיחה הבלתי מוגבלת של hESCs בעת זריעה (איור 4ג).
איור 1: הבנת ה-ecm ליגנד על הכיסויים שנשטפו חומצה והעברה אלקטרופורזה הידרוג'לים. (א) ייצוג סכמטי של הפרוטוקול לצורך המחשה של ecm ליגנד על כיסוי שטוף חומצה והעברת התוספת בדוגמת ליגולאמיד הידרואקרילים. (ב) התמונות של אימונוofor, בדוגמת ecm ליגנד על חומצה שנשטפו כיסוי (משמאל) ובעקבות העברה אלקטרופורזה הידרוג'ל (מימין). Biotin-מתויג מטריצות היה בדוגמת על שמיכות ומסומן עם אלקסה Fluor 555 streptavidin לפני העברה polyacrylamide. מערכות insets מציגות תצוגה מוקטנת של התבניות המלאות שנוצרו. (ג) תמונות פלורסנט מייצגות הפגינו פגמים של ליגנד על שמיכות זכוכית. התוצאה נובעת משגיאות נפוצות בפרוטוקול, כגון דליפת התמיסה מחוץ לגיאומטריה של התבנית (למעלה, חץ מציין את אתר הדליפה), והשמנה של בועות אוויר בתוך הגיאומטריות הגאומטריות של הסטנסיל על הוספת התמיסה ( תחתון, החץ מציין את האתר של בועת האוויר). כל ברים בקנה מידה = 500 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: זריעת hESCs על גבי פוליאקרילאמיד בדוגמת הידרו-למינד. נציג ברייטפילד תמונות להפגין זריעה מוצלחת של hESCs על הידרואקרילאמיד polyאקרילי עם בדוגמת ליגו. ציר הזמן בראש מציין את סדרת שינויי המדיה המשמשים להסרת תאים שאינם מצורפים ולדלל את Y27632. שים לב כי לאחר הזריעה הראשונית, תאים לדבוק באזורים שונים בתוך בדוגמת ליגנט ולאחר מכן מתרבים כדי למלא את האזורים בתבנית במהלך 72 h. סרגל סרגל = 500 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: לוקליזציה אזורית של מתחים המתיחה וכתמים חיסוני של המושבות hESC מוגבלת. (א) תמונות פלורסנט של מיקרוספירות בתוך ההידרואקרילאמיד לפני ואחרי זריעת hESCs. (ב) העלילה התמונה חלקיקים מייצגים (piv) מתווה המתאר את העקירה של microspheres בשל מדגיש המתיחה (שמאל) ומדגיש המתיחה משוחזר המקביל (מימין). (ג) חיסוני מוקף מושבות hesc על בדוגמת אלקטרופורזה, הדגמת היכולת להשוות את הלוקליזציה של חלבונים של עניין ללחצים המתיחה. כל ברים בקנה מידה = 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תוצאות שאינן אידיאליות הניבו שיטות ושגיאות חלופיות. (א) מייצג תמונות פלורסנט של ecm ליגנד בדוגמת על חומצה ששטף שמיכות באמצעות מיקרומגע הדפסה. (ב) ברייטפילד תמונות של hESCs שאינן יוצרות מושבות שהושלמו עקב חוסר הדבקות של תאים. הפערים הגדולים שנותרו במושבות ב -24 שעות לאחר זריעה (חיצים) הם מחוון מוקדם לסוגיה זו. (ג) ברייטפילד דימויים של hESCs שאינם יוצרים מושבות מוגבלים עקב שגיאות בהחשפות שהובילו לנוכחות של ליגאל מחוץ להגאוניות הרצויות. כל ברים בקנה מידה = 500 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| דוגמה SU8 ייצור וופל | |
| 1. מעיל ספין וופל עם SU8-3050 | ספין ב 1,000 RPM עבור 30 s |
| 2. פרוסת אפייה רכה על צלחת חמה | i .3 דקות ב 65 ° צ' |
| ii. 45 דקות בשעה 95 ° c | |
| iii. 3 דקות ב 65 ° צ' | |
| iv. מגניב לטמפרטורת החדר | |
| 3. לחשוף את מסכת התנינים | i. ליישר וופל ופושאל מסכה לתנינים |
| השני. לחשוף עם אנרגיה של 250 mJ/cm2 | |
| • לדוגמה עבור מנורה בעוצמה של 11 mW/cm2, לחשוף עבור 23 s | |
| 4. לאחר לאפות חשיפה על צלחת חם | 1 דקות ב 65 ° צ' |
| ii. 15 דקות ב 95 ° צ' | |
| 3.1 דקות ב 65 ° צ' | |
| רביעי. מגניב לטמפרטורת החדר | |
| 5. פיתוח | i. מתפרעים ב SU8 מפתח, כ. 5-10 דקות |
| השני. בדיקת הפיתוח עם אלכוהול איזופרופילי (IPA) | |
| • אם מפותחים, שטיפה IPA יפיק שארית לבנה | |
| 6. אופים קשה על צלחת חם (אופציונלי) | 1-2 h בשעה 150 ° c |
טבלה 1: SU8 לדוגמה פרוטוקול ייצור וופל. וופלים סיליקון המשמש להפקת בולים PDMS ובסטנסילים הבאים הפוברק באמצעות השלבים המתוארים בטבלה זו. פרוטוקול זה נוצר באמצעות SU8 3000 גיליון נתונים במטרה ליצור עובי הסרט של כ 100-250 μm.
| פוליאקרילאמיד ג'ל ניסוחים | |||||||||
| אמצעי אחסון לפתרון מושלם של 1 מ"ל | |||||||||
| מודול הנפח (פי אי) | סופי% אקרילאמיד | סופי% Bis-אקרילאמיד | ddH2O (μl) | 40% אקרילאמיד (μL) | 2% Bis-אקרילאמיד (μL) | 10x PBS (μL) | 1% TEMED ב-ddH2O (μl) | מיקרוספירות 0.5% מוצקים ב-ddH2O (μl) | 1% PPS ב-ddH2O (μl) |
| 1050 | 3 | 0.1 | 565 | 75 | 50 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 2700 | 7.5 | 0.035 | 485 | 187.5 | 17.5 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 4000 | 7.5 | 0.05 | 477.5 | 187.5 | 25 | 100 | 75 | 60 | 75 |
| 6000 | 7.5 | 0.07 | 467.5 | 187.5 | 35 | 100 | 75 | 60 | 75 |
שולחן 2: ניסוחים מפוליואקרילאמיד ג'ל. כרכים של רכיבים ליצירת הידרו פוליאקרילאמיד של מודולים גמישים שונים עם כדורי פלורסנט עבור TFM. ניתן לשנות אמצעי אחסון למעלה או למטה בהתבסס על כמות הפתרונות הפוליאקרילאמיד הדרושים. כל הרכיבים למעט מיקרוספירות הפלורסצנט ו-PPS מעורבבים יחד לפני הניטרול. מתמיסת מלין = פוספט מאגור באגירה, PPS = אשלגן פרסולפט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כדי לפשט פרוטוקול ארוך ומפורט, שיטה זו מורכבת משלושה שלבים קריטיים: 1) יצירת תבניות של ecm ליגנד על כיסוי זכוכית, 2) העברת הדפוסים להידרואקרילאמיד במהלך פולימוניזציה של ג'ל, ו 3) זריעה hESCs על ה בדוגמת הידרוג'ל. ישנם שלבים קריטיים שיש להתחשב בהם בכל אחד משלושת השלבים הללו. על מנת ליצור דפוסים בעלי אמינות גבוהה על שמיכות זכוכית, הסטנסיל חייב להיות לחוץ היטב על שמיכות כדי למנוע דולף של הפתרון ואת כל בועות האוויר יש להסיר לאחר הוספת ליגנד פתרון למשטח של הסטנסיל ( איור 1ג). אם ליגנד פתרון עושה דליפה דרך הסטנסיל עקב מגע עני עם שמיכות, ליגו יועבר למשטח כולו של הידרואקרילאמיד הידרו ו hESCs לא יהיה מוגבל הגיאומטריה הרצויה המושבה (איור 4ג). הצעד החשוב ביותר בהעברת הדוגמאות והפוליאקרילאמיד מפריד בעדינות את הכיסויים העליונים של ההידרוג'ל, ואילו כל הרכיבים נשארים מתחת למים ב-PBS. אם ההידרוג'ל לא יישאר מתחת למים בזמן ההפרדה, הדפוסים עלולים להיהרס לחלוטין. יתרה מזאת, אם ההפרדה מתרחשת מהר מדי, המשטח של ההידרוג'ל עלול להיקרע או להינזק באופן אחר. ככל שההידרוג'ל רך יותר, כך היא מסכנת את הפגיעה במהלך ההפרדה. לבסוף, המשתמש חייב לפיפטה בזהירות רבה בעת חילופי מדיה במהלך הזריעה והתרבות של hESCs על הידרו-ג'ל בדוגמת מילוי. הhESCs נשארות באופן רופף בכל הפרוטוקול והמושבות העשויות להיות משובשות בקלות על-ידי רשלנות או בהלה.
בנוסף לשלבים הקריטיים שנדונו לעיל, קיימים מספר שלבים אחרים שעשויים לדרוש שינוי ופתרון בעיות בעת התאמת פרוטוקול זה עבור יישומים שונים. בעוד הדפוסים הפגינו כאן הם בקנה מידה אורך של מאות מיקרון כדי מילימטר, יצירת תכונות בדוגמת על וופלים סיליקון עם שקיפות פושphotoresist ושלילי מאפשר מידות תכונות כל הדרך למטה כדי 7-10 μm. לכן, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לצורך העברת הגיאומטריה של תאים בודדים או מושבות קטנות של תאים מעטים על מצעים תואמי.
שני פרמטרים כי סביר להניח שידרוש אופטימיזציה בעת התאמת פרוטוקול זה עבור סוגי תאים שונים הם סוג של ecm ליגונים משמש ואת הריכוז של ליגנד בפתרון במהלך ספיחה על שמיכות זכוכית דרך הסטנסילים. ליגונים מוחלטים של 250 μg/mL היה מספיק להפקת דפוסים הומוגניים של מטריצות והקלה על ההחזקה של hESCs (איור 1B ואיור 2), למרות שניתן יהיה להשיג תוצאות דומות עם נמוך יותר ריכוזים. מצד שני, ייתכן שיהיה צורך להגדיל עוד יותר את הריכוז של ליגנד עבור סוגי תאים פחות מחסיד או עבור יישומים הדורשים הדגירה קצר יותר. ריכוז מוגבר של ליגנד עשוי להידרש גם עבור שונים ecm ליגנדס, כגון fibronectin או קולגן, אשר הם פחות הידרופובי מאשר המטאג, ולכן לא יכול להיות ספוח להידרוג'ל כמו חזק. מכיוון שהעברת הליטרים מcoverslip להידרוג'ל מתרחשת בזמן הפלוניזציה של ההידרוג'ל, טכניקות המשמשות בדרך כלל למעבר ברובוץ המקשר בין ה-ECM לבין משטח ההידרוג'ל (כגון טיפול sulfo-SANPAH) הם בלתי אפשריים. שימוש בפלואורוסקופים ECM ליגנדס כדי לאפשר ויזואליזציה של תבניות בכל שלב של הפרוטוקול הוא מועיל מאוד בעת אופטימיזציה ופתרון בעיות של פרמטרים אלה.
בנוסף, הפרוטוקול לזריעת תאים עשוי לדרוש מיטוב בהתאם לסוג התא ולתנאי המדיה הנמצאים בשימוש. עבור תאים הדבקים במהירות רבה יותר או ביעילות, צפיפות הזריעה הנמוכה יותר עשויה להידרש למנוע הידקויות תא תא המקיפות בין דפוסים וגורמים לאגרגטים במקום למושבות מקושטות. עבור תאים המציגים קובץ מצורף עני מאוד, צפיפות גדולה יותר של זריעה או אורך זמן ארוך יותר לפני החלפת המדיה הראשונית עשוי להידרש כדי להקל על היווצרות מלא של מושבות מוגבלים (איור 4ב).
המגבלה המפתח של שיטה זו היא המורכבות הטכנית שלה, אשר מביא תוצאות בתפוקה נמוכה יחסית בהשוואה לשיטות דומות המערבות תאים culturing על מצעים זכוכית מקושטות8. עם זאת, החיסרון הזה הוא הרבה על ידי הרלוונטיות הפיסיולוגית שהושגו על ידי מושבות hESC מוגבלים על מצעים תואמי. על-ידי הבנת התכונות המכאניות של העובר המוקדם, אנו מסוגלים לדגם טוב יותר ולהבין את התהליכים המובילים לארגון עצמי של שכבות הנבט הראשיות.
יתרון נוסף של הקמת המושבות hesc על אלקטרופורזה הידרולים הוא שהוא מאפשר את השימוש tfm לבחון את הקשר בין הארגון של המושבה hesc, כמודל של העובר המוקדם, ואת התפלגות של כוחות שנוצר התא שעשוי מורפוגנזה ומפרט הגורל של התא. המושבות מגבילה את ההפצות בהפצות של מתחים המתיחה התלויים בגיאומטריה של המושבה (איור 3ב). למרות הלא אחידות של אלה המתיחה מדגיש, תאים ברחבי המושבות להישאר pluripotent בתנאי תחזוקה (איור 3ג). עם זאת, אנחנו ההשערה כי לחץ המתיחה הפצות עשוי להיות מעורב בוויסות דפוסי של מפרט הגורל התא על ידי כוונון התגובה רמזים אינדוקציה, כגון מורפולגנים מסיסים. אנו מצפים ששיטה זו תאפשר לנו ולקבוצות אחרות לדגמן בצורה טובה יותר את העובר האנושי המוקדם עם hESCs, שיוביל להבנה מלאה יותר של התהליכים הבסיסיים הטמונים בembryogenesis האנושית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
ברצוני לאשר מימון מ-CIRM גרנט RB5-07409. J.M.M. רוצה להודות FuiBoon Kai, Dhruv Thakar, ו רוג'ר ריה עבור דיונים שונים שהדריך את הדור ופתרון בעיות של שיטה זו. J.M.M. גם תודה מלגת הגילוי של מדינת קליפורניה לתמיכה המתמשכת של עבודתו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
References
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
- Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).
- Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mace, K., Braun, K. 916, Humana Press. Totowa, NJ. 317-350 (2012).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
- Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
- Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).
