Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Patroon van de geometrie van menselijke embryonale stamcel kolonies op conforme ondergronden om de mechanismen van Weefselniveau te beheersen

Published: September 28, 2019 doi: 10.3791/60334
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 1,3, 2,4,5,6
1Graduate Program in Bioengineering, University of California San Francisco and University of California Berkeley, 2Center for Bioengineering and Tissue Regeneration, Department of Surgery, University of California San Francisco, 3Department of Mechanical Engineering, University of California Berkeley, 4Eli and Edythe Broad Center of Regeneration Medicine and Stem Cell Research, University of California San Francisco, 5UCSF Comprehensive Cancer Center, Helen Diller Family Cancer Research Center, University of California San Francisco, 6Department of Anatomy, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, and Department of Radiation Oncology, University of California San Francisco

Summary

Extracellulaire matrix liganden kunnen worden Gedessineerd op polyacrylamidehydrogels om de cultuur van menselijke embryonale stamcellen in kleine kolonies op conforme ondergronden mogelijk te maken. Deze methode kan worden gecombineerd met tractiekracht microscopie en biochemische testen om de wisselwerking tussen weefsel geometrie, door cellen gegenereerde krachten en de specificatie van het lot te onderzoeken.

Abstract

Menselijke embryonale stamcellen tonen een uniek vermogen om in vitro op morfogenen te reageren door zelforganiserende patronen van de specificatie van het lot van cellen die corresponderen met primaire kiem laagvorming tijdens de embryogenese. Dus, deze cellen vertegenwoordigen een krachtig instrument om te onderzoeken van de mechanismen die vroege menselijke ontwikkeling stimuleren. We hebben een methode ontwikkeld om menselijke embryonale stamcellen te kweken in kleine kolonies op conforme ondergronden die de controle over zowel de geometrie van de kolonies als hun mechanische omgeving bieden om de fysische parameters te recapituleren die ten grondslag embryogenese. Het belangrijkste kenmerk van deze methode is de mogelijkheid om polyacrylamidehydrogels te genereren met gedefinieerde patronen van extracellulaire matrix ligand aan de oppervlakte om celhechting te bevorderen. Dit wordt bereikt door het vervaardigen van stencils met de gewenste geometrische patronen, met behulp van deze stencils te maken patronen van extracellulaire matrix ligand op glas dekstroken, en overbrengen van deze patronen naar Polyacrylamide hydrogels tijdens polymerisatie. Deze methode is ook compatibel met de tractiekracht microscopie, waardoor de gebruiker de verdeling van de door cellen gegenereerde krachten binnen de besloten kolonies kan meten en toewijzen. In combinatie met standaard biochemische testen, kunnen deze metingen worden gebruikt om de rol van mechanische cues spelen in Fate specificatie en morfogenese tijdens de vroege menselijke ontwikkeling te onderzoeken.

Introduction

Menselijke embryonale stamcellen (hESCs) houden grote belofte voor gebruik in regeneratieve geneeskunde en weefsel engineering toepassingen. De pluripotente aard van deze cellen geeft hen de mogelijkheid om onderscheid te maken in een volwassen celtype. Hoewel er grote vooruitgang is geboekt bij het sturen van het lot van hESCs naar bepaalde celtypen, is het erg moeilijk gebleven om hele weefsels of organen de Novo1,2,3,4te genereren, 5. Dit is grotendeels te wijten aan een beperkt begrip van de mechanismen die de vorming van deze weefsels tijdens de menselijke ontwikkeling stimuleren. Om deze kloof in kennis te dichten, zijn er de afgelopen jaren een aantal methoden ontstaan om het vroege embryo en de daaropvolgende ontwikkelingsstadia te modelleren met embryonale stamcellen6,7,8,9 ,10,11,12,13.

Kort na de afleiding van de eerste hESC-lijnen14werd aangetoond dat embryoïde lichamen gevormd uit hescs in staat waren om spontaan cellen te produceren van de drie primaire kiem lagen6. Door het inherente gebrek aan controle over de grootte en morfologie van embryoïde lichamen varieerde de organisatie van kiem lagen echter aanzienlijk en slaagde er niet in om de organisatie van het vroege embryo te matchen. Meer recentelijk heeft Warmflash et al. een methode ontwikkeld om kolonies van hESCs op glas substraten te beperken via micropatterning, wat controle en consistentie biedt over de grootte en geometrie van de kolonies8. In aanwezigheid van BMP4, een belangrijke morfogen in de vroege ontwikkeling, waren deze besloten kolonies in staat om zelforganiserende reproduceerbare patronen van specificatie te geven aan lot die de primaire kiem lagen representeren. Hoewel dit een nuttig model voor het bestuderen van de mechanismen waarmee primaire kiem lagen zijn vastgesteld, de patronen van het lot specificatie niet precies overeenkomen met de organisatie en morfogenese waargenomen tijdens embryogenese15. Een meer getrouwe recapitulatie van de vroege embryonale ontwikkeling werd bereikt door het insluiten van hESCs in een driedimensionale extracellulaire matrix (ECM) van matrigel11, die tot op heden het sterkste bewijs levert voor het vermogen van hescs om zichzelf te organiseren en model de vroege stadia van embryogenese ex vivo. Deze methode levert echter inconsistente resultaten op en is dus onverenigbaar met een aantal assays die kunnen worden gebruikt om de onderliggende mechanismen van zelforganisatie en Fate specificatie te onthullen.

Gezien deze bestaande methodes en hun respectieve beperkingen, probeerden we een methode te ontwikkelen voor het reproduceren van hESC-kolonies met gedefinieerde geometrieën onder omstandigheden die de extracellulaire omgeving van het vroege embryo modelleren. Om dit te bereiken gebruikten we Polyacrylamide hydrogels van instelbare elasticiteit om de mechanische eigenschappen van het substraat te beheersen. Met behulp van atoom kracht microscopie op gastrulatie-stage kippen embryo's, vonden we dat de elasticiteit van de epiblast varieerde van honderden pascal's tot een paar kilopascals. Zo richtten we ons op het opwekken van polyacrylamide hydrogels met elasticiteit in dit bereik om te dienen als substraat voor hESC-kolonies. We hebben onze eerdere methoden voor het kweken van hescs op Polyacrylamide hydrogels7,9 aangepast om een robuuste controle te bieden over de geometrie van de kolonies. Dit hebben we bereikt door eerste patronen ECM ligands, namelijk matrigel, op glazen dekstroken via micro fabricaat stencils, zoals eerder gerapporteerd16. Vervolgens ontwierpen we een nieuwe techniek om het patroon ligand over te brengen naar het oppervlak van polyacrylamidehydrogels tijdens polymerisatie. De methode die we hier beschrijven, is het gebruik van foto lithografie om een silicium wafer te fabriceren met de gewenste geometrische patronen, het maken van postzegels van deze geometrische kenmerken met Polydimethylsiloxaan (PDM'S), en het gebruik van deze stempels om de stencils te genereren die uiteindelijk toestaan van het patroon van ligand op het oppervlak van glas dekstroken en overbrengen naar Polyacrylamide.

Naast het samenstellen van de mechanische omgeving van het vroege embryo, maakt het beperken van hESC-kolonies op Polyacrylamide het mogelijk om door cellen gegenereerde krachten te meten met tractiekracht microscopie (TFM), zoals gerapporteerd in onze vorige methode9. In het kort, fluorescerende kralen kunnen worden ingebed in de Polyacrylamide en gebruikt als fiducial markers. Door de cel gegenereerde krachten worden berekend door de verplaatsing van deze kralen te vervormen na het zaaien van hESCs op het patroon substraat. Bovendien kunnen de resulterende tractiekracht kaarten worden gecombineerd met traditionele assays, zoals immunokleuring, om te onderzoeken hoe de verdeling van door cellen gegenereerde krachten in kleine hESC kolonies de downstream signalering kan reguleren of moduleren. We verwachten dat deze methoden zullen onthullen dat mechanische krachten een cruciale rol spelen in het patroon van de specificatie van het lot van cellen tijdens de vroege embryonale ontwikkeling die momenteel over het hoofd wordt gezien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle hier beschreven methoden met betrekking tot het gebruik van hESCs zijn goedgekeurd door de Human gamete, embryo and stamcel Research (GESCR) Committee aan de University of California San Francisco.

1. bereiding van silicium wafer met geometrische kenmerken

  1. Maak een photomask met de gewenste geometrische kenmerken. Gebruik computer-aided redactie software om de functies te ontwerpen. Voor gebruik met negatieve fotororsist, maken functies dekkend en de rest van het masker transparant.
    Opmerking: voor patronen op 18 mm diameter afdek stroken, groepskenmerken voor elke experimentele conditie in 10 x 10 mm gebieden om ervoor te zorgen dat de stencils gegenereerd in stap 3 passen op de dekstroken.
  2. Spin Coat Negative fotoresist op een 100 mm silicium wafer. Gebruik het fotoresist-gegevensblad om de snelheid en de lengte van de spin te bepalen om een filmdikte van 100-250 μm te genereren.
    Let op: de dikte van de folie moet zodanig worden aangepast dat de hoogte-breedte verhouding van de patronen tot aan het stencil zo dicht mogelijk bij 1:1 ligt. We raden echter een minimale dikte van 100 μm aan, omdat alles minder delicate stencils produceert die gemakkelijk scheuren.
  3. Verwerk de fotoresist volgens het productgegevensblad. Dit betekent meestal een zachte bak, UV-belichting met photomask in een masker aligner, post exposure Bake, ontwikkeling, en harde bakken. In tabel 1wordt bijvoorbeeld de procedure beschreven die gebruikt wordt om de in dit Protocol gebruikte wafers te verwerken.
    Opmerking: Wees voorzichtig bij het hanteren van silicium wafers omdat ze kwetsbaar zijn. Eenmaal gegenereerd, kunnen wafers herhaaldelijk worden gebruikt, zolang ze niet beschadigd zijn.

2. voorbereiding van de dekstroken

  1. Bereiding van zuurgewassen "Top" dekstroken
    1. Plaats 18 mm diameter #1 dikte afdek stroken in een glazen Petri schaaltje. Het juiste aantal afdek stroken is afhankelijk van de grootte van het schaaltje. Voor een 100 mm schotel, bereid 50-100 covers Lips tegelijk. Volume bedragen die door de rest van deze sectie worden gegeven, komen overeen met een schaal van 100 mm.
    2. Voeg 20 mL 1 M HCl toe aan de Petri schaal en schud het gerecht zachtjes om de dekstroken te dispergeren. Zorg ervoor dat alle afdek stroken worden ondergedompeld en luchtbellen uit tussen de dekstroken. Incuberen 's nachts bij kamertemperatuur met zacht schudden.
      Let op: HCl is zuur en corrosief. Wees voorzichtig en draag de juiste PBM terwijl u met HCl werkt.
    3. Decant HCl uit de schaal. Voeg 20 mL ultrapuur water toe en was met zacht schudden gedurende 10 min. Gooi het water weg en herhaal dit voor een totaal van vijf Wassers.
    4. Na het verwijderen van de laatste wasbeurt, Voeg 20 mL 100% ethanol toe aan de schaal. Gebruik de Tang, verwijder de dekstroken afzonderlijk en leg tussen twee stukjes filtreerpapier om te drogen.
    5. Bewaar de gedroogde dekstroken in een verzegelde verpakking. Zuurgewassen dekstroken kunnen van tevoren worden bereid en gedurende een maand of langer worden opgeslagen in stofvrije omstandigheden.
  2. Bereiding van glutaraldehyde-geactiveerde "bottom" dekstroken
    Opmerking: Raadpleeg de vorige methoden voor aanvullende informatie7,9.
    1. Plaats 18 mm diameter #1 dikte afdek stroken in een Petri schaaltje.
    2. Voeg 20 mL 0,2 M HCl toe aan de petrischaal en schud het gerecht zachtjes om de dekstroken te dispergeren. Zorg ervoor dat alle afdek stroken worden ondergedompeld en luchtbellen uit tussen de dekstroken. Incuberen 's nachts bij kamertemperatuur met zacht schudden.
    3. Decant HCl uit de schaal. Voeg 20 mL ultrapuur water toe en was met zacht schudden gedurende 10 min. Gooi het water weg en herhaal dit voor een totaal van vijf Wassers.
    4. Na het verwijderen van de laatste wasbeurt, Voeg 20 mL 0,1 M NaOH toe en schud zachtjes om de dekstroken te dispergeren en te onderdompelen. Incuberen bij kamertemperatuur met zacht schudden gedurende 1 uur.
    5. Decant NaOH uit het gerecht. Voeg 20 mL ultrapuur water toe en was met zacht schudden gedurende 10 min. Gooi het water weg en herhaal dit voor een totaal van vijf Wassers.
    6. Na het verwijderen van de laatste wasbeurt, Voeg 20 mL van een 1:200 verdunning van 3-aminopropyltrimethoxysilaan in ultrapuur water en schud zachtjes om de dekstroken te dispergeren en te onderdompelen. Inincuberen bij kamertemperatuur met zacht schudden gedurende 1 uur of 's nachts.
      Let op: 3-aminopropyltrimethoxysilaan is ontvlambaar en kan huidirritatie veroorzaken. Behandel met zorg, draag de juiste PBM en gooi afval weg volgens de lokale verwijderings voorschriften.
    7. Decanen de verdunde 3-aminopropyltrimethoxysilaanoplossing uit de schaal. Voeg 20 mL ultrapuur water toe en was met zacht schudden gedurende 10 min. gooi water weg en herhaal dit voor een totaal van ten minste vijf wasgewassen. Het is van cruciaal belang om alle 3-aminopropyltrimethoxysilaan te verwijderen voordat u doorgaat.
    8. Na het verwijderen van de laatste spoeling, Voeg 20 mL van een 1:140 verdunning van 70% Glutaaraldehyde in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en schud zachtjes om te dispergeren en onderdompelen dekzeilen. Inincuberen bij kamertemperatuur met zacht schudden gedurende 1 uur of 's nachts.
      Let op: 70% Glutaaraldehyde is giftig en kan huidirritatie veroorzaken. Behandel met zorg, draag de juiste PBM en gooi afval weg volgens de lokale verwijderings voorschriften.
    9. Decanteer de verdunde Glutaaraldehyde oplossing uit de schaal. Voeg 20 mL ultrapuur water toe en was met zacht schudden gedurende 10 min. Gooi het water weg en herhaal dit voor een totaal van vijf Wassers.
    10. Voeg 20 mL 100% ethanol toe na het verwijderen van de laatste wasbeurt. Gebruik de Tang, verwijder de dekstroken afzonderlijk en leg tussen twee stukjes filtreerpapier om te drogen.
    11. Bewaar de gedroogde dekstroken in een verzegelde verpakking. Glutaraldehyde-geactiveerde dekstroken kunnen vooraf worden bereid en maximaal zes maanden worden bewaard.

3. generatie stencils voor patronen ECM ligand

  1. Polydimethylsiloxaan (PDM'S) tussenliggende stempels genereren
    1. Meng PDMS Base met PDMS Uithardings middel bij een verhouding van 10:1, in gewicht. Meng.
      Opmerking: voor de eerste toepassing van PDM'S bereidt u ongeveer 100 g PDM'S voor om een schaal van 100 mm te vullen. Voor volgende toepassingen verwijdert u PDM'S uit het midden van de schaal waar de silicium wafer-functies zich bevinden en bereidt u 20-30 g nieuwe PDM'S voor.
    2. Degas het PDMS mengsel in een exsiccator gedurende 30-60 min of totdat alle luchtbellen zijn verwijderd.
    3. Plaats de gemodificeerde silicium wafer van stap 1 in een plastic 100 mm schaaltje. Giet het mengsel van PDM'S langzaam en gelijkmatig over het oppervlak van de wafer. Tik op het schaaltje op het werkoppervlak om eventuele luchtbelletjes van het oppervlak van de wafer vrij te geven.
    4. Degas het PDMS-mengsel wordt gedurende 10 minuten over de wafer gegoten of totdat alle luchtbellen zijn verwijderd of naar het oppervlak van de PDM'S zijn gekomen.
    5. Bak de PDM'S op 70 °C gedurende 2 uur. laat afkoelen tot kamertemperatuur.
    6. Knip met een scalpel of Box Cutter het gedeelte van PDMS uit het midden van het gerecht dat de geometrische kenmerken bevat.
    7. Snijd de PDM'S in ongeveer 10 x 10 mm vierkantjes, elk met de functies voor een enkele experimentele conditie. Deze worden in de volgende stappen van het Protocol ' stempels ' genoemd.
  2. Vlakke platen van PDM'S genereren
    1. Meng PDMS Base met PDMS Uithardings middel bij een verhouding van 8:1, in gewicht. Bereid ongeveer 20 g voor elke schaal van 100 mm die moet worden gebruikt. Meng.
    2. Degas het PDMS mengsel in een exsiccator gedurende 30-60 min of totdat alle luchtbellen zijn verwijderd.
    3. Giet de PDM'S langzaam en gelijkmatig in een schone 100 mm schaal. Tik op het schaaltje op het werkoppervlak om eventuele luchtbelletjes vrij te geven.
    4. Bak de PDM'S op 70 °C gedurende 2 uur. laat afkoelen tot kamertemperatuur.
    5. Verwijder de PDM'S uit de schaal. Zo omkeren dat het oppervlak van de PDM'S die in aanraking was met de bodem van het gerecht naar boven gericht is.
    6. Knip voor elke in stap 3,1 gegenereerde stempel een vierkant van 15 x 15 mm van PDM'S. Deze worden in de daaropvolgende stappen van het protocol "platte platen" genoemd.
  3. Stencils genereren
    1. Regel platte platen van PDM'S op het deksel van een schotel van 150 mm of een ander vlak oppervlak voor eenvoudiger gebruik. Zorg voor voldoende ruimte tussen platen (bijv. voor een 150 mm schaal, regel negen vlakke platen met gelijkmatige afstand).
    2. Keer elke in stap 3,1 gegenereerde stempel op een vlakke plaat van PDM'S, zodat de functies op de stempel in contact komen met de platte plaat van PDM'S. Druk voorzichtig op de bovenkant van de stempel met een tang om een gelijkmatige contact te garanderen.
    3. Schroef de deksel van de PDMS stempel/slab op de basis van het schaaltje, zodat het deksel onder een hoek ligt. Dit helpt de wicking van het UV-uier bare polymeer in de volgende stap.
    4. Plaats een kleine druppel UV-uikbaar polymeer in de bovenste interface van elk stempel/slab paar. Het polymeer zal goddeloos zijn tussen de twee door oppervlaktespanning, bijgestaan door de zwaartekracht.
      Opmerking: veel verschillende UV-uier bare polymeren kunnen in dit protocol werken. We selecteerden Norland Optical Adhesive 74 voor de volgende eigenschappen: i) snelle uitharding bij blootstelling aan UV-licht, II) eenvoudig verwijderen van PDMS-stempels bij uitharding, III) robuuste hechting op glas dekstroken met handmatige druk.
    5. Zodra het polymeer volledig goddeloos is geweest, plaatst u het deksel met stempel/slab paren plat op het werkoppervlak. Plaats een kleine druppel UV-uikbaar polymeer aan elk van de overige drie zijden van elke stempel/slab-interface.
    6. Verbind met een pipetpunt van 200 μL de druppels polymeer rond de randen van de stempel/plaat-interface. Hiermee maakt u een rand die ligand-oplossing in stap 4 houdt.
      Opmerking: Wees voorzichtig wanneer u het polymeer rond de randen van de stempel werkt. Als de stempel/slab-interface wordt verstoord, zal het polymeer onder de functies staan en zal het stencil niet goed worden vormgegeven.
    7. Plaats de stempel/plaat paren voorzichtig in een UV-sterilisatie doos. Gebruik de steriele "str" vermogensinstelling en bloot gedurende 10 min.
    8. Verwijder de stempel/plaat paren uit de UV-sterilisatie doos. Gebruik twee paar tang, verwijder voorzichtig de PDMS stempel terwijl u de platte plaat en stencil die gevormd uit het UV-uier bare polymeer.
    9. Gebruik de Tang, verwijder voorzichtig het stencil en inverteer het zodanig dat het oppervlak dat in aanraking was met de vlakke plaat van PDMS naar boven is gericht.
      Opmerking: de stencils zijn delicaat. Wees voorzichtig terwijl u ze overhandigt, vooral terwijl u ze in eerste instantie uit de PDM'S verwijdert, zodat ze niet scheuren.
    10. Plaats de omgekeerde stencils terug in een UV-sterilisatie doos. Gebruik de steriele "str" vermogensinstelling en bloot gedurende 3 min.

4. patterning ECM ligand op dekstroken

  1. Drukken op stencils op zuurgewassen dekstroken
    1. Plaats een met zuur gewassen dekslip voor elk stencil op een schoon stukje laboratorium film.
    2. Met behulp van een tang, zorgvuldig plaats elk stencil, platte-side-Down, op een zuur-gewassen coverslip. Plaats zodanig dat de functies gecentreerd zijn op de dekslip.
    3. Plaats een klein stukje laboratorium folie bovenop elk stencil. Druk stevig en gelijkmatig op het stencil om een sterk contact tussen het stencil en de coverslip te creëren.
      Opmerking: Dit is een kritieke stap! Druk stevig en over het gehele oppervlak van het stencil. Als er geen voldoende contact is gemaakt, lekt de ligand-oplossing tussen het stencil en de dekstroken en het patroon zal mislukken. Optioneel: om voldoende contact tussen het stencil en de Afdeklijst te bevestigen, Pipetteer 100 μL ultrapuur steriel water op het oppervlak van elk stencil en incuberen bij kamertemperatuur. Controleer na 1 uur of er lekkage is. Aspirate water uit met succes gebonden stencils en doorgaan.
  2. Plasma reiniging van het oppervlak van de stenciled dekstroken om de hydrofiliciteit te verhogen
    1. Plaats de dekstroken met stencils in een plasma reiniger. Breng hoog vermogen plasma aan voor 30 sec.
  3. Bereiding van de ligand oplossing van ECM
    Opmerking: alle volgende stappen moeten, indien mogelijk, in steriele omstandigheden worden voltooid.
    1. Plaats steriel 100 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 8,0 oplossing op ijs. Eenmaal ijskoud, voeg matrigel en collageen toe om concentraties van respectievelijk 225 μg/mL en 25 μg/mL te bereiken. Optioneel: voor het oplossen van problemen of voor ligand visualisatie, omvatten een fluorescently gelabeld ligand in de ligand oplossing.
      1. Opmerking: bij deze methode kunnen verschillende ECM-liganden worden gebruikt. Voor verschillende liganden kan extra optimalisatie nodig zijn om de ideale concentratie, incubatietijd en incubatietemperatuur te bepalen. Zie discussie sectie voor meer informatie.
    2. Pipetteer de ligand-oplossing op het oppervlak van elk stencil. Voor stencils gemaakt van 10 x 10 mm vierkante stempels, apply 100 μL per stencil.
    3. Controleer op luchtbellen in stencil functies. Gebruik indien nodig een fijngedraaide Tang of een pipetpunt van 2 μL om luchtbellen uit functies te verwijderen.
      Opmerking: Dit is een kritieke stap! Als er luchtbellen aan het oppervlak van de dekslip blijven zitten, zal de ligand niet aan het oppervlak adsorberen en zal het resulterende patroon onvolledig zijn.
    4. Leg de stenciled dekstroken met ligand in een schaaltje, wikkel met een laboratorium folie en inincuberen bij 4 °C 's nachts.

5. overdracht van ligand naar polyacrylamidegel

  1. Het verwijderen van ligand-oplossing en stencil van elke afdek
    1. Aspirate de ligand-oplossing van het oppervlak van een stencil. Ligand-oplossing kan worden verzameld en opgeslagen bij 4 °C en gedurende maximaal een maand worden hergebruikt.
    2. Met behulp van een tang, dompel de dekslip kort samen met een stencil in een schotel met steriele PBS om te wassen.
    3. Dompel de dekslip kort met een stencil in een tweede gerecht van steriel PBS om te wassen.
    4. Verwijder het stencil uit het oppervlak van de coverslip. Wees voorzichtig om de dekslip niet te breken.
    5. Dompel de afdek schaal kort in een schaaltje dat ultra steriel water bevat om zouten uit de PBS-wassings te verwijderen. Tik op de rand van de Afdeklijst om een delicate taak te verwijderen om overtollig water weg te geven.
    6. Droog de dekslip onder een inert gas, zoals stikstof. Markeer de onderzijde van de dekslip om vanaf dit punt de oriëntatie te volgen. Zorg ervoor dat de patroon zijde naar boven is gericht.
    7. Herhaal stap 5.1.1 tot en met 5.1.6 voor elke dekslip van de stenciled.
  2. Polyacrylamidehydrogels maken met patroon dekstroken
    Opmerking: Raadpleeg de vorige methoden voor aanvullende informatie7,9 steriliseren alle Cap-houders, buizen, en spacers gebruikt voor het maken van polyacrylamide gels door wassen met 10% bleekmiddel 's nachts, spoelen met water ten minste vijf keer om bleken te verwijderen, en wassen kort in 70% ethanol. Plaats alle stukken op delicate taak doekjes in een steriele bioveiligheids kast om te drogen voor gebruik.
    1. Bereid polyacrylamideoplossing voor om de gewenste hydrogel elasticiteit te verkrijgen (tabel 2). Meng alle componenten met uitzondering van de fluorescerende microsferen en het Kaliumpersulfaat (PPS).
      Let op: bereid 1% kalium persulfate oplossing elke keer vers.
    2. Degas de polyacrylamideoplossing, microsferen en PPS in afzonderlijke buisjes onder vacuüm gedurende 30 minuten.
    3. Voor elk patroon dekslip, bereid een glutaraldehyde-geactiveerde "bottom" dekmantel met een spacer (18 mm buitendiameter, 14 mm binnendiameter) bovenop geplaatst.
    4. Na ontgassing kort soniceren microsferen en voeg het juiste volume aan Polyacrylamide oplossing. Meng door Pipetteer op en neer, wees voorzichtig om geen luchtbellen te introduceren. Kort soniceren.
    5. Voeg het juiste volume PPS toe aan de Polyacrylamide-oplossing. Pipetteer op en neer om de oplossing te mengen en zorg ervoor dat u geen luchtbellen introduceert.
      Opmerking: na het toevoegen van PPS, werk snel om stappen 5.2.6 door 5.2.11 te voltooien voordat Polyacrylamide polymerizes.
    6. Pipetteer 75-150 μL (afhankelijk van de dikte van de Spacer) tot het midden van elke glutaraldehyde-geactiveerde dekslip.
    7. Met behulp van een tang, plaatst u een dekslip met patroon op elke glutaraldehyde-geactiveerde dekslip met Polyacrylamide en spacer, zodat het patroon ligand tegenover de Polyacrylamide oplossing staat. Als voldoende polyacrylamideoplossing werd toegevoegd, zal de oppervlaktespanning de Polyacrylamide tussen de twee dekstroken en er zullen geen luchtbellen aanwezig zijn.
    8. Pak elke Polyacrylamide "sandwich" en raak voorzichtig de zijkant aan een delicate taak veeg om overtollige Polyacrylamide oplossing weg te geven.
    9. Plaats elke Polyacrylamide "sandwich" zorgvuldig in een dop met draden die compatibel zijn met 15 mL conische bodem buizen. De oriëntatie moet zodanig zijn dat de bodem van de Glutaaraldehyde-dekslip in contact is met de onderkant van de dop, en de dekslip met dessin is bovenop.
    10. Schroef een conische onderste buis van 15 mL in elke dop om de "sandwiches" van polyacrylamide op zijn plaats te houden. De buizen moeten strak om te voorkomen dat lekken, maar wees voorzichtig om niet te spannen en kraken van de dekstroken.
    11. Centrifugeer de Polyacrylamide "sandwiches" in de buisjes in zwenk emmers bij 200 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Verwijder de buizen van de centrifuge en plaats in buis rekken om de oriëntatie te behouden voor een extra 50 min om volledige polymerisatie te garanderen. Blijf bedekt met folie om bleken van fluorescerende microsferen te voorkomen.
      Opmerking: centrifugeren is van cruciaal belang bij het gebruik van deze methode om TFM uit te voeren. De centrifugale kracht beweegt alle microsferen naar een enkel vlak, dat uiteindelijk net onder het oppervlak van de hydrogel zal liggen. Dit is ideaal voor Imaging sfeer verplaatsingen die worden gebruikt om door cellen gegenereerde tractie spanningen te berekenen. Als u geen TFM uitvoert, kunnen microsferen buiten de Polyacrylamide oplossing worden gelaten en kan polymerisatie worden uitgevoerd op het tafelblad zonder centrifugeren.
    12. Verwijder gepolymeriseerde Polyacrylamide "sandwiches" uit de buisjes en dompel in PBS in een 100 mm schaal. Wikkel in laboratorium folie en incuberen gedurende 3 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C.
  3. Bereiding van gedessineerde gels voor zaaien van cellen
    1. Gebruik een scalpel en een tang om de dekslip met patroon en de afstandhouder van de Polyacrylamide "sandwich" voorzichtig te verwijderen terwijl deze in PBS wordt ondergedompeld. Het gedessineerde ligand zal tijdens polymerisatie overgebracht worden naar de Polyacrylamide en zal blijven na het verwijderen van de dekslip. De polyacrylamidegel blijft bevestigd aan de glutaraldehyde-geactiveerde dekslip.
      Opmerking: Dit is een kritieke stap! De Polyacrylamide moet worden ondergedompeld in PBS tijdens het verwijderen van de dekslip of de ligand patronen zullen worden vernietigd.
    2. Plaats elke dekslip met een patroon van polyacrylamide in een cap-houder. Plaats een pakking (een buitendiameter van 18 mm, een binnendiameter van 14 mm) bovenop de Afdeklijst en rond de Polyacrylamide, waar de afstandhouder zich bevindt. Schroef een afgezaaide 15 mm conische onderbuis in de dop en vorm een put met het patroon poly acrylamide onderaan. Deze assemblages passen in de putjes van een standaard 12-Wells plaat voor eenvoudige bediening.
    3. Was elke gel door 500 μL PBS toe te voegen aan de put. Incuberen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met zacht schudden. Verwijder PBS en herhaal tweemaal voor een totaal van drie wast.
    4. Voeg na de laatste PBS-wassing 500 μL afdekmedium toe aan gels en incuberen bij 37 °C 's nachts. Gels kunnen tot 5 dagen vóór het zaaien van cellen worden bewaard bij 37 °C met media.
    5. De dag voor het zaaien van cellen, vervang Knockout-DMEM voor volledige KSR media en incuberen bij 37 °C 's nachts.

6. culturing hESCs op patroon gels

Opmerking: als u van plan bent om monsters voor immunokleuring na tfm op te lossen, neem dan beelden van onbeklemtoonde sfeer posities voordat u cellen zaaien. In dit geval moet fluorescently gelabeld ligand worden gebruikt in stap 4.3.1 zodat de uiteindelijke locaties van cellen bekend zullen zijn voordat zaaien en microsferen in die gebieden kunnen worden afgebeeld.

  1. Onderhouden van voorraad hesc culturen en secundaire feeder-vrije culturen bereid op matrigel gecoate platen in geconditioneerde KSR media voordat zaaien op patroon Polyacrylamide gels zoals eerder beschreven9.
    Opmerking: Genereer geconditioneerde KSR media door het kweken van bestraalde muizen embryonale fibroblasten in KSR media aangevuld met 4 ng/mL basis fibroblast groeifactor (bFGF). Verzamel en vervang media elke 24 h.
  2. Aspireren de media van hESCs. Was kort met afdekmedium. Voeg 0,05% trypsine-EDTA toe, aangevuld met 10 μM Y27632 (Rho kinase remmer) en inincuberen bij 37 °C gedurende 5-10 min.
  3. Voeg media toe met serum om trypsine te remmen. Zuig de media voorzichtig aan en Pipetteer over de schaal om cellen te verwijderen. Blijf zachtjes pipetteren om alle cellen te verwijderen en celclusters te ontkoppelen van afzonderlijke cellen.
  4. Verzamel de celsuspensie en centrifugeer bij 200 x g gedurende 3 minuten.
  5. Zuig de supernatant op en relaat de pellet in een equivalent volume KSR media om te wassen. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 3 min.
  6. Aspireren de supernatant en respenderen de pellet in geconditioneerde KSR media aangevuld met 10 ng/mL bFGF en 10 μM Y27632.
  7. Tel de cellen met een hemocytometer en stel de celsuspensie in op een concentratie van 300.000 cellen per mL. Pipetteer 500 μL van de celsuspensie op elke gel met patroon (150.000 cellen per gel).
  8. 3 h na het zaaien, gebruik een pipet om de media voorzichtig te aspireren van elke gel en vervangen door vers geconditioneerde KSR media aangevuld met 10 ng/mL bFGF en 10 μM Y27632. Hierdoor worden overtollige cellen verwijderd die zich niet hechten aan gedessineerde gebieden van de Polyacrylamide.
    Opmerking: Dit is een kritieke stap! In dit stadium zullen cellen losjes worden gehecht aan de gedessineerde ligand. Wees heel voorzichtig bij het verwisselen van media om de cellen niet los te maken. In de daaropvolgende stappen moet met elk van de media swaps evenveel aandacht worden besteed.
  9. 24 uur na het zaaien, gebruik een pipet om de media zorgvuldig te aspireren en te ruilen voor geconditioneerde KSR-media aangevuld met 10 ng/mL bFGF en 5 μM Y27632.
  10. 48 h na het zaaien, gebruik een pipet om de media zorgvuldig te aspireren en te ruilen voor geconditioneerde KSR-media aangevuld met 10 ng/mL bFGF. Dit verwijdert de Rho kinase remmer uit de media en experimenten kunnen de volgende dag beginnen, 72 h na zaaien.

7. het uitvoeren van TFM

  1. Voer indien gewenst TFM uit zoals eerder beschreven9 onder de gewenste proefomstandigheden.
  2. Als onbeklemtoonde sfeer posities werden afgebeeld vóór het zaaien van cellen, repareer de cellen na het innemen van beklemtoonde sfeer posities en voer immunokleuring uit om de lokalisatie van eiwitten van belang te bepalen ten opzichte van regio's met hoge en lage tractie krachten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De belangrijkste uitdaging om te overwinnen in het proberen om hESCs te cultuur in kolonies van gecontroleerde geometrie op conforme ondergronden is het genereren van een homogeen patroon van ECM-ligand op het oppervlak van het substraat. De strategie die in deze methode wordt voorgesteld, moet eerst het gewenste patroon op het oppervlak van een glazen dekglaasje genereren en vervolgens dat patroon overbrengen naar het oppervlak van een polyacrylamidehydrogel tijdens polymerisatie van de gel (Figuur 1 A). het is dus belangrijk om ervoor te zorgen dat het gewenste patroon met succes wordt gemaakt op het oppervlak van de glazen afdekplaat voorafgaand aan het overgaan op polymerisatie van de hydrogel en overdracht van het patroon (Figuur 1B). Op basis van beeldvorming van fluorescerende ligand patronen die worden overgebracht naar Polyacrylamide, lijkt de ligand slechts aanwezig te zijn in een enkel vlak aan het oppervlak van de Polyacrylamide, hoewel we de dikte van deze laag niet nauwkeurig karakteriseren. Er zijn twee veelvoorkomende soorten defecten waargenomen na het genereren van het patroon op de glazen coverslip, elk met een eigen bron van fouten. De eerste is het verschijnen van fluorescerende ligand die verder reikt dan de marges van het gewenste patroon (Figuur 1C, boven), wat voortvloeit uit het lekken van de fluorescerende ligand-oplossing als gevolg van een kleine scheur in het stencil of onvoldoende afdichting van de stencil naar de glazen coverslip. De tweede is het verschijnen van een onvolledig patroon (Figuur 1C, onder), wat meestal te wijten is aan een luchtbel gevangen in de dekslip-interface die adsorptie van de fluorescerende ligand voorkomt.

De ultieme maatstaf voor succes voor deze methode is de mogelijkheid om hESCs te kweken in de gewenste geometrieën op de patroon hydrogels (Figuur 2). Om dit te bereiken, worden hESCs geseeerd met een relatief hoge dichtheid (300.000 cellen/mL) in aanwezigheid van een Rho kinase remmer (Y27632) en geïnbroed voor 3 uur om de hechting op de patronen van ligand te vergemakkelijken. Media wordt vervolgens vervangen om niet-vastgehouden cellen te verwijderen. In de loop van 72 h wordt de Y27632 geleidelijk uit de media verwaterd door een reeks media-uitwisselingen op 24 en 48 h na het zaaien. Typisch, de hescs vermenigvuldigen om de patroon geometrieën voltooien door 48-72 h, zodat experimenten kunnen beginnen bij 72 h na seeding, zodra de Y27632 volledig uit de media is verwijderd.

Het kweken van hESC-kolonies in beperkte geometrieën op polyacrylamidehydrogels maakt het mogelijk om door cellen gegenereerde tractie krachten te meten met behulp van TFM. Deze metingen worden uitgevoerd door fluorescerende microsferen in de hydrogel in te sluiten en de posities van deze kralen te Imaging voor en na het zaaien van hESCs (Figuur 3A). De verplaatsing van de kralen na het zaaien van cellen is een functie van door cellen gegenereerde krachten en de elasticiteit van de hydrogel, dus de beelden van de kraal posities kunnen worden gebruikt om kaarten van kraal verplaatsingen te genereren en vervolgens gebruikt om de onderliggende tractie spanningen. In circulaire kolonies van hESCs, de grootste tractie spanningen zijn te vinden in de buurt van de perifere rand van de kolonies, terwijl het midden van de kolonies vertonen gelijkmatig lage tractie spanningen (Figuur 3B). Interessant is dat de hoogste tractie spanningen worden gevonden in clusters in de buurt van de rand van de kolonies, in plaats van het vormen van een continue ring van maximale stress. Dit impliceert dat, hoewel de kolonie geometrie een belangrijke rol speelt bij het bepalen van de verdeling van tractie spanningen, meer gelokaliseerde regulering en feedback bepalend zijn voor de precieze locaties van maximale stress. Bovendien, zolang het beeld van sfeer posities zonder gekleefd cellen wordt genomen voorafgaand aan het zaaien van cellen, kunnen hesc kolonies worden vastgesteld voor immunokleuring van eiwitten van belang na tractiekracht metingen. Ondanks de waargenomen niet-uniforme distributies van tractie spanningen, hESCs gekweekt als patronen cirkels in onderhouds condities weergeven uniforme uitdrukking van de pluripotentie marker Oct3/4 en celadhesie molecuul E-cadherin (Figuur 3C ).

De gepresenteerde methode voor het gebruik van stencils om patronen van ligand te genereren is aantoonbaar superieur aan de gebruikelijke techniek van het afdrukken van micro contact voor de relatief grote geometrieën die in deze methode worden gebruikt (d.w.z. voor ronde kolonies van 1 mm in diameter en driehoeken en kwadraten van gelijkwaardig gebied). Micro contactdruk patronen van ligand op deze lengte schaal resulteert in heterogene overdracht aan de randen van patronen, met zeer weinig ligand afgezet in de centrale gebieden van de patronen (Figuur 4A). Dit is duidelijk onvoldoende voor het consequent produceren van hESC-kolonies van specifieke geometrieën. Het verminderen van de celseeding dichtheid leidt ook tot inconsistentie in het bereiken van voltooide kolonies. Cellen die zijn geseat 200.000 cellen/mL, in plaats van 300.000 cellen/mL, zijn niet in staat om voldoende celcelcontacten te genereren om de gereduceerde concentratie van Y27632 na 24 uur na het zaaien te overleven (Figuur 4B). Het kan mogelijk zijn om volledige patronen met lagere celdichtheden te genereren door de periode van Y27632 verdunning te verlengen; echter, over het algemeen is het efficiënter om zaad bij de hogere 300.000 cellen/mL dichtheid. Af en toe worden fouten in het genereren van patronen die niet eerder in het protocol zijn gedetecteerd, duidelijk bij het zaaien van hESCs. Een dergelijke fout is het lekken van ligand-oplossing onder het stencil als gevolg van slecht contact met de dekslip. Dit resulteert uiteindelijk in ligand die wordt overgebracht naar de gebieden van de Polyacrylamide buiten de gewenste geometrieën, en een ongegrensde groei van hESCs bij het zaaien (Figuur 4C).

Figure 1
Figuur 1: patroon van ECM ligand op zuurgewassen dekglazuren en overbrengen naar polyacrylamidehydrogels. A) schematische weergave van het protocol voor patronen ECM ligand op zuurgewassen dekstroken en het overbrengen van de ligand met een patroon tot polyacrylamidehydrogels. (B) immunofluorescentie beelden van gedessineerde ECM ligand op zuurgewassen dekstroken (links) en na overdracht naar polyacrylamidehydrogel (rechts). De met biotin gelabelde matrigel werd op de Afdeklijst Gedessineerd en gelabeld met Alexa Fluor 555 streptavidine voorafgaand aan de overdracht naar Polyacrylamide. Insets tonen uitgezoomde weergave van de volledige patronen die worden gegenereerd. C) representatieve fluorescentie beelden die patronen van ligand op de glazen dekslip aantonen. Deze voortvloeien uit veelvoorkomende fouten in het Protocol, zoals het lekken van de ligand-oplossing buiten de patroon geometrie (boven, pijl geeft de plaats van lekkage aan) en het overvullen van luchtbellen in de patroon geometrieën van het stencil bij het toevoegen van de ligand-oplossing ( onder, pijl geeft de plaats van de luchtbel aan). Alle schaal staven = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: seeding van hESCs op polyacrylamidehydrogels met patroon. Representatieve brightfield-beelden die aantonen dat hESCs op polyacrylamidehydrogels met een gedessineerde ligand worden geseeding. De tijdlijn aan de bovenkant geeft de reeks media wijzigingen aan die worden gebruikt om niet-gekoppelde cellen te verwijderen en de Y27632 te verdunnen. Merk op dat na de eerste seeding, cellen zich vastkleven aan verschillende regio's binnen het patroon ligand en vervolgens prolifereren om de patroon gebieden te vullen in de loop van 72 h. schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: regionale lokalisatie van tractie spanningen en immunokleuring van opgesloten hESC-kolonies. A) fluorescerende afbeeldingen van microsferen binnen de hydrogel van polyacrylamide voor en na het zaaien van hescs. (B) representatief partikel beeld velocimetrie (PIV) plot dat de verplaatsing van microsferen weergeeft als gevolg van tractie spanningen (links) en bijbehorende gereconstrueerde tractie spanningen (rechts). C) immunokleuring van beperkte hesc-kolonies op polyacrylamidehydrogels met een patroon, waaruit het vermogen blijkt om lokalisatie van eiwitten die van belang zijn voor tractie spanningen te vergelijken. Alle schaal staven = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: niet-ideale resultaten opgeleverd door alternatieve methoden en fouten. A) representatieve fluorescerende afbeeldingen van ECM-ligand die zijn Gedessineerd op zuurgewassen dekstroken via micro contactafdrukken. B) brightfield-beelden van hescs die geen voltooide kolonies vormen als gevolg van onvoldoende hechting van cellen. Grote hiaten in de kolonies na 24 uur na het zaaien (pijlen) zijn een vroege indicatie van dit probleem. C) brightfield-beelden van hescs die geen beperkte kolonies vormen als gevolg van fouten in patronen die leidden tot de aanwezigheid van ligand buiten de gewenste geometrieën. Alle schaal staven = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Voorbeeld SU8 wafer Fabrication
1. spin Coat wafer met SU8-3050 Spin bij 1.000 RPM voor 30 s
2. zachte Bake wafer op hete plaat i. 3 min bij 65 °C
II. 45 min bij 95 °C
III. 3 min bij 65 °C
IV. koel tot kamertemperatuur
3. blootstellen in masker aligner i. wafer en photomask in masker aligner uitlijnen
Ii. Blootstellen met energie van 250 mJ/cm2
• Bijvoorbeeld voor lamp met een intensiteit van 11 mW/cm2, blootgesteld voor 23 s
4. post belichting bakken op hete plaat i. 1 min bij 65 °C
II. 15 min bij 95 °C
III. 1 min bij 65 °C
Iv. Koel tot kamertemperatuur
5. Ontwikkel i. agitate in SU8 ontwikkelaar, ca. 5-10 min
Ii. Controleer de ontwikkeling met isopropylalcohol (IPA)
• Als onderontwikkeld, IPA spoelen zal een witte residu te produceren
6. hard bakken op hete plaat (optioneel) 1-2 uur bij 150 °C

Tabel 1: voorbeeld SU8 wafer Fabrication protocol. Silicium wafers die worden gebruikt om PDMS-stempels en volgende stencils te genereren, zijn gefabriceerd volgens de stappen die in deze tabel worden beschreven. Dit protocol werd gegenereerd met behulp van de SU8 3000 data sheet met als doel het creëren van een filmdikte van ongeveer 100-250 μm.

Formuleringen van polyacrylamidegel
Volumes voor 1 mL complete oplossing
Elastische modulus (PA) Definitief% acrylamide Laatste% bis-acrylamide ddH2O (μL) 40% acrylamide (μL) 2% bis-acrylamide (μL) 10x PBS (μL) 1% TEMED in ddH2O (μL) Microsferen 0,5% vaste stoffen in ddH2O (μL) 1% PPS in ddH2O (μL)
1050 3 0,1 565 75 50 100 75 60 75
2700 7,5 0,035 485 187,5 17,5 100 75 60 75
4000 7,5 0,05 477,5 187,5 25 100 75 60 75
6000 7,5 0,07 467,5 187,5 35 100 75 60 75

Tabel 2: formuleringen van polyacrylamidegel. Volumes van componenten voor het opwekken van polyacrylamidehydrogels van verschillende elastische moduli met fluorescerende microsferen voor TFM. Volumes kunnen omhoog of omlaag worden geschaald op basis van de hoeveelheid Polyacrylamide-oplossing die nodig is. Alle componenten behalve de fluorescerende microsferen en KKS worden vóór ontgassing gemengd. PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing, TEMED = tetramethylethyleendiamine, PPS = Kaliumpersulfaat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Om een lang en gedetailleerd protocol te vereenvoudigen, bestaat deze methode uit drie kritieke stadia: 1) het genereren van patronen van ECM ligand op glazen Dekbladen, 2) het overbrengen van de patronen naar polyacrylamidehydrogels tijdens polymerisatie van de gel, en 3) het zaaien van hESCs op de gedessineerde hydrogel. Er zijn kritieke stappen die in elk van deze drie fasen moeten worden overwogen. Om high-fidelity patronen op de glazen dekstroken te genereren, moet het stencil stevig op de afdekplaat worden gedrukt om lekkage van de ligand-oplossing te voorkomen en alle luchtbellen moeten worden verwijderd nadat ligand-oplossing aan het oppervlak van het stencil is toegevoegd ( Figuur 1C). Als ligand-oplossing door het stencil lekt als gevolg van slecht contact met de afdekplaat, wordt ligand overgebracht naar het gehele oppervlak van de hydrogel van polyacrylamide en zal hESCs niet worden beperkt tot de gewenste kolonie geometrie (Figuur 4C). De belangrijkste stap bij het overbrengen van het patroon ligand naar Polyacrylamide is het zachtjes scheiden van de bovenste Afdeklijst van de hydrogel terwijl alle componenten ondergedompeld blijven in PBS. Als de hydrogel niet tijdens het scheiden wordt ondergedompeld, kunnen de patronen volledig worden vernietigd. Bovendien, als de scheiding te snel optreedt, kan het oppervlak van de hydrogel scheuren of anderszins beschadigd raken. Hoe zachter de hydrogel, hoe meer het risico loopt op beschadiging tijdens scheiding. Ten slotte moet de gebruiker zeer zorgvuldig pipetteren bij het uitwisselen van media tijdens het zaaien en de cultuur van hESCs op de patroon hydrogels. De hESCs blijven losjes in het protocol en de gedessineerde kolonies kunnen gemakkelijk worden verstoord door achteloos of gehaast pipetteren.

Naast de kritieke stappen die hierboven zijn besproken, zijn er een aantal andere stappen die mogelijk moeten worden gewijzigd en probleemoplossing bij het aanpassen van dit protocol voor verschillende toepassingen. Terwijl de patronen hier gedemonstreerd zijn op de lengte schaal van honderden micron tot een millimeter, het genereren van patroon functies op silicium wafers met transparantie photomvragen en negatieve fotoresist maakt het mogelijk voor functie maten helemaal tot 7-10 μm. Dit protocol kan dus worden aangepast voor het beperken van de geometrie van enkele cellen of kleinere kolonies van een paar cellen op conforme ondergronden.

Twee parameters die waarschijnlijk moeten worden geoptimaliseerd bij het aanpassen van dit protocol voor verschillende celtypen zijn het type ECM ligand dat wordt gebruikt en de concentratie van de ligand in oplossing tijdens de adsorptie aan de glazen dekslip door de stencils. Een totale ligand concentratie van 250 μg/mL was voldoende voor het produceren van homogeen patronen van matrigel en het vergemakkelijken van de bevestiging van hESCs (Figuur 1B en Figuur 2), hoewel het mogelijk is om vergelijkbare resultaten te behalen met lagere Concentraties. Aan de andere kant kan het nodig zijn om de concentratie van ligand te verhogen voor celtypen die minder hecht zijn of voor toepassingen die kortere incubatie tijden vereisen. Verhoogde concentratie van ligand kan ook nodig zijn voor verschillende ECM-liganden, zoals fibronectine of collageen, die minder hydrofoob dan matrigel zijn en daarom niet zo sterk kunnen adsorworden aan de hydrogel. Omdat de overdracht van ligand van dekslip naar hydrogel optreedt tijdens polymerisatie van de hydrogel, zijn veelgebruikte technieken voor het krachtig dwars koppelen van de ECM ligand aan het hydrogel oppervlak (zoals sulfo-SANPAH behandeling) onmogelijk. Het gebruik van fluorescently gelabelde ECM-liganden om visualisatie van de patronen bij elke stap van het protocol mogelijk te maken, is uitermate nuttig bij het optimaliseren en oplossen van deze parameters.

Bovendien kan het protocol voor zaaien cellen optimalisatie vereisen, afhankelijk van het celtype en de gebruikte media omstandigheden. Voor cellen die zich sneller of efficiënter hechten, kan een lagere zaaien dichtheid nodig zijn om celceladhesies te voorkomen die tussen patronen omspannen en resulteren in aggregaten in plaats van gedessineerde monolaag kolonies. Voor cellen die een zeer slechte hechting vertonen, kan een grotere zaai dichtheid of langere tijd vóór de eerste media wisseling nodig zijn om een volledige vorming van besloten kolonies te vergemakkelijken (Figuur 4B).

De belangrijkste beperking van deze methode is de technische complexiteit, wat resulteert in relatief lage doorvoerresultaten in vergelijking met vergelijkbare methoden die betrekking hebben op het kweken van cellen op gedessineerde glas substraten8. Dit nadeel wordt echter veel zwaarder gewogen door de fysiologische relevantie die wordt bereikt door het kweken van beperkte hESC-kolonies op conforme ondergronden. Door de mechanische eigenschappen van het vroege embryo effectief te recapituleren, kunnen we de processen die leiden tot zelforganisatie van de primaire kiem lagen beter modelleren en begrijpen.

Een bijkomend voordeel van het beperken van hESC-kolonies op polyacrylamidehydrogels is dat het het gebruik van TFM mogelijk maakt om het verband te onderzoeken tussen de organisatie van een hESC-kolonie, als model van het vroege embryo, en de verdeling van door cellen gegenereerde krachten die mogelijk ten grondslag morfogenese en Cell Fate specificatie. Het opdelen van hESC-kolonies resulteert in verdelingen van tractie spanningen die afhankelijk zijn van de kolonie geometrie (Figuur 3B). Ondanks de niet-uniformiteit van deze tractie spanningen, blijven cellen in de kolonies pluripotente in onderhouds condities (Figuur 3C). We veronderstellen echter dat de tractie stress-distributies betrokken kunnen zijn bij het reguleren van patronen van de specificatie van het lot van cellen door het afstemmen van de respons op inductie signalen, zoals oplosbare morfogenen. We verwachten dat deze methode ons en andere groepen in staat zal stellen om het vroege menselijke embryo beter te modelleren met hESCs, wat leidt tot een vollediger begrip van de fundamentele processen die de menselijke embryogenese ten grondslag liggen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij willen graag de financiering van CIRM Grant RB5-07409 erkennen. J.M.M. wil FuiBoon Kai, Dhruv Thakar en Roger Oria bedanken voor verschillende discussies die de generatie en het oplossen van deze methode begeleidde. J.M.M. dankt ook de UCSF Discovery Fellowship voor de voortdurende ondersteuning van zijn werk.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin Gibco 25300054
100 mm glass petri dish Fisher Scientific 08-747B
100 mm plastic petri dish Fisher Scientific FB0875712
15 mL conical-bottom tubes Corning 352095
150 mm plastic petri dish Fisher Scientific FB0875714
18 mm diameter #1 coverslips Thermo Scientific 18CIR-1
2% bisacrylamide Bio-Rad 161-0142
3-aminopropyltrimethoxysilane ACROS Organics 313251000
40% acrylamide Bio-Rad 161-0140
Aluminum foil Fisher Scientific 01-213-100
Basic fibroblast growth factor Sigma-Aldrich F0291
Bleach Clorox N/A
Centrifuge with swing-buckets Eppendorf 22623508 Model: 5804 R
Collagen Corning 354236
Dessicator Fisher Scientific 08-642-7
Ethanol Fisher Scientific AC615095000
Fetal bovine serum Gibco 16000044
Fluorescent microspheres Thermo Scientific F8821
Forceps (for coverslips) Fisher Scientific 16-100-122
Forceps (for wafers) Fisher Scientific 17-467-328
Gel holders N/A N/A Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request
Glutaraldehyde Fisher Scientific 50-261-94
HEPES Thermo Scientific J16926A1
Hot plate Fisher Scientific HP88854100
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144S-500
Isopropyl alcohol Fisher Scientific A416-500
Kimwipes (delicate task wipes) Kimberly-Clark Professional 34120
Knockout serum replacement Gibco 10828028
Knockout-DMEM Gibco 10829018
Mask aligner (for photolithography) Karl Suss America, Inc. Karl Suss MJB3 Mask Aligner
Matrigel Corning 354277
Microscope for traction force Nikon N/A Model: Eclipse TE200 U
Motorized positioning stage Prior Scientific N/A Model: HLD117
Nitrogen gas Airgas NI 250
Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) Norland Products NOA 74
Oven Thermo Scientific PR305225G
Parafilm (laboratory film) Fisher Scientific 13-374-12
PDMS (Sylgard 184) Fisher Scientific NC9285739
Photomask CAD/Art Services, Inc. N/A Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request
Plasma cleaner Fisher Scientific NC9332171
Plastic for gasket Marian Chicago HT6135
Plastic for spacer TAP Plastics N/A Polycarbonate sheet, .01 inch thickness
Potassium chloride (for making PBS) Fisher Scientific P217-500
Potassium phosphate monobasic (for making PBS) Fisher Scientific P285-500
Pottassium persulfate ACROS Organics 424185000
Scalpel Fisher Scientific 14-840-00
Silicon wafer Electron Microscopy Sciences 71893-06 Type P, 3 inch, silicon wafers
Sodium chloride (for making PBS) Fisher Scientific S271-1
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) Fisher Scientific S472-500
SU8-3050 Photoresist MicroChem SU8-3000
SU8-Developer MicroChem Y020100
TEMED Bio-Rad 161-0800
UV-sterilization box Bio-Rad N/A Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber
Y27632 (Rho kinase inhibitor) StemCell Technologies 72304

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
  2. Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
  3. Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
  4. Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).
  5. Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).
  6. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
  7. Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Mace, K., Braun, K. 916, Humana Press. Totowa, NJ. 317-350 (2012).
  8. Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
  9. Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
  10. Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).
  11. Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
  12. Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).
  13. Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
  14. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  15. Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
  16. Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).

Tags

Biotechniek uitgave 151 menselijke embryonale stamcellen (hESCs) polyacrylamidehydrogels tractiekracht microscopie (TFM) foto lithografie celpatronen extracellulaire matrix (ECM) weefsel techniek regeneratieve geneeskunde
Patroon van de geometrie van menselijke embryonale stamcel kolonies op conforme ondergronden om de mechanismen van Weefselniveau te beheersen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Muncie, J. M., Falcón-Banchs,… More

Muncie, J. M., Falcón-Banchs, R., Lakins, J. N., Sohn, L. L., Weaver, V. M. Patterning the Geometry of Human Embryonic Stem Cell Colonies on Compliant Substrates to Control Tissue-Level Mechanics. J. Vis. Exp. (151), e60334, doi:10.3791/60334 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter