Summary
We presenteren een flow flowcytometrieonderzoeken methode om te identificeren gelijktijdig verschillende celtypen opgehaald uit muis hersenen of ruggenmerg. Deze methode kan worden benut om zuivere celpopulaties in neurodegeneratieve ziekten te isoleren of te karakteriseren of om de mate van celtargeting te kwantificeren bij in vivo toediening van virale vectoren of nanodeeltjes.
Abstract
Recente ontwikkelingen in virale vector-en nanomateriaal Wetenschappen hebben de weg geopend voor nieuwe geavanceerde benaderingen om het centrale zenuwstelsel (CNS) te onderzoeken of te manipuleren. Verdere optimalisatie van deze technologieën zou echter baat hebben bij methoden die een snelle en gestroomlijnde bepaling van de omvang van CNS en Cell-specifieke targeting bij toediening van virale vectoren of nanodeeltjes in het lichaam mogelijk maken. Hier presenteren we een protocol dat profiteert van de hoge doorvoer en multiplexing mogelijkheden van flow cytometrie om een eenvoudige kwantificering van verschillende celsubtypen geïsoleerd van muis hersenen of ruggenmerg, namelijk Microglia/macrofagen, lymfocyten, astrocyten, oligodendrocyten, neuronen en endotheliale cellen toe te staan. We passen deze aanpak toe om kritische verschillen tussen twee weefselhomogenisatie methoden in termen van celopbrengst, levensvatbaarheid en samenstelling te benadrukken. Dit kan de gebruiker instrueren om de beste methode te kiezen, afhankelijk van het celtype (s) van de interesse en de specifieke toepassing. Deze methode is niet geschikt voor de analyse van anatomische verdeling, omdat het weefsel wordt gehomogeniseerd om een eencellige suspensie te genereren. Echter, het maakt het mogelijk om te werken met levensvatbare cellen en het kan worden gecombineerd met celsortering, het openen van de weg voor verschillende toepassingen die het repertoire van gereedschappen in handen van de neurowetenschapper kunnen uitbreiden, variërend van de oprichting van primaire culturen afgeleid van zuivere celpopulaties, tot genexpressie analyses en biochemische of functionele assays op goed gedefinieerde celsubtypen in de context van neurodegeneratieve ziekten, bij farmacologische behandeling of gentherapie.
Introduction
Technologieën voor het leveren van genen en medicijnen (zoals virale vectoren en nanodeeltjes) zijn een krachtig hulpmiddel geworden dat kan worden toegepast om beter inzicht te krijgen in specifieke moleculaire trajecten die zijn veranderd in neurodegeneratieve ziekten en voor de ontwikkeling van innovatieve therapeutische benaderingen1,2,3. Optimalisatie van deze instrumenten is afhankelijk van de kwantificering van: (1) de mate van penetratie in het CZS op verschillende toedieningswegen en (2) targeting van specifieke celpopulaties. Histologische analyses worden meestal toegepast om fluorescerende reporter-genen of fluorescentie-gelabelde nanodeeltjes in verschillende CZS-gebieden en over verschillende celtypen te visualiseren, geïdentificeerd door immunokleuring voor specifieke celmarkeringen4,5. Hoewel deze aanpak waardevolle informatie verschaft over de biodistributie van het toegediende gen of medicamenteuze gereedschappen, kan de techniek tijdrovend en arbeidsintensief zijn, omdat dit vereist is: (1) weefsel fixatie, cryopreservatie of paraffine-inbedding en slicing; (2) kleuring voor specifieke cellulaire markers die soms antigeen-opvraging vereisen; (3) overname door fluorescentiemicroscopie, die gewoonlijk de analyse van een beperkt aantal verschillende markers binnen hetzelfde experiment mogelijk maakt; (4) beeldverwerking om een juiste kwantificering van het signaal van belang toe te staan.
Flow cytometrie is uitgegroeid tot een veelgebruikte techniek die gebruik maakt van zeer specifieke fluorescerende markers om niet alleen een snelle kwantitatieve evaluatie van verschillende celfenotypes in celsuspensies mogelijk te maken, op basis van de expressie van oppervlakte-of intracellulaire antigenen, maar ook functionele metingen (bijv. snelheid van apoptosis, proliferatie, celcyclus analyse, enz.). Fysiek isoleren van cellen door middel van fluorescerende geactiveerde celsortering is ook mogelijk, waardoor verdere downstreamtoepassingen (bijv. celkweek, RNAseq, biochemische analyses, enz.) 6,7,8.
Weefselhomogenisatie is een kritieke stap die noodzakelijk is om een enkelvoudige celsuspensie te verkrijgen om betrouwbare en reproduceerbaar stroomcytometrische evaluaties te kunnen ondergaan. Er zijn verschillende methoden beschreven voor de homogenisatie van volwassen hersenweefsel, voornamelijk met als doel Microglia-cellen9,10,11te isoleren; ze kunnen in het algemeen worden ingedeeld in twee hoofdcategorieën: (1) mechanische dissociatie, die slijp-of Afschuifkracht gebruikt door middel van een Dounce homogenisator (DH) om cellen uit hun nissen te rippen en een relatief gehomogeniseerde eencelsuspensie te vormen, en (2) enzymatische spijsvertering, die berust op incubatie van gehakt weefsel brokken bij 37 ° c in aanwezigheid van Proteolytische enzymen, zoals trypsine of papaïne, waarbij de afbraak van de extracellulaire matrix wordt begunstiging om een vrij gehomogeniseerde celsuspensie te creëren12.
Ongeacht welke methode wordt gebruikt, wordt een zuiveringsstap aanbevolen na weefselhomogenisatie om myeline te verwijderen door centrifugeren op een dichtheidsgradiënt of door magnetische selectie9,12, alvorens naar de downstreamtoepassingen te gaan.
Hier beschrijven we een weefsel verwerkingsmethode op basis van papaïne-spijsvertering (PD) gevolgd door zuivering op een dichtheidsgradiënt, geoptimaliseerd om levensvatbare heterogene celsuspensies te verkrijgen van muis hersenen of ruggenmerg in een tijdgevoelige manier en geschikt voor Flowcytometrie. Bovendien beschrijven we een 9-kleuren Flowcytometrie-paneel en de gating-strategie die we in het laboratorium hebben aangenomen om de gelijktijdige discriminatie van verschillende CNS-populaties, levende/dode cellen of positiviteit voor fluorescerende verslaggevers zoals groen fluorescerende eiwitten of Rhodamine-kleurstof mogelijk te maken. Door het toepassen van deze Flow cytometrische analyse, we kunnen vergelijken verschillende methoden van weefsel verwerking, dat wil zeggen, PD versus DH, in termen van behoud van cellulaire levensvatbaarheid en rendementen van verschillende celtypen.
De details die we hier verstrekken, kunnen een beslissing geven over het homogenisatie-protocol en de antilichaam combinatie die moet worden gebruikt in het Flowcytometrie paneel, op basis van het specifieke celtype (s) van belang en de stroomafwaartse analyses (bijv. temperatuurgevoelige toepassingen, tracering van specifieke fluorescentie markers, in vitro cultuur, functionele analyses).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) van het Dana Farber Cancer Institute (Protocolnummer 16-024).
1. voorbereiding van de oplossingen die nodig zijn voor het experiment
- Bereid 1x Hank van gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) door het verdunen van 10x HBSS met steriel water. Pre-Chill de oplossing op ijs. Voor elk monster is ten minste 25 mL oplossing nodig.
- Bereid isotone Percoll-oplossing (IPS) door het mengen van 10x steriele HBSS 1:10 met dichtheidsgradiënt medium (d.w.z. Percoll). Pre-chill op ijs.
NB: IPS kan tot 30 dagen bewaard worden bij 4 °C. - Bereid stroom cytometrie (FACS) blokkering (BL) oplossing (1% boviene serumalbumine [BSA], 5% foetaal runderserum [FBS] in fosfaatgebufferde fysiologische Saline [PBS]). Pre-chill op ijs.
2. euthanasie van dieren door intracardiale perfusie en weefsel dissectie
Opmerking: acht weken oude C57BL/6J muizen, beide seks, werden gebruikt in de experimenten. Perfusie met PBS-oplossing wordt uitgevoerd om bloed verontreiniging door organen te elimineren, voordat u doorgaat met de vertering van het weefsel.
- Anesthetiseer de muis met behulp van een mengsel van ketamine/xylazine (90 − 200 mg/kg ketamine, 10 mg/kg xylazine). Plaats de muis op de achterkant en plak elke ledemaat op de steun. Controleer adequate anesthesie diepte door het controleren van de terugtrekking reflex.
- Maak een incisie van de middenlijn huid op het niveau van de thoracische inlaat om het borstbeen bloot te leggen. Gebruik de tang om de punt van het borstbeen te vatten en maak vervolgens een incisie van 1 cm aan elke kant van de ribbenkast. Snijd tenslotte door het diafragma en open het borstbeen breed genoeg om het hart te visualiseren.
- Gebruik de tang om het hart voorzichtig te vatten door de rechter ventrikel en til het naar de middenlijn en iets uit de borst.
- Plaats een vlindernaald van 23 G in de punt van de linker ventrikel, richting de aorta en houd stevig vast.
- Start de perfusie met 1x PBS. Doorboren de rechter oorschelp met behulp van een schaar zodat de perfusaat om de circulatie te verlaten. Stel de stroomsnelheid van PBS in op 3 mL/min. Parfuaps met ten minste 15 mL 1x PBS om ervoor te zorgen dat de weefsels helder zijn.
Opmerking: Blanching van de lever en mesenterische bloedvaten zijn tekenen van goede perfusie. Indien nodig kan het volume van de prefusie worden verhoogd totdat de vloeistof die het hart verlaat helder is van bloed, op welk punt de spoel lijn kan worden gestopt. - Na perfusie, verbreken van de hersenen van het ruggenmerg en verwijder de hersenen uit de schedel met schaar en Tang. Verwijder de vacht om de zichtbaarheid en controle tijdens het dissectie te vergroten en om te voorkomen dat haar verontreinigingen worden overgedragen. Spoel het ruggenmerg uit de kolom met behulp van een 3 mL spuit gevuld met PBS.
- Breng elk weefsel in een put van een 6-well multi-well plaat vooraf gevuld met 2 mL ijskoude 1x HBSS en blijf op ijs tot de spijsvertering.
- Verdeel de hersenen en het ruggenmerg in twee helften, langs de longitudinale lijn.
Opmerking: de ene helft van elk weefsel wordt gehomogeniseerd (zie onderstaande secties) om stromings cytometrische analyses toe te staan; de andere helft kan worden toegewezen aan verschillende verwerkingen voor alternatieve analyses (bijvoorbeeld gedompeld in Paraformaldehyde fixatieve oplossing voor histologie).
3. enzymatische vertering van de hersenen en het ruggenmerg
Opmerking: volumes die in deze sectie worden beschreven, zijn voldoende voor de vertering van een half brein of ruggenmerg.
- Gebruik een schaar om de weefsels in 1 − 2 mm dikke stukjes te gehakt.
- Snijd de punt van een 1000 μL pipet met een schaar om het voldoende groot te maken voor het verzamelen van de weefsel stukken. Spoel de pipetpunt vooraf af met 1x HBSS. Gebruik vervolgens de pipet om de 2 mL HBSS-oplossing met het gehakt weefsel over te brengen naar een conische buis van 15 mL.
Opmerking: voorspoelen van de pipetpunt is belangrijk om kleverigheid van de weefsel stukjes in de tip te voorkomen. - Was de put met extra 2 mL ijskoude 1x HBSS en breng de oplossing over naar de corresponderende conische buis van 15 mL met de weefsel stukjes.
- Centrifugeer elk monster 5 min bij 250 x g bij 4 °c.
- Bereid enzym mengsel 1 van de neurale weefsel dissociatie Kit (NTDK; Tabel met materialen) door menging van 50 μL enzym P met 1900 μL buffer X per monster. Warm enzym mengsel 1 bij 37 °C in een waterbad. Incubate enzym mengsel 1 bij 37 °C gedurende ten minste 10 minuten vóór gebruik om de volledige activering van het enzym mogelijk te maken.
- Zuig de supernatant uit de conische buis van 15 mL en voeg aan elk monster 1,95 mL enzym mengsel 1 toe. Voorzichtig Vortex om ervoor te zorgen dat de pellet opnieuw wordt opgehangen.
- Inincuberen de monsters op een wiel of Shaker gedurende 15 minuten bij 37 °C.
- Bereid ondertussen enzym mengsel 2 van de NTDK in door 10 μL enzym A te mengen met 20 μL buffer Y per monster; Verwarm de oplossing voor op 37 °C in een waterbad.
- Voeg aan het einde van de incubatie met enzym mengsel 1 30 μL enzym mengsel 2 toe aan elk monster.
- Meng de monsters voorzichtig door op en neer te pipetteren met een pipetpunt van 1000 μL voorgespoeld met 1x HBSS.
- Inincuberen het monster op een wiel of Shaker gedurende 15 minuten bij 37 °C.
- Voeg na incubatie 10 mL ijskoude 1x HBSS toe aan elke buis om enzym mengsel 1 en enzym mengsel 2 te deactiveren.
- Centrifugeer elk monster 10 min bij 320 x g bij 4 °c.
- Gooi het supernatant weg; Voeg ijskoud 1x HBSS toe aan elke buis tot een eindvolume van 7 mL en breng de pellet voorzichtig door vortexing.
- Ga verder naar sectie 5 voor het verwijderen van puin.
4. mechanische homogenisatie van de hersenen en het ruggenmerg
Opmerking: volumes die in deze sectie worden beschreven, zijn voldoende voor homogenisatie van de helft van de hersenen of het ruggenmerg. Het protocol dat in deze sectie wordt beschreven, kan worden gebruikt als alternatief voor de methode die wordt beschreven in sectie 3, afhankelijk van de behoefte van de gebruiker, zoals hieronder wordt besproken.
- Pre-Chill de glas mortel van de Dounce weefsel Grinder (tafel van de materialen) ingesteld op ijs.
- Voeg 3 mL voorgekoelde 1x HBSS toe aan de mortel.
- Breng het weefsel (de hersenen of het ruggenmerg) van de put van de 6-put plaat in de glas mortel, zodat het wordt gedoopt in 1x HBSS en zit aan de onderkant van de mortel.
- Smash het weefsel zachtjes met 10 slagen stamper A gevolgd door 10 slagen van een stamper B. Breng de gehomogeniseerde mix over in een nieuwe conische buis van 15 mL.
- Vul de buis tot een eindvolume van 10 mL met voorgekoelde 1x HBSS en centrifugeer 10 min bij 320 x g bij 4 °c.
- Zuig de supernatant op en voeg ijskoud 1x HBSS toe aan elke buis tot een eindvolume van 7 mL en breng de pellet voorzichtig door met vortexing.
- Ga verder naar sectie 5 voor het verwijderen van puin.
5. verwijderen van vuil
Opmerking: verwijdering van puin, voornamelijk samengesteld uit onverteerd weefsel en myeline omhulsels, is een kritieke stap om efficiënte kleuring van het weefsel homogenaat voor volgende Flow cytometrische analyses mogelijk te maken.
- Filtreer elk monster door een celzeef van 70 μm om alle niet-verteerde weefsel Brok te verwijderen. Deze stap is vooral belangrijk vooral bij het werken met ruggenmerg weefsels, omdat deze monsters hebben meer kans om te bevatten onverteerde zenuw fragmenten of hersenvliezen die de volgende stappen kunnen beïnvloeden.
- Zorg ervoor dat het uiteindelijke volume 7 mL is in elke monsterbuis. Zo niet, vul dan met ijskoud 1x HBSS tot 7 mL.
- Voeg 3 mL voorgekoelde IPS aan elk monster toe om een eindvolume van 10 mL van een oplossing met dichtheidsgradiënt medium bij 30% eindconcentratie te maken. Draai de monsters zachtjes om ervoor te zorgen dat ze homogeen gemengd zijn.
- Centrifugeer monsters gedurende 15 minuten bij 700 x g bij 18 °c en zorg ervoor dat de versnelling van de centrifuge op 7 en de rem op 0 wordt gezet.
Opmerking: centrifugeren moet ongeveer 30 minuten duren. - Haal de monsters voorzichtig uit de centrifuge.
Opmerking: een witachtige schijf die bestaat uit puin en myeline moet zichtbaar zweven op het oppervlak van de oplossing. Een pellet (met de cellen van belang) moet zichtbaar zijn aan de onderkant van de buis. - Zuig voorzichtig alle witachtige schijf van puin en vervolgens de rest van de supernatant ervoor te zorgen dat niet te verdrijven de pellet. Laat ongeveer 100 μL oplossing bovenop de celpellet om te voorkomen dat het risico van onbedoeld loskomen.
- Voeg 1 mL FACS BL toe, hervat de pellet door pipetteren op en neer met een 1000 μL pipetpunt en breng samples over naar 1,5 mL tubes.
- Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 x g bij kamertemperatuur (RT).
- Zuig het supernatant zachtjes aan en breng de pellet in passende buffer die compatibel is met downstreamanalyses (zie rubriek 6 voor het protocol dat wordt gebruikt voor de flowcytometrische evaluatie van meerdere celtypen).
6. kleuring voor flowcytometrische evaluatie van meerdere celtypen
- Respendeer de pellet verkregen in stap 5,9 met 350 μL FACS BL. Voeg FC-block toe aan elk monster in een uiteindelijke concentratie van 5 μg/mL.
Opmerking: voor één kleuring moet ten minste 100 μL van het monster worden gebruikt, om ervoor te zorgen dat voldoende cellen worden verwerkt om betrouwbare analyses mogelijk te maken. - Inbroed het monster gedurende 10 minuten bij 4 °C voordat u doorgaat met de kleuring.
- Bereid een antilichaam mengsel volgens tabel 1.
- Voeg een antilichaammix toe aan elke buis, Vortex voor 5 sec. en inbroed de monsters gedurende 15 minuten bij 4 °C in het donker.
- Voeg 1 mL PBS toe aan elke buis, Vortex en centrifuge gedurende 5 min bij 450 x g bij RT.
- Ondertussen bereiden streptavidine mix volgens tabel 1.
- Gooi de supernatant weg en regeer de pellet in de streptavidine mix bereid in stap 6,6. Gebruik voor elk monster hetzelfde volume als dat voor de kleuring is gebruikt in stap 6,4.
- Vortex voor 5 sec. en inbroed de monsters gedurende 10 minuten bij 4 °C in het donker.
- Voeg 1 mL PBS toe aan elke buis, Vortex en centrifuge gedurende 5 min bij 450 x g bij RT.
- Gooi het supernatant weg en regeer de pellet in FACS BL. gebruik 300 μL FACS BL voor elke 100 μL monster gekleurd.
- Voeg 7-amino-actinomycine D (7-AAD) oplossing voor elk voorbeeld. Gebruik 5 μL 7-AAD voor elke 300 μL monster bereid in stap 6,10.
- Bewaar monsters bij 4 °C in het donker tot cytofluorimetrische analyse. Voer de analyse uit binnen 16 uur vanaf de monstervoorbereiding, om > 60% cellevens vatbaarheid te garanderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We vergeleek twee verschillende homogenisatie methoden (DH versus PD) toegepast op muis hersenen en ruggenmerg, om de efficiëntie te testen bij het ophalen van verschillende levensvatbare celtypen die geschikt zijn voor downstreamtoepassingen. Om dit te doen, we uitgebuit een 9-Color flow cytometrie panel ontworpen om te karakteriseren, in hetzelfde monster, verschillende CNS celtypen, waaronder Microglia, lymfocyten, neuronen, astrocyten, oligodendrocyten en endotheel.
Hersenen en ruggenmerg weefsels werden opgehaald uit verschillende muizen (n ≥ 6), gesplitst in twee halzen longitudinaal, gewogen en parallel verwerkt door het toepassen van hetzij mechanische verstoring met behulp van de dounce homogenisator (DH-methode) of zachtjes gehakt en verteerd enzymatisch met behulp van de commerciële ntdk op basis van papaïne (PD-methode) (Figuur 1 Na verwijdering van puin werden cellen uit de hersenen of het ruggenmerg verdund 1/10 of 1/2 − 1/5, respectievelijk, in Trypan blauw om de celopbrengst en levensvatbaarheid te bepalen met een Neubauer kamer (Figuur 1B, C). De DH-methode produceerde in het algemeen een hogere celopbrengst van zowel de hersenen als het ruggenmerg. De meerderheid van de opgehaalde cellen was echter dood, wat resulteerde in slechts 13,8% ± 3,3% van de levensvatbare cellen in de hersenen en 10,5% ± 1,5% in het ruggenmerg (Figuur 1B). Veel van de dode cellen vormden aggregaten (Figuur 1C); Dit verschijnsel kan te wijten zijn aan de aanwezigheid van zeer onderling verbonden celnetwerken (zoals de endotheel-en gliacellen die de vasculatuur van het CZS binnenlaten) die niet konden worden opgesplitst door de Afschuifkracht die met de DH werd toegepast. Deze aggregaten van de dood cellen werden waarschijnlijk niet verwijderd door de dichtheidsgradiënt en eindigden in de uiteindelijke celpellet die werd gebruikt voor cytofluorimetrische analyse. Integendeel, de PD-methode bepaald een algeheel beter behoud van cellulaire levensvatbaarheid (90,6% ± 0,6% in de hersenen en 85,2% ± 2,8% in het ruggenmerg). Papaïne is in staat om de extracellulaire matrix en cel-naar-cel knooppunten efficiënt te verteren, wat leidt tot een uniformere eencellige suspensie. Sommige cellen die tijdens het gehakt proces sterven, kunnen verder worden verteerd door papaïne, wat leidt tot de vorming van celresten die efficiënter door de dichtheidsgradiënt worden gescheiden. In het algemeen, dit waarschijnlijk bepaald een beter behoud van de levensvatbaarheid van de cel met PD-methode, ondanks een iets lagere celopbrengst in vergelijking met de DH-methode.
Een aliquot van 100 μL van het hersen-en de ruggenmerg cel suspensies werd gekleurd met de antilichaammix (tabel 1) en geanalyseerd door flow cytometrie met een 9-kleuren paneel. Figuur 2A toont de gating-strategie die wordt gebruikt om de verschillende celtypen van de hersen-en ruggenmerg celsuspensies te identificeren. Kort, de eerste poort identificeert de algemene populatie volgens forward Scatter (FSC) en side Scatter (SSC), met uitzondering van kleine celresten. Vervolgens worden live (7-AAD-) cellen geïdentificeerd. Binnen de totale Live-celpopulatie worden CD45 + en CD45-cellen gemarkeerd. Binnen de CD45 + poort worden CD45 + CD11b + Microglia/macrofagen en CD45 + CD11b-lymfocyten geïdentificeerd. Binnen CD45-Gate worden cellen gediscrimineerd volgens positiviteit voor ACSA2 (astrocyten) of O4 (oligodendrocyten). CD45-ACS2-O4-cellen zijn verder onderverdeeld volgens positiviteit voor Thy1 (neuronen) of CD31 (endotheel). Overgebleven Thy1-CD31-cellen worden geclassificeerd als "andere celtypes", niet verantwoord door onze antilichaammix.
Zoals weergegeven in Figuur 2B, met DH methode ongeveer 38% van de levensvatbare cellen opgehaald uit de hersenen en over 32% van de levensvatbare cellen opgehaald uit het ruggenmerg waren van hematopoietische oorsprong (CD45 +). Aan de andere kant, PD methode toegestaan om op te halen een significant hoge opbrengst van levensvatbare cellen in beide weefsels, met een zeer grote fractie vertegenwoordigd door niet-hematopoietische CD45-cellen (over 82% in de hersenen en 92% in het ruggenmerg). Opvallend, CD45 + CD11b + Microglia/macrofagen vertegenwoordigde de meest overvloedige levensvatbare celbreuk met de DH-methode (Figuur 2C). Echter, PD methode produceerde een meer heterogene representatie van celtypen, met inbegrip van ACSA + astrocyten, O4 + oligodendrocyten, CD31 + endotheliale cellen en Thy1 + neuronen (Figuur 2C). Belangwekkend, levensvatbare neuronen en endotheel cellen waren nauwelijks detecteerbaar met de DH-methode.
De DH-methode berust op mechanisch slijpen van het weefsel tussen de glazen stamper en mortel van de Dounce homogenisator om weefselhomogenisatie te verkrijgen. Dit kan leiden tot sommige shear stress die waarschijnlijk schade en invloed op de levensvatbaarheid van grote of zeer gevoelige cellen zoals neuronen of cellen van de neurovasculature zal. We evalueerden de cellulaire levensvatbaarheid (percentage van 7-AAD-cellen) binnen elke cel subpopulatie geïdentificeerd via het antilichaam panel (Figuur 3). Hematopoietische cellen (CD45 +) geïsoleerd van de hersenen en het ruggenmerg, met inbegrip van Microglia/macrofagen (CD45 + CD11b +) en andere niet-myeloïde cellen (CD45 + Cd11b-), weergegeven zeer hoge levensvatbaarheid onafhankelijk van de homogenisatie methode die werd gebruikt (Figuur 3A). Integendeel, de DH-methode heeft een significante reductie van de levensvatbaarheid van CD45-populaties bepaald (Figuur 3B), terwijl de PD-methode een uitgebreid behoud van verschillende typen CZS-cellen heeft bepaald. In detail waren neuronen en endotheelcellen de subpopulaties die het meest significant werden beïnvloed door DH en bewaard door de PD-methode.
Een schematische voorstelling van de kritieke stappen die nodig zijn voor een goede monstervoorbereiding en een efficiënte verwijdering van het puin, wordt samengevat in Figuur 4.
Figuur 1: de opbrengst van cellen die worden opgehaald uit de hersenen en het ruggenmerg wordt beïnvloed door de homogenisatie methode.
A) experimentele omtrek. Muizen werden verdouseerd en intracardiacaal perfgebruikt met PBS om intra-vasculaire circulerende bloedcellen te verwijderen. De hersenen en het ruggenmerg werden zorgvuldig ontleed en gesplitst in twee halzen longitudinaal. Weefsels werden gehomogeniseerd met behulp van dounce homogenisator (DH) of papaïne spijsvertering (PD) zoals beschreven in de hoofdtekst. Myeline en weefsel puin werden vervolgens verwijderd door centrifugeren in een 30% dichtheidsgradiënt medium oplossing resulterend in een heterogene celsuspensie met verschillende celtypen die kunnen worden geanalyseerd door flow cytometrie. B) histogrammen die de opbrengst weergeven van cellen die uit de hersenen of het ruggenmerg zijn gehaald bij weefselhomogenisatie met de DH-of pd-methode. De gemiddelde ± SEM van ten minste 6 dieren per aandoening is vertegenwoordigd. C) representatieve, door de twee methoden uit de hersenen of het ruggenmerg verkregen fotomicrografen van trypan Blue, positieve (dode) en negatieve (levende) cellen. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: relatieve verhoudingen van verschillende celtypen die worden opgehaald uit het CZS worden beïnvloed door de weefselhomogenisatie methode.
A) representatieve Flowcytometrie plots die de gating-strategie tonen om verschillende celsubpopulatie te identificeren binnen celpreparaten die zijn verkregen uit hersenen of ruggenmerg: celpopulatie wordt afgesloten op de fysieke parameters FSC en SSC, gevolgd door selectie voor 7-Aad-levende cellen; vervolgens worden cellen gediscrimineerd volgens positiviteit voor CD45 marker; Microglia/macrofagen worden geïdentificeerd als CD11b + cellen binnen de CD45 + Fractie, terwijl lymfocyten CD11b-. Astrocyten, oligodendrocyten, endotheel en neuronale cellen worden geïdentificeerd als ACSA2 +, O4 +, CD31 + of Thy1 + cellen binnen CD45-, respectievelijk. B) histogrammen met het percentage van CD45 + en CD45-cellen in de totale levende of dode celpopulaties, in de hersenen of het ruggenmerg bij homogenisatie met de DH-of pd-methode. De statistische analyse van de in de grafieken getoonde resultaten wordt vermeld in tabel 2. C) cirkeldiagrammen met het percentage van verschillende levensvatbare celsubtypen binnen de totale celpopulatie, in de hersenen of het ruggenmerg bij homogenisatie met de DH-of pd-methode. Het percentage van de totale dode cellen wordt ook gerapporteerd. N ≥ 6. CD45 + CD11b + = Microglia/macrofagen; CD45 + CD11b-= lymfocyten/niet-myeloïde cellen; CD45-ACSA2 + = astrocyten; CD45-O4 + = oligodendrocyten; CD45-Thy1 + = neuronen; CD45-CD31 + = endotheliale cellen; Andere = cellen negatief voor alle bovengenoemde markers. De statistische analyse van de in de grafieken getoonde resultaten wordt vermeld in tabel 2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: cellulaire levensvatbaarheid van verschillende CZS-celtypen wordt beïnvloed door de toegepaste homogenisatie methode.
(A) histogrammen met het percentage van 7-Aad-levende cellen binnen CD45 + hematopoietische populaties, waaronder CD11b + Microglia/macrofagen en CD11b-niet-myeloïde cellen. (B) histogrammen met het percentage van 7-Aad-levende cellen binnen CD45-niet-hematopoietische populaties, waaronder astrocyten, oligodendrocyten, neuronen, endotheliale en andere celtypen. * = p < 0,05, * * = p < 0,01, Mann-Whitney tussen DH en PD. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: schematische weergave van de kritische stappen die nodig zijn voor de juiste weefsel verwerking.
Een lijst van de meest kritische stappen die nodig zijn voor de juiste weefsel verwerking en efficiënte verwijdering van vuil wordt getoond. Het is belangrijk om de puin schijf (zwarte pijl) en de cel pellet (blauwe pijl) gevormd na centrifugeren van de monsters op de 30% dichtheidsgradiënt te identificeren. De puin schijf, samen met de rest van de supernatant, moet zorgvuldig worden verwijderd door aspiratie zonder de cel pellet om monsterverlies te voorkomen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Antilichaam mengsel | Initiële concentratie (μg/mL) | Eindconcentratie (μg/mL) | Verdunningsfactor |
| anti CD45/BV510 | 200 | 2 | 100 |
| anti CD11b/APC. 780 | 200 | 2 | 100 |
| anti CD31/BV421 | 200 | 2 | 100 |
| anti ACSA2/APC | 150 | 0,75 | 200 |
| anti O4/Biotine | na | na | 40 |
| anti-CD 90.2/PE. Cy7 | 200 | 2 | 100 |
| Streptavidine mix | Initiële concentratie (μg/mL) | Eindconcentratie (μg/mL) | Verdunningsfactor |
| Streptavidin/Alexa 680 | 1000 | 1 | 1000 |
Tabel 1: recept voor de bereiding van mengsels voor Flowcytometrie kleuring. De tabel beschrijft de optimale concentraties van antilichamen en streptavidine die worden gebruikt om flowcytometrische analyses van meerdere celtypen toe te staan. Raadpleeg de tabel met materialen voor meer informatie over de catalogusnummers van elk reagens dat in de tabel wordt vermeld.
| Statistieken voor figuur 2B | ||||||||||
| HERSENEN (% cellen) | ||||||||||
| CD45 + | CD45 | |||||||||
| Live | Dood | Live | Dood | |||||||
| Methode | Bedoel | ± SEM | Bedoel | ± SEM | Bedoel | ± SEM | Bedoel | ± SEM | ||
| Dh | 15,20 | ± 2,32 | 1,90 | ± 0,30 | 24,78 | ± 4,045 | 51,58 | ± 6,033 | ||
| Pd | 15,20 | ± 2,65 | 2,33 | ± 1,10 | 68,53 | ± 3,618 | 13,93 | ± 2,180 | ||
| Mann-Whitney | Ns | Ns | *** | ** | ||||||
| p-waarde | 0,9989 | 0,738 | 0,0006 | 0,0015 | ||||||
| RUGGENmerg (% cellen) | ||||||||||
| CD45 + | CD45 | |||||||||
| Live | Dood | Live | Dood | |||||||
| Methode | Bedoel | ± SEM | Bedoel | ± SEM | Bedoel | ± SEM | Bedoel | ± SEM | ||
| Dh | 15,00 | ± 8,21 | 1,41 | ± 0,11 | 31,64 | ± 8,21 | 51,95 | ± 16,52 | ||
| Pd | 7,49 | ± 4,99 | 1,15 | ± 0,68 | 84,27 | ± 9,39 | 7,09 | ± 3,75 | ||
| Mann-Whitney | Ns | Ns | * | Ns | ||||||
| p-waarde | 0,5548 | 0,7236 | 0,0438 | 0,1144 | ||||||
| Statistieken voor figuur 2C | |||||||||||||||||
| HERSENEN (% cellen) | |||||||||||||||||
| CD45 + | CD45 | ||||||||||||||||
| CD11b + | CD11b- | ACSA2 | O4 | Thy1 | CD31 | Andere | Dood | ||||||||||
| Methode | Bedoel | ± SEM | Bedoel | ± SEM | Bedoel | ± SEM | Bedoel | ± SEM | Bedoel | ± SEM | Bedoel | ± SEM | Bedoel | ± SEM | Bedoel | ± SEM | |
| Dh | 19,32 | ± 3,88 | 1,17 | ± 0,27 | 9,52 | ± 2,68 | 3,41 | ± 1,01 | 1,39 | ± 0,77 | 0,48 | ± 0,29 | 10,52 | ± 4,49 | 53,83 | ± 5,79 | |
| Pd | 10,88 | ± 2,03 | 1,65 | ± 0,48 | 8,17 | ± 2,66 | 6,54 | ± 0,76 | 6,37 | ± 1,76 | 8,27 | ± 1,25 | 33,28 | ± 6,34 | 23,72 | ± 5,31 | |
| Mann-Whitney | Ns | Ns | Ns | * | ** | *** | ** | ** | |||||||||
| p-waarde | 0,1206 | 0,4819 | 0,5894 | 0,0264 | 0,0093 | 0,0003 | 0,0084 | 0,0022 | |||||||||
| RUGGENmerg (% cellen) | |||||||||||||||||
| CD45 + | CD45 | ||||||||||||||||
| CD11b + | CD11b- | ACSA2 | O4 | Thy1 | CD31 | Andere | Dood | ||||||||||
| Methode | Bedoel | ± SEM | Bedoel | ± SEM | Bedoel | ± SEM | Bedoel | ± SEM | Bedoel | ± SEM | Bedoel | ± SEM | Bedoel | ± SEM | Bedoel | ± SEM | |
| Dh | 21,23 | ± 6,25 | 2,51 | ± 0,57 | 4,26 | ± 2,34 | 9,40 | ± 1,89 | 2,82 | ± 1,51 | 0,97 | ± 0,50 | 22,74 | ± 9,04 | 35,28 | ± 1,89 | |
| Pd | 9,63 | ± 1,67 | 2,77 | ± 0,48 | 4,23 | ± 1,59 | 28,62 | ± 3,57 | 1,26 | ± 0,49 | 6,94 | ± 2,14 | 26,39 | ± 8,17 | 19,09 | ± 4,76 | |
| Mann-Whitney | Ns | Ns | Ns | * | Ns | * | Ns | Ns | |||||||||
| p-waarde | 0,1905 | > 0.9999 | 0,7302 | 0,0159 | 0,7302 | 0,0317 | 0,7302 | 0,1111 | |||||||||
Tabel 2: statistische analyse van verschillende populaties die worden opgehaald door toepassing van de DH-of pd-methode. De tabel beschrijft de statistieken voor de grafieken in Figuur 2B en Figuur 2C. Het gemiddelde en het SEM van ten minste zes onafhankelijke monsters is vertegenwoordigd. De p-waarde en de details van de statistische test die voor elke vergelijking wordt toegepast, worden ook gerapporteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hierin beschrijven we een protocol voor de co-zuivering en gelijktijdige Flow cytometrische analyse van enkele van de meest relevante CNS-cellen van muis hersenen en ruggenmerg. Traditioneel zijn histologische analyses toegepast om de verdeling van nanodeeltjes of de transductie-efficiëntie van virale vectoren in het CZS5,13te beschrijven of om inzichten te verschaffen over morfologische en moleculaire veranderingen die zich voordoen in specifieke celtypen tijdens een pathologie of bij farmacologische behandeling14. Echter, histologie mist processiviteit en het is niet mogelijk uitgebreid onderzoek van meerdere functies in dezelfde histologische monsters, als gevolg van het beperkte aantal markeringen die gelijktijdig kunnen worden geanalyseerd. Onze aanpak kan complementair zijn aan traditionele histologische analyses en kan worden gekoppeld aan verschillende downstreamtoepassingen (sorteren, primaire cultuur, biochemische of volgende-generatie-sequencing-analyses) om de compilatie van informatie die kan worden verkregen uit individuele monsters uit te breiden. Enkele belangrijke factoren die hieronder worden opgesomd, moeten echter worden overwogen omdat ze het succes van deze aanpak kritisch kunnen beïnvloeden:
- Hoeveelheid start weefsel. We hebben de celscheiding geoptimaliseerd om te beginnen met zo weinig als half ruggenmerg of halve hersenen. In onze ervaring, het verwerken van halve hersenen of half ruggenmerg van een volwassen 8-week-oude muis met de PD-methode levert 1 − 6 x 106 levensvatbare cellen uit de hersenen en ongeveer 0,1 − 0,5 x 106 levensvatbare cellen uit het ruggenmerg na de dichtheidsgradiënt stap. We hebben niet gemeten cellen rendement na het toepassen van de PD-methode op weefsels van pasgeborenen of muizen jonger dan 8 weken. In onze handen is het resultaat echter evenredig met het gewicht van het uitgangs weefsel. Voor jongere dieren (bijv. 10-Day-Old pups) moet de hele hersenen of het ruggenmerg dus worden verwerkt om een goede celopbrengst te garanderen voor betrouwbare stroomafwaartse analyses. Indien nodig, het bundelen van weefsels van meerdere dieren zou helpen verhogen van de celopbrengsten. In onze ervaring kan dit protocol ook zonder wijzigingen worden toegepast om cellen te isoleren van de hersenen of het ruggenmerg van ratten, voor zover het aandeel van de gebruikte reagentia per gewicht van het start weefsel wordt gerespecteerd. Voor weefsels van meer dan 250 mg gewicht, wordt aanbevolen reagentia op te schalen of te splitsen in meerdere monsters (elke weging < 250 mg).
- Verwijderen van hersenvliezen/rest weefsel stukken vóór de dichtheidsgradiënt. In onze ervaring is de beschreven PD-methode niet in staat om efficiënte hersenvliezen of zeer sterk myelinehoudende weefsels, zoals de zenuwen en zenuwwortels die uit het ruggenmerg komen, te verteren. Wanneer deze weefsels aanwezig zijn, kunnen sommige niet-verteerde kleverige stukjes achterblijven in de celsuspensie die na de enzymatische digestie stappen is opgehaald, voordat de verwijdering van het puin wordt verwijderd. Het verwijderen van deze chunks door het filteren van de oplossing door middel van een 70 μm cel zeef (zoals voorgesteld in stap 5,1) is van cruciaal belang voor een succesvolle cel preparaat. In feite, als niet verwijderd, hersenvliezen of weefsel stukken zal belemmeren efficiënte dichtheidsgradiënt scheiding resulterend in slechte celopbrengsten.
- Timing, temperatuur en steriliteit. Het is zeer belangrijk om alle stappen tijdig uit te voeren met behulp van de juiste temperatuurinstellingen en incubaties zoals gesuggereerd. Dit is essentieel om te zorgen voor een hoge cel levensvatbaarheid en integriteit van het monster. Afhankelijk van de downstream toepassing kan het nodig zijn alle stappen onder een steriele kap en met steriele reagentia uit te voeren (bijv. het opzetten van primaire celculturen). Uitgebreide incubatie in de enzymatische spijsvertering oplossing na de voorgestelde tijd (sectie 3) kan resulteren in een daling van de levensvatbaarheid van de cel. De epitopen van sommige oppervlakte antigenen kan gevoelig zijn voor papaïne, wat resulteert in verlies van signaal bij Flow cytometrie. Voor specifieke toepassingen waarvoor andere markeringen nodig zijn dan die welke in dit artikel worden beschreven, wordt het testen van de prestaties van verschillende antilichaam klonen aanbevolen voordat het experiment wordt gestart. Er is gemeld dat het dichtheidsgradiënt een aantal sporen van endotoxinen kan bevatten die de activering van immuuncellen kunnen activeren (Microglia/macrofagen). Wanneer deze populaties worden geanalyseerd, moeten er altijd passende interne controles worden toegevoegd om mogelijke effecten van de procedure uit te sluiten. Vasthouden aan de voorgestelde temperaturen en wassen dichtheid gradiënt medium restjes onmiddellijk na de puin verwijdering stap is meestal genoeg om te voorkomen dat overt immuun cellen activering. In het geval dat de downstreamtoepassingen (bijvoorbeeld RNAseq of functionele analyses) worden beïnvloed door deze stap, moet de gebruiker overschakelen naar een laag-endotoxine dichtheidsgradiënt medium voorbereiding (voorgesteld in de materiaallijst).
- FACS antilichamen en machine. Het doorstroming cytometrie kleuring protocol maakt gebruik van antilichaamconcentraties en kleur vervloeiingen die het beste werkten met de celopbrengsten die in onze laboratorium ervaring zijn teruggevonden en met FACS-machines die beschikbaar zijn in ons instituut. De gebruiker moet de antilichamen in zijn/haar handen titer voor het starten van een nieuw experiment, als de concentratie moet mogelijk enigszins worden aangepast. Bovendien moedigen we aan om in elk experiment altijd single-Color kleurings regelaars te gebruiken om te controleren of alle antilichamen en de compensatie-instellingen van de FACS-machine adequaat werken. Opgemerkt moet worden dat het CD90 (Thy) antigeen dat wordt gebruikt voor het opsporen van neuronen bestaat in twee verschillende isotypes, namelijk CD 90.2 of CD 90.1 afhankelijk van de muis stam: de meest gebruikte muis stammen, zoals C57BL6/J Express CD 90.2; muis stammen zoals AKR/J, PL en FVB/N Express CD 90.1. Dus, de gebruiker moet zorgvuldig controleren of de muis stam en kies de juiste anti-CD90 antilichaam (zoals voorgesteld in de tabel van de materialen) voordat u begint met de experimenten.
Samenvattend, het protocol hier gepresenteerd maakt gebruik van een zachte enzymatische spijsvertering gevolgd door een 9-Color kleuring waardoor efficiënte gelijktijdige Flow cytometrische evaluatie van verschillende celtypen van muis hersenen en ruggenmerg. Het protocol kan worden benut om de efficiëntie van de celtargeting door nanodeeltjes of virale vectoren die in het CZS-15worden toegediend, op een gestroomlijnde en alomvattende manier te bewaken. Bovendien zou het protocol gemakkelijk kunnen worden aangenomen voor zeer delicate downstreamtoepassingen, zoals celsortering, ex vivo-subcultuur, RNAseq met één cel, wat het uiterst belangrijk is, niet alleen voor de preklinische beoordeling van celtargeting door Therapeutics, maar ook voor een grondige karakterisering van pathologische processen in neurodegeneratieve ziekten.
Een fractie van de hele CZS-celpopulatie wordt niet gediscrimineerd door dit Protocol (zie "andere" celtypen in Figuur 2); Dit kan worden verklaard door de aanwezigheid van andere subtypen van cellen die aanwezig zijn in het CZS, maar die niet worden gevangen door de antilichamen die we gebruikten. In onze voorbereidende analyses, ongeveer 14% van de "andere cellen" fractie is positief voor CD73, een mesenchymale cel marker verrijkt in de neurovasculature en betrokken bij verschillende neuroinflammatoire processen16,17. Bovendien veronderstellen we dat de Fractie "andere cellen" ook minder gedifferentieerde cellen zou kunnen bevatten, zoals voor ouders in verschillende stadia van rijping, zoals nestin + neurale stamcellen, nestin + vimentin + radiaal glia-voor ouders, doublecortin + neurale voor ouders, ng2 + oligodendrocyten precursor cellen, onder andere. Deze celsubtypen kunnen gemakkelijk worden onderzocht door het toepassen van ons flow cytometrie-protocol, omdat we een configuratie van fluorescerende kleurstoffen hebben gekozen die het mogelijk maakt om maximaal twee extra celmarkeringen toe te passen die zijn geconjugeerd met ofwel de fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) of phycoerythrin (PE) fluor Foren.
Over het geheel genomen zou onze aanpak een nieuw instrument kunnen bieden voor uitgebreidere onderzoeken in het kader van het CZS (in gezondheid en ziekte), door gebruik te maken van een goed geconsolideerde technologie die kwantitatieve evaluaties van zowel kwalitatieve als hoge doorvoer mogelijk maakt zoals Flowcytometrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd gefinancierd door de start-up fondsen van het Boston Children's Hospital voor A.B., ALSA Grant nr. 17-IIP-343 tot M.P., en het kantoor van de adjunct-secretaris van defensie voor gezondheidszaken via het Amyotrofische laterale sclerose onderzoeksprogramma onder Awardnr. W81XWH-17-1-0036 tot M.P. We erkennen DFCI flow Cytometrie core voor technische ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
References
- Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).
- Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System. Nanomaterials. 9 (3), 371 (2019).
- Chen, S., et al. Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools. Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67 (2019).
- Alves, S., et al. Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain. Scientific Reports. 6 (1), 28272 (2016).
- Peviani, M., et al. Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons. Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Sykora, M. M., Reschke, M. Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).
- Legroux, L., et al. An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry. Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).
- Lee, J. K., Tansey, M. G. Microglia Isolation from Adult Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).
- Grabert, K., McColl, B. W. Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells. Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635 (2012).
- Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Isolation and analysis of mouse microglial cells. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).
- Papa, S., et al. Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury. ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).
- Peviani, M., et al. Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation. Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).
- Peviani, M., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release. Biomaterials. 209, 25-40 (2019).
- Meng, F., et al. CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling. Brain. 142 (3), 700-718 (2019).
- Nedeljkovic, N. Complex regulation of ecto-5'-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation. Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).
