Summary
Fare beyninden veya omurilikten alınan farklı hücre tiplerini aynı anda belirlemek için bir akış sitometri yöntemi sintometri sitometri sitometri sitometrisi sintometrisi sitometri sintometrisi sintometrisi sintometri Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklarda saf hücre popülasyonlarını izole etmek veya karakterize etmek veya viral vektörlerin veya nano partiküllerin in vivo uygulamasında hücre hedeflemesinin kapsamını ölçmek için kullanılabilir.
Abstract
Viral vektör ve nanomalzeme bilimlerinde son gelişmeler araştırmak veya merkezi sinir sistemi (CNS) işlemek için yeni üstün yaklaşımlar için önünü açmıştır. Ancak, bu teknolojilerin daha fazla optimizasyon cns ve vücutta viral vektörler veya nano tanecikleri uygulanması üzerine hücre özel hedefleme ölçüde hızlı ve aerodinamik belirlenmesine olanak sağlayan yöntemleryararlanacaktır. Burada, fare beyin veya omurilikten izole edilen farklı hücre alt tiplerinin, yani mikroglia/makrofajların, lenfositlerin, astrositlerin, oligodendrositlerin, nöronların ve endotel hücrelerinin basit bir şekilde ölçülmesine olanak sağlamak için akış sitometrisinin yüksek üretim ve çoklama yeteneklerinden yararlanan bir protokol sintometri sitometrisi sitometrisi sitometrisini silyon ile karşılıyoruz. Bu yaklaşımı, hücre verimi, canlılık ve bileşim açısından iki doku homojenizasyon yöntemi arasındaki kritik farklılıkları vurgulamak için uyguluyoruz. Bu, kullanıcıya ilgi çeken hücre türüne ve belirli uygulamaya bağlı olarak en iyi yöntemi seçmesini sağlayabilir. Doku tek hücreli süspansiyon oluşturmak için homojenize olduğundan bu yöntem, anatomik dağılımın analizi için uygun değildir. Ancak, canlı hücrelerle çalışmaya olanak sağlar ve hücre ayrıştırma ile kombine edilebilir, saf hücre popülasyonlarından elde edilen birincil kültürlerin kurulmasından, gen ekspresyonu analizleri ve biyokimyasal veya fonksiyonel analizler nörodejeneratif hastalıklar bağlamında iyi tanımlanmış hücre alt tipleri, üzerine farmakolojik tedavi veya gen tedavisi bağlamında değişen, nörobilimcinin elinde araçların repertuarını genişletebilecek çeşitli uygulamaların önünü açar.
Introduction
Gen ve ilaç dağıtım teknolojileri (viral vektörler ve nano tanecikleri gibi) nörodejeneratif hastalıklarda değiştirilmiş belirli moleküler yollar hakkında daha iyi anlayışlar elde etmek ve yenilikçi terapötik yaklaşımların geliştirilmesi için uygulanabilir güçlü bir araç haline gelmiştir1,2,3. Bu araçların optimizasyonu, aşağıdakilerin nicelleştirilmesine dayanır: (1) CNS'deki penetrasyonun farklı yönetim yolları üzerindeki nüfuz derecesi ve (2) belirli hücre popülasyonlarının hedeflenmesi. Histolojik analizler genellikle floresan muhabir genleri veya floresan etiketli nano tanecikleri farklı CNS alanlarda ve farklı hücre tipleri arasında görselleştirmek için uygulanır, belirli hücre belirteçleri için immünboyama ile tanımlanan4,5. Bu yaklaşım, uygulanan genin veya ilaç dağıtım araçlarının biyodağıtımı hakkında değerli bilgiler sağlasa da, teknik zaman alıcı ve emek açısından yoğun olabilir: (1) doku fiksasyonu, kriyopreservation veya parafin katıştırma ve dilimleme; (2) bazen antijen alımı gerektiren belirli hücresel belirteçler için boyama; (3) floresan mikroskobu ile edinimi, genellikle aynı deney içinde farklı belirteçleri sınırlı sayıda analizi sağlar; (4) görüntü işleme ilgi sinyalinin doğru niceliksel izin vermek.
Akış sitometrisi, hücre süspansiyonlarında farklı hücre fenotiplerinin sadece yüzey veya hücre içi antijenlerin ekspresyonuna dayalı olarak hızlı bir nicel değerlendirmesine değil, aynı zamanda fonksiyonel ölçümlere (örn. apoptoz oranı, çoğalma, hücre döngüsü analizi vb.) olanak sağlamak için çok özel floresan belirteçlerden yararlanan yaygın olarak kullanılan bir teknik haline gelmiştir. Floresan aktif hücre ayrıştırma yoluyla hücrelerin fiziksel izolasyonu da mümkündür, daha fazla aşağı akım uygulamaları (örneğin, hücre kültürü, RNAseq, biyokimyasal analizler vb) izin 6,7,8.
Doku homojenizasyonu güvenilir ve tekrarlanabilir aşağı akım sitometrik değerlendirmeler sağlamak için tek bir hücre süspansiyon elde etmek için gerekli kritik bir adımdır. Farklı yöntemler yetişkin beyin dokusu homojenizasyonu için tarif edilmiştir, özellikle mikroglia hücreleri izole etmek amacıyla9,10,11; genel olarak iki ana kategoride sınıflandırılabilirler: (1) hücreleri nişlerinden ayırmak ve nispeten homojenleştirilmiş tek hücresüspansiyonu oluşturmak için bir Don homogenizer (DH) ile taşlama veya kesme kuvveti kullanan mekanik ayrışma, ve (2) enzimositsel sindirim, hangi 37 °C'de kin doku parçalarının kuluçka dayanır proteolitik enzimlerin varlığında, tripsin veya papain gibi, oldukça homojenleştirilmiş hücre süspansiyon oluşturmak için ekstrasellüler matris bozulması lehine12.
Hangi yöntemden ne olursa olsun, doku homojenizasyonundan sonra bir yoğunluk gradyan üzerinde santrifüj yoluyla miyelin ilerlediği veya manyetik seçimle 9,12, aşağı akım uygulamalarına geçmeden önce bir arınma adımı önerilir.
Burada, papain sindirimine dayalı bir doku işleme yöntemini (PH) ve ardından, fare beyninden veya omurilikten zamana duyarlı ve akış sitometrisine uygun olarak uygulanabilir heterojen hücre süspansiyonları elde etmek için optimize edilmiş bir yoğunluk gradyan üzerinde saflaştırmayı tanımlıyoruz. Ayrıca, 9 renkli akış sitometri paneli ve farklı CNS popülasyonları, canlı / ölü hücreler veya pozitiflik floresan muhabirler için yeşil floresan protein veya rhodamine boya gibi eşzamanlı ayrımcılık sağlamak için laboratuvarda kabul edilen gating stratejisi açıklar. Bu akış sitometrik analizini uygulayarak, hücresel canlılığın korunması ve farklı hücre tiplerinin verimleri açısından doku işleme yöntemlerini, yani PH ile DH'yi karşılaştırabiliriz.
Burada sağladığımız ayrıntılar, homojenizasyon protokolü ve akış sitometri panelinde kullanılacak antikor kombinasyonu hakkında, belirli hücre tipi(ler) ve akış analizlerine (örn. ısıya duyarlı) dayanarak karar verebilir. uygulamalar, spesifik floresan belirteçlerin takibi, in vitro kültür, fonksiyonel analizler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Burada açıklanan tüm yöntemler Dana Farber Kanser Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (protokol numarası 16-024).
1. Deney için gerekli çözümlerin hazırlanması
- 10x HBSS'yi steril suyla seyrelterek 1x Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) hazırlayın. Çözeltiyi buz üzerinde önceden soğutun. Her numune için en az 25 mL çözelti gereklidir.
- 10x steril HBSS 1:10'u yoğunluk gradyan ortamla (yani Percoll) karıştırarak İzotonik Percoll çözeltisini (IPS) hazırlayın. Buzda önceden soğutun.
NOT: IPS 4 °C'de 30 güne kadar saklanabilir. - Akış sitometrisi (FACS) bloke edici (BL) çözeltisi (%1 sığır serum albumini [BSA], fosfat tamponlu salinde %5 fetal sığır serumu [FBS]' hazırlayın. Buzda önceden soğutun.
2. İntrakardiyak perfüzyon ve doku diseksiyonu ile hayvan ötanazisi
NOT: Deneylerde sekiz haftalık C57BL/6J fareler, her iki cinste de kullanıldı. Doku sindirimine geçmeden önce, organlardan kan kontaminasyonunu ortadan kaldırmak için PBS solüsyonu ile perfüzyon yapılır.
- Ketamin/ksilazin karışımı (90−200 mg/kg ketamin, 10 mg/kg xylazine) kullanarak fareyi anestezi edin. Fareyi sırtına yerleştirin ve her uzvunu desteğe bantlayın. Çekilme refleksini kontrol ederek yeterli anestezi derinliğini doğrulayın.
- Sternum maruz torasik giriş düzeyinde bir orta hat deri kesi olun. Göğüs kafesinin ucunu kavramak için forceps kullanın, sonra göğüs kafesinin her iki tarafında bir 1 cm kesi yapmak. Son olarak diyaframı kesin ve göğüs kafesini kalbi görselleştirecek kadar geniş bir şekilde açın.
- Kalbi sağ ventrikülden yavaşça kavramak ve orta hatta ve göğüsten hafifçe çıkarmak için forseps kullanın.
- Sol ventrikülucu ucuna 23 G kelebek iğnesi takın, aort doğru ve sıkıca tutun.
- Perfüzyonu 1x PBS ile başlatın. Delmek sağ auricle kullanarak makas kullanarak perfusate dolaşım çıkmak için izin vermek. PBS'nin akış hızını 3 mL/dk olarak ayarlayın.
NOT: Karaciğer ve mezenterik kan damarlarının beyazlatma iyi perfüzyon belirtileri vardır. Gerekirse, prefüzyon hacmi kalp çıkan sıvı kan temiz, bu noktada floş hattı durdurulabilir kadar artabilir. - Perfüzyon sonra, omurilik beyin kesmek ve makas ve forceps ile kafatasından beyin kaldırın. Diseksiyon sırasında görünürlüğü ve kontrolü artırmak ve saç kirleticileri üzerinde taşımaktan kaçınmak için kürkü çıkarın. PBS ile dolu 3 mL şırınga kullanarak omuriliği kolonunun dışına atın.
- Her dokuyu 2 mL buz gibi 1x HBSS ile önceden doldurulmuş 6 kuyuluk çok kuyulu bir tabakta aktarın ve sindirime kadar buzda tutun.
- Beyni ve omuriliği uzunlamasına çizgi boyunca ikiye bölün.
NOT: Her dokunun yarısı homojenize edilerek akış sitometrik analizleri yapılır; diğer yarısı alternatif analizler için farklı işleme atanabilir (örneğin, histoloji için paraformaldehit fiksatif çözeltiye batırılmış).
3. Beyin ve omurilik enzimatik sindirim
NOT: Bu bölümde açıklanan hacimler yarım beyin veya omuriliğin sindirimi için yeterlidir.
- 1−2 mm kalınlığında parçalar halinde dokuları kıyma kmak bir çift kullanın.
- Doku parçalarının toplanması için yeterince büyük yapmak için makasla 1000 μL pipet ucu kesin. Pipet ucunu 1x HBSS ile önceden durula. Daha sonra kıyma dokusunu içeren 2 mL HBSS çözeltisini 15 mL konik tüpe aktarmak için pipetkullanın.
NOT: Pipet ucunun önceden durulanması, ucun içindeki doku parçalarının yapışmasını önlemek için önemlidir. - Kuyuyu ilave 2 mL buz gibi 1x HBSS ile yıkayın ve çözeltiyi doku parçalarını içeren ilgili 15 mL konik tüpe aktarın.
- 4 °C'de 250 x g'de 5 dk için her numuneyi santrifüj edin.
- Nöral doku dissosiyasyon kitinin enzim karışımını hazırlayın (NTDK; Malzeme Tablosu) 50 μL enzimP ile numune başına 1900 μL tampon X karıştırılarak. Sıcak enzim karışımı 1 37 °C bir su banyosunda. İnkübasyon enzimi, enzimin tam aktivasyonuna izin vermek için kullanmadan önce en az 10 dakika boyunca 37 °C'de 1'i karıştırın.
- 15 mL konik tüpten süpernatant aspire ve her numuneye 1,95 mL enzim karışımı ekleyin. Peletin yeniden askıya alınmasını sağlamak için yavaşça girdap.
- Numuneleri 37 °C'de 15 dakika boyunca bir tekerlek veya çalkalayıcı üzerinde kuluçkaya yatırın.
- Bu arada, 10 μL'lik A enzimini numune başına 20°L tampon Y ile karıştırarak NTDK'nın 2 enzim karışımını hazırlayın; çözeltiyi 37 °C'de bir su banyosunda ısıtın.
- Enzim karışımı 1 ile kuluçka sonunda, her numuneye 30 μL enzim karışımı 2 ekleyin.
- 1x HBSS ile önceden durulanmış 1000 μL pipet ucu ile yukarı ve aşağı boru lar oluşturarak numuneleri hafifçe karıştırın.
- Numuneyi 37 °C'de 15 dakika boyunca bir tekerlek veya çalkalayıcı üzerine kuluçkaya yatırın.
- Kuluçkadan sonra, enzim karışımı 1 ve enzim karışımı 2 inaktive etmek için her tüpe 10 mL buz gibi 1x HBSS ekleyin.
- Her numuneyi 4 °C'de 320 x g'de 10 dk santrifüj edin.
- Supernatant atın; her tüpe 7 mL'lik son bir hacme kadar buz gibi 1x HBSS ekleyin ve girdap yaparak peleti yavaşça yeniden askıya alın.
- Enkaz kaldırma için bölüm 5 devam edin.
4. Beyin ve omuriliğin mekanik homojenizasyonu
NOT: Bu bölümde açıklanan hacimler, bir-yarım beyin veya omuriliğin homojenizasyonu için yeterlidir. Bu bölümde açıklanan protokol, aşağıda açıklandığı gibi kullanıcı ihtiyacına bağlı olarak bölüm 3'te açıklananyöntem alternatifi olarak kullanılabilir.
- Önceden dounce doku öğütücü cam harç soğutun(Tablo Malzemeler) buz üzerine ayarlanmış.
- Harcın üzerine 3 mL önceden soğutulmuş 1x HBSS ekleyin.
- 6 kuyulu plakanın kuyularından 1x HBSS'ye batırılır ve harcın altına oturur emin olmak için dokuyu (beyin veya omurilik) cam harç içine aktarın.
- 10 vuruşla dokuyu a tam 10 vuruşla hafifçe parçalayın ve ardından 10 vuruş la havaneli B. Homojenize karışımı yeni bir 15 mL konik tüpe aktarın.
- 4 °C'de 320 x g'de 10 dk önceden soğutulmuş 1x HBSS ve santrifüj kullanarak tüpü 10 mL'lik son bir hacme doldurun.
- Supernatant aspirate ve 7 mL son bir hacme kadar her tüp buz gibi 1x HBSS ekleyin ve yavaşça girdap tarafından pelet askıya.
- Enkaz kaldırma için bölüm 5 devam edin.
5. Enkaz kaldırma
NOT: Çoğunlukla sindirilmemiş doku ve miyelin kılıflarından oluşan enkazların çıkarılması, sonraki akış sitometrik analizleri için homojen dokunun verimli bir şekilde boyanmasını sağlamak için kritik bir adımdır.
- Sindirilmemiş doku parçalarını çıkarmak için her numuneyi 70 μm'lik bir hücre süzgecine süzün. Bu örnekler daha sonraki adımları etkileyebilecek sindirilmemiş sinir parçaları veya menenjler içerme olasılığı daha yüksek olduğundan bu adım özellikle omurilik dokuları ile çalışırken önemlidir.
- Her numune tüpünde son hacmin 7 mL olduğundan emin olun. Aksi takdirde, 7 mL'ye kadar buz gibi 1x HBSS ile doldurun.
- %30 son konsantrasyonda yoğunluk gradyan ortam içeren bir çözeltinin 10 mL'lik son hacmini yapmak için her numuneye 3 mL önceden soğutulmuş IPS ekleyin. Homojen bir şekilde karıştırıldığından emin olmak için numuneleri yavaşça girdaplayın.
- 18 °C'de 700 x g'da 15 dk'lık santrifüj numuneleri, santrifüjün ivmesini 7'ye, frenin ise 0'a ayarladığından emin olun.
NOT: Santrifüj yaklaşık 30 dakika sürmelidir. - Numuneleri santrifüjden hassas bir şekilde çıkarın.
NOT: Enkaz ve miyelinden oluşan beyazımsı bir disk çözeltinin yüzeyinde görünür olmalıdır. Bir pelet (ilgi hücreleri içeren) tüpün alt kısmında görünür olmalıdır. - Dikkatlice enkaz tüm beyazımsı disk aspire ve sonra supernatant geri kalanı pelet yerinden değil emin olun. Yanlışlıkla çıkarma riskini önlemek için hücre peletinin üzerine yaklaşık 100 μL çözelti bırakın.
- 1 mL FACS BL ekleyin, 1000 μL pipet ucu ile yukarı ve aşağı borular ile pelet yeniden askıya ve 1,5 mL tüpler için örnekleri aktarın.
- Oda sıcaklığında 450 x g 5 dakika santrifüj (RT).
- Süpernatant'ı yavaşça aspire edin ve peleti akış aşağı analizleriyle uyumlu uygun arabellekte yeniden askıya alın (birden fazla hücre tipinin akış sitometrik değerlendirilmesi için kullanılan protokol için bölüm 6'ya bakın).
6. Birden fazla hücre tiplerinin akış sitometrik değerlendirilmesi için boyama
- Adım 5.9'da elde edilen pele'yi 350 μL FACS BL ile yeniden askıya alın.
NOT: Güvenilir analizlere izin verecek kadar hücre nin işlendiğinden emin olmak için bir boyama için numunenin en az 100 μL'si kullanılmalıdır. - Boyama işlemine geçmeden önce numuneyi 4 °C'de 10 dk kuluçkaya yatırın.
- Tablo 1'egöre antikor karışımı hazırlayın.
- Her tüpe antikor karışımı, 5 s'lik girdap ekleyin ve numuneleri karanlıkta 4 °C'de 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- RT'de 450 x g'da 5 dk'lık her tüp, girdap ve santrifüjiçin 1 mL PBS ekleyin.
- Bu arada Tablo 1göre streptavidin karışımı hazırlamak .
- Supernatant atın ve adım 6.6 hazırlanan streptavidin karışımı pelet resuspend. Her numune için, 6.4 adımda boyama için kullanılan hacimle aynı hacmi kullanın.
- 5 s için girdap ve karanlıkta 4 °C'de 10 dakika boyunca örnekleri inkübetmek.
- RT'de 450 x g'da 5 dk'lık her tüp, girdap ve santrifüjiçin 1 mL PBS ekleyin.
- Supernatant atın ve FACS BL pelet resuspend. Lekeli numune her 100 μL için 300 μL FACS BL kullanın.
- Her numuneye 7-amino-aktilosisin D (7-AAD) çözeltisi ekleyin. Adım 6.10'da hazırlanan her 300 μL numune için 5 μL 7-AAD kullanın.
- Örnekleri 4 °C'de sitoflorimetrik analize kadar karanlıkta saklayın. Analizin numune hazırlanmasından 16 saat içinde ,%gt;%60 hücre canlılığını garanti etmek için gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fare beynine ve omuriliğe uygulanan iki farklı homojenizasyon yöntemini (DH karşı PD) karşılaştırdık ve downstream uygulamalarına uygun farklı canlı hücre tiplerinin alınmasında verimliliği test ettik. Bunu yapmak için, aynı örnekte, mikroglia, lenfositler, nöronlar, astrositler, oligodendrositler ve endotel dahil olmak üzere farklı CNS hücre tiplerini karakterize etmek için tasarlanmış 9 renkli akış sitometri panelinden yararlandık.
Beyin ve omurilik dokuları farklı farelerden (n ≥ 6), uzunlamasına olarak ikiye bölündü, Dounce homogenizer (DH yöntemi) kullanılarak mekanik bozulma uygulanarak tartıldı ve paralel olarak işlendi veya papain (PD yöntemi) (PDyöntemi) dayalı ticari NTDK kullanılarak hafifçe kıyılmış ve sindirildi. Enkaz alındıktan sonra, beyin veya omurilikteki hücreler, neubauer bir oda ile hücre verimini ve canlılığını belirlemek için Trypan mavisinde sırasıyla 1/10 veya 1/2−1/5 seyreltildi (Şekil 1B,C). DH yöntemi genel olarak hem beyin hem de omurilikten daha yüksek hücre verimi üretti. Ancak, alınan hücrelerin çoğu ölü idi ve bu da beyindeki canlı hücrelerin sadece %13.8±'su ± %3.3'ü ve omurilikteki %10.5 ± %1.5'i ile sonuçlandı(Şekil 1B). Ölü hücrelerin çoğu oluşan agregalar (Şekil 1C); bu fenomen, DH ile uygulanan kesme kuvveti tarafından ayrıştırılamayan son derece birbirine bağlı hücre ağlarının (CNS vaskülatürü oluşturan endotel ve glial hücreler gibi) varlığından kaynaklanıyor olabilir. Ölüm hücrelerinin bu agregaları büyük olasılıkla yoğunluk gradyanı tarafından kaldırılmadı ve sitoflorimetrik analiz için kullanılan son hücre peletinde son landı. Tam tersine, PH yöntemi hücresel canlılığın genel olarak daha iyi korunmasını belirledi (90.6% ± 0.6% beyinde ve 85.2% ± 2.8% omurilik). Papain ekstrasellüler matris ve hücre-hücre kavşakları verimli bir şekilde sindirmek mümkün, daha düzgün bir tek hücre süspansiyon yol açan. Kıyma işlemi sırasında ölen hücrelerin bazıları daha fazla yoğunluk gradyanı ile ayrılır hücre enkaz oluşumuna yol açan papain tarafından sindirilir olabilir. Genel olarak, bu büyük olasılıkla PH yöntemi ile hücre canlılığı daha iyi bir koruma belirledi, DH yöntemi ile karşılaştırıldığında biraz daha düşük hücre verimi rağmen.
Beyin ve omurilik hücresi süspansiyonlarından 100 μL'lik bir aliquot antikor karışımı(Tablo 1)ile boyandı ve 9 renkli panel ile akış sitometrisi ile analiz edildi. Şekil 2A, beyin ve omurilik hücresi süspansiyonlarından farklı hücre tiplerini tanımlamak için kullanılan gating stratejisini gösterir. Kısaca, ilk kapı, küçük hücre enkazları hariç, ileri dağılım (FSC) ve yan dağılıma (SSC) göre genel popülasyonu tanımlar. Daha sonra canlı (7-AAD-) hücreler tanımlanır. Toplam canlı hücre popülasyonu içinde CD45+ ve CD45 hücreleri vurgulanır. CD45+ kapı içinde CD45+CD11b+ mikroglia/makrofajlar ve CD45+CD11b- lenfositler tanımlanır. CD45-kapı içinde, hücreler ACSA2 (astrositler) veya O4 (oligodendrocytes) için pozitifliğe göre ayrımcılığa maruz kalır. CD45-ACS2-O4- hücreleri Thy1 (nöronlar) veya CD31 (endotel) için pozitifliğe göre daha fazla bölünür. Kalan Thy1-CD31- hücreler antikor karışımımız tarafından hesaba katılmadan "diğer hücre tipleri" olarak sınıflandırılır.
Şekil 2B'degösterildiği gibi, DH yöntemi ile beyinden alınan canlı hücrelerin yaklaşık %38'i ve omurilikten alınan canlı hücrelerin yaklaşık %32'si hematopoetik kökenlidir (CD45+). Öte yandan, PH yöntemi her iki dokuda canlı hücrelerin önemli ölçüde yüksek verim almak için izin, çok büyük bir kısmı olmayan hematopoetik CD45 ile temsil- hücreleri (yaklaşık% 82 beyin ve 92% omurilik). Dikkat çekici bir şekilde, CD45+CD11b+ mikroglia/makrofajlar DH yöntemi ile en bol bulunan canlı hücre fraksiyonudur (Şekil 2C). Ancak, PD yöntemi ACSA+ astrositler, O4+ oligodendrositler, CD31+ endotel hücreleri ve Thy1+ nöronlar(Şekil 2C)dahil olmak üzere hücre tiplerinin daha heterojen bir temsilini üretmiştir. İlginçtir, canlı nöronlar ve endotel hücreleri neredeyse DH yöntemi ile tespit edildi.
DH yöntemi, doku homojenizasyonu elde etmek için Dounce homogenizer cam havanele ve harç arasındaki dokunun mekanik taşlama dayanır. Bu büyük olasılıkla zarar ve nöronlar veya nörovaskülatür hücreleri gibi büyük veya çok hassas hücrelerin canlılığını etkileyecek bazı kesme stresine neden olabilir. Antikor paneli ile tanımlanan her hücre alt popülasyonundaki hücresel canlılığı (7-AAD-hücrelerin yüzdesi) değerlendirdik(Şekil 3). Mikroglia/makrofajlar (CD45+CD11b+) ve diğer miyeloid olmayan hücreler (CD45+Cd11b-) dahil olmak üzere beyin ve omurilikten izole edilmiş hematopoetik hücreler (CD45+Cd11b-), kullanılan homojenizasyon yönteminden bağımsız olarak çok yüksek canlılık göstermiştir(Şekil 3A). Tam tersine, DH yöntemi CD45 popülasyonlarının(Şekil 3B)canlılıklarında önemli bir azalma saptanırken, PH yöntemi farklı CNS hücre tiplerinin kapsamlı bir şekilde korunmasını belirlemiştir. Ayrıntılı olarak, nöronlar ve endotel hücreleri en önemli DH etkilenen ve PH yöntemi ile korunmuş alt popülasyonlar edildi.
Uygun numune hazırlama ve verimli enkaz kaldırma için gerekli kritik adımların şematik bir sunumu Şekil 4'teözetlenmiştir.
Şekil 1: Beyin ve omurilikten alınan hücrelerin verimi homojenizasyon yöntemiile etkilenir.
(A) Deneysel anahat. Fareler anestezi ve intrakardiyak pbs ile intravasküler dolaşan kan hücrelerini kaldırmak için perfüzyon edildi. Beyin ve omurilik dikkatlice incelenmiş ve uzunlamasına iki ye bölündü. Dokular ana metinde ayrıntılı olarak Dounce homogenizer (DH) veya papain sindirim (PH) kullanılarak homojenleştirildi. Miyelin ve doku enkazı daha sonra %30 yoğunlukgradient orta çözeltide santrifüj ile çıkarıldı ve bu da akış sitometrisi ile analiz edilebilen farklı hücre tiplerini içeren heterojen hücre süspansiyonu ile sonuçlandı. (B) DH veya PD yöntemi ile doku homojenizasyonu üzerine beyinden veya omurilikten alınan hücrelerin verimini gösteren histogramlar. Ortalama ± SEM her koşulda en az 6 hayvan temsil edilir. (C) Trypan mavisi pozitif (ölü) ve negatif (canlı) hücrelerin beyin veya omurilikten alınan iki yöntemle temsili brightfield mikroskobu fotomikrografları. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: CNS'den alınan farklı hücre tiplerinin göreli oranları doku homojenizasyon yönteminden etkilenir.
(A) Beyin veya omurilikten elde edilen hücre preparatları içinde farklı hücre alt popülasyonlarını belirlemek için gating stratejisini gösteren temsili akış sitometrisi çizer: hücre popülasyonu FSC ve SSC fiziksel parametreleri üzerinde, ardından 7-AAD canlı hücreler için seçim; sonra hücreler CD45 belirteci için pozitifliğe göre ayrımcılığa uğrar; mikroglia/makrofajlar CD45+ fraksiyonu içinde CD11b+ hücreleri olarak tanımlanırken, lenfositler CD11b-. Astrositler, oligodendrositler, endotel ve nöronal hücreler CD45 içinde ACSA2+, O4+, CD31+ veya Thy1+ hücreleri olarak tanımlanır. (B) CD45+ ve CD45- hücrelerinin toplam canlı veya ölü hücre popülasyonları içindeki, beyin veya omurilikteki hücrelerin yüzdesini gösteren histogramlar, DH veya PD yöntemi ile homojenizasyon üzerine. Grafiklerde gösterilen sonuçların istatistiksel analizi Tablo 2'devermiştir. (C) Dh veya PD yöntemi ile homojenizasyon üzerine beyin veya omurilikte, toplam hücre popülasyonu içinde farklı canlı hücre alt tiplerinin yüzdesini gösteren pasta grafikleri. Toplam ölü hücrelerin yüzdesi de bildirilmiştir. N ≥ 6. CD45+CD11b+ = microglia/makrofajlar; CD45+CD11b- = lenfositler/miyeloid olmayan hücreler; CD45-ACSA2+ = astrositler; CD45-O4+ = oligodendrositler; CD45-Thy1+ = nöronlar; CD45-CD31+ = endotel hücreleri; Diğer = hücreler yukarıda belirtilen tüm belirteçler için negatif. Grafiklerde gösterilen sonuçların istatistiksel analizi Tablo 2'devermiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Farklı CNS hücre tiplerinin hücresel canlılığı uygulanan homojenizasyon yönteminden etkilenir.
(A) CD45+ hematopoetik popülasyonlarda cd11b+ mikroglia/makrofajlar ve CD11b-miyeloid olmayan hücrelerde yaşayan hücrelerin yüzdesini gösteren histogramlar. (B) CD45 içinde 7-AAD-canlı hücrelerin yüzdesini gösteren histogramlar- astrositler de dahil olmak üzere hematopoetik olmayan popülasyonlar, oligodendrositler, nöronlar, endotel ve diğer hücre tipleri. * = p < 0.05, ** p < 0.01, Mann-Whitney ARASıNDA DH ve PD. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Doğru doku işleme için gerekli kritik adımların şematik gösterimi.
Uygun doku işleme ve enkaz verimli kaldırılması için gerekli en kritik adımların bir listesi gösterilir. %30 yoğunluk degradesi üzerindeki örneklerin santrifüjünden sonra oluşan enkaz diskini (siyah ok) ve hücre peletini (mavi ok) doğru şekilde tanımlamak önemlidir. Enkaz diski, supernatant geri kalanı ile birlikte, örnek kaybını önlemek için hücre pelet sislodging olmadan aspirasyon tarafından dikkatle kaldırılmalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Antikor karışımı | Başlangıç konsantrasyonu (3g/mL) | Son konsantrasyon (3g/mL) | Seyreltme faktörü |
| anti CD45/BV510 | 200 | 2 | 100 |
| anti CD11b/APC.780 | 200 | 2 | 100 |
| anti CD31/BV421 | 200 | 2 | 100 |
| anti ACSA2/APC | 150 | 0.75 | 200 |
| anti O4/biotin | Na | Na | 40 |
| anti CD90.2/PE. Cy7 | 200 | 2 | 100 |
| Streptavidin karışımı | Başlangıç konsantrasyonu (3g/mL) | Son konsantrasyon (3g/mL) | Seyreltme faktörü |
| Streptavidin/Alexa 680 | 1000 | 1 | 1000 |
Tablo 1: Akış sitometri boyama karışımları hazırlanması için tarifi. Tablo, birden fazla hücre tipinin akış sitometrik analizlerine izin vermek için kullanılan antikor ve streptavidin konsantrasyonlarını en iyi şekilde tanımlar. Tabloda belirtilen her reaktifin katalog numaraları hakkında ayrıntılı bilgi için lütfen Malzeme Tablosu'na bakın.
| Şekil 2B İstatistikleri | ||||||||||
| BEYİn (%hücreleri) | ||||||||||
| CD45+ | CD45- | |||||||||
| Canlı | Ölü | Canlı | Ölü | |||||||
| Yöntem | Demek | ± SEM | Demek | ± SEM | Demek | ± SEM | Demek | ± SEM | ||
| Dh | 15.20 | ± 2,32 | 1.90 | ± 0,30 | 24.78 | ± 4.045 | 51.58 | ± 6.033 | ||
| Pd | 15.20 | ± 2,65 | 2.33 | ± 1.10 | 68.53 | ± 3.618 | 13.93 | ± 2.180 | ||
| Mann-Whitney | Ns | Ns | *** | ** | ||||||
| p değeri | 0.9989 | 0.738 | 0.0006 | 0.0015 | ||||||
| SPINAL CORD (% hücreler) | ||||||||||
| CD45+ | CD45- | |||||||||
| Canlı | Ölü | Canlı | Ölü | |||||||
| Yöntem | Demek | ± SEM | Demek | ± SEM | Demek | ± SEM | Demek | ± SEM | ||
| Dh | 15.00 | ± 8.21 | 1.41 | ± 0,11 | 31.64 | ± 8.21 | 51.95 | ± 16,52 | ||
| Pd | 7.49 | ± 4,99 | 1.15 | ± 0,68 | 84.27 | ± 9,39 | 7.09 | ± 3.75 | ||
| Mann-Whitney | Ns | Ns | * | Ns | ||||||
| p değeri | 0.5548 | 0.7236 | 0.0438 | 0.1144 | ||||||
| Şekil 2C İstatistikleri | |||||||||||||||||
| BEYİn (%hücreleri) | |||||||||||||||||
| CD45+ | CD45- | ||||||||||||||||
| CD11b+ | CD11b- | ACSA2 | O4 | Thy1 | CD31 | Diğer | Ölü | ||||||||||
| Yöntem | Demek | ± SEM | Demek | ± SEM | Demek | ± SEM | Demek | ± SEM | Demek | ± SEM | Demek | ± SEM | Demek | ± SEM | Demek | ± SEM | |
| Dh | 19.32 | ± 3,88 | 1.17 | ± 0,27 | 9.52 | ± 2,68 | 3.41 | ± 1,01 | 1.39 | ± 0,77 | 0.48 | ± 0,29 | 10.52 | ± 4.49 | 53.83 | ± 5,79 | |
| Pd | 10.88 | ± 2,03 | 1.65 | ± 0,48 | 8.17 | ± 2,66 | 6.54 | ± 0,76 | 6.37 | ± 1,76 | 8.27 | ± 1,25 | 33.28 | ± 6.34 | 23.72 | ± 5,31 | |
| Mann-Whitney | Ns | Ns | Ns | * | ** | *** | ** | ** | |||||||||
| p değeri | 0.1206 | 0.4819 | 0.5894 | 0.0264 | 0.0093 | 0.0003 | 0.0084 | 0.0022 | |||||||||
| SPINAL CORD (% hücreler) | |||||||||||||||||
| CD45+ | CD45- | ||||||||||||||||
| CD11b+ | CD11b- | ACSA2 | O4 | Thy1 | CD31 | Diğer | Ölü | ||||||||||
| Yöntem | Demek | ± SEM | Demek | ± SEM | Demek | ± SEM | Demek | ± SEM | Demek | ± SEM | Demek | ± SEM | Demek | ± SEM | Demek | ± SEM | |
| Dh | 21.23 | ± 6.25 | 2.51 | ± 0,57 | 4.26 | ± 2,34 | 9.40 | ± 1,89 | 2.82 | ± 1,51 | 0.97 | ± 0,50 | 22.74 | ± 9.04 | 35.28 | ± 1,89 | |
| Pd | 9.63 | ± 1,67 | 2.77 | ± 0,48 | 4.23 | ± 1,59 | 28.62 | ± 3,57 | 1.26 | ± 0,49 | 6.94 | ± 2.14 | 26.39 | ± 8.17 | 19.09 | ± 4,76 | |
| Mann-Whitney | Ns | Ns | Ns | * | Ns | * | Ns | Ns | |||||||||
| p değeri | 0.1905 | >0.9999 | 0.7302 | 0.0159 | 0.7302 | 0.0317 | 0.7302 | 0.1111 | |||||||||
Tablo 2: DH veya PD yöntemi uygulanarak alınan farklı popülasyonların istatistiksel analizi. Tablo, Şekil 2B ve Şekil 2 C'degösterilen grafiklerin istatistiklerini açıklar. En az altı bağımsız örnekten oluşan ortalama ve SEM temsil edilir. Her karşılaştırma için uygulanan istatistiksel testin p değeri ve ayrıntıları da raporlanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada fare beyni ve omurilikten en alakalı CNS hücrelerinin eş saflaştırma ve eşzamanlı akış sitometrik analizi için bir protokol açıklıyoruz. Geleneksel olarak, histolojik analizler nano tanecikleri dağılımı veya CNS viral vektörlerin transdüksiyon verimliliği tanımlamak için uygulanmıştır5,13, veya bir patoloji sırasında veya farmakolojik tedavi üzerine belirli hücre tiplerinde meydana gelen morfolojik ve moleküler değişiklikler hakkında anlayışlar sağlamak için14. Ancak histoloji de prosesiviteden yoksundır ve aynı anda analiz edilebilen belirteçsayısının sınırlı olması nedeniyle aynı histolojik örneklerde birden fazla özelliğin kapsamlı bir şekilde incelenmesine izin vermez. Yaklaşımımız geleneksel histolojik analizleri tamamlayıcı olabilir ve bireysel örneklerden elde edilebilen bilgilerin derlemesini genişletmek için çeşitli alt akım uygulamaları (sıralama, birincil kültür, biyokimyasal veya yeni nesil sıralama analizleri) ile birleşebilir. Ancak, bu yaklaşımın başarısını kritik olarak etkilenebildiklerinden, aşağıda listelenen bazı önemli faktörler göz önünde bulundurulmalıdır:
- Başlangıç dokusu miktarı. Hücre ayrılığını yarı omurilik ya da yarı beyin kadar az bir şeyle başlamak için optimize ettik. Deneyimlerimize göre, 8 haftalık yetişkin bir fareden yarım beyin veya yarım omuriliğin PD yöntemi ile işlenmesi, yoğunluk gradyan adımından sonra beyinden 1−6 x 106 canlı hücre ve omurilikten yaklaşık 0.1−0.5 x 106 canlı hücre verir. 8 haftadan küçük yenidoğan veya farelerden dokular üzerinde PH yöntemi uygulandıktan sonra hücre verimini ölçmedik. Ancak, elimizde, sonuç başlangıç dokusunun ağırlığı ile orantılıdır. Bu nedenle, genç hayvanlar için (örneğin, 10 günlük yavrular) tüm beyin veya omurilik güvenilir downstream analizleri için iyi bir hücre verimi garanti etmek için işlenmelidir. Gerekirse, birden fazla hayvan dokuları havuzlama hücre verimi artırmaya yardımcı olacaktır. Deneyimlerimize göre, bu protokol aynı zamanda başlangıç dokusunun ağırlığı başına kullanılan reaktiflerin oranına saygı duyulur gibi, sıçanların beyin veya omurilik hücreleri izole etmek için değişiklikler olmadan uygulanabilir. 250 mg'dan fazla ağırlık tanınan dokularda, reaktifleri ölçekleme veya birden fazla örnekte (her ağırlık <250 mg) doku bölünmesi önerilmektedir.
- Yoğunluk gradyan önce menenjler / artık doku parçaları çıkarma. Bizim deneyim, PH yöntemi burada açıklanan verimli menenjler veya çok yüksek miyelinli dokular sinirler ve sinir kökleri omurilik çıkan gibi sindirmek mümkün değildir. Bu dokular mevcut olduğunda, bazı sindirilmemiş yapışkan parçalar enzimatik sindirim adımlarından sonra alınan hücre süspansiyon kalabilir, enkaz kaldırma önce. Çözeltiyi 70 μm'lik hücresüzden filtreleyerek bu parçaların çıkarılması (adım 5.1'de önerildiği gibi) başarılı bir hücre hazırlığı için çok önemlidir. Aslında, kaldırılmazsa, menenjler veya doku parçaları zayıf hücre verimleri ile sonuçlanan verimli yoğunluk gradyan ayırma engelleyecektir.
- Zamanlama, sıcaklık ve kısırlık. Önerildiği gibi doğru sıcaklık ayarlarını ve kuluçkaları kullanarak tüm adımları zamanında gerçekleştirmek çok önemlidir. Bu, numunenin yüksek hücrecanlılığını ve bütünlüğünü sağlamak için çok önemlidir. Downstream uygulamasına bağlı olarak, steril bir başlık altında ve steril reaktiflerle tüm adımları gerçekleştirmek gerekli olabilir (örn. birincil hücre kültürleri oluşturmak). Enzimatik sindirim çözeltisi önerilen süre (bölüm 3) ötesinde genişletilmiş kuluçka hücre canlılığı bir damla neden olabilir. Bazı yüzey antijenlerinin epitopları papaine karşı duyarlı olabilir ve bu da akış sitometrisinde sinyal kaybına neden olabilir. Bu makalede açıklananlar dışında ek belirteçler gerektiren özel uygulamalar için, denemeye başlamadan önce farklı antikor klonların performansını test edilmesi önerilir. Bu yoğunluk gradyan orta bağışıklık hücrelerinin aktivasyonunu tetikleyebilir endotoksinlerin bazı izleri içerebilir bildirilmiştir (mikroglia / makrofajlar). Bu popülasyonlar analiz edildiğinde, prosedür tarafından indüklenen olası etkileri dışlamak için deneylere her zaman uygun iç kontroller eklenmelidir. Önerilen sıcaklıklar ve yıkama yoğunluğu gradyan orta artıkları hemen enkaz kaldırma adımı sonra yapışması genellikle açık bağışıklık hücrelerinin aktivasyonönlemek için yeterlidir. Ancak, downstream uygulamaları (örneğin, RNAseq veya fonksiyonel analizler) bu adımdan etkileniyorsa, kullanıcı düşük endotoksin yoğunluk gradyan orta preparat (Malzeme Tablosu'ndaönerilen) geçmelidir.
- FACS antikorları ve makine. Burada sunulan akış sitometri boyama protokolü, laboratuvar deneyimimizde ve enstitümüzde bulunan FACS makineleri ile alınan hücre verimleri ile en iyi şekilde çalışan antikor konsantrasyonları ve renk çekimlerinden yararlanmaktadır. Kullanıcı yeni bir deneye başlamadan önce antikorları ellerine almalıdır, çünkü konsantrasyonun biraz ayarlanması gerekebilir. Ayrıca, tüm antikorların ve FACS makinesinin kompanzasyon kurulumunun yeterli çalıştığını doğrulamak için her deneyde her zaman tek renkli boyama kontrolleri kullanmayı öneririz. Bu cd90 (THY) antijen nöronların tespit etmek için kullanılan iki farklı izotip, yani CD90.2 veya CD90.1 fare zorlanma bağlı olarak var fark edilmelidir: C57BL6/ J ekspres CD90.2 gibi en sık kullanılan fare suşları; AKR/J, PL ve FVB/N express CD90.1 gibi fare suşları. Bu nedenle, kullanıcı dikkatle fare zorlanma doğrulamak ve uygun anti-CD90 antikor (Malzeme Tablosunda önerildiği gibi) deneylerbaşlamadan önce seçmelisiniz.
Özetle, burada sunulan protokol fare beyin ve omurilik farklı hücre tiplerinin verimli eşzamanlı akış sitometrik değerlendirme sağlayan 9 renkli boyama ardından nazik bir enzimatik sindirim yararlanır. Protokol, CNS15'teuygulanan nano partiküller veya viral vektörler tarafından hücre hedeflemesinin verimliliğini akıcı ve kapsamlı bir şekilde izlemek için kullanılabilir. Ayrıca, protokol kolayca hücre tasnif, ex vivo alt kültür, tek hücreli RNAseq gibi çok hassas downstream uygulamalar için kabul edilebilir, terapötik hücre hedefleme preklinik değerlendirilmesi için değil, aynı zamanda nörodejeneratif hastalıklarda patolojik süreçlerin derinlemesine karakterizasyonu için son derece önemli sonuçlanan.
Tüm CNS hücre popülasyonunun bir kısmı bu protokol tarafından ayrımcılığa uğramaz (Bkz. Şekil 2'deki"diğer" hücre tipleri); bu, CNS'de bulunan ancak kullandığımız antikorlar tarafından yakalanmayan diğer hücre alt tiplerinin varlığı ile açıklanabilir. Bizim ön analizlerde, "diğer hücreler" fraksiyonunun yaklaşık% 14 CD73 için pozitif, bir mezenkimal hücre belirteci nörovasküle zenginleştirilmiş ve çeşitli nöroinflamatuar süreçlerde yer16,17. Ayrıca, "diğer hücreler" fraksiyonunun, nestin+ nöral kök hücreler, nestin+ vimentin+ radyal glia progenitorları, doublecortin+ nöral progenitorlar, NG2+ oligodendrocyte öncül hücreleri gibi olgunlaşmanın farklı aşamalarındaki atalar gibi daha az farklılaşmış hücrelerden oluşabileceğini varsayıyoruz. Floresan izothiocyanat (FITC) veya phycoerythrin (PE) flüorororlarla birlikte konjuge iki ek hücre belirteci nin uyumunu sağlayan floresan boyaların konfigürasyonunu seçtiğimizden, bu hücre alt tipleri akış sitometri protokolümüzü uygulayarak kolayca araştırılabilir.
Genel olarak, yaklaşımımız CNS bağlamında daha kapsamlı araştırmalar için yeni bir araç sağlayabilir (sağlık ve hastalık) hem nitel hem de yüksek iş letimatif nicel değerlendirmeler sağlayan iyi konsolide teknoloji yararlanarak akış sitometrisi gibi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Boston Çocuk Hastanesi start-up fonları a.b., ALSA hibe nr tarafından finanse edilmiştir. 17-IIP-343 M.P., ve Ödül No altında Aminotrofik Lateral Skleroz Araştırma Programı ile Sağlık İşleri Savunma Bakan Yardımcısı Ofisi. W81XWH-17-1-0036'dan M.P.'ye. Teknik destek için DFCI Flow Cytometry Core'u kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free) | Gibco | 14185-052 | |
| 70 mm Cell Strainer | Corning | 431751 | |
| ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody | Miltenyi Biotec | 130-117-535 | APC conjugated |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-1KG | |
| CD11b rat anti-mouse antibody | Invitrogen | 47-0112-82 | APC-eFluor 780 conjugated |
| CD31 rat anti-mouse antibody | BD Bioscience | 562939 | BV421 conjugated |
| CD45 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 103138 | Brilliant Violet 510 conjugated |
| CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 202518 | PE/Cy7 conjugated |
| CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody | Biolegend | 1005325 | PE/Cy7 conjugated |
| Conical Tubes (15 mL) | CellTreat | 229411 | |
| Conical Tubes (50 mL) | CellTreat | 229422 | |
| Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B) | Sigma-Aldrich | D9063-1SET | |
| Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody | BD Pharmingen | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Benchmark | 100-106 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| O4 anti mouse/rat/human antibody | Miltenyi Biotec | 130-095-895 | Biotin conjugated |
| Percoll | GE Healthcare | 10266569 | sold as not sterile reagent |
| Percoll | Sigma | 65455529 | sterile reagent (to be used for applications requiring sterility) |
| Percoll PLUS | Sigma | GE17-5445-01 | reagent containing very low traces of endotoxin |
| Streptavidin | Invitrogen | S3258 | Alexa Fluor 680 conjugated |
References
- Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. Gene therapy for neurological disorders: progress and prospects. Nature Reviews Drug Discovery. 17 (9), 641-659 (2018).
- Teleanu, D., Negut, I., Grumezescu, V., Grumezescu, A., Teleanu, R. Nanomaterials for Drug Delivery to the Central Nervous System. Nanomaterials. 9 (3), 371 (2019).
- Chen, S., et al. Recombinant Viral Vectors as Neuroscience Tools. Current Protocols in Neuroscience. 87 (1), 67 (2019).
- Alves, S., et al. Ultramicroscopy as a novel tool to unravel the tropism of AAV gene therapy vectors in the brain. Scientific Reports. 6 (1), 28272 (2016).
- Peviani, M., et al. Lentiviral vectors carrying enhancer elements of Hb9 promoter drive selective transgene expression in mouse spinal cord motor neurons. Journal of Neuroscience Methods. 205 (1), 139-147 (2012).
- Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
- Sykora, M. M., Reschke, M. Immunophenotyping of Tissue Samples Using Multicolor Flow Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1953, 253-268 (2019).
- Legroux, L., et al. An optimized method to process mouse CNS to simultaneously analyze neural cells and leukocytes by flow cytometry. Journal of Neuroscience Methods. 247, 23-31 (2015).
- Lee, J. K., Tansey, M. G. Microglia Isolation from Adult Mouse Brain. Methods in Molecular Biology. 1041, 17-23 (2013).
- Grabert, K., McColl, B. W. Isolation and Phenotyping of Adult Mouse Microglial Cells. Methods in Molecular Biology. 1784, 77-86 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 635 (2012).
- Garcia, J. A., Cardona, S. M., Cardona, A. E. Isolation and analysis of mouse microglial cells. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 1-15 (2014).
- Papa, S., et al. Selective Nanovector Mediated Treatment of Activated Proinflammatory Microglia/Macrophages in Spinal Cord Injury. ACS Nano. 7 (11), 9881-9895 (2013).
- Peviani, M., et al. Neuroprotective effects of the Sigma-1 receptor (S1R) agonist PRE-084, in a mouse model of motor neuron disease not linked to SOD1 mutation. Neurobiology of Disease. 62, 218-232 (2014).
- Peviani, M., et al. Biodegradable polymeric nanoparticles administered in the cerebrospinal fluid: Brain biodistribution, preferential internalization in microglia and implications for cell-selective drug release. Biomaterials. 209, 25-40 (2019).
- Meng, F., et al. CD73-derived adenosine controls inflammation and neurodegeneration by modulating dopamine signalling. Brain. 142 (3), 700-718 (2019).
- Nedeljkovic, N. Complex regulation of ecto-5'-nucleotidase/CD73 and A2AR-mediated adenosine signaling at neurovascular unit: A link between acute and chronic neuroinflammation. Pharmacological Research. 144, 99-115 (2019).
