Ein System zur Verfolgung der Dynamik des Verhaltens sozialer Präferenzen bei kleinen Nagetieren

Summary

Beschrieben wird hier ein neuartiges automatisiertes Experimentiersystem, das eine Alternative zum Dreikammertest bietet und auch mehrere Vorbehalte löst. Dieses System liefert mehrere Verhaltensparameter, die eine rigorose Analyse der Verhaltensdynamik kleiner Nagetiere während der sozialen Präferenz- und sozialneuheitspräferenzbegründeten Tests ermöglichen.

Abstract

Die Erforschung der neurobiologischen Mechanismen des sozialen Verhaltens erfordert Verhaltenstests, die auf Tiermodelle unvoreingenommen und beobachterunabhängig angewendet werden können. Seit Beginn des Jahrtausends wird der Dreikammertest weithin als Standardparadigma zur Bewertung der Geselligkeit (soziale Präferenz) und der sozialen Neuheitspräferenz bei kleinen Nagetieren eingesetzt. Dieser Test leidet jedoch unter mehreren Einschränkungen, einschließlich seiner Abhängigkeit von der räumlichen Navigation und der Nachlässigkeit der Verhaltensdynamik. Präsentiert und validiert hier ist ein neuartiges experimentelles System, das eine Alternative zum Dreikammertest bietet und gleichzeitig einige seiner Vorbehalte löst. Das System erfordert ein einfaches und erschwingliches Experimentelles Gerät und ein öffentlich verfügbares Open-Source-Analysesystem, das automatisch mehrere Verhaltensparameter auf individueller und Populationsebene misst und analysiert. Es ermöglicht eine detaillierte Analyse der Verhaltensdynamik kleiner Nagetiere während eines sozialen Diskriminierungstests. Wir zeigen die Effizienz des Systems bei der Analyse der Dynamik des sozialen Verhaltens während der sozialen Präferenz- und sozialen Neuheitspräferenztests, wie sie von erwachsenen männlichen Mäusen und Ratten durchgeführt werden. Darüber hinaus validieren wir die Fähigkeit des Systems, modifizierte Dynamik endendes Soziales Verhaltens bei Nagetieren nach Manipulationen wie Whisker Trimmen aufzudecken. Somit ermöglicht das System eine strenge Untersuchung des Sozialverhaltens und der Dynamik in kleinen Nagetiermodellen und unterstützt genauere Vergleiche zwischen Stämmen, Bedingungen und Behandlungen.

Introduction

Die Aufdeckung der biologischen Mechanismen, die Neuroentwicklungsstörungen (NDDs) zugrunde liegen, ist eine der größten Herausforderungen im Bereich der Neurowissenschaften¹. Um diese Herausforderung anzugehen, sind Verhaltensparadigmen und experimentelle Systeme erforderlich, die das Verhalten von Nagetieren auf standardisierte und unvoreingenommene Weise typisieren. Eine einflussreiche Studie, die vor mehr als einem Jahrzehnt von Moy und Kollegen² veröffentlicht wurde, stellte den Dreikammertest vor. Seitdem wurde dieser Test häufig verwendet, um soziales Verhalten in Nagetiermodellen von NDDs zu untersuchen. Dieser Test bewertet zwei angeborene Tendenzen von Nagetieren: 1) in der Nähe eines sozialen Reizes gegenüber einem Objekt zu bleiben (Geselligkeit, auch soziale Präferenz genannt [SP]), und 2) die Nähe eines neuartigen sozialen Stimulus einem vertrauten (soziale Neuheitspräferenz [SNP]) vorzuziehen^3,4. Mehrere nachfolgende Studien schlugen Methoden der automatisierten Analyse des Dreikammertests mit computergestützten Methoden^5,6vor.

Dieser Test leidet noch immer unter mehreren Einschränkungen. Erstens untersucht sie hauptsächlich die Präferenz des sozialen Ortes und nicht die Motivation des Subjekts, direkt mit einem sozialen Stimulus zu interagieren, obwohl einige Gruppen auch die geruchswissenschaftliche Untersuchungszeit (Schnüffelzeit) messen, entweder manuell⁷ oder mit kommerziellen computergestützten Systemen^8,9,10. Zweitens wird der Dreikammertest hauptsächlich verwendet, um die Gesamtzeit des Probanden in jeder Kammer zu messen, und er vernachlässigt die Verhaltensdynamik. Schließlich stützt sie sich nur auf einen Aspekt des sozialen Verhaltens, d. h. auf die Zeit, die das Subjekt in jeder Kammer vergibt (oder, wenn gemessen, Schnüffelzeit).

Hier präsentieren wir ein neuartiges und erschwingliches Experimentiersystem, das eine Alternative zum Dreikammerapparat ist. Es ermöglicht auch die Durchführung der gleichen Verhaltenstests bei der Lösung der oben genannten Vorbehalte. Das vorgestellte Verhaltenssystem misst automatisch und direkt das Untersuchungsverhalten eines Nagers in Richtung zweier Reize. Darüber hinaus analysiert es die Verhaltensdynamik auf beobachterunabhängige Weise. Darüber hinaus misst dieses System mehrere Verhaltensparameter und analysiert diese sowohl auf individueller als auch auf Bevölkerungsebene; Daher unterstützt es eine rigorose Analyse des Sozialverhaltens und seiner Dynamik während jedes Tests. Darüber hinaus neutralisiert die zufällige Neupositionierung der Kammern in gegenüberliegenden Ecken der Arena während der verschiedenen Testphasen alle Auswirkungen des räumlichen Gedächtnisses oder der Präferenzen. Dieses System kann auch für andere Diskriminierungstests wie Diskriminierung aufgrund des Geschlechts verwendet werden. Das kundenspezifische Gerät ist einfach herzustellen, und das Analysesystem ist öffentlich zugänglich als Open-Source-Code, wodurch es in jedem Labor verwendet wird. Wir zeigen die Fähigkeit dieses Systems, mehrere Parameter des sozialen Verhaltens in Nagetierstämmen mit unterschiedlichen Fellfarben während der sozialen Präferenz- und sozialen Neuheitspräferenztests zu messen. Wir validieren auch die Fähigkeit des Systems, modifizierte Dynamik endendes Soziales Verhaltens bei Nagetieren nach Manipulationen, wie Whisker Trimmen, aufzudecken.

TrackRodent Software: drei Algorithmen wurden in MATLAB (2014a-2019a) geschrieben, um das experimentelle Thema und seine Wechselwirkungen mit den Reizen zu verfolgen. Alle Algorithmen wurden in GitHub hinterlegt, gefunden unter . Das Hauptziel aller vier Algorithmen ist es, die Konturen des Körpers des Motivs zu verfolgen, um jeden direkten Kontakt mit den Reizbereichen zu erkennen.

Körperbasierter Algorithmus: Dieser Algorithmus hat drei Versionen, die die Konturen einer unverdrahteten dunklen Maus auf einem weißen Hintergrund (BlackMouseBodyBased), eine weiße Maus auf einem dunklen Hintergrund (WhiteMouseBodyBased) oder eine weiße Ratte auf einem dunklen Hintergrund (WhiteRatBodyBased) verfolgen. ). Die grafische Benutzeroberfläche (GUI) der Software erfordert, dass der Experimentierer ein Experiment mit Mäusen oder Ratten auswählt und dann den richtigen Code auswählt. Für jede Version des Algorithmus gibt es zwei optionale Codes: einen, der den Tracking-Prozess auf dem Bildschirm darstellt, während er die Analyse durchführt, und einen, der dies nicht tut (daher läuft er schneller und wird als "schnell" bezeichnet). Beispielsweise lauten die Namen der relevanten Codes für den BlackMouseBodyBased-Algorithmus: "BlackMouseBodyBased23_7_14" und "BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast". Alle Algorithmen, die mit "schnell" enden, zeigen das Tracking nicht online an, und Benutzer müssen die Daten direkt in der Ergebnisdatei (.mat-Datei) speichern. Alle körperbasierten Algorithmen erfordern die Festlegung eines einzelnen Schwellenwerts ("niedriger Schwellenwert" in der GUI der Software), um den Körper des Motivs zu erkennen.

Head-directionality-basierter Algorithmus: Der zweite Algorithmus, der nur für schwarze Mäuse verfügbar ist, basiert auf dem körperbasierten Algorithmus, zusätzlich zur Bestimmung der Kopfrichtung. Dieser Algorithmus erkennt die Wechselwirkungen des Kopfes des Subjekts mit den "Reizen" Bereichen und vermeidet so falsche Positivmeldungen, die aus zufälligen Kontakten des Subjekts' mit diesen Bereichen entstehen können. Für diesen Algorithmus werden zwei Erkennungsschwellen für Mauskörperkonturen definiert: hohe Schwelle, die den helleren Schwanz schwarzer Mäuse einschließt, und niedrige Schwelle, die den Körper ohne Schwanz einschließt. Danach passt der Algorithmus ein Ellipsoid mit dem unteren Schwellenwert an die erkannten Grenzen an und definiert die Position von Mauskopf und Schwanz (ohne Unterschied zwischen den beiden). Die endgültige Diskriminierung zwischen Schwanz und Kopf basiert auf den Grenzen, die durch die höhere Schwelle definiert werden.

Verdrahteter Tieralgorithmus: Der dritte Algorithmus zielt darauf ab, Artefakte zu minimieren, die aus Kabeln (d. h. elektrischem Draht oder Glasfaser) stammen, die mit dem Tier verbunden sind, und ermöglicht eine Analyse des Verhaltens des Tieres, während es mit einem Kabel verbunden ist. Dieser Algorithmus hat Codes nur für schwarze Mäuse und weiße Ratten. Der Code für Ratten erfordert, dass der Experimentator sowohl niedrige als auch hohe Schwellenwerte definiert, während der Mauscode nur einen niedrigen Schwellenwert erfordert.

Protocol

Alle beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Universität Haifa genehmigt.

1. Versuchsaufbau

1. Arena
   1. Konstruieren Sie die Versuchsarena für Mäuse(Abbildung 1A,D) durch Platzieren einer weißen oder schwarzen (je nach Tierfarbe) Plexiglasbox (37 cm x 22 cm x 35 cm) in der Mitte einer Akustikkammer (60 cm x 65 cm x 80 cm, innen mit 2 cm dickem Schaumstoff beschichtetem Holz). Für das Licht, entfernen Sie einen Streifen (2 cm breit, 10 cm unter der Decke der Kammer) des Schaums um die Akustikkammer (neben der Tür), und befestigen Sie einen LED-Streifen mit entweder roten oder weißen Glühbirnen. Stellen Sie sicher, dass das Licht so gleichmäßig wie möglich um die Arena herum ist, um Reflexionen zu verhindern.
   2. Konstruieren Sie die Arena für Ratten ähnlich der oben beschriebenen für Mäuse, mit unterschiedlichen Abmessungen, die der Größe von Sprague-Dawley (SD) Ratten angemessen entsprechen (Abbildung 1G). Legen Sie eine schwarze Plexiglasbox (50 cm x 50 cm x 40 cm) in die Mitte einer Akustikkammer (90 cm x 60 cm x 85 cm, innen mit 2 cm dickem Schaumstoff beschichtet) aus 2 cm dickem Holz.
2. Kammern
   1. Für Mäuse, erstellen Sie zwei schwarze oder weiße (je nach Fellfarbe) dreieckige Kammern (12 cm Isosceles, 35 cm Höhe, mit geschlossenen Böden) aus 6 mm dickem Plexiglas. Suchen Sie sie in zwei zufällig ausgewählten gegenüberliegenden Ecken der Arena (Abbildung 1B,E). Kleben Sie ein Metallgitter (18 mm x 6 cm; 1 cm x 1 cm Löcher) im unteren Teil jeder Kammer mit Epoxidkleber, um direkte Wechselwirkungen mit dem Stimulus durch das Netz zu ermöglichen (Abbildung 1C,F). Markieren Sie jede Kammer in einer Weise, die Diskriminierung von den anderen in einem Video zulässt, ohne den Probanden Hinweise zu geben (Beispiele siehe Abbildung 1B,E).
      HINWEIS: Jede Kammer wird schließlich einen sozialen Reiz (Maus) oder Eintauffindet (Plastikspielzeug, 5 cm x 5 cm x 5 cm, mit einer ausgeprägten Form und Farbe; Abbildung 1C,I Einläufe). Lassen Sie den Epoxid-Kleber für mindestens eine Woche vor Gebrauch verdampfen.
   2. Für Ratten, erstellen Sie zwei schwarze dreieckige Kammern (20,5 cm Isosceles, 40 cm Höhe, aus 6 mm dickem Plexiglas, mit geschlossenen Böden) und legen Sie sie in zwei zufällig ausgewählte gegenüberliegende Ecken der Arena(Abbildung 1H), jeweils mit einem Metallgitter (25 cm x 7 cm; 2,5 cm x 1 cm Löcher) bedeckt seinen unteren Teil (Abbildung 1I).
3. Platzieren Sie eine hochwertige monochromatische Kamera, die mit einem Weitwinkelobjektiv ausgestattet ist, an der Spitze der Akustikkammer und schließen Sie sie an einen Computer an, um eine klare Betrachtung und Aufzeichnung des Verhaltens des Motivs mit kommerzieller Software zu ermöglichen (siehe Tabelle der Materialien für Vorschläge).

2. Verhaltensparadigma

HINWEIS: Die Schritte 2.1-2.7 beschreiben das Verhaltensparadigma für Mäuse. Siehe Abschnitt 2.8 für spezifische Anweisungen, an denen Ratten beteiligt sind.

1. Stellen Sie sicher, dass die Käfige aller Tiere (Themen: 2-4 Monate alte männliche Mäuse; Reize: 21-30 Tage alte Jungmäuse) mindestens 1 h im Versuchsraum verbleiben, bevor Sie mit dem Verhaltensexperiment beginnen.
2. Legen Sie nach der Akklimatisierungszeit zwei leere Kammern zufällig an zwei gegenüberliegenden Ecken in die Arena ein. Platzieren Sie das Thema in der Mitte der Arena für 15 min der Gewöhnung. Während dieser Zeit, stellen Sie die beiden sozialen Reize, jeder in einer anderen Kammer asortatabefindet sich für die Gewöhnung. Legen Sie ein Objekt (ein Plastikspielzeug, 5 cm x 5 cm x 5 cm, mit einer deutlichen Form und Farbe) in eine andere Kammer.
3. Um den SP-Test (Social Preference) durchzuführen, starten Sie die Videoaufzeichnung und führen Sie die Aufzeichnung bis zum Ende des Tests auf.
4. Entfernen Sie die beiden leeren Kammern und fügen Sie sofort das Objekt und einen der sozialen Reize, jeweils in einer eigenen Kammer. Finden Sie diese Kammern zufällig in den gegenüberliegenden Ecken der Arena, die während der Gewöhnung leer waren. Lassen Sie das Subjekt mit den Reizen für die 5 min des SP-Tests interagieren. Beenden Sie am Ende des Tests die Aufzeichnung.
5. Nach dem SP-Test die Reize-haltigen Kammern aus der Arena entfernen und das Motiv 15 min in der leeren Arena lassen. Reinigen Sie die Kammern von außen mit 10% Ethanoltüchern.
6. Um den Social Novelty Preference (SNP)-Test durchzuführen, starten Sie die Videoaufzeichnung und fügen Sie zwei Kammern in die Arena ein: eine mit dem gleichen sozialen Stimulus, die für den SP-Test verwendet wird (vertrauter Stimulus), und die andere enthält den neuartigen sozialen Reiz. Platzieren Sie diese Kammern nach dem Zufallsprinzip in zwei gegenüberliegenden Ecken der Arena, um sicherzustellen, dass diese Standorte nicht für den SP-Test verwendet wurden. Lassen Sie das Subjekt mit den Reizen für die 5 min des SNP-Tests interagieren.
7. Beenden Sie am Ende des SNP-Tests die Videoaufzeichnung, entfernen Sie das Motiv und die Kammern aus der Arena, und legen Sie das Motiv wieder in den heimischen Käfig. Lassen Sie die Reize in den Kammern für das nächste Experiment (mit einem anderen Thema) oder bringen Sie sie in ihre heimischen Käfige zurück. Reinigen Sie die Arena und die Kammern mit fließendem Wasser, gefolgt von 10% Ethanol und lassen Sie es trocknen.
8. Verhaltensparadigma für Ratten
   1. Für Ratten, wiederholen Sie das Verhaltensparadigma in den Schritten 2.1-2.7 beschrieben, mit zwei Modifikationen: 1) behandeln die Ratten subjekte und habituate die sozialen Reize zu den Kammern für 2 Tage (10 min jeden Tag) vor dem Experiment; und 2) den SP-Test um 15 min verlängern, um den Ratten eine längere Expositionsdauer gegenüber sozialen Reizen zu geben. Beschränken Sie später die Analyse des SP-Tests auf die anfänglichen 5 min.
      HINWEIS: Mindestens eine Arena und fünf Kammern werden benötigt, um eine einzige Sitzung durchzuführen.

3. Verwenden der TrackRodent-GUI für die Verhaltensanalyse

HINWEIS: Siehe das obere Panel von Abbildung 2A für die TrackRodent GUI.

1. Öffnen Sie MATLAB (getestet mit 2014a-2019a) und wählen Sie den Ordner TrackRodent.
2. Fügen Sie alle Unterordner zum Arbeitspfad hinzu, indem Sie mit der rechten Maustaste auf jeden Ordner klicken und Zum Pfad hinzufügen | Ausgewählte Ordner und Unterordner.
3. Geben Sie TrackRodent in das Befehlsfenster ein und drücken Sie die Eingabetaste.
4. Laden Sie eine einzelne Datei oder mehrere Videodateien (AVI- oder MP4-Format) hoch, indem Sie Sitzungsdatei laden (AVI) auswählen.
5. Ein Filminspektor, der die Überprüfung des Videoclips Frame für Frame ermöglicht, wird sofort für die erste Datei in der Liste geöffnet (Abbildung 2A). Verwenden Sie ihn, um den Videoclip zu untersuchen und den ersten und letzten Frame des zu analysierenden Segments zu definieren. Zeichnen Sie die Anzahl dieser Frames auf, die später benötigt werden. Schließen Sie das Fenster, wenn Sie fertig sind.
6. Um zusätzliche Videodateien zu überprüfen, öffnen Sie den Videoinspektor jederzeit, indem Sie Film prüfen und eine bestimmte Videodatei auswählen.
7. Wählen Sie die getestete Art (Maus oder Ratte; Maus ist die Standardeinstellung).
8. Schließen Sie alle Bereiche aus, die die Verfolgung unterbrechen können, in Übereinstimmung mit den Farben des Motivs und der Arena (schwarz oder weiß).
   1. Um einen bestimmten Bereich auszuschließen, drücken Sie Bereich ausschließen, und markieren Sie nach dem Wechsel des Cursors in eine Kreuzform alle Ecken des Bereichs für den Ausschluss. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Maus, und doppelklicken Sie dann mit der linken Maustaste auf die Mitte des markierten Bereichs. Der ausgeschlossene Bereich wird zu einem Rotton auf dem Bildschirm. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um so viele Bereiche wie erforderlich auszuschließen.
9. Um einen Bereich aus dem Ausschluss zu entfernen, drücken Sie Ausgeschlossener Bereich entfernen, und klicken Sie dann (mit dem gekreuzten Cursor) auf den Bereich, der aus dem Ausschluss entfernt werden soll.
10. Um jede Kammer als "Stimulus"-Bereich zu definieren, wählen Sie zur automatischen Erkennung ihrer Untersuchung durch das Subjekt die Form des "Stimulus"-Bereichs aus, der entweder polygon- oder elliptisch sein soll, indem Sie das entsprechende Kästchen aktivieren und dann Stimulus X drücken (wobei "X" 1, 2 oder 3 darstellt). Markieren Sie die "Stimulus"-Bereiche ähnlich wie die ausgeschlossenen Bereiche, die dann gelb werden. Um die Position eines bestimmten Stimulusbereichs zu ändern, drücken Sie erneut Stimulus X und markieren Sie die neue Bereichsposition (dies aktualisiert automatisch die Position).
    HINWEIS: Wählen Sie die unterschiedliche Reizzahl in konsistenter Weise für alle Dateien aus (d. h. Objekt als Stimulus 1 für alle SP-Testdateien).
11. Um das Vorhandensein des Motivs in einem bestimmten virtuellen Fach innerhalb der Arena zu verfolgen, wählen Sie die Form des "Fachbereichs" (Polygon oder ellipsiver) und drücken Sie dann Fach X (wobei "X" 1, 2, 3, 4 oder 5 darstellt). Markieren Sie die "Abteilbereiche" ähnlich wie die ausgeschlossenen oder Reizbereiche, die dann blau in der Farbe werden. Um die Position eines bestimmten "Fachbereichs" zu ändern, drücken Sie erneut Fach X und markieren Sie die neue Bereichsposition (dadurch wird die Position automatisch aktualisiert).
12. Wählen Sie den gewünschten Algorithmus (BlackMouseBodyBased wurde für das Video verwendet) aus der Liste aus (siehe verfügbare Algorithmen in Abbildung 2B).
13. Schreiben Sie die Zahlen der Start- und Endframes für die Analyse in die entsprechenden Bearbeitungsfelder der GUI.
14. Wählen Sie einen Schwellenwert für die Erkennung des Subjektkörpers aus.
    HINWEIS: Die meisten Algorithmen verwenden nur den Schwellenwert "Niedrig", während die algorithmen für die Kopfrichtung ebenfalls den Schwellenwert "Hoch" verwenden. Wählen Sie für die "Niedrige" Schwelle eine Ebene aus, die den Maus-/Rattenkörper ohne Schwanz (so weit wie möglich) enthält, während die "Hohe" Schwelle auch den Schwanz enthalten sollte. Im Falle der Verwendung von Kopfrichtungsbasierten Algorithmen bestimmt die Software die Kopfposition als gegenüber der Schwanzposition.
    HINWEIS: Die Software ignoriert später kleine Objekte, die mit dem gewählten Schwellenwert erkannt werden.
15. Um die automatische Erkennung der Subjektgrenzen für einen bestimmten Schwellenwert auszuwerten, fügen Sie einen Wert in das entsprechende Schwellenwertfeld ein, und drücken Sie auf der Tastatur die Eingabetaste.
16. Wenn Sie mehrere Dateien auswählen, wechseln Sie zur nächsten Datei (mit der Schaltfläche Weiter oben) und wählen Sie die entsprechenden Definitionen für jede Datei aus. Überprüfen Sie nach Abschluss der Parameter und Bereichsspeicherorte für alle Dateien, indem Sie zwischen den einzelnen Dateien wechseln, indem Sie die Schaltflächen "Vorherige" und "Weiter" oben in der GUI verwenden.
    HINWEIS: Die Definitionen aller Bereiche und Parameter sind spezifisch für eine bestimmte Datei.
17. Um die Verhaltensanalyse aller ausgewählten Dateien zu starten, wechseln Sie zur ersten Datei, und drücken Sie Start.
18. Am Ende der Analyse wird für jeden Film im selben Verzeichnis der Filmdateien eine Ergebnisdatei (.mat-Datei) gespeichert.
    HINWEIS: Wenn die langsame (nicht schnelle) Version des Algorithmus verwendet wird, wird auch eine Version des Films mit einem weißen Kreuz des Mittelpunkts der Körpermasse gespeichert, das seine Farbe jeden Frame ändert, der als Untersuchung erkannt wird, es sei denn, der Schaltfläche "Analysieren analysierter Film" der GUI ist deaktiviert. Diese Version des Films (gespeichert im selben Verzeichnis, mit dem gleichen Namen wie der Originalfilm, mit dem Suffix 'analysierter Film') kann offline verwendet werden, um die Qualität der automatischen Erkennung durch das System zu bewerten.

4. Verwenden der TrackRodent GUI für die Ergebnispräsentation

HINWEIS: Die Ergebnispräsentation finden Sie im unteren Bereich von Abbildung 2A.

1. Um die Ergebnisse jeder Filmdatei zu überprüfen, drücken Sie die Datei Ergebnisse laden, und wählen Sie die .mat-Dateien aus, die von der Verhaltensanalyse generiert wurden.
2. Wechseln Sie zwischen den Umschaltflächen, um auf dem Bildschirm eine der folgenden Analysen zu untersuchen: Mauspositionsablauf (Abbildung 2A); Fächer Besetzung entlang sitzungsbetätigt (wenn "Kompartimente" definiert wurden, nicht angezeigt); Stimuli-Exploration entlang der Sitzung (Abbildung 2C); Gesamtzeit in Fächern (wenn "Kompartimente" definiert wurden, nicht angezeigt); und Gesamtreize Explorationszeit (Abbildung 2D).
   HINWEIS: "Stimulus"-Bereiche sind Bereiche, in denen die Software die Interaktion zwischen den Themen bewertet, während "Compartment"-Bereiche Bereiche sind, in denen die Software das Vorhandensein des Subjekts nachverfolgt. Wenn Sie die Analyse mit der Schaltfläche Analyse beenden beenden, werden die bis zum zuletzt analysierten Frame generierten Ergebnisse automatisch gespeichert. Für die meisten Computer sollte es möglich sein, bis zu 20 Filme gleichzeitig hochzuladen und zu analysieren (abhängig von der Computerleistung).

5. Verwenden der TrackRodentPopulationSummary GUI für die Bevölkerungsanalyse (Abbildung 2E)

1. Öffnen Sie MATLAB (getestet mit 2014a-2019a) und wählen Sie den Ordner TrackRodent.
2. Geben Sie TrackRodentPopulationSummary in das Befehlsfenster ein, und drücken Sie die Eingabetaste.
3. Laden Sie mehrere TrackRodent-Ergebnisdateien (.mat-Format) hoch, indem Sie Ergebnisdateien auswählendrücken.
4. Geben Sie die Zahlen des letzten Frames für die Analyse, Testname, Stimulus 1 Nameund Stimulus 2 Nameein.
5. Wählen Sie die gewünschten Analysen aus der Liste der optionalen Analysen aus, indem Sie alle entsprechenden Kästchen aktivieren.
6. Wählen Sie die Ergebnisse in ein Speadsheet exportieren aus, indem Sie das entsprechende Kontrollkästchen aktivieren, um alle Ergebnisse der überprüften Analysen als eine einzelne Tabellenkalkulationsdatei zu extrahieren.
7. Drücken Sie Start, und warten Sie, bis die Analyse abgeschlossen ist.
   HINWEIS: Damit ist die Analyse abgeschlossen. Die Software kann verwendet werden, um die Ergebnisse von so vielen Filmdateien wie gewünscht zu analysieren, da sie alle verhaltensauffällig mit der TrackRodent Software analysiert wurden. Die von der Software durchgeführte Analyse geht von einer Videoaufzeichnung mit einer Bildrate von 30 Hz aus. Wenn eine andere Bildrate verwendet wurde, multiplizieren Sie die Zeit mit 30 und dividieren Sie durch die Bildrate, die für die Aufnahme verwendet wird, um sie in den richtigen Wert (s) zu konvertieren.

Representative Results

Verwendung des Systems für den Sozialpräferenztest bei C57BL/6J-Mäusen
Abbildung 1 zeigt drei Versionen des Versuchsaufbaus. Die erste Version (Abbildung 1A-C) ist für Mäuse mit dunklen Fellfarben, wie C57BL/6J Mäuse, konzipiert. Die zweite (Abbildung 1D-F) ist für Mäuse mit hellen Fellfarben geplant, wie BALB/c oder ICR (CD-1) Mäuse. Die dritte ist größer(Abbildung 1G-I) und für Ratten mit hellen Fellfarben, wie SD-Ratten, konzipiert. Die ersten untersuchten Probanden waren naive Erwachsene (8-12 Wochen alt), Gruppenuntergebracht (zwei bis fünf Tiere pro Käfig) männliche C57BL/6J-Mäuse. Soziale Reize waren jung (21-30 Tage alt), Gruppenuntergebracht (zwei bis sechs Tiere pro Käfig), männliche C57BL/6J Mäuse. Objektreize waren geruchloses Plastikspielzeug mit unterschiedlichen Farben (Eingaben in Abbildung 1C,I). Videodateien der Experimente wurden mit der TrackRodent-Software (körperbasierter Algorithmus, siehe Beispiel bildbild und GUI in Abbildung 2A) analysiert, die automatisch und kontinuierlich die Betreffposition basierend auf 1) Körperzentrum und 2) den Kontakt ihrer Körperkonturen mit den Reizen-haltigen Kammern nachverfolgt.

Die Analyse umfasste die folgenden Verfahren. Nach dem Hochladen einer Filmdatei und der grafischen Definition von Bereichen, die von der Analyse ausgeschlossen werden sollen, definierte der Experimentator zwei Bereiche, die jeweils eine eigene Kammer umfasst, grafisch als "Stimuli"(Abbildung 2A, gelbliche Bereiche). Benutzer können auch bis zu fünf Bereiche als virtuelle "Abteilungen" definieren. Dann wählen benutzer den "BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast"-Algorithmus aus der Liste der möglichen Algorithmen (Abbildung 2B). Nach Dem Drücken der Startanalyse-Taste verfolgte die Software die Tierposition Frame für Frame und stellte die Mauspositionsspur in der Arena dar(Abbildung 2A, blaue Linie). Während dieser Analyse verfolgte die Software auch Kontakte zwischen den "Reizbereichen" und der Körperkontur des Motivs (Abbildung 2C). Solche Kontaktereignisse wurden als Untersuchung definiert und dienten der Berechnung der Untersuchungszeit für jeden Stimulus und der Zeit, in der kein Untersuchungsverhalten angezeigt wurde (Abbildung 2D). Wie in Abbildung 2C,D, die den analysierten Film zeigt, deutlich wird, wurde eine höhere Untersuchungszeit für "Stimulus 2" beobachtet, die der soziale Reiz war, verglichen mit dem Objekt, das in diesem Fall als "Stimulus 1" definiert wurde.

Populationsanalyse des Sozialpräferenztests bei C57BL/6J-Mäusen
Nachdem die TrackRodent-Software alle Videodateien der experimentellen Gruppe analysieren konnte, wurde eine Bevölkerungsanalyse für diese Gruppe mit der GUI "TrackRodentPopulationSummary" (Abbildung 2E) durchgeführt, wobei alle möglichen Analysen dieser Software ausgewählt wurden. Die unterschiedlichen Ergebnisse dieser Analysen für den SP-Test mit 58 C57BL/6J erwachsenen männlichen Mäusen sind in Abbildung 3dargestellt, genau so, wie sie auf dem Computerbildschirm erschienen sind, wobei alle Fehlerbalken SEM darstellen. Statistische Analysen dieser Ergebnisse wurden zuvor veröffentlicht¹¹.

Die durchschnittliche Gesamtuntersuchungszeit der Bevölkerung der Probanden zu jedem der beiden Reize (gleichgeschlechtliche jugendliche soziale Reize und ein Objekt) ist in Abbildung 3Adargestellt, die eine klare Präferenz des Subjekts gegenüber dem sozialen Reiz darstellt. Obwohl der Algorithmus einfach ist, wurde eine ausgezeichnete Korrelation beobachtet (r² = 0,91, p < 10^-6, Pearsons Korrelation) zwischen der Untersuchungszeit, die manuell von einem geschulten Beobachter gemessen wurde, und dem von der Software berechneten Wert. Die Dynamik dieser Präferenz kann in Abbildung 3Bdargestellt werden, in der die mittlere Untersuchungszeit für jeden Stimulus entlang der Zeit in 20 s Behältern dargestellt wird. Wie sich gezeigt hat, wird die soziale Präferenz von den Probanden während der gesamten Sitzung beibehalten, obwohl sie in frühen Stadien etwas stärker schien.

Abbildung 3C zeigt die Untersuchungszeit für jeden Stimulus, kategorisiert nach Bout-Dauer in kurze (ca. 6 s), mittlere (>6 s, 19 s) und lange (>19 s) Kämpfe, zusammen mit der gesamten Untersuchungszeit. Die Verteilung der Untersuchungszeit für jeden Stimulus nach Bout-Dauer in 1 s Behältern ist in Abbildung 3Ddargestellt. Wie in Abbildung 3C,Ddargestellt, gab es keinen Unterschied zwischen Reizen in den kurzen Kämpfen, während die mittleren und langen Kämpfe klare soziale Präferenzen zeigten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass bei C57BL/6J-Mäusen kurze Kämpfe Neugier deute, während lange Kämpfe eine Wechselwirkung zwischen dem Subjekt und Reizen widerspiegeln. Die relative Dauer der Untersuchung (FEI, [Social-Objekt]/[Social+Objekt]) Werte für jede Kategorie (kurze, mittlere und lange Anfälle) sowie für die gesamte Untersuchungszeit sind in Abbildung 3Edargestellt. Wie gezeigt, wird der höchste FEI-Wert mit den langen Kämpfen erreicht, was darauf hindeutet, dass sie die sozialen Präferenzen der Probanden am besten widerspiegeln.

Um die Dynamik des Untersuchungskampfes während des Tests zu analysieren, wurden Verteilungen im Zeitverlauf für jede Kategorie separat dargestellt. Die Verteilungen im Zeitverlauf der kurzen (Abbildung 3F) und mittleren (Abbildung 3G) Untersuchungskämpfe deuten auf eine allmähliche Verringerung dieser Kämpfe im Laufe der Zeit hin. Im Gegensatz dazu zeigt eine ähnliche Analyse der langen Bouts (Abbildung 3H) einen allmählichen Anstieg im Verlauf des Tests. Diese Tendenz spiegelt sich auch in der Verteilung der mittleren Kampfdauer wider (Abbildung 3I), die eine allmähliche Zunahme im Laufe der Zeit zeigt. So scheint es, als ob die Probanden Neugier vor allem in den frühen Stadien des Tests zeigten, während sie später mehr Interaktionen mit den Reizen zeigten. Es sollte beachtet werden, dass in der letzten Minute eine inhärente Verzerrung der Analyse in Richtung kurzer Kämpfe besteht, da lange Kämpfe am Ende der Sitzung künstlich beendet wurden. Daher sollte bei der Betrachtung des Zeitverlaufs der Ermittlungskämpfe die letzte Minute ignoriert werden.

Wir analysierten auch die Intervalle zwischen aufeinanderfolgenden Untersuchungskämpfen in Richtung des gleichen Stimulus (d. h. die Zeit, die das Subjekt benötigte, um nach dem Ende jedes Untersuchungskampfes wieder zum gleichen Stimulus zurückzukehren). Dieser Parameter spiegelt den Drang des Subjekts wider, zum gleichen Stimulus zurückzukehren und zu untersuchen. Hier wurden die Intervalle auch in kurze (5 s), mittlere (>5 s, 20 s) und lange (>20 s) Kämpfe kategorisiert, die zusammen mit den Gesamtzeitintervallen für jeden Stimulus in Abbildung 3Jangezeigt werden. Das Histogramm der Intervalle in 1 s Abschnitten in Abbildung 3Kdargestellt . Wie in Abbildung 3J,Kdargestellt, waren die Intervalle zwischen den Untersuchungen des sozialen Stimulus viel kürzer als die zwischen den Untersuchungen des Objekts. Dementsprechend ergaben die FEI-Werte der Intervalle im Fernbereich den höchsten absoluten Wert (Abbildung 3L); daher können sie als eine zeitunabhängige investigative Variable verwendet werden, die die sozialen Präferenzen bewertet. Die Verteilungen über den Zeitraum der für jede Kategorie getrennt dargestellten Intervalle (Abbildung 3M-O) deuten auf eine allmähliche Verringerung der kurzen und mittleren Intervalle und eine entgegengesetzte Änderung der langen Intervalle zwischen den Untersuchungskämpfen hin, die höchstwahrscheinlich die allgemeine Verlängerung der Untersuchungskämpfe widerspiegeln. Ähnlich wie bei der Verteilung von Untersuchungskämpfen ist die letzte Minute der Intervalle auf kurze Werte ausgerichtet und sollte ignoriert werden.

Wir analysierten auch die Übergänge, die bei Probanden von einem Stimulus zum anderen beobachtet wurden. Dieses Diagramm wird in Abbildung 3Pangezeigt, bei dem jeder Zeitpunkt, zu dem das Subjekt mit der Untersuchung eines neuen Stimulus begann, durch einen blauen Punkt markiert ist, jede Zeile ein eigenes Motiv darstellt und die rote Linie die mittlere Übergangsrate darstellt. Wie sich herausstellte, war die Übergangsrate während der ersten 2 min des Tests am höchsten (1,5 Übergänge/min) und wurde allmählich auf weniger als 50 % des Peaks reduziert. Die gleiche Tendenz ergibt sich aus der Verteilung der mittleren Übergangsrate im Zeitverlauf (Abbildung 3Q).

Schließlich werden Heatmaps von Untersuchungskämpfen in Richtung des sozialen Stimulus (Abbildung 3R ) und Objekt (Abbildung 3S) während des Tests für jedes Probanden gezeigt, wobei die Farben die Dauer des Kampfes markieren (Abbildung 3S). Insgesamt deuten die Ergebnisse darauf hin, dass bei C57Bl/6J-Mäusen der SP-Test grob in eine frühe Sondierungsphase (gekennzeichnet durch eine hohe Übergangsrate und kurze Untersuchungskämpfe) und eine späte Interaktionsphase (gekennzeichnet durch niedrige Übergangsrate und lange Untersuchungskämpfe) unterteilt ist.

Populationsanalyse des Sozialneuheitspräferenztests bei SD-Ratten
Abbildung 4 zeigt die gleiche Analyse wie oben für den SNP-Test, der von 59 SD-Ratten durchgeführt wurde. In der Regel ist die Präferenz von roman vs. vertraute soziale Reize sind schwächer als die Bevorzugung zu einem neuartigen sozialen Stimulus vs. ein Objekt, das von Mäusen im SP-Test ausgestellt wurde (Abbildung 3). Dennoch spiegelt sich die soziale Neuheitspräferenz deutlich in allen Parametern wider. Wie oben aus dem SP-Test bei Mäusen festgestellt, sind die langen Untersuchungskämpfe und langen Intervalle die Parameter, die am deutlichsten Unterschiede zwischen den Reizen aufweisen, wie sie sich in ihren höchsten absoluten FEI-Werten widerspiegeln(Abbildung 4E,L; es sei darauf hingewiesen, dass FEI-Werte für den SNP-Test als [familiar-novel]/[familiar+novel] definiert sind).

Verlust von Schnurrhaaren beeinträchtigt soziale Präferenz sowohl bei C57BL/6J-Mäusen als auch bei SD-Ratten
Um die Auswirkungen somatosensorischer Manipulation auf die Dynamik des Sozialverhaltens zu bewerten, wurde eine Analyse des SP-Tests durchgeführt, der von 29 C57BL/6J-Mäusen und 33 SD-Ratten nach Whisker-Trimmen (3-7 Tage vor dem Test durchgeführt) durchgeführt wurde. Dann wurden diese Ergebnisse mit Kontrolltieren verglichen. Wie in Abbildung 5A-Fdargestellt, bevorzugten die mit Schnurrhaaren beschnittenen Mäuse nicht den sozialen Reiz gegenüber dem Objekt, was sich in der fehlenden Differenz der Untersuchungszeit zwischen den beiden Reizen (vergleiche Abbildung 5A mit Abbildung 5D) und dem Verlust langer Untersuchungskämpfe in Richtung sozialer Reize widerspiegelt (vergleiche Abbildung 5B mit Abbildung 5E). Interessanterweise zeigten die mit Schnurrhaaren beschnittenen Mäuse auch erhöhte Übergangsraten im Vergleich zu Kontrollmäusen (vergleiche Abbildung 5C mit Abbildung 5F).

Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass schnurrbeschnittene Mäuse die Dauer ihrer Wechselwirkungen mit dem sozialen Reiz deutlich reduziert haben. Im Gegensatz zu Mäusen haben schnurrbeschnittene Ratten ihre sozialen Vorlieben nicht verloren(Abbildung 5G-L). Sie änderten jedoch ihr Verhalten in der ersten Minute des Tests erheblich, wenn sie weniger lange Untersuchungskämpfe hatten (vergleiche Abbildung 5H mit Abbildung 5K) und viele weitere Übergänge (vergleiche Abbildung 5I mit Abbildung 5L). So veränderte das Whisker-Trimmen das Verhalten von Ratten und Mäusen im SP-Test signifikant, allerdings auf sehr unterschiedliche Weise zwischen den beiden Arten. Diese Ergebnisse deuten auf eine eindeutige Rolle bei der Schnurrbart-abhängigen somatosensorischen Stimulation in sozialen Interaktionen von Ratten und Mäusen hin.

Abbildung 1: Versuchsaufbau. (A) Eine schematische Darstellung der Versuchsarena für Mäuse mit schwarzem Fell. (B) Ein Bild der Arena von oben, mit dim rotem Licht, zeigt eine C57BL/6J Thema Maus in der Arena. (C) Ein Bild, das den vernetzten Bereich einer weißen Kammer zeigt, durch den das Subjekt mit einem Stimulus interagiert (Einset: ein Bild eines Objektreizes, das für Mäuse verwendet wird). (D-F) Wie in den Paneelen A-C gezeigt, eine experimentelle Arena und Kammern für Mäuse mit hellem Fell entwickelt. (G-I) Wie in den Panels A-C gezeigt, eine experimentelle Arena und Kammern für Ratten mit hellem Fell (in [I]: Bild eines Objektstimulus für Ratten verwendet). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: TrackRodent-Software. (A) Ein Bildschirm eines Computers, auf dem die TrackRodent-Software ausgeführt wird. Links: das Videobild zu Beginn des analysierten Films (erster vom Experimentator ausgewählter Frame), das die beschrifteten "Reize"-Bereiche und den verfolgten Bewegungspfad des C57BL/6J-Themas zeigt. Rechts: die Software-GUI. (B) Die Liste der optionalen Codes der Software, die mit der GUI verwendet werden soll. Jeder dieser Codes passt zu einem eindeutigen experimentellen Zustand. (C) Die Analyse des spezifischen Experiments in Panel A, wenn die Option der Stimuli-Exploration entlang der Sitzung im Abschnitt Ergebnisse Präsentation der GUI ausgewählt wurde. Diese Darstellung zeigt (bei jedem Frame), ob das Motiv mit "Stimulus 1" oder "Stimulus 2" in Kontakt war. Im vorliegenden Fall zeigt sich eine klare Präferenz gegenüber "Stimulus 2" in der höheren Anzahl und Dauer der Untersuchungskämpfe, die in Diesem Stimulus festgestellt wurden. (D) Die Analyse des Experiments in den Panels A und C, wenn die Option der Gesamtstimuli Explorationszeit im Abschnitt Ergebnisse Präsentation der GUI ausgewählt wurde. Auch hier zeigt sich eine klare Präferenz gegenüber "Stimulus 2" aus der höheren Untersuchungszeit gegenüber diesem Stimulus. (E) Die GUI der TrackRodentPopulationSummary-Software, die die Analyse und Darstellung der Ergebnisse einer Tierpopulation ermöglicht, die jeweils mit der TrackRodent-Software analysiert wird (siehe Abbildung 3 für die Ergebnisse einer solchen Analyse). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Analysieren des Untersuchungsverhaltens von C57BL/6J-Mäusen während des SP-Tests mit der TrackRodent-Software. Diese Abbildung zeigt die verschiedenen Diagramme aller optionalen Analysen der Software TrackRodentPopulationSummary (Abbildung 2E), die für eine Population von 58 C57BL/6J erwachsenen männlichen Mäusen verwendet werden, die den SP-Test durchführen. Die verschiedenen Plots werden in einer ähnlichen Reihenfolge und Weise angezeigt, wie sie auf dem Computerbildschirm angezeigt wurden (siehe Abschnitt der repräsentativen Ergebnisse für eine detaillierte Erklärung der einzelnen Diagramme). (A) Gesamtzeit der Reizuntersuchung, (B) Untersuchung von Stimuli entlang der Zeit, (C) Kurze vs. lange Anfälle - Gesamtzeit, (D) 1s bin Histogramm der Bouts, (E) Kurze vs. lange Bouts - RDI, (F) <6 s Kämpfe entlang der Zeit, (G) 6-19 s Kämpfe entlang der Zeit, (H) >19 s Kämpfe entlang der Zeit, (I) Mittlere Kampfdauer entlang der Zeit, (J) Kurze vs. lange Intervalle - Gesamtzeit, (K) 1 s bin Histogramm der Intervalle, (L) Kurz Intervalle - FEI, (M) <5 s Intervalle entlang der Zeit, (N) 5-20 s Intervalle entlang der Zeit, (O) >20 s Intervalle entlang der Zeit, (P) Übergänge zwischen Reizen - Raster-Plot, (Q) Übergang zwischen Stimuli entlang der Zeiten, (R) Heat-Map der Kampfdauer mit sozialer, (S) Heat-Map von Kampfdauer mit Objekt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Analysieren des Untersuchungsverhaltens von SD-Ratten während des SNP-Tests mit der TrackRodent-Software. Plots für alle optionalen Analysen der TrackRodentPopulationSummary-Software (Abbildung 2E), die für eine Population von 59 erwachsenen männlichen SD-Ratten verwendet wird, die den SNP-Test durchführen. Die verschiedenen Plots werden in einer ähnlichen Reihenfolge und Weise angezeigt, wie sie auf dem Computerbildschirm angezeigt wurden (siehe Abschnitt der repräsentativen Ergebnisse für eine detaillierte Erklärung der einzelnen Diagramme). (A-Q) Wie in Abbildung 3beschrieben . (R) Heat-Map der Kampfdauer mit Familiar, (S) Heat-Map der Kampfdauer mit Novel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Whisker-Trimmen von Mäusen und Ratten beeinträchtigt das Sozialverhalten. (A) Diagramm der mittleren Untersuchungszeit (gemessen in 20 s Behältern) während des SP-Tests für männliche C57BL/6J-Mäuse (n = 58). (B) Verteilung (1 min. bin) der mittleren Gesamtzeit langer (>19 s) Untersuchungskämpfe entlang des SP-Tests, der in Panel A für soziale und Objektreize gezeigt wird. Beachten Sie die viel längere Zeit der langen Untersuchung Kämpfe in Richtung der sozialen Stimulus im Vergleich zum Objekt. (C) Verteilung (1 Min.) der Übergangsrate zum Zeitpunkt des SP-Tests in (A). (D-F) Wie in den Panels A-C gezeigt, wurden 29 Mäuseschnurrhaare etwa 1 Woche vor dem Test getrimmt. Diese Tiere verloren ihre soziale Präferenz, wie sie sich in der allgemeinen Untersuchungszeit (D) und (E) Verteilung langer Kämpfe widerspiegelten. Sie zeigten auch eine höhere allgemeine Rate von Übergängen (F), was auf weniger nachhaltige Wechselwirkungen mit dem sozialen Stimulus hindeutet. (G-I) Wie in den Panels A-C gezeigt, führten 60 SD-Ratten den SP-Test durch. Beachten Sie die unterschiedliche Dynamik des Verhaltens der Ratten im Vergleich zu Mäusen, mit niedrigeren Übergangsraten und längeren Perioden langer Untersuchungskämpfe in der frühen Phase (2 min) des Tests. (J-L) Wie in den Paneelen G-H dargestellt, wurden 33 Ratten mit Schnurrbart beschnitten. Beachten Sie, dass die Ratten zwar nicht die soziale Präferenz nach dem Whisker-Trimmen verloren haben, aber die Dynamik ihres Sozialverhaltens in den ersten 2 min des Tests geändert wurde und mehr Übergänge und weniger lange Anfälle zeigte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Das hier beschriebene Versuchssystem, das als Alternative zum Dreikammergerät^2,5konzipiert wurde, ermöglicht die Durchführung der gleichen Tests bei gleichzeitiger Lösung einiger seiner Einschränkungen. Die Verwendung von Dreieckskammern, die sich in zwei gegenüberliegenden Ecken der rechteckigen Arena befinden, begrenzt den Interaktionsbereich Subjekt-Stimulus auf eine klar definierte Ebene und ermöglicht so eine präzise automatisierte Analyse des Untersuchungsverhaltens. Ein Vorteil ist die Verwendung der Analysesoftware (TrackRodent), um mehrere Verhaltensparameter für jeden Test zu berechnen. Es ermöglicht auch die Neupositionierung der Kammern in zufällig entgegengesetzten Ecken der Arena während der verschiedenen Phasen des Paradigmas, neutralisieren alle Auswirkungen der räumlichen Navigationsfähigkeiten.

Darüber hinaus bieten die beiden Ecken der Arena, die in jeder Phase leer gelassen werden, dem Thema einen bequemen Ort zum Ausruhen und Pflegen und Wegziehen aus den Kammern, wodurch falsch-positive Ergebnisse minimiert werden. Somit ermöglicht das System eine direkte Bewertung der Motivation des Subjekts, jeden Stimulus während der SP- und SNP-Tests zu untersuchen. Da die Verhaltensanalyse der Videos automatisiert durch die TrackRodent-Software durchgeführt wird, kann ein Experimentator mehrere Filme zur Analyse laden, die richtigen Parameter für jeden einzelnen definieren und den Softwareprozess über Nacht verarbeiten lassen, was wertvolle Zeit spart. Insbesondere kann das System für jede Art von sozialer Diskriminierung verwendet werden, wie z. B. Die Diskriminierung zwischen männlichen und weiblichen sozialen Reizen oder Reizen unterschiedlicher Belastungen. Darüber hinaus gibt es keine Beschränkungen (oben/unten) für die Größe von Themen, die mit diesem System verfolgt werden können; daher kann es mit Jungtieren oder fettleibigen Tieren verwendet werden. Dieses experimentelle System ist kostengünstig und einfach zu produzieren, und die für die Analyse verwendeten Computercodes sind öffentlich als Open-Source-Codes verfügbar, so dass jedes Labor die Methode einfach anwenden kann.

Die automatisierte Erkennung des Untersuchungsverhaltens im System basiert auf der Erkennung des physischen Kontakts zwischen den Körperkonturen eines Subjekts und jedem der vom Experimentator als "Reize" definierten Bereiche. Wenn also das Subjekt den Bereich "Reize" mit seinem Körper und nicht mit dem Kopf berührt, wird dieses Ereignis als Untersuchung betrachtet (d. h. ein falsch positives). Zu diesem Zweck wurde der kopfgerichtete Algorithmus generiert, der den Kopf des Subjekts identifiziert und nur den Kontakt zwischen Kopf und "Stimuli" berücksichtigt. Dieser Algorithmus läuft jedoch deutlich langsamer als die körperbasierten Algorithmen. Daher wird es nicht für die Analyse einer großen Anzahl von Filmen empfohlen, es sei denn, experimentelle Bedingungen erfordern es.

Ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet (1,1% Differenz, n = 11 Experimente, je 5 min, daten nicht gezeigt) zwischen den beiden Algorithmen; Daher wurden die körperbasierten Algorithmen am häufigsten verwendet. Es sei darauf hingewiesen, dass, obwohl hier Analysen großer Tiergruppen vorgestellt werden, eine viel kleinere Gruppengröße erforderlich ist, um einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen zwei Reizen zu beobachten, basierend auf der vom System gemessenen Gesamtuntersuchungszeit. So ergaben beispielsweise Leistungsberechnungen, dass für die SP- und SNP-Tests von Mäusen nur Stichprobengrößen von nur fünf bzw. acht Tieren erforderlich sind (b = 0,05, Leistung = 0,8). Dennoch wurden hier deutlich größere Tiergruppen eingesetzt, um die Beobachtung aller Dynamiken des Sozialverhaltens zu gewährleisten.

Das System erfordert, dass der Experimentator manuell den Schwellenwert für die Erkennung der Körperkonturen des Motivs definiert. Die Suche nach der richtigen Schwelle für die Verwendung kann einige Erfahrung erfordern; Daher haben die meisten Algorithmen, die in diesem System verwendet werden, regelmäßige, langsamere Versionen. Diese Versionen präsentieren den analysierten Film und erkennen Ermittlungsereignisse online, während ihre schnellen Versionen keine Online-Präsentation ermöglichen. Es wird empfohlen, dass neue Benutzer die regulären Versionen verwenden und Analysen online überwachen, um sicherzustellen, dass es ordnungsgemäß funktioniert, und dass sie die "schnellen" Algorithmen erst verwenden, nachdem sie Erfahrungen mit dem Analyseverfahren gesammelt haben.

Ein Vorteil dieses Systems gegenüber dem Dreikammertest besteht darin, dass es mehrere Parameter des Untersuchungsverhaltens misst und somit detailliertere Analysen unterstützt. Dieser Vorteil ist zweifach. Erstens muss sich der Experimentator nicht allein auf die gesamte Untersuchungszeit verlassen, um die Präferenz zu bestimmen. Es wurde festgestellt, dass die langen Untersuchungskämpfe und langen Intervalle empfindlicher sind als die gesamte Untersuchungszeit, wenn eine Präferenz eines Stimulus gegenüber einem anderen erkannt wird. In Bezug auf diese Parameter ist zu beachten, dass ihre Werte in der letzten Minute des Tests nach unten verzerrt sind, da die langen Untersuchungskämpfe und Intervalle am Ende der 5-Minuten-Sitzung vorzeitig beendet werden.

Zweitens ermöglichen die mehrfachen Parameter die Erkennung subtiler Veränderungen in der Dynamik der sozialen Untersuchung nach verschiedenen Manipulationen. So wurde beispielsweise festgestellt, dass männliche C57BL/6J-Mäuse ihre soziale Präferenz nach dem Whisker-Trimmen verloren. Im Gegensatz dazu behielten männliche SD-Ratten ihre soziale Präferenz bei, änderten aber die Soziale Verhaltensdynamik, wie kürzere Untersuchungskämpfe und höhere Übergänge in der frühen Phase des Tests zeigten. Insgesamt deuten diese Daten auf eine Verringerung der Tendenz von Ratten und Mäusen für soziale Interaktionen nach Whisker-Trimmen hin. Somit unterstützt dieses System eine rigorose Analyse der Dynamik des Sozialverhaltens, die sehr empfindlich auf verschiedene Manipulationen reagieren kann.

Zusammenfassend haben wir hier ein neuartiges, einfaches und erschwingliches experimentelles System vorgestellt, das die automatisierte Analyse der Verhaltensdynamik sozialer Untersuchungen unterstützt. Dieses System wird detaillierte Analysen von sozialen Verhaltensdefiziten in verschiedenen Stämmen und genetisch veränderten Linien kleiner Nagetiere ermöglichen. Darüber hinaus ermöglicht die hier gezeigte präzise Erkennung von Untersuchungskämpfen in Verbindung mit der Fähigkeit dieses Systems, das Verhalten zu analysieren, während die Probanden mit elektrischen Kabeln oder Glasfasern verbunden sind, ihre Verwendung in Experimenten mit Aufzeichnung Hirnaktivität im Zusammenhang mit sozialem Verhalten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flea3 1.3 MP Mono USB3 Vision	FLIR (formerly PointGrey)	FL3-U3-13Y3M-C	Monochromatic Camera
FlyCap 2.0	FLIR (formerly PointGrey)	FlyCapture 2.13.3.61X64	Video recording software
Home 5 minute Epoxy glue	Devocon	20845	For gluing the metal mesh to the Plexiglas stimuli chambers
Matlab 2014-2019	MathWorks	R2014a - R2019a	Programming environment
Plexiglas boards (6 mm thickBlack or white)	Melina (1990) LTD, Israel	NaN	For arena and stimuli chambers construction
Red led strips (60 leds per meter) connected to a 12 V power supply	2012topdeal eBay supplier	NaN	For illumination of the acoustic chamber