Um sistema para acompanhar a dinâmica do comportamento de preferência social em pequenos roedores

Summary

Descrito aqui é um novo sistema experimental automatizado que oferece uma alternativa ao teste de três câmaras e também resolve várias ressalvas. Este sistema fornece múltiplos parâmetros comportamentais que permitem uma análise rigorosa da dinâmica comportamental de pequenos roedores durante os testes de preferência de preferência social e novidade social.

Abstract

Explorar os mecanismos neurobiológicos do comportamento social requer testes comportamentais que podem ser aplicados a modelos animais de forma imparcial e independente do observador. Desde o início do milênio, o teste de três câmaras tem sido amplamente utilizado como paradigma padrão para avaliar a sociabilidade (preferência social) e a preferência de novidade social em pequenos roedores. No entanto, este teste sofre de múltiplas limitações, incluindo sua dependência da navegação espacial e negligência da dinâmica comportamental. Apresentado e validado aqui é um novo sistema experimental que oferece uma alternativa para o teste de três câmaras, ao mesmo tempo, resolver algumas de suas ressalvas. O sistema requer um aparato experimental simples e acessível e um sistema de análise de código aberto disponível publicamente, que mede e analisa automaticamente vários parâmetros comportamentais em níveis individuais e populacionais. Permite a análise detalhada da dinâmica comportável de roedores pequenos durante todo o teste social da discriminação. Demonstramos a eficiência do sistema na análise da dinâmica do comportamento social durante os testes de preferência de preferência social e novidade social realizados por camundongos e camundongos machos adultos. Além disso, validamos a capacidade do sistema de revelar dinâmicas modificadas de comportamento social em roedores após manipulações como corte de bigode. Assim, o sistema permite uma investigação rigorosa do comportamento social e da dinâmica em pequenos modelos de roedores e suporta comparações mais precisas entre cepas, condições e tratamentos.

Introduction

Revelar os mecanismos biológicos subjacentes aos distúrbios do neurodesenvolvimento (NdDs) é um dos principais desafios no campo da neurociência^1. Enfrentar esse desafio requer paradigmas comportamentais e sistemas experimentais que tipificam o comportamento dos roedores de forma padrão e imparcial. Um estudo influente publicado há mais de uma década por Moy e colegas² apresentou o teste de três câmaras. Desde então, este teste tem sido amplamente utilizado para investigar o comportamento social em modelos de roedores de DND. Este teste avalia duas tendências inatas dos roedores: 1) para ficar na proximidade de um estímulo social sobre um objeto (sociabilidade, também denominado preferência social [SP]), e 2) a preferir a proximidade de um novo estímulo social sobre um familiar (preferência de novidade social [SNP])^3,4. Vários estudos subsequentes sugeriram métodos de análise automatizada do teste de três câmaras usando métodos computadorizados^5,6.

Este teste ainda sofre de várias ressalvas. Em primeiro lugar, examina principalmente a preferência de lugar social e não a motivação do sujeito para interagir diretamente com um estímulo social, embora alguns grupos também meçam o tempo de investigação olfativa (sniffing), seja manualmente⁷ ou usando sistemas informatizados comerciais^8,9,10. Em segundo lugar, o teste de três câmaras é usado principalmente para medir o tempo total gasto pelo sujeito em cada câmara, e negligencia a dinâmica comportamental. Finalmente, ele se baseia em apenas um aspecto do comportamento social, que é o tempo gasto pelo sujeito em cada câmara (ou farejando tempo, se medido).

Aqui apresentamos um sistema experimental novo e acessível que é uma alternativa ao aparelho de três câmaras. Ele também permite o desempenho dos mesmos testes comportamentais ao resolver as ressalvas acima mencionadas. O sistema comportamental apresentado mede automaticamente e diretamente o comportamento investigativo de um roedor em direção a dois estímulos. Além disso, analisa a dinâmica comportamental de forma independente do observador. Além disso, esse sistema mede múltiplos parâmetros comportamentais e os analisa em nível individual e populacional; assim, ele suporta uma análise rigorosa do comportamento social e sua dinâmica durante cada teste. Além disso, o reposicionamento aleatório das câmaras em cantos opostos da arena durante os vários estágios de teste neutraliza quaisquer efeitos da memória espacial ou preferência. Este sistema também pode ser usado para outros testes de discriminação, como a discriminação sexual. O aparelho personalizado é fácil de produzir, e o sistema de análise é acessível ao público como um código de código aberto, permitindo assim seu uso em qualquer laboratório. Demonstramos a capacidade deste sistema de medir múltiplos parâmetros de comportamento social em cepas de roedores com cores distintas de pele durante os testes de preferência social e novidade social. Também validamos a capacidade do sistema de revelar dinâmicamodifica do comportamento social em roedores após manipulações, como corte de bigode.

Software TrackRodent: três algoritmos foram escritos em MATLAB (2014a-2019a) para rastrear o sujeito experimental e suas interações com os estímulos. Todos os algoritmos foram depositados no GitHub, encontrados em . O principal objetivo de todos os quatro algoritmos é rastrear os contornos do corpo do sujeito para detectar qualquer contato direto com as áreas de estímulos.

Algoritmo baseado no corpo: este algoritmo tem três versões que rastreiam os contornos de um mouse escuro sem fio em um fundo branco (BlackMouseBodyBased), um mouse branco em um fundo escuro (WhiteMouseBodyBased), ou um rato branco em um fundo escuro (WhiteRatBodyBased ). A interface gráfica do usuário (GUI) do software requer que o experimentador escolha um experimento usando mouses ou ratos e, em seguida, selecione o código correto. Para cada versão do algoritmo, existem dois códigos opcionais: um que apresenta o processo de rastreamento na tela enquanto executa a análise, e um que não (portanto, ele é executado mais rápido e é denominado "rápido"). Por exemplo, os nomes dos códigos relevantes para o algoritmo BlackMouseBodyBased são: "BlackMouseBodyBased23_7_14" e "BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast". Todos os algoritmos que terminam com "rápido" não mostram o rastreamento on-line, e os usuários devem salvar diretamente os dados para o arquivo de resultados (arquivo.mat). Todos os algoritmos baseados no corpo exigem a definição de um único limite ("limite baixo" no GUI do software) para detectar o corpo do sujeito.

Algoritmo baseado na direcionalidade da cabeça: o segundo algoritmo, que está disponível apenas para camundongos pretos, é baseado no algoritmo baseado no corpo, além de determinar a direcionalidade da cabeça. Esse algoritmo detecta as interações da cabeça do sujeito com as áreas de "estímulos", evitando assim falsos positivos que podem surgir de contatos aleatórios do sujeito com essas áreas. Para este algoritmo, dois limiares de detecção de contornos do corpo do rato são definidos: limiar elevado, que inclui a cauda mais brilhante de ratos pretos, e baixo limiar, que inclui o corpo sem cauda. Depois disso, o algoritmo se encaixa em um elipsóide para os limites detectados usando o limiar inferior e define a localização da cabeça e cauda do mouse (sem distinção entre os dois). A discriminação final entre a cauda e a cabeça baseia-se nos limites definidos pelo limiar mais elevado.

Algoritmo animal com fio: o terceiro algoritmo visa minimizar artefatos resultantes de cabos (ou seja, fio elétrico ou fibra óptica) conectados ao animal, permitindo a análise do comportamento do animal enquanto conectado a um cabo. Este algoritmo tem códigos apenas para ratos pretos e ratos brancos. O código para ratos requer que o experimentador defina limites baixos e altos, enquanto o código do mouse requer apenas um limiar baixo.

Protocol

Todos os métodos descritos foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade de Haifa.

1. Configuração experimental

1. Arena
   1. Construa a arena experimental para camundongos(Figura 1A,D)colocando uma caixa de plexiglass branca ou preta (dependendo da cor do animal) (37 cm x 22 cm x 35 cm) no meio de uma câmara acústica (60 cm x 65 cm x 80 cm, feita de madeira grossa de 2 cm revestida por dentro com espuma de 2 cm de espessura). Para a luz, retire uma tira (2 cm de largura, 10 cm abaixo do teto da câmara) da espuma ao redor da câmara acústica (além da porta), e anexar uma tira de LED com lâmpadas vermelhas ou brancas. Certifique-se que a luz é tão uniforme quanto possível em torno da arena para impedir reflexões.
   2. Construa a arena para ratos similarmente a esse descrito acima para ratos, com as dimensões diferentes que cabem apropriadamente o tamanho de ratos de Sprague-Dawley (SD) (figura 1G). Coloque uma caixa de plexiglass preto (50 cm x 50 cm x 40 cm) no meio de uma câmara acústica (90 cm x 60 cm x 85 cm, feita de madeira de 2 cm de espessura revestida no interior com espuma de 2 cm de espessura).
2. Câmaras
   1. Para camundongos, crie duas câmaras triangulares pretas ou brancas (dependendo da cor da pele) (isosceles de 12 cm, 35 cm de altura, com os pisos fechados) a partir de plexiglass de 6 mm de espessura. Localizá-los em dois cantos opostos selecionados aleatoriamente da arena (Figura 1B,E). Coloque uma malha de metal (18 mm x 6 cm; 1 cm x 1 cm buracos) na parte inferior de cada câmara usando cola epóxi para permitir interações diretas com o estímulo através da malha(Figura 1C,F). Marque cada câmara de uma forma que permita a discriminação dos outros em um vídeo sem dar pistas sobre os sujeitos (ver Figura 1B,E, por exemplo).
      Nota: Cada câmara acabará por conter um estímulo social (mouse) ou objeto (brinquedo de plástico, 5 cm x 5 cm x 5 cm, com uma forma e cor distintas; Figura 1C, i inserções). Deixe o cheiro de cola epóxi evaporar por pelo menos uma semana antes do uso.
   2. Para ratos, crie duas câmaras triangulares pretas (20,5 cm de isosceles, 40 cm de altura, feita de plexiglass de 6 mm de espessura, com os pisos fechados) e coloque-as em dois cantos opostos selecionados aleatoriamente da arena (Figura 1H), cada um com uma malha metálica (25 cm x 7 cm; 2,5 cm x 1 cm de buracos) cobrindo sua porção inferior(Figura 1).
3. Coloque uma câmera monocromática de alta qualidade, equipada com uma lente grande angular, no topo da câmara acústica e conecte-a a um computador para permitir visualização e gravação claras do comportamento do sujeito usando software comercial (veja Tabela de Materiais para sugestões).

2. Paradigma comportamental

Nota: Os passos 2.1-2.7 descrevem o paradigma comportamental para camundongos. Veja a seção 2.8 para instruções específicas que envolvem ratos.

1. Certifique-se de que as gaiolas de todos os animais (sujeitos: camundongos machos de 2-4 meses de idade; estímulos: camundongos juvenis de 21-30 dias de idade) permaneçam na sala experimental por pelo menos 1 h antes de iniciar o experimento comportamental.
2. Após o período de aclimatação, insira duas câmaras vazias na arena aleatoriamente em dois cantos opostos. Coloque o assunto no meio da arena por 15 min de habituação. Durante esse tempo, coloque os dois estímulos sociais, cada um em uma câmara diferente localizada fora da arena para habituação. Coloque um objeto (um brinquedo de plástico, 5 cm x 5 cm x 5 cm, com uma forma e cor distintas) em outra câmara.
3. Para realizar o teste de preferência social (SP), inicie a gravação de vídeo e continue gravando até o final do teste.
4. Retire as duas câmaras vazias e insira imediatamente o objeto e um dos estímulos sociais, cada um em uma câmara distinta. Localizar essas câmaras aleatoriamente nos cantos opostos da arena que estavam vazios durante a habituação. Permita que o sujeito interaja com os estímulos para os 5 min do teste sp. No final do teste, pare de gravar.
5. Após o teste sp, remover as câmaras contendo estímulos da arena e deixar o assunto na arena vazia por 15 min. Limpar as câmaras de fora com 10% lenços de etanol.
6. Para realizar o teste de preferência de novidade social (SNP), iniciar gravação de vídeo e inserir duas câmaras na arena: uma contendo o mesmo estímulo social utilizado para o teste sp (estímulo familiar), e o outro contendo o novo estímulo social. Coloque essas câmaras aleatoriamente em dois cantos opostos da arena, certificando-se de que esses locais não foram usados para o teste sp. Permita que o sujeito interaja com os estímulos para os 5 min do teste SNP.
7. No final do teste SNP, parar a gravação de vídeo, remover o assunto e câmaras da arena, e colocar o assunto de volta em sua gaiola em casa. Deixe os estímulos nas câmaras para o próximo experimento (com outro assunto) ou devolvê-los às suas gaiolas em casa. Limpe a arena e câmaras com água corrente seguida de 10% de etanol e deixe secar.
8. Paradigma comportamental para ratos
   1. Para os ratos, repita o paradigma comportamental descrito nos passos 2.1-2.7, com duas modificações: 1) lidar com os sujeitos do rato e habituar os estímulos sociais para as câmaras por 2 dias (10 min todos os dias) antes do experimento; e 2) estender o teste sp para 15 min para dar aos ratos um longo período de exposição a estímulos sociais. Posteriormente, restringir a análise do teste SP ao inicial de 5 min.
      Nota: Pelo menos uma arena e cinco câmaras são necessárias para executar uma única sessão.

3. Usando o GUI TrackRodent para análise comportamental

Nota: Veja o painel superior da Figura 2A para o TrackRodent GUI.

1. Abra o MATLAB (testado com 2014a-2019a) e escolha a pasta TrackRodent.
2. Adicione todas as subdobras à via de trabalho clicando em cada pasta e selecionando Adicionar ao Caminho | Pastas selecionadas e subdobradores.
3. Tipo TrackRodent na janela de comando e imprensa Enter.
4. Envie um único arquivo ou vários arquivos de vídeo (formato AVI ou MP4) selecionando o arquivo da sessão de carga (AVI).
5. Um inspetor de filmes, permitindo a inspeção do clipe de vídeo quadro a quadro, será imediatamente aberto para o primeiro arquivo na lista(Figura 2A). Use-o para examinar o clipe de vídeo e definir o primeiro e último quadros do segmento a serem analisados. Registre os números desses quadros, que serão necessários mais tarde. Feche a janela quando estiver pronto.
6. Para inspecionar arquivos de vídeo adicionais, abra o inspetor de vídeo a qualquer momento pressionando o filme inspect e selecionando um arquivo de vídeo específico.
7. Selecione as espécies testadas (rato ou rato; o rato é o padrão).
8. Exclua todas as áreas que podem interromper o rastreamento, de acordo com as cores do sujeito e da arena (preto ou branco).
   1. Para excluir uma determinada área, a imprensa exclui a área,e após as alterações do cursor para uma forma transversal, marque todos os cantos da área para exclusão. Quando feito, clique à direita no mouse, em seguida, clique duas vezes à esquerda no centro da área marcada. A área excluída se tornará um tom de vermelho na tela. Repita este procedimento para excluir tantas áreas quanto necessário.
9. Para remover uma área da exclusão, pressione remover a área excluída,em seguida ( usando o cursor cruzado) clique na área para ser removido da exclusão.
10. Para definir cada câmara como uma área de "estímulo", para detecção automática de sua investigação pelo sujeito, escolha a forma da área de 'estímulo' para ser poligão ou elíptica, verificando a caixa apropriada, em seguida, pressionando Estímulo X (onde "X" representa 1, 2 ou 3). Marque as áreas de "estímulo" de forma semelhante às áreas excluídas, que se tornarão de cor amarela. Para alterar a localização de uma área específica de "estímulo", pressione o Estímulo X novamente e marque o novo local da área (isso atualizará automaticamente o local).
    Nota: Escolha o número de estímulos diferentes de forma consistente para todos os arquivos (ou seja, objeto como estímulo 1 para todos os arquivos de teste SP).
11. Para acompanhar a presença do sujeito em um compartimento virtual específico dentro da arena, escolha a forma da área 'compartimento' (polígono ou elíptico), em seguida, pressione o Compartimento X (onde "X" representa 1, 2, 3, 4 ou 5). Marque as áreas "compartimento" de forma semelhante às áreas excluídas ou estímulos, que, em seguida, tornar-se-ão de cor azul. Para alterar a localização de uma área específica de "compartimento", pressione o Compartimento X novamente e marque o novo local da área (isso atualizará automaticamente o local).
12. Escolha o algoritmo desejado (BlackMouseBodyBased foi usado para o vídeo) da lista (veja algoritmos disponíveis na Figura 2B).
13. Escreva os números de quadros de partida e final para a análise nas caixas de eitamento correspondentes do GUI.
14. Escolha um limite para detectar o corpo do sujeito.
    Nota: A maioria dos algoritmos usa apenas o limite "baixo", enquanto os algoritmos baseados em direcionalidade da cabeça também usam o limite "Alto". Para o limite "baixo", escolha um nível que inclua o corpo do rato/rato sem a cauda (tanto quanto possível), quando o ponto inicial "elevado" igualmente der a cauda. No caso do uso de algoritmos baseados em direcionalidade da cabeça, o software determinará a localização da cabeça como sendo oposta à localização da cauda.
    Nota: O software mais tarde ignora pequenos objetos detectados usando o limite escolhido.
15. Para avaliar a detecção automática das fronteiras do sujeito para um determinado limite, insira um valor no campo limite relevante e pressione O Digite no teclado.
16. Ao escolher vários arquivos, mova-se para o próximo arquivo (usando o botão Next na parte superior) e selecione as definições apropriadas para cada arquivo. Quando terminar, verifique os parâmetros e locais da área para todos os arquivos, movendo-se entre cada um, usando os botões Anteriores e Next na parte superior do GUI.
    Nota: As definições de todas as áreas e parâmetros são específicas de um determinado arquivo.
17. Para iniciar a análise comportamental de todos os arquivos selecionados, mova-se para o primeiro arquivo e pressione O Início.
18. No final da análise, um arquivo de resultados (.arquivo mat) é guardado para cada filme no mesmo diretório dos arquivos do filme.
    Nota: Se a versão lenta (não-rápida) do algoritmo for usada, ele também salvará uma versão do filme com uma cruz branca do centro da massa corporal, que muda sua cor a cada quadro que é detectado como investigação, a menos que o botão de alternância do filme analisado da Save seja descontrolado. Esta versão do filme (salvo no mesmo diretório, com o mesmo nome do filme original, com o sufixo 'filme analisado') pode ser usada offline para avaliar a qualidade da detecção automática realizada pelo sistema.

4. Usando o GUI TrackRodent para apresentação de resultados

Nota: Veja o painel inferior da Figura 2A para apresentação de resultados.

1. Para inspecionar os resultados de cada arquivo de filme, a imprensa load resulta no arquivo e escolha os arquivos .mat gerados pela análise comportamental.
2. Mova-se entre os botões de alternância para examinar na tela qualquer uma das seguintes análises: rastreamento de localização do mouse (Figura 2A); Ocupação de compartimentos ao longo da sessão (se 'compartimentos' foram definidos, não mostrados); Exploração de estímulos ao longo da sessão(Figura 2C); Tempo total em compartimentos (se 'compartimentos' foram definidos, não mostrado); e Tempo total de exploração de estímulos(Figura 2D).
   Nota: Áreas de 'estímulo' são áreas em que o software avalia a interação do sujeito, enquanto as áreas 'Compartimento' são áreas em que o software rastreia a presença do sujeito. Interromper a análise usando o botão de análise stop economizará automaticamente os resultados gerados até o último quadro analisado. Para a maioria dos computadores, deve ser possível fazer upload e analisar até 20 filmes ao mesmo tempo (dependendo do desempenho do computador).

5. Usando o TrackRodentPopulationSummary GUI para análise populacional (Figura 2E)

1. Abra o MATLAB (testado com 2014a-2019a) e escolha a pasta TrackRodent.
2. Tipo TrackRodentPopulationSummary na janela de comando e imprensa Enter.
3. Faça upload de vários arquivos de resultados do TrackRodent (formato.mat) pressionando os arquivos de resultados da Escolha.
4. Preencha os números do Último quadro para análise, nome de teste, nome de estímulo 1e nome de Estímulo 2.
5. Escolha as análises desejadas da lista de análises opcionais, verificando todas as caixas apropriadas.
6. Escolha os resultados da Exportação para uma folha de epeadsheet, verificando a caixa apropriada para extrair todos os resultados das análises verificadas como um único arquivo de planilha.
7. Pressione Comece e espere até que a análise seja concluída.
   Nota: Isso conclui a análise. O software pode ser usado para analisar os resultados de tantos arquivos de filmes quanto desejado, uma vez que todos eles foram analisados comportamentalmente usando o software TrackRodent. A análise realizada pelo software assume gravação de vídeo a uma taxa de quadros de 30 Hz. No caso de uma taxa de quadros diferente foi utilizada, multiplique o tempo em 30 e divida pela taxa de quadros utilizada para o registo para a converter ao valor correto (s).

Representative Results

Usando o sistema para o teste de preferência social em camundongos C57BL/6J
A Figura 1 mostra três versões da configuração experimental. A primeira versão(Figura 1A-C)é projetada para ratos com cores de pele escura, como camundongos C57BL/6J. O segundo (Figura 1D-F)está prevista para camundongos com cores de peles brilhantes, como balb/c ou icr (CD-1) ratos. O terceiro é maior(Figura 1G-I)e projetado para ratos com cores brilhantes da pele, tais como ratos do SD. Os primeiros sujeitos examinados foram adultos ingênuos (8-12 semanas de idade), ratos C57BL/6J masculinos abrigados em grupo (dois a cinco animais por gaiola). Os estímulos sociais eram juvenis (21-30 dias velho), grupo-abrigados (dois a seis animais por a gaiola), ratos masculinos de C57BL/6J. Os estímulos do objeto eram brinquedos plásticos inodoros com cores distintas (inserções na figura 1C,I). Arquivos de vídeo dos experimentos foram analisados usando o software TrackRodent (algoritmo baseado no corpo, ver imagem de tela exemplificada e GUI na Figura 2A), que rastreou automaticamente e continuamente a localização do sujeito com base em 1) centro corporal e 2) o contato de seus contornos corporais com as câmaras contendo estímulos.

A análise envolveu os seguintes procedimentos. Depois de carregar um arquivo de filme e definir graficamente áreas a serem excluídas da análise, o experimentador definiu graficamente duas áreas, cada uma compreendendo uma câmara distinta, como 'estímulos' (Figura 2A,áreas amareladas). Os usuários também podem definir até cinco áreas como "compartimentos" virtuais. Em seguida, os usuários escolhem o algoritmo "BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast" da lista de possíveis algoritmos(Figura 2B). Depois de pressionar o botão de análise Iniciar, o software rastreou a localização animal quadro a quadro e descreveu o traço de localização do mouse na arena(Figura 2A,linha azul). Durante esta análise, o software também rastreou contatos entre as áreas de 'estímulos' e contorno corporal do sujeito(Figura 2C). Tais eventos de contato foram definidos como investigação e serviram para calcular o tempo de investigação para cada estímulo e o tempo durante o qual nenhum comportamento de investigação foi exibido(Figura 2D). Como aparente na Figura 2C,D mostrando o filme analisado, maior tempo de investigação para 'estímulo 2 foi observado', que foi o estímulo social, em comparação com o objeto, que neste caso foi definido como 'estímulo 1'.

Análise populacional do teste de preferência social em camundongos C57BL/6J
Depois de permitir que o software TrackRodent analisasse todos os arquivos de vídeo do grupo experimental, uma análise populacional para esse grupo foi realizada usando o GUI(Figura 2E),ao escolher todas as análises possíveis deste software. As saídas distintas dessas análises para o teste sp realizada com 58 camundongos adultos c57BL/6J do sexo masculino são exibidos na Figura 3, exatamente como eles apareceram na tela do computador, com todas as barras de erro representando SEM. Análises estatísticas desses resultados foram publicadas anteriormente¹¹.

O tempo médio de investigação total da população de sujeitos em relação a cada um dos dois estímulos (estímulo social juvenil do mesmo sexo e um objeto) é exibido na Figura 3A,que retrata uma clara preferência do sujeito em relação ao estímulo social. Embora o algoritmo seja simples, observou-se uma excelente correlação (r² = 0,91, p < 10^-6,correlação da Pearson) entre o tempo de investigação medido manualmente por um observador treinado e o valor calculado pelo software. A dinâmica dessa preferência pode ser vista na Figura 3B,na qual o tempo médio de investigação para cada estímulo é traçado ao longo do tempo em 20 caixas. Como mostrado, a preferência social é mantida pelos sujeitos ao longo da sessão, embora parecesse um pouco mais forte nos estágios iniciais.

Figura 3C retrata o tempo de investigação para cada estímulo, categorizado de acordo com a duração do ataque em curto (≤6 s), médio (>6 s, ≤19 s), e longos (>19 s) bouts, juntamente com o tempo total de investigação. A distribuição do tempo de investigação para cada estímulo de acordo com a duração do ataque em 1 s bins é exibido na Figura 3D. Como mostrado na Figura 3C,D,não houve diferença entre estímulos nas lutas curtas, enquanto as lutas médias e longas mostraram claras preferências sociais. Estes resultados sugerem que em camundongos C57BL/6J, ataques curtos refletem curiosidade, enquanto longas lutas refletem uma interação entre o sujeito e estímulos. A duração relativa dos valores de investigação (RDI, [objeto social]/[social+objeto]) para cada categoria (curto, médio e longo período), bem como para o tempo total de investigação, são mostradas na Figura 3E. Como mostrado, o maior valor de RDI é alcançado com os longos ataques, sugerindo que eles melhor refletem as preferências sociais dos sujeitos.

Para analisar a dinâmica da luta de investigação durante o teste, as distribuições ao longo do tempo para cada categoria foram traçadas separadamente. As distribuições ao longo do tempo do curto(Figura 3F)e médio(Figura 3G)lutas de investigação sugerem uma redução gradual desses ataques ao longo do tempo. Em contraste, uma análise semelhante das longas lutas(Figura 3H)mostra um aumento gradual ao longo do teste. Essa tendência também se reflete na distribuição da duração média do ataque(Figura 3I),mostrando um aumento gradual ao longo do tempo. Assim, parece que os sujeitos apresentaram curiosidade principalmente durante os estágios iniciais do teste, enquanto mais tarde eles apresentaram mais interações com os estímulos. Note-se que durante o último minuto, há um viés inerente da análise para ataques curtos, porque ataques longos foram artificialmente encerrados no final da sessão. Portanto, ao considerar o curso de tempo das lutas de investigação, o último minuto deve ser ignorado.

Também analisamos os intervalos entre as sucessivas lutas de investigação em direção ao mesmo estímulo (ou seja, o tempo que levou o sujeito a retornar ao mesmo estímulo após o final de cada luta de investigação). Este parâmetro reflete o desejo do sujeito de retornar ao mesmo estímulo e investigar. Aqui, os intervalos também foram categorizados em curto (≤5 s), médio (>5 s, ≤20 s), e longas (>20 s) lutas, que são mostrados em conjunto com intervalos de tempo total para cada estímulo na Figura 3J. O histograma dos intervalos em 1 s bins em exibido na Figura 3K. Como mostrado na Figura 3J,K,os intervalos entre as investigações do estímulo social foram muito mais curtos do que aqueles entre as investigações do objeto. Assim, os valores de RDI de intervalos na faixa de longo prazo produziram o maior valor absoluto (Figura 3L); assim, eles podem ser usados como uma variável independente do tempo de investigação avaliando a preferência social. As distribuições ao longo do tempo de intervalos traçados separadamente para cada categoria(Figura 3M-O)sugerem uma redução gradual em intervalos curtos e médios e uma mudança oposta em longos intervalos entre os ataques de investigação, o que provavelmente reflete o alongamento geral dos ataques de investigação. Semelhante à distribuição de crises de investigação, o último minuto de intervalos é tendencioso para valores curtos e deve ser ignorado.

Também analisamos as transições observadas em sujeitos de um estímulo para outro. Este enredo é exibido na Figura 3P, em que cada ponto de tempo o sujeito começou a investigar um novo estímulo é marcado por um ponto azul, cada linha representa um assunto distinto, ea linha vermelha representa a taxa de transição média. Como aparente, a taxa de transição foi maior (~1,5 transições/min) durante os primeiros 2 min do teste e foi gradualmente reduzida para menos de 50% do pico. A mesma tendência é aparente a partir da distribuição da taxa de transição média ao longo do tempo (Figura 3Q).

Finalmente, são mostrados mapas de calor de lutas de investigação em direção ao estímulo social(Figura 3R)e objeto(Figura 3S)durante o teste para cada sujeito, com as cores marcando duração do ataque(Figura 3S). Ao todo, os resultados sugerem que em camundongos C57Bl/6J, o teste sp é aproximadamente dividido em uma fase exploratória precoce (caracterizada por uma alta taxa de transição e ataques de investigação curta) e uma fase de interação tardia (caracterizada por baixa taxa de transição e longos ataques de investigação).

Análise populacional do teste de preferência de novidade social em ratos SD
A figura 4 mostra a mesma análise acima para o teste de SNP executado por 59 ratos do SD. Normalmente, a preferência do romance vs. estímulos sociais familiares é mais fraco do que a preferência para um estímulo social novo contra. um objeto, exibido por camundongos no teste sp (Figura 3). No entanto, a preferência da novidade social é claramente refletida por todos os parâmetros. Notavelmente, conforme concluído acima do teste de SP em camundongos, os longos ataques de investigação e intervalos longos são os parâmetros mais claramente exibindo diferenças entre os estímulos, como refletido por seus maiores valores absolutos de RDI (Figura 4E,L; deve-se notar que os valores de RDI para o teste SNP são definidos como [romance familiar]/[romance familiar+]).

Perda de bigodes prejudica a preferência social em camundongos C57BL/6J e ratos SD
Para avaliar os efeitos da manipulação somatossensorial na dinâmica do comportamento social, a análise foi realizada do teste SP concluído por 29 camundongos C57BL/6J e 33 ratos SD após o corte de bigode (realizado 3-7 dias antes do teste). Em seguida, esses resultados foram comparados aos animais controle. Como indicado na Figura 5A-F, os camundongos aparados de bigode não preferem o estímulo social sobre o objeto, como refletido pela falta de diferença no tempo de investigação entre os dois estímulos (compare a Figura 5A com a Figura 5D)e a perda de longas lutas de investigação em direção ao estímulo social (compare a Figura 5B à Figura 5E). Curiosamente, os camundongos aparados de bigode também mostraram aumento das taxas de transição em comparação com ratos controle (compare a Figura 5C com a Figura 5F).

Ao todo, esses dados sugerem que os camundongos aparados de bigode reduziram significativamente a duração de suas interações com o estímulo social. Em contraste com os camundongos, os ratos aparados de bigode não perderam suas preferências sociais (Figura 5G-L). No entanto, eles mudaram significativamente seu comportamento durante o primeiro minuto do teste, quando eles tiveram menos lutas de investigação longas (compare a Figura 5H com a Figura 5K)e muitas mais transições (compare a Figura 5I com a Figura 5L). Assim, o corte de bigodes modificou significativamente o comportamento de ratos e camundongos no teste sp, mas de uma maneira muito diferente entre as duas espécies. Estes resultados sugerem um papel distinto para a estimulação somatossensorial whisker-dependente em interações sociais dos ratos e dos ratos.

Figura 1: Configuração experimental. (A)Uma representação esquemática da arena experimental projetada para ratos com pele preta. (B)Uma imagem da arena de cima, usando luz vermelha fraca, mostrando um mouse sujeito C57BL/6J na arena. (C)Uma imagem mostrando a área de malha de uma câmara branca, através da qual o sujeito interage com um estímulo (inserção: uma imagem de um estímulo objeto usado para ratos). (D-F) Como mostrado nos painéis A-C, uma arena experimental e câmaras projetadas para ratos com pele brilhante. (G-I) Como mostrado nos painéis A-C, uma arena experimental e câmaras projetadas para ratos com pele brilhante (inserida em [I]: imagem de um estímulo de objeto usado para ratos). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 2: Software TrackRodent. (A)Uma tela de um computador executando o software TrackRodent. Esquerda: a imagem de vídeo no início do filme analisado (primeiro quadro escolhido pelo experimentador), mostrando as áreas rotuladas de 'estímulos' e seguiu o caminho do movimento do sujeito C57BL/6J. Direita: o software GUI. (B)A lista de códigos opcionais do software a ser usado com o GUI. Cada um desses códigos se encaixa em uma condição experimental distinta. (C)A análise do experimento específico mostrado no painel A, quando a opção de exploração de Estímulos ao longo da sessão foi selecionada na seção de apresentação de Resultados do GUI. Este enredo mostra (em cada quadro) se o assunto estava em contato com 'estímulo 1' ou 'estímulo 2'. No caso apresentado, uma clara preferência em relação ao 'estímulo 2' é evidente pelo maior número e duração dos ataques de investigação detectados em direção a esse estímulo. (D)A análise do experimento mostrado nos painéis A e C, quando a opção do tempo total de exploração de estímulos foi selecionada na seção de apresentação de Resultados do GUI. Aqui também, uma clara preferência para "estímulo 2" é evidente a partir do maior nível de tempo de investigação para este estímulo. (E)O GUI do software TrackRodentPopulationSummary que permite a análise e plotagem dos resultados de uma população de animais, cada um dos quais é analisado usando o software TrackRodent (ver Figura 3 para os resultados de tal análise). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 3: Analisando o comportamento de investigação de camundongos C57BL/6J durante o teste sp usando o software TrackRodent. Este número mostra as várias parcelas de todas as análises opcionais do software TrackRodentPopulationSummary(Figura 2E)empregado para uma população de 58 camundongos adultos C57BL/6J do sexo masculino que executam o teste sp. As várias parcelas são exibidas de forma semelhante como apareceram na tela do computador (veja a seção de resultados representativos para uma explicação detalhada de cada parcela). (A) Tempo total de investigação de estímulos, (B)Investigação de estímulos ao longo do tempo, (C) Curto vs longas lutas - tempo total, (D) 1s bin histograma de lutas, (E) Curto vs lutas longas - RDI, (F) <6 s lutas ao longo do tempo, (G) 6-19 s lutas ao longo do tempo, (H) >19 s lutas ao longo do tempo, (I) Média duração da luta ao longo do tempo, (J) Curto vs intervalos longos - tempo total, (K) 1 s bin histograma de intervalos, (L) Longo vs intervalos - RDI, (M) <5 s intervalos ao longo do tempo, (N) 5-20 s intervalos ao longo do tempo, (O) >20 s intervalos ao longo do tempo, (P) Transições entre estímulos - raster enredo, (Q) Transição entre estímulos ao longo dos tempos, (R) Calor da duração do mapa com social, (S) Calor mapa de duração com objeto. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 4: Analisando o comportamento de investigação de ratos SD durante o teste SNP usando o software TrackRodent. Parcelas para todas as análises opcionais do software TrackRodentPopulationSummary(Figura 2E)empregado para uma população de 59 ratos machos adultos SD realizando o teste SNP. As várias parcelas são exibidas de forma semelhante como apareceram na tela do computador (veja a seção de resultados representativos para uma explicação detalhada de cada parcela). (A-Q) Mesmo que descrito na Figura 3. (R)Mapa de calor da duração da luta com Familiar,(S)Mapa de calor da duração do ataque com Novel. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 5: Bigode-corte de ratos e ratos diferencialmente prejudica o comportamento social. (A)Enredo do tempo médio de investigação (medido em 20 caixas) durante o teste sp para camundongos c57BL/6J masculinos (n = 58). (B) Distribuição (1 min bins) do tempo médio total de longos (>19 s) lutas de investigação ao longo do teste SP mostrado no painel A para estímulos sociais e objetos. Observe o tempo muito mais longo de longos ataques de investigação para o estímulo social em comparação com o objeto. (C)Distribuição (1 min bins) da taxa de transição ao longo do tempo do teste SP mostrado em (A). (D-F) Como mostrado nos painéis A-C, 29 bigodes de camundongos foram cortados cerca de 1 semana antes do teste. Esses animais perderam sua preferência social, como refletido pelo tempo de investigação geral(D)epeladistribuição de longos ataques. Eles também apresentaram uma maior taxa geral de transições (F), sugerindo interações menos sustentadas com o estímulo social. (G-I) Como mostrado nos painéis A-C, 60 ratos SD realizaram o teste sp. Observe a dinâmica diferente do comportamento dos ratos em comparação com camundongos, com menores taxas de transição e períodos mais longos de longos períodos de investigação na fase inicial (2 min) do teste. (J-L) Como mostrado nos painéis G-H, 33 ratos foram whisker-aparado. Note-se que, embora os ratos não perderam preferência social após bigode-corte como ratos fizeram, a dinâmica de seu comportamento social nos primeiros 2 min do teste foi alterado, mostrando mais transições e menos lutas longas. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Discussion

O sistema experimental descrito aqui, que foi projetado como uma alternativa ao aparelho de três câmaras^2,5,permite o desempenho dos mesmos testes ao resolver algumas de suas limitações. O uso de câmaras triangulares, que estão localizadas em dois cantos opostos da arena retangular, limita a área de interação de estímulo ao sujeito a um plano bem definido, permitindo assim uma análise automatizada precisa do comportamento de investigação. Uma vantagem é o uso do software de análise (TrackRodent) para calcular vários parâmetros comportamentais para cada teste. Ele também permite o reposicionamento das câmaras em cantos opostos aleatórios da arena durante as várias fases do paradigma, neutralizando quaisquer efeitos das habilidades de navegação espacial.

Além disso, os dois cantos da arena, que são deixados vazios durante cada etapa, oferecem ao assunto um lugar conveniente para descansar e preparar e extrai-lo longe das câmaras, minimizando resultados falso-positivos. Assim, o sistema permite a avaliação direta da motivação do sujeito para investigar cada estímulo durante os testes sp e SNP. Além disso, como a análise comportamental dos vídeos é feita de forma automatizada pelo software TrackRodent, um experimentador pode carregar vários filmes para análise, definir os parâmetros corretos para cada um e deixar o processo de software durante a noite, o que economiza tempo precioso. Notavelmente, o sistema pode ser usado para qualquer tipo de teste de discriminação social, como a discriminação entre estímulos sociais masculinos e femininos ou estímulos de cepas distintas. Além disso, não há limites (superior/inferior) ao tamanho dos sujeitos que podem ser rastreados usando este sistema; assim, pode ser usado com juvenis ou animais obesos. Este sistema experimental é barato e simples de produzir, e os códigos de computador usados para análise estão disponíveis publicamente como códigos de código aberto, permitindo que qualquer laboratório adote facilmente o método.

A detecção automatizada do comportamento de investigação no sistema baseia-se na detecção de contato físico entre os contornos corporais de um sujeito e cada uma das áreas definidas pelo experimentador como 'estímulos'. Assim, se o assunto toca a área de 'estímulos' com seu corpo em vez de cabeça, este evento é considerado investigador (ou seja, um falso positivo). Para isso, foi gerado o algoritmo baseado na cabeça-direcionalidade, que identifica o chefe do sujeito e leva em conta apenas o contato entre a cabeça e os 'estímulos'. No entanto, este algoritmo é executado significativamente mais lento do que os algoritmos baseados no corpo; portanto, não é recomendado para análise de um grande número de filmes, a menos que as condições experimentais exigi-lo.

Resultados semelhantes foram observados (diferença de 1,1%, n = 11 experimentos, 5 min cada, dados não mostrados) entre os dois algoritmos; portanto, os algoritmos baseados no corpo foram mais frequentemente usados. Note-se que, embora sejam apresentadas análises de grandes grupos de animais, é necessário um tamanho de grupo muito menor para observar uma diferença estatisticamente significativa entre dois estímulos, com base no tempo total de investigação medido pelo sistema. Por exemplo, cálculos de energia revelaram que são necessários tamanhos amostrais de apenas cinco e oito animais para os testes sp e SNP de camundongos, respectivamente (α = 0,05, potência = 0,8). No entanto, grupos significativamente maiores de animais foram usados aqui para garantir a observação de toda a dinâmica do comportamento social.

O sistema exige que o experimentador defina manualmente o limiar para a detecção dos contornos corporais do sujeito. Encontrar o limite certo para ser útil pode exigir alguma experiência; assim, a maioria dos algoritmos usados neste sistema têm versões regulares e mais lentas. Essas versões apresentam o filme analisado e detectam eventos de investigação on-line, enquanto suas versões rápidas não permitem a apresentação on-line. Recomenda-se que os novos usuários usem as versões regulares e monitorem análises on-line para garantir que ele funcione corretamente e que eles usem os algoritmos "rápidos" somente após a coleta de experiência com o procedimento de análise.

Uma vantagem deste sistema sobre o teste de três câmaras é que ele mede vários parâmetros de comportamento de investigação, apoiando assim análises mais detalhadas. Esta vantagem é dupla. Primeiro, o experimentador não precisa confiar apenas no tempo total de investigação para determinar a preferência. Verificou-se que os longos ataques de investigação e intervalos longos são mais sensíveis do que o tempo total de investigação ao detectar uma preferência de um estímulo sobre o outro. Em relação a esses parâmetros, deve-se notar que seus valores durante o último minuto do teste são tendenciosos para baixo, como os longos ataques de investigação e intervalos são prematuramente encerrados no final da sessão de 5 minutos.

Em segundo lugar, os múltiplos parâmetros permitem a detecção de mudanças sutis na dinâmica da investigação social após várias manipulações. Por exemplo, verificou-se que os ratos machos C57BL/6J perderam a sua preferência social após o corte de bigodes. Ao contrário, os ratos masculinos do SD retiveram sua preferência social mas mudaram a dinâmica social do comportamento como mostrado por uns bouts mais curtos da investigação e por um nível mais elevado de transições na fase adiantada do teste. No geral, esses dados sugerem uma redução na tendência de ratos e camundongos para interações sociais após o corte do bigode. Assim, esse sistema suporta uma análise rigorosa da dinâmica do comportamento social, que pode ser altamente sensível a várias manipulações.

Em resumo, apresentamos aqui um sistema experimental novo, simples e acessível que suporta a análise automatizada da dinâmica de comportamento de investigação social. Este sistema facilitará análises detalhadas de deficits comportáveis sociais em várias tensões e em linhas genetically modificadas de roedores pequenos. Além disso, a detecção precisa de crises de investigação demonstradas aqui, combinada com a capacidade deste sistema de analisar o comportamento enquanto os sujeitos estão conectados a cabos elétricos ou fibras ópticas, permite seu uso em experimentos envolvendo registro da atividade cerebral associada ao comportamento social.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flea3 1.3 MP Mono USB3 Vision	FLIR (formerly PointGrey)	FL3-U3-13Y3M-C	Monochromatic Camera
FlyCap 2.0	FLIR (formerly PointGrey)	FlyCapture 2.13.3.61X64	Video recording software
Home 5 minute Epoxy glue	Devocon	20845	For gluing the metal mesh to the Plexiglas stimuli chambers
Matlab 2014-2019	MathWorks	R2014a - R2019a	Programming environment
Plexiglas boards (6 mm thickBlack or white)	Melina (1990) LTD, Israel	NaN	For arena and stimuli chambers construction
Red led strips (60 leds per meter) connected to a 12 V power supply	2012topdeal eBay supplier	NaN	For illumination of the acoustic chamber