Summary
ここで説明する新しい自動実験システムは、3チャンバーテストの代替を提供し、また、いくつかの注意事項を解決します。このシステムは、社会的嗜好および社会的新規性嗜好試験中に小さなげっ歯類の行動ダイナミクスの厳密な分析を可能にする複数の行動パラメータを提供する。
Abstract
社会的行動の神経生物学的メカニズムを探索するには、公平で観察者に依存しない方法で動物モデルに適用できる行動テストが必要です。ミレニアムの初め以来、3室のテストは、小さなげっ歯類の社会性(社会的嗜好)と社会的新規性の好みを評価するための標準的なパラダイムとして広く使用されてきました。しかし、このテストは、空間ナビゲーションへの依存や行動ダイナミクスの過失など、複数の制限に苦しんでいます。ここで提示され、検証されたは、3つのチャンバーテストの代替を提供し、同時にその注意事項の一部を解決する新しい実験システムです。このシステムは、シンプルで手頃な価格の実験装置と、一般に公開されているオープンソース分析システムを必要とし、個々および人口レベルで複数の行動パラメータを自動的に測定および分析します。これは、任意の社会的差別テスト中に小さなげっ歯類の行動ダイナミクスの詳細な分析を可能にします。成人男性マウスやラットが行う社会的嗜好や社会的新規性嗜好試験における社会的行動のダイナミクスを分析するシステムの効率性を実証する。さらに、ウィスカートリミングなどの操作に続くげっ歯類の社会的行動の修正されたダイナミクスを明らかにするシステムの能力を検証します。したがって、システムは小さいげっ歯類モデルの社会的行動およびダイナミクスの厳密な調査を可能にし、株、条件および処置間のより正確な比較をサポートする。
Introduction
神経発達障害(NDD)の基礎となる生物学的メカニズムを明らかにすることは、神経科学1の分野における主要な課題の一つである。この課題に取り組むには、げっ歯類の行動を標準的かつ公平に表現する行動パラダイムと実験システムが必要です。Moyと同僚2によって10年以上前に発表された影響力のある研究は、3つのチャンバーテストを提示しました。それ以来、このテストはNDDのげっ歯類モデルにおける社会的行動を調査するために広く使用されている。このテストは、げっ歯類の2つの先天的傾向を評価する:1)物体に対する社会的刺激の近接にとどまる(社交性、社会的嗜好[SP]とも呼ばれる)、および2)身近な1つよりも新しい社会的刺激の近接性を好む(社会的新規性好み[SNP])3、4。いくつかの後続の研究は、コンピュータ化された方法5、6を使用して3チャンバー試験の自動分析の方法を示唆した。
このテストはまだいくつかの注意事項に苦しんでいます。第一に、主に社会的刺激と直接相互作用する被験者の動機ではなく、社会的な場所の好みを調べるが、一部のグループは、手動で7、または商用コンピュータ化されたシステム8、9、10を使用して嗅覚調査(スニッフィング)時間を測定する。第二に、3チャンバーテストは、主に各チャンバー内の被験者が費やした合計時間を測定するために使用され、それは行動ダイナミクスを無視します。最後に、それは社会的行動の1つの側面にのみ依存し、これは各チャンバ内の被験者が費やした時間(または測定された場合はスニッフィング時間)である。
ここでは、3室装置に代わる新しい手頃な価格の実験システムを紹介します。また、上記の注意事項を解決しながら、同じ動作テストのパフォーマンスを可能にします。提示された行動システムは、2つの刺激に向かってげっ歯類の調査行動を自動的かつ直接測定する。さらに、観察者に依存しない方法で行動ダイナミクスを分析します。さらに、このシステムは、複数の行動パラメータを測定し、個々のレベルと母集団レベルの両方でこれらを分析します。したがって、各テスト中の社会的行動とそのダイナミクスの厳密な分析をサポートします。さらに、様々なテスト段階の間にアリーナの反対側のコーナーのチャンバーのランダムな再配置は、空間メモリまたは好みの任意の効果を中和する。このシステムは、性差別などの他の差別テストにも使用できます。カスタム装置は簡単に製造でき、分析システムはオープンソースコードとして一般にアクセス可能であり、あらゆる実験室での使用を可能にします。我々は、社会的嗜好および社会的新規性嗜好試験の間に明確な毛皮の色を有するげっ歯類株における社会的行動の複数のパラメータを測定するこのシステムの能力を実証する。また、ウィスカートリミングなどの操作に続くげっ歯類の社会的行動の修正されたダイナミクスを明らかにするシステムの能力を検証します。
TrackRodentソフトウェア:3つのアルゴリズムは、実験対象とその刺激との相互作用を追跡するためにMATLAB(2014a-2019a)で書かれました。すべてのアルゴリズムは GitHub に寄託されました。すべての4つのアルゴリズムの主な目的は、刺激領域との直接接触を検出するために被験者の体の輪郭を追跡することです。
ボディベースのアルゴリズム:このアルゴリズムには、白い背景上のワイヤードされていない暗いマウスの輪郭を追跡する3つのバージョン(BlackMouseBodyBased)、暗い背景に白いマウス(WhiteMouseBodyBased)、または暗い背景の白いネズミ(WhiteRatBodyBased)があります。).ソフトウェアのグラフィカル ユーザー インターフェイス (GUI) では、実験者がマウスまたはラットを使用して実験を選択し、正しいコードを選択する必要があります。アルゴリズムのバージョンごとに、分析の実行中に追跡プロセスを画面に表示するコードと、実行しないコード (高速実行され、「高速」と呼ばれます) の 2 つのオプション コードがあります。たとえば、BlackMouseBodyBased アルゴリズムに関連するコードの名前は、"BlackMouseBodyBased23_7_14" と "BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast" です。"fast" で終わるすべてのアルゴリズムはトラッキングをオンラインで表示せず、ユーザーはデータを結果ファイル (.mat ファイル) に直接保存する必要があります。すべての本文ベースのアルゴリズムでは、サブジェクトの本文を検出するために、単一のしきい値 (ソフトウェアの GUI の 「低しきい値」) を設定する必要があります。
頭方向ベースのアルゴリズム: 黒いマウスでのみ使用できる 2 番目のアルゴリズムは、頭部の方向性を決定することに加えて、ボディベースのアルゴリズムに基づいています。このアルゴリズムは、被験者の頭部と「刺激」領域との相互作用を検出し、被験者のランダムな接触から生じる誤検知を回避します。このアルゴリズムでは、マウス本体の輪郭の 2 つの検出しきい値が定義されます: 黒いマウスの明るい尾を含む高しきい値と、尾のない体を含む低しきい値。その後、アルゴリズムは、下限しきい値を使用して検出された境界に楕円体を適合させ、マウスの頭と尾の位置を定義します(2つの区別はありません)。尾と頭の間の最終的な判別は、より高いしきい値によって定義された境界に基づいています。
有線動物アルゴリズム:第3のアルゴリズムは、動物に接続されたケーブル(すなわち、電線または光ファイバ)から生じるアーティファクトを最小限に抑えることを目的とし、ケーブルに接続されている間の動物の行動の分析を可能にする。このアルゴリズムには、黒いマウスと白いラットのコードのみが含まれています。ラットのコードでは、実験者は低しきい値と高しきい値の両方を定義する必要がありますが、マウス コードでは低いしきい値のみを定義する必要があります。
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Protocol
記載されているすべての方法は、ハイファ大学の制度動物管理利用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. 実験的なセットアップ
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アリーナ
- マウス用の実験場(図1A,D)を、白または黒(動物の色に応じて)プレキシガラスボックス(37 cm x 22 cm x 35 cm)を音響室の中央に置いて構築します(60 cm x 65 cm x 80 cm、内側に厚さ2cmの厚い木材で構成されています)。ライトの場合は、音響室(ドアの他に)の泡のストリップ(幅2cm、チャンバーの天井下10cm)を取り外し、赤または白の電球でLEDストリップを取り付けます。反射を防ぐために、アリーナの周りの光ができるだけ均一であることを確認してください。
- マウスに対して上記のものと同様にラットのアリーナを構築し、スプレイグ・ドーリー(SD)ラットのサイズに適した異なる寸法を有する(図1G)。音響室の中央に黒いプレキシガラスボックス(50 cm x 50 cm x 40 cm)を置きます(90 cm x 60 cm x 85 cm、内側に厚さ2cmの厚い泡で覆われた厚さ2cmの木で作られています)。
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室
- マウスの場合は、厚さ 6 mm のプレキシガラスから 2 つの黒または白(毛皮の色に応じて)三角形のチャンバー(12 cmの二重、高さ35cm、床を閉じた)を作成します。アリーナの2つのランダムに選択された反対側のコーナーでそれらを見つけます (図 1B,E)。エポキシ接着剤を使用して各チャンバーの下部に金属メッシュ(18 mm x 6 cm; 1 cm x 1 cm の穴)を貼り付け、メッシュを介して刺激と直接相互作用できるようにします(図1C,F)。被験者に手がかりを与えることなく、ビデオで他の人からの差別を可能にする方法で各チャンバーをマークします(例については、図1B,Eを参照)。
注:各チャンバーは、最終的に社会的刺激(マウス)またはオブジェクト(プラスチックおもちゃ、5 cm x 5 cm x 5 cm、明確な形状と色を含みます。図1C,Iインセット)。エポキシ接着剤の臭いを使用前に少なくとも1週間蒸発させます。 - ラットの場合は、2つの黒い三角形のチャンバー(20.5 cmのアイソセレス、40 cmの高さ、床を閉じた状態で厚さ6mmのプレキシガラスで作られています)を作成し、アリーナの2つのランダムに選択された反対側のコーナーに配置します(図1H)。それぞれに金属製メッシュ(25 cm x 7 cm;2.5 cm x 1 cmの穴)を覆います(図1I)。
- マウスの場合は、厚さ 6 mm のプレキシガラスから 2 つの黒または白(毛皮の色に応じて)三角形のチャンバー(12 cmの二重、高さ35cm、床を閉じた)を作成します。アリーナの2つのランダムに選択された反対側のコーナーでそれらを見つけます (図 1B,E)。エポキシ接着剤を使用して各チャンバーの下部に金属メッシュ(18 mm x 6 cm; 1 cm x 1 cm の穴)を貼り付け、メッシュを介して刺激と直接相互作用できるようにします(図1C,F)。被験者に手がかりを与えることなく、ビデオで他の人からの差別を可能にする方法で各チャンバーをマークします(例については、図1B,Eを参照)。
- 広角レンズを装備した高品質の単色カメラを音響室の上部に設置し、コンピュータに接続して、商用ソフトウェアを使用して被写体の動作を明確に表示および記録できるようにします(提案については、材料表を参照)。
2. 行動パラダイム
注:手順 2.1 ~ 2.7 では、マウスの動作パラダイムについて説明します。ラットに関する具体的な指示については、セクション2.8を参照してください。
- 行動実験を開始する前に、すべての動物(被験者:2-4ヶ月の雄マウス;刺激:21-30日齢の若いマウス)のケージが少なくとも1時間実験室に残っていることを確認してください。
- 順応期間に続いて、2つの反対側のコーナーでランダムにアリーナに2つの空の部屋を挿入します。15分間の習慣のためにアリーナの真ん中に被験者を配置します。その間、2つの社会的刺激を置き、それぞれが習慣のためにアリーナの外に位置する別の部屋に置きます。別のチャンバーにオブジェクト(プラスチック製のおもちゃ、5 cm x 5 cm x 5 cm、明確な形状と色)を配置します。
- ソーシャルプリファレンス(SP)テストを実行するには、ビデオ録画を開始し、テストが終了するまで録画を続けます。
- 2つの空の部屋を取り外し、すぐにオブジェクトと社会的刺激の1つを挿入し、それぞれ別個のチャンバーに入れます。習慣の間に空だったアリーナの反対側のコーナーでランダムにこれらの部屋を見つけます。被験者がSPテストの5分間の刺激と相互作用することを許可する。テストの終了時に、記録を停止します。
- SPテストの後、刺激を含むチャンバーをアリーナから取り出し、被験者を空のアリーナに15分間放置します。
- 社会的新規性の好み(SNP)テストを実行するには、ビデオ録画を開始し、アリーナに2つのチャンバーを挿入します:1つはSPテストに使用されるのと同じ社会的刺激を含み(使い慣れた刺激)、もう1つは新しい社会的刺激を含みます。これらのチャンバーをアリーナの2つの反対側のコーナーにランダムに配置し、これらの場所がSPテストに使用されていないことを確認します。被験者がSNPテストの5分間の刺激と相互作用することを許可する。
- SNPテストの終わりに、ビデオ録画を停止し、アリーナから被写体とチャンバーを取り除き、被写体をホームケージに戻します。次の実験のために(別の被験者と)チャンバーに刺激を残すか、彼らの家のケージにそれらを返します。流水でアリーナとチャンバーをきれいにし、10%のエタノールを続け、乾燥させます。
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ラットの行動パラダイム
- ラットの場合は、ステップ2.1-2.7で説明した行動パラダイムを繰り返し、2つの修正を加えて:1)ラットの被験者を処理し、実験の前に2日間(毎日10分)チャンバーに社会的刺激を習慣化します。そして2)15分間SP試験を延長し、ラットに社会的刺激への暴露のより長い期間を与える。その後、SPテストの分析を最初の5分に制限します。
注:1つのセッションを実行するには、少なくとも1つのアリーナと5つのチャンバーが必要です。
- ラットの場合は、ステップ2.1-2.7で説明した行動パラダイムを繰り返し、2つの修正を加えて:1)ラットの被験者を処理し、実験の前に2日間(毎日10分)チャンバーに社会的刺激を習慣化します。そして2)15分間SP試験を延長し、ラットに社会的刺激への暴露のより長い期間を与える。その後、SPテストの分析を最初の5分に制限します。
3. 行動分析のためのトラックローデント GUI の使用
注:トラックローデント GUI については、図 2Aの上部パネルを参照してください。
- MATLAB(2014a-2019aでテスト)を開き、TrackRodentフォルダを選択します。
- 各フォルダを右クリックし、[パスに追加|選択したフォルダとサブフォルダ。
- コマンド ウィンドウに TrackRodent と入力し、Enter キーを押します。
- セッション ファイルの読み込み(AVI) を選択して、1 つまたは複数のビデオ ファイル (AVI または MP4 形式) をアップロードします。
- ビデオクリップのフレームごとに検査を可能にするムービーインスペクタは、リスト内の最初のファイルに対して直ちに開かれます(図2A)。ビデオクリップを調べ、分析するセグメントの最初と最後のフレームを定義するために使用します。後で必要になるこれらのフレームの番号を記録します。完了したら、ウィンドウを閉じます。
- 追加のビデオファイルを検査するには、ムービーの検査を押して特定のビデオファイルを選択して、いつでもビデオインスペクタを開きます。
- テストした種を選択します(マウスまたはラット、マウスがデフォルト)。
- 被写体とアリーナ(黒または白)の色に応じて、追跡を中断する可能性のあるすべての領域を除外します。
- 特定の領域を除外するには、[除外領域]を押し、カーソルが十字形に変わったら、その領域のすべてのコーナーに除外のマークを付けます。完了したら、マウスを右クリックし、マークされた領域の中心をダブルクリックします。除外された領域は、画面上で赤の網掛けになります。必要な数の領域を除外するには、この手順を繰り返します。
- 除外からエリアを削除するには、 (交差カーソルを使用して) 除外から除外する領域をクリックします。
- 各チャンバを「刺激」領域として定義するには、被験者による調査の自動検出のために、適切なボックスをチェックして「刺激」領域の形状をポリゴンまたは楕円形に選択し、Stimulus X("X"は1、2、または3を表します)を押します。「刺激」領域を除外された領域と同様にマークすると、色が黄色になります。特定の「刺激」領域の位置を変更するには、Stimulus X をもう一度押して、新しい領域の位置をマークします(これにより、自動的に位置が更新されます)。
注:すべてのファイルに対して一貫した方法で異なる刺激番号を選択します(つまり、すべてのSPテストファイルに対する刺激1としてのオブジェクト)。 - アリーナ内の特定の仮想コンパートメント内の被写体の存在を追跡するには、「コンパートメント」領域(ポリゴンまたは楕円形)の形状を選択し、コンパートメントX("X"は 1、2、3、4、または5)を押します。「コンパートメント」領域を除外領域または刺激領域と同様にマークすると、青色になります。特定の「コンパートメント」領域の位置を変更するには、コンパートメント Xをもう一度押して、新しいエリアの位置をマークします(これにより、場所が自動的に更新されます)。
- リストから目的のアルゴリズム (BlackMouseBodyBased がビデオに使用されました) を選択します (図 2Bの使用可能なアルゴリズムを参照)。
- 解析の開始フレームと終了フレームの数を GUI の対応する編集ボックスに書き込みます。
- サブジェクト本体を検出するためのしきい値を選択します。
注:ほとんどのアルゴリズムは「低」しきい値のみを使用し、ヘッド指向性ベースのアルゴリズムも「高」しきい値を使用します。「低」しきい値には、尾のないマウス/ラットボディを含むレベルを選択し(可能な限り)、「高」しきい値にもテールを含める必要があります。ヘッド指向性ベースのアルゴリズムを使用する場合、ソフトウェアは頭部の位置を尾部の位置とは反対であると判断します。
注:ソフトウェアは、選択したしきい値を使用して検出された小さなオブジェクトを無視して後で行われます。 - 特定のしきい値のサブジェクト境界の自動検出を評価するには、関連するしきい値フィールドに値を挿入し、キーボードの Enter キーを押します。
- 複数のファイルを選択する場合は、上部にある [次へ] ボタンを使用して次のファイルに移動し、各ファイルに適切な定義を選択します。完了したら、GUI の上部にある[前へ]ボタンと[次へ]ボタンを使用して、各ファイル間を移動して、すべてのファイルのパラメータと領域の場所を確認します。
注:すべての領域とパラメーターの定義は、特定のファイルに固有です。 - 選択したすべてのファイルの動作分析を開始するには、最初のファイルに移動し、Start キーを押します。
- 解析の最後に、ムービー ファイルの同じディレクトリにムービーごとに結果ファイル (.mat ファイル) が保存されます。
注:アルゴリズムの低速(非高速)バージョンを使用する場合は、GUIの[分析されたムービーを保存]トグル ボタンがオフでない限り、調査として検出されたすべてのフレームの色を変更するボディマスの中心の白い十字でムービーのバージョンも保存されます。このバージョンのムービー (元のムービーと同じ名前で、サフィックスが 「分析されたムービー」と同じディレクトリに保存されている) をオフラインで使用して、システムによって実行される自動検出の品質を評価できます。
4. 結果表示のためのトラックローデント GUI の使用
注:結果の表示については、図 2Aの下部パネルを参照してください。
- 各ムービー ファイルの結果を調べるには、[結果ファイルの読み込み] を押し、動作解析によって生成された .mat ファイルを選択します。
- トグル ボタン間を移動して、次のいずれかの分析を画面上で調べます。セッションに沿ったコンパートメント職業(「コンパートメント」が定義されている場合、示されていません)。セッションに沿った刺激探査(図2C);コンパートメント内の合計時間 (「コンパートメント」が定義されている場合、表示されません)。および総刺激探査時間 (図 2D)。
注:「刺激」領域は、ソフトウェアが主題の相互作用を評価する領域であり、「コンパートメント」領域は、ソフトウェアが被験者の存在を追跡する領域です。[解析の停止]ボタンを使用して解析を停止すると、最後に解析されたフレームまで生成された結果が自動的に保存されます。ほとんどのコンピュータでは、一度に最大 20 本のムービーをアップロードして分析できる必要があります (コンピュータのパフォーマンスによって異なります)。
5. 集団分析のためのトラックローデント人口サマリーGUIの使用 (図 2E)
- MATLAB(2014a-2019aでテスト)を開き、TrackRodentフォルダを選択します。
- コマンド ウィンドウに「トラックの一般概要」と入力し、Enterキーを押します。
- [ 結果ファイルの選択 ] を押して、複数の TrackRodent 結果ファイル (.mat 形式)をアップロードします。
- 分析のための最後のフレームの数字を記入してください,テスト名,刺激1名と刺激2名.
- すべての適切なボックスをオンにして、オプションの解析のリストから目的の解析を選択します。
- 適切なチェックボックスをオンにして[結果をスピードシートにエクスポート]を選択し、チェックした解析のすべての結果を 1 つのスプレッドシート ファイルとして抽出します。
- [開始] をクリックし、分析が完了するまで待ちます。
注:これで分析は終了です。ソフトウェアは、それらがTrackRodentソフトウェアを使用して行動的に分析されたことを考えると、必要な数のムービーファイルの結果を分析するために使用することができます。ソフトウェアによって実行される分析は、30 Hzのフレームレートでのビデオ録画を前提としています。異なるフレームレートを使用した場合は、時間に30を掛け、正しい値に変換するために記録に使用されるフレームレートで割ります。
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Representative Results
C57BL/6Jマウスにおける社会的嗜好試験のためのシステムの使用
図 1は、実験セットアップの 3 つのバージョンを示しています。最初のバージョン(図1A-C)は、C57BL/6Jマウスのような暗い毛皮の色を持つマウス用に設計されています。2番目の(図1D-F)は、BALB/cまたはICR(CD-1)マウスのような明るい毛皮色を有するマウスに対して計画されている。3つ目は大きく(図1G-I)、SDラットなどの明るい毛皮色のラット用に設計されています。最初に調べた被験者は、ナイーブ成人(生後8〜12週)、グループ収容(ケージあたり2〜5匹)雄C57BL/6Jマウスであった。社会的刺激は、若年(生後21〜30日)、グループハウス(ケージあたり2〜6匹)、雄C57BL/6Jマウスであった。物体刺激は、異なる色を持つ無臭のプラスチック玩具でした(図1C,Iのインセット)。実験のビデオファイルは、TrackRodentソフトウェア(ボディベースのアルゴリズム、図2Aの例示された画面画像およびGUIを参照)を使用して分析した。1)ボディセンターと2)刺激含有チャンバーとの身体輪郭の接触を自動的かつ継続的に追跡する。
分析には以下の手順が含まれました。ムービーファイルをアップロードし、分析から除外する領域をグラフィカルに定義した後、実験者は2つの領域をグラフィカルに定義し、それぞれが「刺激」として別個のチャンバーを構成します(図2A、黄色がかった領域)。ユーザーは、最大 5 つの領域を仮想の「コンパートメント」として定義することもできます。次に、ユーザーは可能なアルゴリズムの一覧から "BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast" アルゴリズムを選択します (図 2B)。[解析の開始]ボタンを押した後、ソフトウェアは動物の位置をフレームごとに追跡し、アリーナ内のマウス位置のトレースを示しました (図 2A、青い線)。この分析の間、ソフトウェアはまた、被験者の「刺激」領域と身体輪郭との間の接触を追跡した(図2C)。このような接触イベントは調査対象として定義され、各刺激の調査時間と、調査動作が表示されなかった時間を計算するために役立ちました(図2D)。図2C、Dに明らかなように、分析された映画を示すように、社会的刺激であった「刺激2」に対するより高い調査時間が観察され、この場合は「刺激1」と定義された対象物と比較した。
C57BL/6Jマウスにおける社会嗜好試験の集団分析
TrackRodentソフトウェアが実験グループのすべてのビデオファイルを分析することを許可した後、このグループの母集団分析は、このソフトウェアのすべての可能な分析を選択しながら、「TrackRodentPopulationSummary」GUI(図2E)を使用して行われました。58 C57BL/6J成人男性マウスで行われたSP試験に対するこれらの分析の明確な出力は、コンピュータ画面に表示されたとおりに図3に表示され、SEMを示す全ての誤差バーが11に公表された。
2つの刺激(同性少年社会刺激と物体)のそれぞれに向かう被験者の集団の平均総調査時間は、社会的刺激に向けた被験者の明確な好みを示す図3Aに表示される。アルゴリズムは単純ですが、トレーニングされた観察者によって手動で測定された調査時間とソフトウェアによって計算された値との間に優れた相関(r2 = 0.91、p < 10-6、ピアソンの相関)が観察されました。この好みのダイナミクスは図3Bで見ることができ、各刺激の平均調査時間が20sビンに時間とともにプロットされます。図に示すように、社会的嗜好はセッション全体を通じて被験者によって維持されますが、初期の段階では若干強いように見えました。
図 3C は、各刺激の調査時間を短い (≤6 s)、中 (>6 s、≤19 s)、および長い (>19 s) に分類し、合計調査時間を示しています。1 sビンのバウト持続時間に従った各刺激の調査時間の分布を図3Dに示す。図3C,Dに示すように、ショートバウトの刺激には違いはなく、中型と長いバウトは明確な社会的好みを示した。これらの結果は、C57BL/6Jマウスにおいて、ショートバウトは好奇心を反映し、長いバウトは被験者と刺激の相互作用を反映することを示唆している。各カテゴリ (ショート、ミディアム、およびロング バウト) の調査期間 (RDI, [ソーシャル オブジェクト]/[ソーシャル+オブジェクト]) と、合計調査時間の相対的な期間を図 3Eに示します。示すように、最も高いRDI値は、被験者の社会的嗜好を最もよく反映することを示唆し、長いバウトで達成されます。
テスト中の調査バウトのダイナミクスを分析するために、各カテゴリの経時分布を別々にプロットしました。短い (図 3 F) および中型 (図3G)の調査バウトの経時の分布は、時間の経過と同じ時間の経過に従ってこれらのバウトを徐々に減少させたいことを示唆しています。対照的に、ロングバウトの同様の分析(図3H)は、試験の過程で徐々に増加を示す。この傾向は、平均バウト持続時間(図3I)の分布によっても反映され、時間の経過とともに徐々に増加することを示す。したがって、被験者は主にテストの初期段階で好奇心を示したかのように見えますが、後で刺激とのより多くの相互作用を示しました。セッションの最後に長いバウトが人工的に終了したため、最後の最後の間に、短いバウトに向かって分析の本質的なバイアスがあることに留意すべきです。したがって、調査の経過時間を考慮する場合、最後の分は無視する必要があります。
我々はまた、同じ刺激に向かって連続した調査の打撃の間の間隔を分析した(すなわち、各調査の終わりの後に被験者が同じ刺激に戻るのにかかった時間)。このパラメータは、被験者が同じ刺激に戻り、調査する衝動を反映しています。ここでは、間隔は短い (≤5 s)、中 (>5 s,≤20 s)、および長い (>20 s) の吹き出物にも分類され、図3Jの各刺激の合計時間間隔と共に示されています。図 3Kに示す 1 s ビン内の間隔のヒストグラム。図3J,Kに示すように、社会的刺激の調査間の間隔は、対象物の調査間の間隔よりもはるかに短かった。したがって、長距離内の区間のRDI値は、最高の絶対値を生み出しました(図3L)。したがって、それらは社会的嗜好を評価する調査時間に依存しない変数として使用され得る。各カテゴリ (図 3M-O)ごとに個別にプロットされた間隔の分布は、短い間隔と中程度の間隔の段階的な減少と、調査バウト間の長い間隔の逆の変化を示唆しています。調査バウトの分布と同様に、間隔の最後の分は短い値に偏っているので、無視する必要があります。
また、ある刺激から別の刺激に対して被験者に見られる遷移を分析した。このプロットは図3Pに表示され、被験者が新しい刺激を調査し始めるたびに青い点がマークされ、すべての行が明確な主題を表し、赤い線は平均遷移率を表します。明らかなように、転移率は試験の最初の2分の間に最も高かった(〜1.5遷移/分)、徐々にピークの50%未満に減少した。時間の経過に従う平均遷移速度の分布からも同じ傾向が明らかです (図 3Q)。
最後に、各被験者の試験の過程で、社会的刺激(図3R)とオブジェクト(図3S)に向けた調査のヒートマップが示され、色はバウト持続時間を示す(図3S)。全体として、結果は、C57Bl/6Jマウスにおいて、SP試験が初期の探索段階(高い遷移率と短い調査バウトによって特徴付けられる)と後期相互作用段階(低い遷移率および長い調査バウトによって特徴付けられる)に大別されることを示唆している。
SDラットにおける社会新規嗜好試験の集団分析
図4は、59匹のSDラットによって行われたSNP試験について上記と同様の分析を示す。一般的に、小説との好み。身近な社会的刺激は、新しい社会的刺激対に対する好みよりも弱い.SP試験でマウスが示す物体(図3)。それにもかかわらず、社会的新規性の好みは、すべてのパラメータによって明確に反映されます。特に、マウスにおけるSP試験から上述したように、長い調査バウトと長い間隔は、刺激間の差異を最も明確に示すパラメータであり、その最も高い絶対RDI値によって反映される(図4E,L;SNP試験のRDI値は[近い小説]/[近い+novel])として定義されている点に留意すべきである。
ウィスカーの喪失は、C57BL/6JマウスとSDラットの両方で社会的嗜好を損なう
社会行動のダイナミクスに対する体性感覚操作の影響を評価するために、ウィスカートリミング後に29個のC57BL/6Jマウスおよび33匹のSDラットによって完了したSP試験の解析を行った(試験の3〜7日前に実施)。次いで、これらの結果を対照動物と比較した。図5A-Fに示すように、ウィスカートリミングされたマウスは、2つの刺激の間の調査時間の差の欠如(図5Aと図5Dを比較)と社会的刺激に向けた長い調査の喪失(図5Bと図5Eを比較)によって、物体よりも社会的刺激を好まない。興味深いことに、ウィスカートリミングマウスは、対照マウスと比較して遷移速度の増加も示した(図5Cと図5Fを比較)。
全体として、これらのデータは、ウィスカートリミングマウスが社会的刺激との相互作用の持続時間を著しく減少させたことを示唆している。マウスとは対照的に、ウィスカートリミングされたラットは社会的嗜好を失わなかった(図5G-L)。ただし、長い調査の場が少なく (図 5Hと図 5Kを比較)、さらに多くの遷移 (図 5と図 5 Lを比較) の場合、テストの最初の 1 分間の動作は大幅に変更されました。したがって、ウィスカートリミングは、SP試験におけるラットとマウスの両方の挙動を有意に改変したが、2つの種の間で非常に異なる方法で。これらの結果は、ラットおよびマウスの社会的相互作用におけるウィスカー依存性体性感覚刺激に対する明確な役割を示唆している。
図1:実験的なセットアップ。(A) 黒い毛皮を持つマウス用に設計された実験場の概略描写。(B)上からのアリーナの写真を、薄暗い赤色光を用いて、アリーナ内のC57BL/6J被験者マウスを示す。(C)白いチャンバーのメッシュ領域を示す画像で、被験者が刺激と相互作用する(差し込み:マウスに使用される物体刺激の画像)。(D-F)パネルA-Cに示すように、明るい毛皮を持つマウスのために設計された実験的なアリーナとチャンバー。(G-I)パネルA-Cに示すように、明るい毛皮を持つラットのために設計された実験的なアリーナとチャンバー([I]のインセット:ラットに使用される物体刺激の画像)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:トラックローデントソフトウェア(A) TrackRodentソフトウェアを実行しているコンピュータの画面。左:分析されたムービーの開始時のビデオ画像(実験者が選択した最初のフレーム)で、C57BL/6J被験者の「刺激」領域と追跡移動経路を示す。右: ソフトウェア GUI。(B) GUI で使用するソフトウェアのオプション・コードのリスト。これらの各コードは、個別の実験条件に適合します。(C)パネルAに示す具体的な実験の分析は、GUIの結果提示部でセッションに沿った刺激探査のオプションが選択されたときである。このプロットは、被験者が「刺激1」または「刺激2」と接触したかどうかを(各フレームで)示す。提示されたケースでは、「刺激2」に対する明確な好みは、この刺激に向かって検出された調査バウトのより高い数と持続時間によって明らかである。(D)パネルA及びCに示す実験の分析を、GUIの結果提示部で全刺激探索時間のオプションを選択した場合。ここでも、「刺激2」に対する明確な好みは、この刺激に向けた調査時間の高いレベルから明らかです。(E) 動物集団からの結果の分析とプロットを可能にする TrackRodentPopulationSummary ソフトウェアの GUI。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:TrackRodentソフトウェアを用いたSP試験中のC57BL/6Jマウスの調査挙動の解析この図は、SP試験を行う58 C57BL/6J成人男性マウスの集団に対して用いたTrackRodentPopulationSummaryソフトウェア(図2E)のすべてのオプション分析の様々なプロットを示す。さまざまなプロットは、コンピュータ画面に表示されたのと同様の順序と方法で表示されます(各プロットの詳細な説明については、代表的な結果セクションを参照してください)。(A)刺激調査の合計時間、(B)時間に沿った刺激の調査、(C)ショート対ロングバウト - 合計時間、 (D) 1s bin ヒストグラムのバウト、 (E) ショート対ロングバウト - RDI、 (F)<6 s 時間に沿って吹き出し、 (H) >19 s 時間に沿ったバウト、 (I)時間に沿った平均バウト持続時間、 (J)短い対長の間隔 - 合計時間、 (K) 1 ビンの長い間隔間隔 - RDI、(M)<5 s間隔、時間に沿った(N)5−20s間隔、(O)>20s間隔、(P)刺激間の遷移-ラスタプロット、(Q)刺激時間に沿った遷移、(R)社会との吹き出時間の熱マップ、(S)熱マップこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:TrackRodentソフトウェアを用いたSNP試験中のSDラットの調査挙動の分析SNPテストを実行する59匹のSD成人男性ラットの集団に対して採用されたTrackRodentPopulationSummaryソフトウェア(図2E)のすべてのオプション分析のためのプロット。さまざまなプロットは、コンピュータ画面に表示されたのと同様の順序と方法で表示されます(各プロットの詳細な説明については、代表的な結果セクションを参照してください)。(A-Q)図 3で説明したものと同じです。(R) おなじみのバウト持続時間のヒートマップ, (S) 小説とのバウト持続時間のヒートマップ.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:マウスとラットのウィスカートリミングは、社会的行動を差別的に損なう。(A)男性C57BL/6JマウスのSP試験中の平均調査時間(20sビンで測定)のプロット(n=58)。(B)平均総時間の分布(>19s)は、パネルAに示されたSPテストに沿って、社会的および物体刺激を行う。オブジェクトと比較して、社会的刺激に向かって長い調査のはるかに長い時間に注意してください。(C)(A)に示すSP試験時の遷移速度の分布(1分ビン)。(D-F)パネルA-Cに示すように、29匹のマウスのウィスカーを試験の約1週間前にトリミングした。これらの動物は、(D)一般的な調査時間と(E)長いバウトの分布によって反映されているように、彼らの社会的好みを失いました。彼らはまた、より高い一般的な遷移率(F)を示し、社会的刺激との持続的な相互作用が少ないことを示唆した。(G-I)パネルA〜Cに示すように、60匹のSDラットがSP試験を行った。ラットの行動の異なるダイナミクスは、マウスと比較して、より低い遷移率とテストの初期段階(2分)における長い調査の打撃の長い期間に注意してください。(J-L)パネルG-Hに示すように、33匹のラットがウィスカートリミングされた。ラットは、マウスのようにウィスカートリミング後に社会的嗜好を失わなかったが、テストの最初の2分で彼らの社会的行動のダイナミクスが変化し、より多くの遷移とより少ない長いバウトを示すことに注意してください。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明する実験システムは、3チャンバ装置2、5の代替として設計されたが、その制限の一部を解決しながら、同じ試験の性能を可能にする。長方形アリーナの2つの反対側のコーナーに位置する三角形のチャンバーの使用は、被験者刺激相互作用領域を適切に定義された平面に制限し、調査行動の正確な自動分析を可能にします。1つの利点は、分析ソフトウェア(TrackRodent)を使用して、各検定の複数の行動パラメータを計算することです。また、パラダイムの様々な段階でアリーナのランダムな反対側のコーナーにチャンバーの再配置を可能にし、空間ナビゲーションスキルの任意の効果を中和します。
さらに、各ステージの間に空のままであるアリーナの2つのコーナーは、被験者に休息とグルーミングのための便利な場所を提供し、誤検知の結果を最小限に抑え、チャンバーから離れて引き出します。したがって、システムは、SPおよびSNPテスト中に各刺激を調査する被験者の動機の直接評価を可能にする。さらに、ビデオの動作分析はTrackRodentソフトウェアによって自動化された方法で行われるため、実験者は分析のために複数のムービーをロードし、それぞれに対して正しいパラメータを定義し、ソフトウェアを一晩で処理させ、貴重な時間を節約することができます。特に、このシステムは、男性と女性の社会的刺激または明確な株の刺激のようなあらゆるタイプの社会的差別テストに使用され得る。さらに、このシステムを使用して追跡できる被験者のサイズに制限(上下)はありません。したがって、若年性または肥満動物と共に使用され得る。この実験システムは安価で生産が簡単で、分析に使用されるコンピュータコードはオープンソースコードとして一般に公開されており、どの研究室でも簡単にこの方法を採用することができます。
システム内の調査動作の自動検出は、被験者の身体輪郭と実験者によって定義された各領域との間の物理的接触の検出に基づいています。.したがって、被験者が頭部ではなく身体で「刺激」領域に触れた場合、この事象は調査(すなわち偽陽性)とみなされます。この目的のために、被験者の頭部を識別し、頭部と「刺激」の間の接触のみを考慮する、頭方向ベースのアルゴリズムが生成された。ただし、このアルゴリズムは本体ベースのアルゴリズムよりも大幅に遅く実行されます。したがって、実験的な条件がそれを必要としない限り、多数の映画の分析にはお勧めしません。
2つのアルゴリズムの間で同様の結果(1.1%の差、n =11の実験、それぞれ5分、データは示されていません)が観察されました。したがって、本体ベースのアルゴリズムが最も頻繁に使用されました。ここでは、大きな動物群の分析が提示されるが、システムによって測定された全調査時間に基づいて、2つの刺激間の統計的に有意な差を観察するためには、はるかに小さいグループサイズが必要である。例えば、電力計算では、マウスのSPおよびSNP試験に必要なのは5匹と8匹の動物のサンプルサイズだけである(α= 0.05、パワー= 0.8)ことが明らかになった。しかし、社会的行動のすべてのダイナミクスの観察を確実にするために、ここでかなり大きな動物群が使用されました。
システムでは、実験者が被験者の身体輪郭を検出するためのしきい値を手動で定義する必要があります。使用する適切なしきい値を見つけるには、ある程度の経験が必要な場合があります。したがって、このシステムで使用されるほとんどのアルゴリズムには、通常の低速バージョンがあります。これらのバージョンでは、分析されたムービーが表示され、調査イベントがオンラインで検出されますが、高速バージョンではオンライン プレゼンテーションが有効になっていません。新しいユーザーは、通常のバージョンを使用し、分析をオンラインで監視して、正しく動作することを確認し、分析手順の経験を収集した後にのみ「高速」アルゴリズムを使用することをお勧めします。
3チャンバーテストに対するこのシステムの利点の1つは、調査行動の複数のパラメータを測定し、より詳細な分析をサポートすることです。この利点は2倍です。第一に、実験者は、好みを決定するために総調査時間だけに依存する必要はありません。長い調査の打撃と長い間隔は、別の刺激の好みを検出するときの総調査時間よりも敏感であることがわかりました。これらのパラメータに関しては、5分セッションの終了時に長い調査のバウトと間隔が途中で終了するので、テストの最後の分の間に値が下向きに偏っていることに留意すべきです。
第二に、複数のパラメータは、様々な操作に続く社会調査のダイナミクスの微妙な変化を検出することを可能にする。例えば、C57BL/6J雄マウスはウィスカートリミング後に社会的嗜好を失ったことがわかった。対照的に、SDの雄のラットは社会的嗜好を維持したが、テストの初期段階では、より短い調査の打撃とより高いレベルの遷移によって示すように、社会的行動のダイナミクスを変更した。全体として、これらのデータは、ウィスカートリミング後の社会的相互作用に対するラットおよびマウスの傾向の減少を示唆している。したがって、このシステムは、様々な操作に非常に敏感である社会的行動のダイナミクスの厳密な分析をサポートしています。
要約すると、社会調査行動ダイナミクスの自動解析を支援する、斬新でシンプルで手頃な価格の実験システムを紹介した。このシステムは、様々な株や小さなげっ歯類の遺伝子組み換えラインにおける社会的行動の欠陥の詳細な分析を容易にします。さらに、ここで実証された調査バウトの精密な検出は、被験者が電気ケーブルまたは光ファイバに接続されている間の行動を分析するこのシステムの能力と組み合わせることで、記録を含む実験での使用を可能にする社会的行動に関連する脳活動の。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
この研究は、ヒューマンフロンティア科学プログラム(HFSP助成金RGP0019/2015)、イスラエル科学財団(ISF助成金#1350/12、1361/17)、ミルグロム財団、イスラエル科学技術宇宙省(grant #3-12068)によって支援されました。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Flea3 1.3 MP Mono USB3 Vision | FLIR (formerly PointGrey) | FL3-U3-13Y3M-C | Monochromatic Camera |
FlyCap 2.0 | FLIR (formerly PointGrey) | FlyCapture 2.13.3.61X64 | Video recording software |
Home 5 minute Epoxy glue | Devocon | 20845 | For gluing the metal mesh to the Plexiglas stimuli chambers |
Matlab 2014-2019 | MathWorks | R2014a - R2019a | Programming environment |
Plexiglas boards (6 mm thickBlack or white) | Melina (1990) LTD, Israel | NaN | For arena and stimuli chambers construction |
Red led strips (60 leds per meter) connected to a 12 V power supply | 2012topdeal eBay supplier | NaN | For illumination of the acoustic chamber |
References
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