En system for oppsporer det dynamikk av sosiale preferanse opptreden inne liten Red

Summary

Beskrevet her er en roman automatisert eksperimentell system som tilbyr et alternativ til de tre-kammer test og løser også flere begrensninger. Denne system leverer mangfoldig opptreden parameterene det sette i stand streng analyse av liten gnager opptreden dynamikk under sosiale preferanse og sosiale nyhet preferanse prøver.

Abstract

Utforske nevrobiologiske mekanismer for sosial atferd krever atferdsdata tester som kan brukes til dyremodeller i en upartisk og observatør-uavhengig måte. Siden begynnelsen av årtusenet, de tre-kammer test har vært mye brukt som et standard paradigme å evaluere omgjengelighet (sosial preferanse) og sosial nyhet preferanse i små gnagere. Imidlertid lider denne testen av flere begrensninger, inkludert avhengigheten av romlig navigasjon og uaktsomhet av atferds dynamikk. Presentert og validert her er en roman eksperimentelle system som tilbyr et alternativ til de tre-kammer test, samtidig løse noen av sine begrensninger. Systemet krever en enkel og rimelig eksperimentell apparat og offentlig tilgjengelig åpen kildekodeanalyse system, som automatisk måler og analyserer flere atferdsdata parametere på individ-og befolkningsnivå. Den gir detaljert analyse av atferdsdata dynamikken i små gnagere under enhver sosial diskriminering test. Vi viser effektiviteten av systemet i å analysere dynamikken i sosial atferd under sosiale preferanser og sosial nyhet preferanse tester som utføres av voksne mannlige mus og rotter. Videre validerer vi evnen til systemet for å avdekke endrede dynamikken i sosial adferd i gnagere etter manipulasjoner som whisker trimming. Således, systemet innrømmer for streng granskning av sosiale opptreden og dynamikk inne liten gnager modeller og hjelper flere akkurat Sammenligningene imellom belastninger, vilkårene, og handling.

Introduction

Avslører de biologiske mekanismer underliggende neurodevelopmental lidelser (NDDs) er en av de viktigste utfordringene på området nevrovitenskap¹. Adressering denne utfordringen krever atferdsmessige paradigmer og eksperimentelle systemer som typisk oppførselen til gnagere i en standard og upartisk måte. En innflytelsesrik studie publisert mer enn et ti år siden av Moy og kolleger² presenterte tre-kammer test. Siden da har denne testen blitt mye brukt til å undersøke sosial adferd i gnager modeller av NDDs. Denne testen evaluerer to medfødte tendenser av gnagere: 1) å bo i nærheten av en sosial stimulans over et objekt (omgjengelighet, også kalt sosial preferanse [SP]), og 2) å foretrekke nærhet til en roman sosial stimulans over en kjent ett (sosial nyhet preferanse [SNP])^3,4. Flere påfølgende studier foreslo metoder for automatisert analyse av tre-kammer test ved hjelp av datastyrte metoder^5,6.

Denne testen fortsatt lider av flere begrensninger. For det første undersøker det i hovedsak sosiale sted preferanse snarere enn motivasjonen til faget for å direkte samhandle med en sosial stimulans, selv om noen grupper også måle olfactory gransking (sniffing) tid, enten manuelt⁷ eller ved hjelp av kommersielle datastyrte systemer^8,9,10. For det andre er de tre-kammer test mest brukt for å måle den totale tiden brukt av faget i hvert kammer, og det forsømmer atferdsdata dynamikk. Til slutt, det er avhengig av bare ett aspekt av den sosiale atferden, som er tiden som brukes av faget i hvert kammer (eller sniffing tid, hvis målt).

Her presenterer vi en ny og rimelig eksperimentell system som er et alternativ til de tre-kammer apparater. Den likeledes innrømmer gjennomførelse av det likt opptreden prøver stund løser det ovennevnte advarsler. Den presenterte atferds systemet automatisk og direkte måler undersøkende atferden til en gnager mot to stimuli. I tillegg analyserer den atferdsmessige dynamikken i en observatør-uavhengig måte. Videre måler dette systemet flere atferds parametere og analyserer disse på både individuelle og befolknings nivåer; dermed støtter den en streng analyse av sosial atferd og dens dynamikk under hver test. Videre, tilfeldig omplassering av kamrene i motsatte hjørner av arenaen under de ulike test stadier nøytraliserer noen effekter av romlig minne eller preferanse. Dette systemet kan også brukes til andre diskriminering tester, for eksempel sex diskriminering. Den egendefinerte apparater er lett å produsere, og analyse systemet er offentlig tilgjengelig som en åpen kildekode, og dermed tillater bruk i ethvert laboratorium. Vi demonstrerer evnen til dette systemet til å måle flere parametre for sosial atferd i gnager stammer med distinkte pels farger under sosiale preferanser og sosiale nyhet preferanse tester. Vi validerer også evnen til systemet å avdekke endrede dynamikken i sosial adferd i gnagere etter manipulasjoner, for eksempel whisker trimming.

TrackRodent programvare: tre algoritmer ble skrevet i MATLAB (2014a-2019a) for å spore den eksperimentelle faget og dens interaksjon med stimuli. Alle algoritmer ble avsatt i GitHub, funnet på < https://github.com/shainetser/TrackRodent >. Hovedformålet med alle fire algoritmer er å spore konturene av motivet kropp å oppdage noen direkte kontakt med stimuli områder.

Body-basert algoritme: denne algoritmen har tre versjoner som sporer konturene av en theunwired mørk mus på hvit bakgrunn (BlackMouseBodyBased), en hvit mus på en mørk bakgrunn (WhiteMouseBodyBased), eller en hvit rotte på en mørk bakgrunn (WhiteRatBodyBased ). Det grafiske brukergrensesnittet (GUI) av programvaren krever at eksperimentator velger et eksperiment som bruker enten mus eller rotter, og deretter velger den riktige koden. For hver versjon av algoritmen, er det to valgfrie koder: en som presenterer sporings prosessen på skjermen mens den utfører analysen, og en som ikke (derav, det går raskere og kalles "rask"). Navnene på de relevante kodene for BlackMouseBodyBased-algoritmen er for eksempel: "BlackMouseBodyBased23_7_14" og "BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast". Alle algoritmer som slutter med "rask" ikke viser sporing på nettet, og brukerne må direkte lagre dataene til resultatene filen (. mat fil). Alle kroppens-baserte algoritmer krever å sette en enkelt terskel ("lav terskel" i programvaren ' s GUI) for å oppdage kroppen av faget.

Head-retning basert algoritme: den andre algoritmen, som er tilgjengelig kun for sorte mus, er basert på den Body-baserte algoritmen, i tillegg til å bestemme hodet retning. Denne algoritmen oppdager samspillet av faget hode med "stimuli" områder, og dermed unngår falske positiver som kan oppstå fra tilfeldige kontakter av faget med disse områdene. For denne algoritmen er to deteksjon terskler av musen kroppens konturer definert: høy terskel, som inkluderer lysere halen av sorte mus, og lav terskel, som inkluderer kroppen uten hale. Deretter passer algoritmen en ellipsoiden til de oppdagede grenser ved hjelp av nedre terskel og definerer plasseringen av musen hodet og halen (uten skille mellom de to). Den endelige diskriminering mellom halen og hodet er basert på grensene definert av høyere terskel.

Wired dyr algoritme: den tredje algoritmen tar sikte på å minimere gjenstander som følge av kabler (dvs. elektrisk wire eller optisk fiber) koblet til dyret, slik at analyse av dyrets atferd mens du er koblet til en kabel. Denne algoritmen har koder bare for svart mus og hvit rotter. Koden for rotter krever at eksperimentator definerer både lave og høye terskler, mens muse koden krever bare en lav terskel.

Protocol

Alle metodene som er beskrevet har blitt godkjent av den institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC) ved Universitetet i Haifa.

1. eksperimentell oppsett

1. Arena
   1. Konstruere den eksperimentelle arena for mus (figur 1A, D) ved å plassere en hvit eller svart (avhengig av dyrets farge) plexiglass boksen (37 cm x 22 cm x 35 cm) i midten av et akustisk kammer (60 cm x 65 cm x 80 cm, laget av 2 cm tykk tre belagt på innsiden med 2 cm tykt skum). For lyset, fjerne en stripe (2 cm bred, 10 cm under taket av kammeret) av skummet rundt det akustiske kammeret (i tillegg til døren), og fest en LED-stripe med enten røde eller hvite lyspærer. Sørg for at lyset er så ensartet som mulig rundt arenaen for å hindre refleksjoner.
   2. Konstruere arenaen for rotter på samme måte som den som er beskrevet ovenfor for mus, med forskjellige dimensjoner som passer riktig til størrelsen på Sprague-Dawley (SD) rotter (figur 1G). Plasser en svart plexiglass boks (50 cm x 50 cm x 40 cm) i midten av et akustisk kammer (90 cm x 60 cm x 85 cm, laget av 2 cm tykt tre belagt på innsiden med 2 cm tykt skum).
2. Kamre
   1. For mus, lage to svart eller hvitt (avhengig av pels farge) trekantede kamre (12 cm likebent, 35 cm høyde, med gulvene lukket) fra 6 mm tykk plexiglass. Finn dem i to tilfeldig valgte motsatte hjørner av arenaen (figur 1B, E). Stick en metall mesh (18 mm x 6 cm; 1 cm x 1 cm hull) i den nedre delen av hvert kammer ved hjelp av epoxy lim for å tillate direkte interaksjon med stimulans gjennom mesh (figur 1C, F). Merk hvert kammer på en måte som tillater diskriminering fra de andre i en video uten å gi ledetråder til fagene (se figur 1B, E for eksempler).
      Merk: Hvert kammer vil til slutt inneholde en sosial stimulans (mus) eller objekt (plast leketøy, 5 cm x 5 cm x 5 cm, med en distinkt form og farge; Figur 1C, jeg har et opp- La epoxy lim lukter fordamper i minst en uke før bruk.
   2. For rotter, opprette to sorte trekantede kamre (20,5 cm likebent, 40 cm høyde, laget av 6 mm tykke plexiglass, med gulvene lukket) og plassere dem i to tilfeldig utvalgte hjørner av arenaen (figur 1H), hver med en metall mesh (25 cm x 7 cm; 2,5 cm x 1 cm hull) som dekker den nedre delen (figur 1I).
3. Plasser en høy kvalitet monokromatisk kamera, utstyrt med en vidvinkelobjektiv, på toppen av det akustiske kammeret og koble den til en datamaskin for å muliggjøre klar visning og opptak av motivet atferd ved hjelp av kommersiell programvare (se tabell over materialer for forslag).

2. Behavioral paradigme

Merk: Trinn 2.1-2.7 beskrive atferdsdata paradigmet for mus. Se avsnitt 2,8 for spesifikke instruksjoner som involverer rotter.

1. Pass på at burene av alle dyr (fag: 2-4 måneder gamle mannlige mus, stimuli: 21-30 dag gamle unge mus) forblir i eksperimentell rom i minst 1 time før du begynner atferdsdata eksperimentet.
2. Etter acclimation periode, sette inn to tomme kamre i arenaen tilfeldig på to motstående hjørner. Plasser motivet i midten av arenaen i 15 min av tilvenning. I løpet av den tiden, plasserer de to sosiale stimuli, hver i et annet kammer som ligger ute av arenaen for tilvenning. Plasser et objekt (en plast leketøy, 5 cm x 5 cm x 5 cm, med en distinkt form og farge) i et annet kammer.
3. Hvis du vil utføre testen for sosial preferanse (SP), starter du videoinnspilling og fortsetter innspillingen til slutten av testen.
4. Fjern de to tomme kamre og umiddelbart sette inn objektet og en av de sosiale stimuli, hver i en distinkt kammer. Finn disse kamrene tilfeldig i motsatt hjørner av arenaen som var tomme under tilvenning. Tillat faget å samhandle med stimuli for 5 min av SP test. Stopp innspillingen på slutten av testen.
5. Etter SP-testen, Fjern stimuli som inneholder kamre fra arenaen og la motivet stå i den tomme arenaen i 15 min. Rengjør kamrene utenfra med 10% etanol kluter.
6. For å utføre sosiale nyhet preferanse (SNP) test, start videoopptak og sette inn to kamre i arenaen: en som inneholder samme sosiale stimulans brukes for SP test (kjent stimulans), og den andre inneholder romanen sosial stimulans. Plasser disse kamrene tilfeldig i to motsatte hjørner av arenaen, noe som gjør at disse stedene ikke ble brukt til SP-testen. Tillat faget å samhandle med stimuli for 5 min av SNP test.
7. På slutten av SNP test, stopp videoopptak, fjerne faget og kamre fra arenaen, og plassere motivet tilbake i sitt hjem buret. La stimuli i kamrene for neste eksperiment (med et annet emne) eller returnere dem til sine hjem bur. Rengjør arenaen og kamre med rennende vann etterfulgt av 10% etanol og la tørke.
8. Behavioral paradigme for rotter
   1. For rotter, gjentagelse det opptreden paradigme beskrevet inne skritt 2.1-2.7, med to modifiseringer: 1) hånd rotta emner og venne det sosiale stimuli å det kammer for 2 dager (10 min hver dag) tidligere å forsøket; og 2) forlenge SP-test for 15 min å gi rottene en lengre periode med eksponering for sosiale stimuli. Senere begrense analysen av SP-testen til den første 5 min.
      Merk: Minst en arena og fem kamre er nødvendig for å kjøre en enkelt økt.

3. bruke TrackRodent GUI for atferdsanalyse

Merk: Se den øvre panel av figur 2A for The TrackRodent GUI.

1. Åpne MATLAB (testet med 2014a-2019a) og velg mappen TrackRodent
2. Legg til alle undermapper i arbeids banen ved å høyreklikke på hver mappe og velge Legg til i bane | Valgte mapper og undermapper.
3. Type TrackRodent inne kommandoen vindu og presse gå inn.
4. Last opp en enkelt fil eller flere videofiler (AVI eller MP4-format) ved å velge Last Session fil (AVI).
5. En film inspektør, slik at inspeksjon av videoklippet ramme-for-ramme, vil umiddelbart bli åpnet for den første filen i listen (figur 2A). Bruk den til å undersøke videoklippet og definere første og siste del av segmentet som skal analyseres. Registrer tallene for disse rammene, som vil bli nødvendig senere. Lukk vinduet når du er ferdig.
6. Hvis du vil kontrollere flere videofiler, åpner du video inspektøren når som helst ved å trykke på Inspiser film og velge en bestemt videofil.
7. Velge arten testet (musen eller rotten; musen er uteblivelsen).
8. Ekskluder alle områder som kan avbryte sporingen, i samsvar med fargene i faget og Arena (svart eller hvit).
   1. Hvis du vil utelate et gitt område, trykker du Ekskluder-området, og når markøren endres til en kryss figur, merker du alle hjørner av området for ekskludering. Når du er ferdig, høyreklikker du på musen, deretter dobbelt venstre-klikk på midten av det markerte området. Det ekskluderte området vil bli en nyanse av rødt på skjermen. Gjenta denne fremgangsmåten for å utelate så mange områder som nødvendig.
9. For å fjerne et område fra eksklusjon, trykk Fjern ekskludert området, deretter (ved hjelp av krysset markøren) klikk på området som skal fjernes fra utelukkelse.
10. For å definere hvert kammer som en "stimulans" området, for automatisk påvisning av etterforskningen av faget, velger formen på "stimulans" området for å være enten polygon eller elliptiske ved å merke den aktuelle boksen, og deretter trykke stimulans X (der "X" representerer 1, 2 eller 3). Merk "stimulans" områder på samme måte som de ekskluderte områdene, som deretter vil bli gul i fargen. For å endre plasseringen av en bestemt "stimulans" området, trykk stimulans X igjen og merke den nye området sted (dette vil automatisk oppdatere plasseringen).
    Merk: Velg de forskjellige stimuli nummeret på en konsistent måte for alle filer (dvs. objekt som stimulans 1 for alle SP test filer).
11. For å spore tilstedeværelsen av motivet i et bestemt virtuelt rom inne i arenaen, Velg formen på "kupé området" (polygon eller elliptisk), og trykk deretter på rom x (der "x" representerer 1, 2, 3, 4 eller 5). Merk "kupé" områder på samme måte som de ekskluderte eller stimuli områder, som deretter vil bli blå i fargen. For å endre plasseringen av et bestemt "kupé område" trykker du på rom X igjen og markerer det nye området (dette vil automatisk oppdatere stedet).
12. Velg ønsket algoritme (BlackMouseBodyBased ble brukt for video) fra listen (se tilgjengelige algoritmer i figur 2B).
13. Skriv tallene for start-og slutt bilder for analysen i de tilsvarende redigeringsboksene i det grafiske brukergrensesnittet.
14. Velg en terskel for registrering av emneteksten.
    Merk: De fleste algoritmer bruker "Low" terskel bare, mens hodet retnings BAS ert algoritmer bruker "høy" terskelen også. For "Low" terskelen, Velg et nivå som inkluderer mus/rotte kroppen uten halen (så mye som mulig), mens "high" terskelen bør også inkludere halen. I tilfelle av å bruke hodet retning-baserte algoritmer, vil programvaren bestemme hodet plasseringen som motsatte til halen plassering.
    Merk: Programvaren vil senere ignorerer små objekter som oppdages ved hjelp av den valgte terskelen.
15. Hvis du vil evaluere automatisk gjenkjenning av emne kantlinjene for en gitt terskel, setter du inn en verdi i det aktuelle terskel feltet og trykker ENTER på tastaturet.
16. Når du velger flere filer, flytter du til neste fil (ved hjelp av neste-knappen øverst) og velger de riktige definisjonene for hver fil. Når du er ferdig, kontrollerer du parametrene og område plasseringene for alle filene ved å flytte mellom hver av dem ved hjelp av knappene Forrige og neste øverst i det grafiske brukergrensesnittet.
    Merk: Definisjonene av alle områder og parametere er spesifikke for en gitt fil.
17. For å starte atferdsanalyse av alle valgte filer, gå til den første filen og trykk start.
18. På slutten av analysen lagres en resultat fil (. mat-fil) for hver film i samme mappe i filmfilene.
    Merk: Hvis den langsomme (ikke-rask) versjon av algoritmen brukes, vil det også lagre en versjon av filmen med et hvitt kors av sentrum av kroppens masse, som endrer fargen hver ramme som er oppdaget som undersøkende, med mindre Lagre analysert film Toggle-knappen i GUI er ukontrollert. Denne versjonen av filmen (lagret i samme katalog, med samme navn som den opprinnelige filmen, med suffikset ' analysert film ') kan brukes frakoblet for å evaluere kvaliteten på automatisk deteksjon utført av systemet.

4. bruke TrackRodent GUI for resultat presentasjon

Merk: Se det nederste panelet i figur 2A for resultat presentasjon.

1. Du kan inspisere resultatene av hver filmfil ved å trykke på Last resultatfilen og velge. mat-filene som genereres av atferdsanalysen.
2. Flytt mellom veksleknapper for å se på skjermen en av følgende analyser: sporing av muse plassering (figur 2A); Avdelinger okkupasjon langs Session (hvis "avdelinger" ble definert, ikke vist); Stimuli leting langs sesjon (figur 2C); Total tid i rom (hvis "avdelinger" ble definert, ikke vist); og total stimuli leting tid (figur 2D).
   Merk: "Stimulans" områder er områder der programvaren evaluerer faget samhandling, mens ' kupé ' områder er områder der programvaren sporer tilstedeværelsen av faget. Hvis du stopper analysen ved hjelp av knappen Stopp analyse , lagres resultatene automatisk som genereres opp til den sist analyserte rammen. For de fleste datamaskiner, bør det være mulig å laste opp og analysere så mange som 20 filmer samtidig (avhengig av datamaskinens ytelse).

5. bruke TrackRodentPopulationSummary GUI for Populasjonsanalyse (figur 2E)

1. Åpne MATLAB (testet med 2014a-2019a) og velg mappen TrackRodent
2. Type TrackRodentPopulationSummary inne kommandoen vindu og presse gå inn.
3. Last opp flere TrackRodent resultat filer (. mat-format) ved å trykke på Velg resultat filer.
4. Fylle inn tallene av vare rammen for analyse, test navnet, stimulans 1 navnet, og stimulans 2 navnet.
5. Velg de ønskede analysene fra listen over valgfrie analyser ved å krysse av i alle de aktuelle boksene.
6. Velg Eksporter resultatene til en speadsheet ved å merke av i den aktuelle boksen for å trekke ut alle resultatene av de merkede analysene som en enkeltregneark fil.
7. Trykk på Start og vent til analysen er fullført.
   Merk: Dette konkluderer analysen. Programvaren kan brukes til å analysere resultatene av så mange filmfiler som ønsket, gitt at de alle var behaviorally analysert ved hjelp av TrackRodent programvare. Analysen utført av programvaren forutsetter videoopptak med en bildefrekvens på 30 Hz. I tilfelle at en annen bildefrekvens ble brukt, multiplisere tiden med 30 og dividere med bildefrekvens brukes til opptak for å konvertere den til den riktige verdien (e).

Representative Results

Bruke systemet for den sosiale preferanse testen i C57BL/6J-mus
Figur 1 viser tre versjoner av det eksperimentelle oppsettet. Den første versjonen (figur 1A-C) er designet for mus med mørke pels farger, for eksempel C57BL/6J mus. Den andre (figur 1D-F) er planlagt for mus med lyse pels farger, for eksempel BALB/c eller ICR (CD-1) mus. Det tredje er større (skikkelsen 1G-i) og beregnet på rotter med lys fur fargene, som SD rotter. De første fagene undersøkt var naiv voksen (8-12 uker gamle), gruppe-huset (to til fem dyr per bur) mannlige C57BL/6J mus. Sosiale stimuli var juvenile (21-30 dager gamle), gruppe-huset (to å seks dyrene per bur), mannlig C57BL/6J mus. Objekt stimuli var luktfri plastleker med distinkte farger (inn i figur 1C, i). Video filer av eksperimentene ble analysert ved hjelp av TrackRodent programvare (Body-basert algoritme, se eksempler på skjermen bilde og GUI i figur 2A), som automatisk og kontinuerlig spores emne sted basert på 1) Body Center og 2) kontakt av kroppens konturer med stimuli som inneholder kamre.

Analysen involverte følgende prosedyrer. Etter å ha lastet en filmfil og grafisk definere områder som skal utelukkes fra analysen, eksperimentator grafisk definert to områder, som hver består av en distinkt kammer, som "stimuli" (figur 2a, gulaktig områder). Brukernes kanne likeledes definere til fem arealer idet virkelig ' avdelinger '. Deretter velger brukerne "BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast" algoritmen fra listen over mulige algoritmer (figur 2B). Etter å ha trykket på Start analyse knappen, sporet programvaren dyret sted ramme-for-ramme og avbildet musen plasseringen spor i arenaen (figur 2A, blå linje). I løpet av denne analysen, programvaren også spores kontakter mellom "stimuli" områder og kroppens kontur av faget (figur 2C). Slike kontakt hendelser ble definert som undersøkende og tjente til å beregne etterforskningen tid for hver stimulans og tiden der ingen etterforskning atferd ble vist (figur 2D). Som tydelig i figur 2C, D viser analysert filmen, høyere etterforskning tid for "stimulans 2 ble observert", som var sosial stimulans, sammenlignet med objektet, som i dette tilfellet ble definert som "stimulans 1 '.

Befolknings analyse av den sosiale preferanse testen i C57BL/6J-mus
Etter at TrackRodent programvare for å analysere alle videofiler av eksperimentell gruppe, en befolkning analyse for denne gruppen ble utført ved hjelp av "TrackRodentPopulationSummary" GUI (figur 2E), mens du velger alle mulige analyser av denne programvaren. Den distinkte utganger av disse analysene for SP test utført med 58 C57BL/6J voksne mannlige mus vises i Figur 3, akkurat som de dukket opp på dataskjermen, med alle feil barer som viser SEM. statistiske analyser av disse resultatene ble tidligere utgitt¹¹.

Den gjennomsnittlige totale etterforskning tiden av befolkningen i fagene mot hver av de to stimuli (same-sex juvenile sosial stimulans og et objekt) vises i Figur 3A, som viser en klar preferanse for faget mot sosial stimulans. Selv om algoritmen er enkel, en utmerket korrelasjon ble observert (r² = 0,91, p < 10^-6, Pearson ' s korrelasjon) mellom etterforskningen tid manuelt målt ved en utdannet observatør og verdien beregnet av programvaren. Dynamikken i denne preferansen kan sees i Figur 3B, hvor den gjennomsnittlige etterforskningen tid for hver stimulans er plottet langs tid i 20 s binger. Som vist, sosiale preferanse opprettholdes av fagene gjennom hele økten, selv om det virket litt sterkere i tidlige stadier.

Figur 3C viser undersøkelses tiden for hver stimulans, kategorisert etter bout-varighet i kort (≤ 6 s), middels (> 6 s, ≤ 19 s) og lang (> 19 s) kamper, sammen med den totale undersøkelses tiden. Fordelingen av etterforskningen tid for hver stimulans i henhold til bout varighet i 1 s binger vises i Figur 3D. Som vist i Figur 3C, D, var det ingen forskjell mellom stimuli i korte utbrudd, mens middels og lange kamper viste klare sosiale preferanser. Disse resultatene tyder på at i C57BL/6J mus, korte utbrudd reflekterer nysgjerrighet, mens lange utbrudd reflekterer en interaksjon mellom faget og stimuli. Den relative varigheten av undersøkelsen (RDI, [sosial-Object]/[sosiale + Object]) verdier for hver kategori (korte, mellom store og lange kamper), samt for total undersøkelses tid, vises i Figur 3E. Som vist er den høyeste RDI-verdien oppnådd med de lange kampene, noe som tyder på at de best reflekterer de sosiale preferansene til.

For å analysere dynamikken i etterforskningen bout under testen, distribusjoner over tid for hver kategori ble separat plottet. Distribusjonene over tid av den korte (Figur 3F) og medium (Figur 3G) etterforskning anfall foreslå en gradvis reduksjon av disse kampene over tid. I motsetning til dette viser en tilsvarende analyse av de lange kampene (Figur 3H) en gradvis økning i løpet av testen. Denne tendensen gjenspeiles også av fordelingen av gjennomsnittet bout varighet (Figur 3I), viser en gradvis økning over tid. Dermed virker det som om fagene utstilt nysgjerrighet hovedsakelig i de tidlige stadier av testen, mens de senere vist mer interaksjon med stimuli. Det bør bemerkes at i løpet av siste minutt, er det en iboende skjevhet av analysen mot korte kamper, fordi lange utbrudd ble kunstig avsluttet på slutten av økten. Derfor, når de vurderer tiden løpet av etterforskningen kamper, siste minutt bør ignoreres.

Vi har også analysert intervallene mellom påfølgende etterforskning kamper mot samme stimulans (dvs. den tiden det tok faget å gå tilbake til samme stimulans etter slutten av hver etterforskning bout). Denne parameteren reflekterer trangen av faget å gå tilbake til samme stimulans og undersøke. Her ble intervallene også kategorisert i korte (≤ 5 s), medium (> 5 s, ≤ 20 s) og lange (> 20 s) kamper, som vises sammen med total tidsintervaller for hver stimulans i Figur 3J. Histogrammet med intervallene i 1 s hyller vises i Figur 3K. Som vist i Figur 3J, K, intervallene mellom undersøkelser av sosial stimulans var mye kortere enn de mellom undersøkelser av objektet. Følgelig gav RDI-verdiene av intervaller i det lange området den høyeste absolutte verdien (Figur 3L); Derfor kan de brukes som et undersøkende tids uavhengig variabel vurdere sosiale preferanse. Distribusjonene over tid av intervaller plottet separat for hver kategori (Figur 3M-O) foreslår en gradvis reduksjon i korte og mellom store intervaller og en motsatt endring i lange intervaller mellom etterforskning utbrudd, som mest sannsynlig reflekterer den generelle forlengelsen av etterforskningen kamper. I likhet med fordelingen av etterforskningen utbrudd, siste minutt av intervaller er forutinntatt mot korte verdier og bør ignoreres.

Vi har også analysert overganger observert i fra en stimulans til en annen. Dette plottet vises i Figur 3P, der hver timepoint faget begynte å undersøke en ny stimulans er preget av en blå prikk, representerer hver rad en distinkt emne, og den røde linjen representerer gjennomsnittlig overgangs raten. Som tydelig var overgangen rate høyeste (~ 1,5 overganger/min) i løpet av de første 2 min av testen og ble gradvis redusert til mindre enn 50% av peak. Den samme tendensen er tydelig fra fordelingen av gjennomsnittlig overgangs rate over tid (Figur 3Q).

Til slutt, heatmaps av etterforskningen kamper mot sosial stimulans (Figur 3R) og objekt (Figur 3S) i løpet av testen for hvert emne er vist, med fargene merking bout varighet (Figur 3S). Alt i alt resultatene tyder på at i C57Bl/6J mus, SP testen er grovt delt inn i en tidlig undersøkende fase (preget av en høy overgang rate og kort etterforskning kamper) og en sen interaksjon fase (preget av lav overgang rate og lang etterforskning kamper).

Befolknings analyse av sosiale nyhet preferanse test i SD rotter
Figur 4 viser den samme analysen som ovenfor for SNP test utført av 59 SD rotter. Vanligvis preferanse for romanen vs. kjente sosiale stimuli er svakere enn preferanse mot en roman sosial stimulans vs. et objekt, utstilt av mus i SP-testen (Figur 3). Likevel er det sosiale nyhet preferanse gjenspeiles tydelig av alle parametere. Spesielt, som konkluderte over fra SP test i mus, den lange etterforskningen kamper og lange intervaller er parametrene mest tydelig viser forskjellene mellom stimuli, som gjenspeiles av deres høyeste absolutte RDI verdier (Figur 4E, L; det bør bemerkes at RDI verdier for SNP testen er definert som [kjent-romanen]/[kjent + Novel]).

Tap av kinnskjegg svekker sosiale preferanser i både C57BL/6J-mus og SD-rotter
For å evaluere effekten av somatosensory manipulasjon på dynamikken i sosial atferd, ble analysen utført av SP test fullført av 29 C57BL/6J mus og 33 SD rotter etter whisker trimming (gjennomført 3-7 dager før testing). Deretter ble disse resultatene sammenlignet med kontroll dyr. Som vist i figur 5a-F, whisker-trimmet mus ikke foretrekker den sosiale stimulans over objektet, som gjenspeiles av mangelen på forskjell i etterforskningen tid mellom de to stimuli (sammenlign figur 5a til figur 5D) og tap av lang etterforskning kamper mot sosial stimulans (sammenlign figur 5B til figur 5E). Interessant, whisker-trimmet mus viste også økt utbredelsen av overgangen i forhold til kontroll mus (sammenlign figur 5C til figur 5F).

I alt tyder disse dataene på at whisker mus har markert redusert varigheten av deres interaksjon med sosial stimulans. I motsetning til mus hadde ikke whisker-trimmet rotter mistet sine sosiale preferanser (figur 5G-L). Men de betydelig endret sin atferd i løpet av første minutt av testen, da de hadde færre lange etterforskning anfall (sammenlign figur 5H å figur 5K) og mange flere overganger (sammenlign figur 5i å figur 5L). Således, whisker trimming betydelig modifisert oppførselen av begge to rotter og mus inne det SP test, bortsett fra inne en meget annerledes måte imellom det to art. Disse resultatene tyder på en distinkt rolle for whisker-avhengige somatosensory stimulering i sosiale interaksjoner av rotter og mus.

Figur 1: eksperimentell oppsett. (A) en skjematisk fremstilling av den eksperimentelle arenaen designet for mus med svart pels. (B) et bilde av arenaen ovenfra, ved hjelp av svakt rødt lys, viser en C57BL/6J emne musen i arenaen. (C) et bilde som viser det meshed området av et hvitt kammer, der motivet samhandler med en stimulans (innfelt: et bilde av et objekt stimulans brukes for mus). (D-F) Som vist i paneler A-C, en eksperimentell Arena og kamre designet for mus med lys pels. (G-I) Idet vist inne panel en-C, en eksperimentelle Arena og kamre beregnet på rotter med lys fur (innfelt inne [jeg]: bilde av en gjenstand stimulans anvendt for rotter). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: TrackRodent programvare. (A) en skjerm av en datamaskin som kjører TrackRodent programvare. Venstre: videobildet i begynnelsen av den analyserte filmen (første bilde valgt av eksperimentator), viser merket "stimuli" områder og spores bevegelse banen til C57BL/6J emne. Høyre: programvaren GUI. (B) listen over valgfrie koder av programvaren som skal brukes med GUI. Hver av disse kodene passer en distinkt eksperimentell tilstand. (C) analyse av det spesifikke eksperimentet vist i panel A, når muligheten for stimuli leting langs økten ble valgt i resultatene presentasjonen delen av GUI. Dette plottet viser (på hver ramme) om motivet var i kontakt med ' stimulans 1 ' eller ' stimulans 2 '. I den presenterte saken, en klar preferanse mot "stimulans 2" er tydelig av høyere antall og varighet av etterforskningen anfall oppdaget mot denne stimulans. (D) analysen av eksperimentet vist i panelene A og C, da muligheten for Total stimuli leting tid ble valgt i resultatene presentasjonen delen av GUI. Også her, en klar preferanse mot "stimulans 2" er tydelig fra høyere nivå av etterforskningen tid mot denne stimulans. (E) GUI av TrackRodentPopulationSummary programvare som muliggjør analyse og plotting av resultatene fra en populasjon av dyr, som hver er analysert ved hjelp av TrackRodent programvare (se Figur 3 for resultatene av slike analyser). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: analysere etterforskningen atferden til C57BL/6J mus under SP test ved hjelp av TrackRodent programvare. Denne illustrasjonen viser de ulike plott av alle valgfrie analyser av TrackRodentPopulationSummary programvare (figur 2e) ansatt for en befolkning på 58 C57BL/6J voksne mannlige mus utfører SP test. De ulike plott vises i en lignende rekkefølge og måte som de dukket opp på dataskjermen (se representative resultater delen for en detaljert forklaring av hvert plott). (A) total tid for stimuli etterforskning, (B) gransking av stimuli langs tid, (C) kort vs lange kamper-total tid, (D) 1s histogram av anfall, (E) kort vs lange utbrudd-RDI,(F) < 6 s kamper langs tiden,(G) 6 − 19 s kamper langs tid, (H) > 19 s kamper langs tid, (I) Mean bout varighet langs tid, (J) kort vs lange intervaller-total tid, (K) 1 s bin histogram med intervaller, (L) kort vs lang intervaller-RDI, (M) < 5 s intervaller langs tid, (N) 5 − 20 s intervaller langs tid, (O) > 20 s intervaller langs tid, (P) overganger mellom stimuli-raster plot, (Q) overgang mellom stimuli langs ganger, (R) Heat-kart over bout varighet med sosiale, (s) Heat-kart over bout varighet med objekt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4: analysere etterforskningen atferden til SD rotter under SNP test ved hjelp av TrackRodent programvare. Tomter for alle valgfrie analyser av TrackRodentPopulationSummary programvare (figur 2e) ansatt for en befolkning på 59 SD voksne hannrotter utføre SNP testen. De ulike plott vises i en lignende rekkefølge og måte som de dukket opp på dataskjermen (se representative resultater delen for en detaljert forklaring av hvert plott). (A-Q) Samme som beskrevet i Figur 3. (R) Heat-kart over bout varighet med kjente, (S) Heat-kart over bout varighet med Novel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5: whisker av mus og rotter differensielt svekker sosial adferd. (A) plot of Mean etterforskning tid (målt i 20 s binger) under SP test for mannlige C57BL/6J mus (n = 58). (B) distribusjon (1 min binger) av gjennomsnittlig total tid for lang (> 19 s) etterforskning kamper langs SP test vist i panel A for sosiale og objekt stimuli. Legg merke til mye lengre tid for lang etterforskning kamper mot sosial stimulans i forhold til objektet. (C) fordeling (1 min binger) av overgangs raten langs tidspunktet for SP-testen som vises i (A). (D-F) Som vist i panel A-C, 29 mus kinnskjegg ble trimmet ca 1 uke før testen. Disse dyrene mistet sin sosiale preferanse, som gjenspeiles av (D) generell undersøkelse tid og (E) fordeling av lange utbrudd. De viste også en høyere generell rate av overganger (F), noe som tyder mindre vedvarende interaksjoner med sosial stimulans. (G-I) Som vist i panelene A-C, utførte 60 SD-rotter en SP-test. Note det annerledes dynamikken av rottene ' opptreden sammenlignet med mus, med lavere overgang ratene og lengere perioder av lang granskning utbrudd inne det tidlig Phase (2 min) av prøven. (J-L) Idet vist inne panel G-H, 33 rotter var whisker-trimming. Note det stund rottene bydde ikke miste sosiale preferanse fulgte whisker-trimmer idet mus did, det dynamikken av deres sosiale opptreden inne det for det første 2 min av prøven var forandret, viser flere overgang og færre lang utbrudd. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Den eksperimentelle systemet er beskrevet her, som ble utformet som et alternativ til de tre-kammer apparat^2,5, tillater ytelsen til de samme testene mens løse noen av sine begrensninger. Bruken av trekantede kamre, som ligger i to motsatte hjørner av den rektangulære arenaen begrenser faget-stimulans samspill området til en veldefinert plan, og dermed muliggjør presis automatisert analyse av etterforskningen atferd. En fordel er bruken av analyseprogramvaren (TrackRodent) til å beregne flere atferds parametere for hver test. Den tillater også omplassering av kamre i tilfeldig motsatte hjørner av arenaen under de ulike stadier av paradigmet, nøytralisere noen effekter av romlig navigasjon ferdigheter.

Videre er de to hjørnene av arenaen, som er tomme under hver etappe, tilbyr faget et praktisk sted for hvile og stell og trekke den bort fra kamrene, minimere falske positive resultater. Dermed tillater systemet direkte vurdering av faget motivasjon til å undersøke hver stimulans under SP og SNP tester. Videre, som atferdsanalyse av videoene er gjort på en automatisert måte av TrackRodent programvare, en eksperimentator kan laste flere filmer for analyse, definere de riktige parametrene for hver, og la programvaren prosessen over natten, noe som sparer dyrebar tid. Spesielt, systemet kan brukes til alle typer sosial diskriminering test, slik som diskriminering mellom mannlige og kvinnelige sosiale stimuli eller stimuli av distinkte stammer. Videre er det ingen grenser (øvre/nedre) til størrelsen på fagene som kan spores ved hjelp av dette systemet; Dermed kan det brukes med yngel eller overvektige dyr. Dette eksperimentelle systemet er billig og enkel å produsere, og datamaskinen koder som brukes for analyse er offentlig tilgjengelig som en åpen kildekode-koder, slik at ethvert laboratorium for enkelt å vedta metoden.

Den automatiserte oppdagelsen av undersøkelses atferd i systemet er basert på påvisning av fysisk kontakt mellom kroppens konturer av et subjekt og hvert av områdene definert av eksperimentator som "stimuli". Således, hvis motivet berører "stimuli" område med kroppen sin i stedet for hodet, er denne hendelsen anses undersøkende (dvs. en falsk positiv). For dette formålet, hode-retning basert algoritme ble generert, som identifiserer leder av faget og tar hensyn til bare kontakt mellom hodet og "stimuli". Denne algoritmen kjører imidlertid betydelig tregere enn de Body-baserte algoritmene. Derfor er det ikke anbefalt for analyse av et stort antall filmer, med mindre eksperimentelle forhold krever det.

Lignende resultater ble observert (1,1% differanse, n = 11 eksperimenter, 5 min hver, data ikke vist) mellom de to algoritmene; Derfor, det kropp-basert algoritmer var oftest anvendt. Det bør bemerkes at selv om analyser av store grupper av dyr er presentert her, en mye mindre gruppe størrelse er nødvendig for å observere en statistisk signifikant forskjell mellom to stimuli, basert på den totale undersøkelsen tid målt av systemet. For eksempel viste makt beregninger at utvalgsstørrelser på bare fem og åtte dyr er nødvendig for SP og SNP tester av mus, henholdsvis (α = 0,05, Power = 0,8). Likevel, betydelig større grupper av dyr ble brukt her for å sikre observasjon av alle dynamikken i sosial atferd.

Systemet krever at eksperimentator manuelt definerer terskelen for påvisning av kroppens kroppskonturer. Finne riktig terskel som skal brukes kan kreve litt erfaring; Herav, høyst algoritmer anvendt i denne system ha stamgjest, senere versjoner. Disse versjonene presentere analysert filmen og oppdage etterforskning hendelser på nettet, mens deres raske versjoner ikke aktiverer online presentasjon. Det anbefales at nye brukere bruker de vanlige versjonene og overvåker analysene på nettet for å sikre at de fungerer som de skal, og at de bare bruker de "raske" algoritmene etter at de har samlet erfaring med analyse prosedyren.

En fordel med dette systemet over tre-kammer testen er at den måler flere parametre for etterforskning atferd, og dermed støtte mer detaljerte analyser. Denne fordelen er todelt. Først eksperimentator ikke å stole utelukkende på den totale etterforskningen tid til å bestemme preferanse. Det ble funnet at den lange etterforskningen kamper og lange intervaller er mer følsomme enn den totale etterforskningen tid når oppdager en preferanse for en stimulans over en annen. Når det gjelder disse parametrene, bør det bemerkes at deres verdier i løpet av siste minutt av testen er partisk nedover, som den lange etterforskningen kamper og intervaller er for tidlig avsluttet på slutten av 5-min økt.

For det andre, flere parametre tillate påvisning av subtile endringer i dynamikken i sosial etterforskning etter ulike manipulasjoner. For eksempel ble det funnet at C57BL/6J mannlige mus mistet sin sosiale preferanse etter whisker-trimming. I kontrast, SD hannrotter beholdt sin sosiale preferanse, men endret sosial atferd dynamikk som vist ved kortere etterforskning kamper og høyere nivå av overganger i den tidlige fasen av testen. Samlet disse dataene tyder på en reduksjon i tendensen til rotter og mus for sosial interaksjon etter whisker trimming. Dermed støtter dette systemet en streng analyse av dynamikken i sosial atferd, som kan være svært følsomme for ulike manipulasjoner.

Oppsummert presenterte vi her en roman, enkel og rimelig eksperimentell system som støtter automatisert analyse av sosial etterforskning atferd dynamikk. Dette systemet vil lette detaljerte analyser av sosial atferdsmessige underskudd i ulike stammer og genmodifiserte linjer av små gnagere. Videre er nøyaktig påvisning av etterforskningen anfall demonstrert her, kombinert med evnen til dette systemet til å analysere atferd mens fagene er koblet til elektriske kabler eller optiske fibre, tillater bruk i eksperimenter som involverer opptak av hjernens aktivitet knyttet til sosial adferd.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flea3 1.3 MP Mono USB3 Vision	FLIR (formerly PointGrey)	FL3-U3-13Y3M-C	Monochromatic Camera
FlyCap 2.0	FLIR (formerly PointGrey)	FlyCapture 2.13.3.61X64	Video recording software
Home 5 minute Epoxy glue	Devocon	20845	For gluing the metal mesh to the Plexiglas stimuli chambers
Matlab 2014-2019	MathWorks	R2014a - R2019a	Programming environment
Plexiglas boards (6 mm thickBlack or white)	Melina (1990) LTD, Israel	NaN	For arena and stimuli chambers construction
Red led strips (60 leds per meter) connected to a 12 V power supply	2012topdeal eBay supplier	NaN	For illumination of the acoustic chamber