Система отслеживания динамики поведения социальных предпочтений у малых грызунов

Summary

Описана здесь новая автоматизированная экспериментальная система, которая предлагает альтернативу трехкамерному тесту, а также решает несколько оговорок. Эта система поставляет несколько поведенческих параметров, которые позволяют тщательный анализ малых грызунов поведенческой динамики во время социальных предпочтений и социальной новизны предпочтения испытаний.

Abstract

Изучение нейробиологических механизмов социального поведения требует поведенческих тестов, которые могут быть применены к моделям животных беспристрастным и независимым наблюдателем образом. С начала тысячелетия трехкамерный тест широко используется в качестве стандартной парадигмы для оценки коммуникабельности (социальных предпочтений) и предпочтений в области социальной новизны у мелких грызунов. Однако этот тест страдает от многочисленных ограничений, включая его зависимость от пространственной навигации и небрежность поведенческой динамики. Представлена и проверена здесь новая экспериментальная система, которая предлагает альтернативу трехкамерного испытания, а также решение некоторых из его предостережений. Система требует простого и доступного экспериментального аппарата и общедоступной системы анализа с открытым исходным кодом, которая автоматически измеряет и анализирует несколько поведенческих параметров на индивидуальном уровне и уровне населения. Это позволяет детально проанализировать поведенческую динамику мелких грызунов во время любого теста социальной дискриминации. Мы демонстрируем эффективность системы в анализе динамики социального поведения во время социальных предпочтений и социальных тестов предпочтений новизны в исполнении взрослых мышей и крыс мужского пола. Кроме того, мы проверяем способность системы выявлять измененную динамику социального поведения у грызунов после манипуляций, таких как обрезка усов. Таким образом, система позволяет тщательно исследуют социальное поведение и динамику в небольших моделях грызунов и поддерживает более точное сравнение штаммов, условий и методов лечения.

Introduction

Выявление биологических механизмов, лежащих в основе нейроразвития расстройств (NDDs) является одной из основных проблем в области неврологии¹. Для решения этой задачи требуются поведенческие парадигмы и экспериментальные системы, которые охарактеризовывают поведение грызунов стандартным и беспристрастным образом. Влиятельное исследование, опубликованное более десяти лет назад Мой и его коллеги² представил трехкамерный тест. С тех пор этот тест широко используется для исследования социального поведения в моделях грызунов НДД. Этот тест оценивает две врожденные тенденции грызунов: 1) оставаться в непосредственной близости от социального стимула над объектом (коммуникабельность, также называется социальными предпочтениями ,SP), и 2), чтобы предпочесть близость нового социального стимула над знакомым (социальная новинка предпочтения »SNP)^3,4. Несколько последующих исследований предложили методы автоматизированного анализа трехкамерного теста с использованием компьютеризированных методов^5,6.

Этот тест по-прежнему страдает от нескольких оговорок. Во-первых, он главным образом рассматривает социальные предпочтения место, а не мотивация субъекта непосредственно взаимодействовать с социальным стимулом, хотя некоторые группы также измеряют обонятельное исследование (нюхать) время, либо вручную⁷ или с использованием коммерческих компьютеризированных систем^8,9,10. Во-вторых, трехкамерный тест в основном используется для измерения общего времени, затраченного субъектом в каждой камере, и он пренебрегает поведенческой динамикой. Наконец, он опирается только на один аспект социального поведения, которое время, проведенное субъектом в каждой камере (или нюхать время, если измеряется).

Здесь мы представляем новую и доступную экспериментальную систему, которая является альтернативой трехкамерным аппаратам. Это также позволяет производительность же поведенческие тесты при решении вышеупомянутых оговорок. Представленная поведенческая система автоматически и непосредственно измеряет следственное поведение грызуна по отношению к двум раздражителям. Кроме того, он анализирует поведенческую динамику в независимом от наблюдателя манере. Кроме того, эта система измеряет несколько поведенческих параметров и анализирует их как на индивидуальном уровне, так и на уровне населения; Таким образом, он поддерживает строгий анализ социального поведения и его динамики во время каждого теста. Кроме того, случайное перепозиционирование камер в противоположных углах арены во время различных этапов тестирования нейтрализует любые эффекты пространственной памяти или предпочтений. Эта система может также использоваться для других тестов на дискриминацию, таких, как дискриминация по признаку пола. Пользовательский аппарат прост в производстве, а система анализа является общедоступной в качестве кода с открытым исходным кодом, что позволяет использовать ее в любой лаборатории. Мы демонстрируем способность этой системы измерять несколько параметров социального поведения у грызунов штаммов с различными цветами меха во время социальных предпочтений и социальной новизны предпочтения испытаний. Мы также проверяем способность системы выявлять измененную динамику социального поведения у грызунов после манипуляций, таких как обрезка усов.

TrackRodent программное обеспечение: три алгоритма были написаны в MATLAB (2014a-2019a) для отслеживания экспериментальной темы и его взаимодействия со стимулами. Все алгоритмы были депонированы в GitHub, найдены на lt;https://github.com/shainetser/TrackRodent.gt;.gt. Основной целью всех четырех алгоритмов является отслеживание контуров тела субъекта для обнаружения любого прямого контакта с областями стимулов.

Алгоритм на основе тела: этот алгоритм имеет три версии, которые отслеживают контуры непроводной темной мыши на белом фоне (BlackMouseBodyBased), белой мыши на темном фоне (WhiteMouseBodyBased), или белой крысы на темном фоне (WhiteRatBodyBased ). Графический пользовательский интерфейс (GUI) программного обеспечения требует, чтобы экспериментатор выбирает эксперимент с использованием мышей или крыс, а затем выбирает правильный код. Для каждой версии алгоритма есть два дополнительных кода: один, который представляет процесс отслеживания на экране во время выполнения анализа, и тот, который не выполняет (отсюда, он работает быстрее и называется "быстрый"). Например, имена соответствующих кодов для алгоритма BlackMouseBodyBased: "BlackMouseBodyBased23_7_14" и "BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast". Все алгоритмы, заканчивающиеся "быстрым", не отображают отслеживание в Режиме онлайн, и пользователи должны непосредственно сохранять данные в файле результатов (файл.mat). Все алгоритмы на основе тела требуют установления единого порога ("низкий порог" в ГРАФИЧЕСКОм интерфейсе программного обеспечения) для обнаружения тела субъекта.

Алгоритм, основанный на направлении головы: второй алгоритм, который доступен только для черных мышей, основан на алгоритме на основе тела, в дополнение к определению направления головы. Этот алгоритм обнаруживает взаимодействие головы субъекта с "стимулами" областях, тем самым избегая ложных срабатываний, которые могут возникнуть из случайных контактов субъекта "с этими областями. Для этого алгоритма определены два порога обнаружения контуров тела мыши: высокий порог, который включает в себя более яркий хвост черных мышей, и низкий порог, который включает в себя тело без хвоста. После этого алгоритм приспосабливает эллипсоид к обнаруженным границам с помощью нижнего порога и определяет расположение головы и хвоста мыши (без различия между ними). Окончательная дискриминация между хвостом и головой основана на границах, определенных более высоким порогом.

Проводной алгоритм животных: третий алгоритм направлен на минимизацию артефактов, полученных в результате кабелей (т.е. электрической проволоки или оптического волокна), подключенных к животному, что позволяет анализировать поведение животного при подключении к кабелю. Этот алгоритм имеет коды только для черных мышей и белых крыс. Код для крыс требует, чтобы экспериментатор определял как низкие, так и высокие пороги, в то время как код мыши требует только низкого порога.

Protocol

Все описанные методы были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Университета Хайфы.

1. Экспериментальная настройка

1. Арена
   1. Постройте экспериментальную арену для мышей(рисунок 1A,D), поместив белый или черный (в зависимости от цвета животного) плексиглас поле (37 см х 22 см х 35 см) в середине акустической камеры (60 см х 65 см х 80 см, из 2 см древесины, покрытой внутри с 2 см толщиной пены). Для освещения снимите полоску (шириной 2 см, на 10 см ниже потолка камеры) пены вокруг акустической камеры (кроме двери) и прикрепите светодиодную полосу с красными или белыми лампочками. Убедитесь, что свет как можно более однородный вокруг арены, чтобы предотвратить отражения.
   2. Постройте арену для крыс аналогично описанному выше для мышей, с различными размерами, которые соответствующим образом соответствуют размеру Крыс Sprague-Dawley (SD)(Рисунок 1G). Поместите черную коробку из плексигласа (50 см х 50 см х 40 см) в середине акустической камеры (90 см х 60 см х 85 см, изготовленную из дерева толщиной 2 см, покрытого внутри пеной толщиной 2 см).
2. Камеры
   1. Для мышей создайте две черные или белые (в зависимости от мехового цвета) треугольные камеры (12 см, высота 35 см, с закрытыми полами) от плексигласа толщиной 6 мм. Найдите их в двух случайно выбранных противоположных углах арены(рисунок 1B,E). Придерживайтесь металлической сетки (18 мм х 6 см; 1 см х 1 см отверстия) в нижней части каждой камеры с помощью эпоксидного клея, чтобы позволить прямое взаимодействие со стимулом через сетку (Рисунок 1C, F). Отметьте каждую палату таким образом, чтобы позволить дискриминацию от других в видео, не давая ключ к предметам (см. рисунок 1B, для примеров).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая камера в конечном итоге будет содержать социальный стимул (мышь) или объект (пластиковая игрушка, 5 см х 5 см х 5 см, с определенной формой и цветом; Рисунок 1C,I вставки). Пусть эпоксидный запах клея испаряется, по крайней мере за неделю до использования.
   2. Для крыс создайте две черные треугольные камеры (20,5 см, высота 40 см, из 6 мм толщиной плексигласа, с закрытыми полами) и поместите их в два случайно выбранных противоположных углах арены(рисунок 1H),каждая с металлической сеткой (25 см х 7 см; 2,5 см х 1 см отверстий), покрывающих ее нижнюю часть(рисунок 1I).
3. Поместите высококачественную монохромную камеру, оснащенную широкоугольным объективом, в верхней части акустической камеры и подключите ее к компьютеру, чтобы обеспечить четкий просмотр и запись поведения субъекта с помощью коммерческого программного обеспечения (см. Таблицу Материалов для предложений).

2. Поведенческая парадигма

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.1-2.7 описывают поведенческую парадигму для мышей. Смотрите раздел 2.8 для конкретных инструкций с участием крыс.

1. Убедитесь, что клетки всех животных (субъекты: 2-4-месячные мыши-самцы; стимулы: 21-30 дневных ювенильных мышей) остаются в экспериментальной комнате не менее 1 ч до начала поведенческого эксперимента.
2. После периода акклиматизации, вставьте две пустые камеры на арену случайным образом на двух противоположных углах. Поместите предмет в середине арены в течение 15 минут привыкания. В течение этого времени, место двух социальных стимулов, каждый в другой камере, расположенной вне арены для привыкания. Поместите предмет (пластиковая игрушка, 5 см х 5 см х 5 см, с определенной формой и цветом) в другой камере.
3. Для выполнения теста социальных предпочтений (SP) начните видеозапись и продолжайте запись до конца теста.
4. Удалите две пустые камеры и сразу же вставьте объект и один из социальных стимулов, каждый в отдельной камере. Найдите эти камеры случайным образом в противоположных углах арены, которые были пустыми во время привыкания. Разрешить субъекту взаимодействовать со стимулами в течение 5 минут теста SP. В конце теста прекратите запись.
5. После теста SP удалите с арены камеры, содержащие стимулы, и оставьте объект на пустой арене на 15 мин. Очистите камеры снаружи 10% этилового спирта.
6. Для выполнения социальной новинки предпочтения (SNP) тест, начать видеозапись и вставить две камеры на арене: один, содержащий тот же социальный стимул, используемый для теста SP (знакомый стимул), а другой, содержащий новый социальный стимул. Поместите эти камеры случайным образом в двух противоположных углах арены, убедившись, что эти места не были использованы для теста SP. Разрешить субъекту взаимодействовать со стимулами в течение 5 минут теста SNP.
7. В конце теста SNP, остановить видеозапись, удалить объект и камеры с арены, и поместить объект обратно в свою домашнюю клетку. Оставьте стимулы в камерах для следующего эксперимента (с другим предметом) или верните их в свои домашние клетки. Очистите арену и камеры с проточной водой следуют 10% этанола и дайте высохнуть.
8. Поведенческая парадигма для крыс
   1. Для крыс, повторите поведенческую парадигму, описанную в шагах 2.1-2.7, с двумя изменениями: 1) обрабатывать крыс субъектов и привыкать социальные стимулы в камеры в течение 2 дней (10 минут каждый день) до эксперимента; и 2) продлить тест SP на 15 минут, чтобы дать крыс более длительный период воздействия социальных стимулов. Позже ограничьте анализ теста SP первоначальными 5 минутами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения одной сессии требуется по крайней мере одна арена и пять камер.

3. Использование графического интерфейса TrackRodent для поведенческого анализа

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите верхнюю панель рисунка 2А для графического интерфейса TrackRodent.

1. Откройте MATLAB (проверено с 2014a-2019a) и выберите папку TrackRodent.
2. Добавьте все подфачки в рабочий путь, нажав на каждую папку и выбрав Добавить в путь Выбранные фоллеры и подфолки.
3. Введите TrackRodent в окне команды и нажмите Enter.
4. Загрузите один файл или несколько видеофайлов (формат AVI или MP4), выбрав файл сеанса нагрузки (AVI).
5. Инспектор фильма, позволяющий осмотр видеоклип кадр за кадром, будет немедленно открыт для первого файла в списке (Рисунок 2A). Используйте его для изучения видеоклипа и определения первых и последних кадров сегмента, которые будут проанализированы. Запишите количество этих кадров, которые потребуются позже. Закройте окно, когда сделано.
6. Для проверки дополнительных видеофайлов откройте видеоинспектора в любое время, нажав фильм Inspect и выбрав конкретный видеофайл.
7. Выберите проверенный вид (мышь или крыса; мышь по умолчанию).
8. Исключите все области, которые могут прервать отслеживание, в соответствии с цветами объекта и арены (черный или белый).
   1. Чтобы исключить заданную область, нажмите Исключить область, и после того, как курсор изменения в крест форму, отметьте все углы области для исключения. После этого, правой кнопкой мыши, а затем дважды слева щелкните центр отмеченной области. Исключенная область станет оттенком красного цвета на экране. Повторите эту процедуру, чтобы исключить столько областей, сколько необходимо.
9. Чтобы удалить область из исключения, нажмите Удалить исключенную область,затем (с помощью скрещенного курсора) нажмите на область, которая будет удалена из исключения.
10. Чтобы определить каждую камеру как "стимул" области, для автоматического обнаружения его расследования субъектом, выбрать форму "стимул" области будет либо полигон или эллиптические, проверяя соответствующие окна, то нажав Стимул X (где "X" представляет 1, 2, или 3). Отметьте области «стимула» по аналогии с исключенными областями, которые затем станут желтыми цветами. Для изменения местоположения определенной области «стимула» нажмите На Stimulus X и отметьте новое местоположение области (это автоматически обновит местоположение).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите различные стимулы номер в последовательной манере для всех файлов (т.е. объект в качестве стимула 1 для всех файлов теста SP).
11. Чтобы отследить присутствие объекта в определенном виртуальном отсеке внутри арены, выберите форму области «купона» (полигона или эллиптической), затем нажмите «Х» (где «X» представляет 1, 2, 3, 4 или 5). Отметьте области «купе» по аналогии с исключенными или раздражителями, которые затем станут синими цветами. Для изменения местоположения определенной области «купе» нажмите «Compartment X» и отметьте новое местоположение области (это автоматически обновит местоположение).
12. Выберите нужный алгоритм (BlackMouseBodyBased был использован для видео) из списка (см. доступные алгоритмы на рисунке 2B).
13. Напишите номера начальных и заканчивающихся кадров для анализа в соответствующих коробках для отсвагов графического интерфейса.
14. Выберите порог для обнаружения тела субъекта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство алгоритмов используют только "низкий" порог, в то время как алгоритмы, основанные на направлении головы, также используют порог «Высокий». Для "низкий" порог, выбрать уровень, который включает в себя мышь / крыса тела без хвоста (насколько это возможно), в то время как "Высокий" порог должен также включать хвост. В случае использования алгоритмов на основе направления головы, программное обеспечение будет определять местоположение головы как противоположное расположению хвоста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение будет позже игнорировать небольшие объекты, обнаруженные с помощью выбранного порога.
15. Для автоматического обнаружения границ субъекта для данного порога вставьте значение в соответствующее поле порога и нажмите Enter на клавиатуре.
16. При выборе нескольких файлов перейдите к следующему файлу (используя кнопку Next в верхней части) и выберите соответствующие определения для каждого файла. После завершения проверки параметров и местоположений площади для всех файлов, перемещаясь между каждым из них, используя кнопки «Предыдущий» и «Следующий» в верхней части графического интерфейса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определения всех областей и параметров специфичны для данного файла.
17. Для начала поведенческого анализа всех выбранных файлов перейдите на первый файл и нажмите Start.
18. В конце анализа для каждого фильма сохраняется файл результатов (.mat) в одном каталоге файлов фильма.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если используется медленная (небыстрая) версия алгоритма, она также сохранит версию фильма с белым крестом центра массы тела, который изменяет свой цвет каждый кадр, который обнаруживается как следственный, если только кнопка переключения воспроизведения сохранить анализируемый фильм GUI не будет бесконтрольна. Эта версия фильма (сохраненная в том же каталоге, с тем же названием, что и оригинальный фильм, с суффиксом 'анализированного фильма') может быть использована в автономном режиме для оценки качества автоматического обнаружения, выполняемого системой.

4. Использование графического интерфейса TrackRodent для презентации результатов

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите нижнюю панель рисунка 2А для презентации результатов.

1. Чтобы проверить результаты каждого файла фильма, нажмите файл результатов загрузки и выберите файлы .mat, генерируемые поведенческим анализом.
2. Перемещение между кнопками переключения для изучения на экране любого из следующих анализов: след местоположения мыши(рисунок 2A); Отсеки занятия вдоль сессии (если "отсеки" были определены, не показаны); Stimuli разведки вдоль сессии(рисунок 2C); Общее время в отсеках (если "отсеки" определены, не показаны); и Общее время исследования стимулов(рисунок 2D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Области «Стимул» — это области, в которых программное обеспечение оценивает взаимодействие объекта, в то время как области «Compartment» — это области, в которых программное обеспечение отслеживает присутствие объекта. Остановка анализа с помощью кнопки анализа Стоп автоматически сохранит результаты, генерируемые до последнего анализируемого кадра. Для большинства компьютеров, это должно быть возможно загрузить и проанализировать до 20 фильмов одновременно (в зависимости от производительности компьютера).

5. Использование TrackRodentPopulationSummary GUI для анализа населения(Рисунок 2E)

1. Откройте MATLAB (проверено с 2014a-2019a) и выберите папку TrackRodent.
2. Введите TrackRodentPopulationSummary в окне команды и нажмите Enter.
3. Загрузите несколько файлов результатов TrackRodent (формат.mat) путем нажатия файлов результатов выбора.
4. Заполните номера Последнее кадр для анализа, Название теста, Стимул 1 имя, и Стимул 2 имя.
5. Выберите нужный анализ из списка факультативных анализов, проверив все соответствующие коробки.
6. Выберите результаты экспорта в speadsheet, проверив соответствующую коробку, чтобы извлечь все результаты проверенного анализа в виде единого файла электронной таблицы.
7. Нажмите "Начать" и подождите, пока не завершится анализ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом завершается анализ. Программное обеспечение может быть использовано для анализа результатов столько фильмов файлов, как хотелось бы, учитывая, что все они были поведенчески проанализированы с помощью программного обеспечения TrackRodent. Анализ, выполняемый программным обеспечением, предполагает видеозапись со скоростью 30 Гц. В случае использования другой частоты кадров умножьте время на 30 и разделите на частоту кадров, используемую для записи, чтобы преобразовать ее в правильное значение (ы).

Representative Results

Использование системы для теста социальных предпочтений у мышей C57BL/6J
На рисунке 1 показаны три версии экспериментальной настройки. Первая версия(Рисунок 1A-C) предназначена для мышей с темными цветами меха, таких как мыши C57BL/6J. Второй(рисунок 1D-F) планируется для мышей с яркими цветами меха, таких как BALB/c или ICR (CD-1) мышей. Третий больше(рисунок 1G-I) и предназначен для крыс с яркими цветами меха, таких как SD крыс. Первыми испытуемыми были наивные взрослые (8-12 недель), групповые (от двух до пяти животных на клетку) самцы c57BL/6J мышей. Социальные стимулы были несовершеннолетними (21-30 дней), групповыми (от двух до шести животных на клетку), мышами C57BL/6J. Объект стимулы были без запаха пластиковые игрушки с различными цветами (вставки на рисунке 1C,I). Видеофайлы экспериментов были проанализированы с помощью программного обеспечения TrackRodent (алгоритм на основе тела, см. пример изображения экрана и GUI на рисунке 2A),который автоматически и непрерывно отслеживает сядек объекта на основе 1) центра тела и 2) контакт его контуров тела с стимулами-содержащими камерами.

Анализ включал следующие процедуры. После загрузки файла фильма и графического определения областей, которые должны быть исключены из анализа, экспериментатор графически определил две области, каждая из которых состоит из отдельной камеры, как "стимулы"(Рисунок 2A, желтоватые области). Пользователи также могут определить до пяти областей как виртуальные "купе". Затем пользователи выбирают алгоритм «BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast» из списка возможных алгоритмов(рисунок 2B). После нажатия кнопки анализа пуска программное обеспечение отслеживало расположение животных кадр за кадром и изображало след расположения мыши на арене(рисунок 2A,синяя линия). В ходе этого анализа, программное обеспечение также отслеживается контакты между "стимулы" областях и контур тела субъекта (Рисунок 2C). Такие контактные события были определены как следственные действия и служили для расчета времени расследования для каждого стимула и времени, в течение которого не было показано поведение расследования(рисунок 2D). Как видно на рисунке 2C,D показаны проанализированные фильм, более высокое время расследования для "стимул 2 наблюдался", который был социальный стимул, по сравнению с объектом, который в данном случае был определен как "стимул 1".

Анализ популяции теста социальных предпочтений у мышей C57BL/6J
После того, как программное обеспечение TrackRodent позволило проанализировать все видеофайлы экспериментальной группы, анализ популяции для этой группы был выполнен с помощью GUI "TrackRodentPopulationSummary"(рисунок 2E), при выборе всех возможных анализов этого программного обеспечения. Различные результаты этих анализов для теста SP, выполненного с 58 C57BL/6J взрослых мышей мужского пола отображаются на рисунке 3, точно так же, как они появились на экране компьютера, со всеми ошибками баров с изображением SEM. Статистический анализ этих результатов были ранее опубликованы¹¹.

Среднее общее время исследования населения субъектов к каждому из двух стимулов (однополые несовершеннолетних социальных стимулов и объект) отображается на рисунке 3A, который изображает четкое предпочтение субъекта к социальному стимулу. Хотя алгоритм прост, была отмечена отличная корреляция (r² и 0.91, стр. йт; 10^-6, корреляция Пирсона) между временем исследования, вручную измеренным обученным наблюдателем, и значением, рассчитанным программным обеспечением. Динамика этого предпочтения можно увидеть на рисунке 3B, в котором среднее время исследования для каждого стимула построено по времени в 20 с бункеров. Как показано на рисунке, социальные предпочтения поддерживаются субъектами на протяжении всей сессии, хотя на ранних стадиях они казались незначительными.

Рисунок 3C изображает время расследования для каждого стимула, классифицируется в соответствии с продолжительностью боя в короткие (No 6 s), средний (Зgt;6 s, 19 s), и длинные (Зgt;19 s) бои, наряду с общим временем расследования. Распределение времени исследования для каждого стимула в соответствии с продолжительностью боя в 1 с бункеров отображается на рисунке 3D. Как показано на рисунке 3C,D, не было никакой разницы между стимулами в коротких поединках, в то время как средние и длинные поединки показали четкие социальные предпочтения. Эти результаты показывают, что в C57BL/6J мышей, короткие приступы отражают любопытство, в то время как длинные приступы отражают взаимодействие между субъектом и стимулы. Относительная продолжительность исследования (RDI, «социально-объектные» значения для каждой категории (короткие, средние и длинные схваи), а также для общего времени исследования показаны на рисунке 3E. Как показано на рисунке, самое высокое значение RDI достигается с длинными боями, предполагая, что они наилучшим образом отражают социальные предпочтения субъектов.

Для анализа динамики следственного боя во время теста были распределены с течением времени для каждой категории. Распределение с течением времени короткий (Рисунок 3F) и среднего (Рисунок 3G) расследования приступы предложить постепенное сокращение этих боев с течением времени. В отличие от этого, аналогичный анализ длинных поединков(рисунок 3H) показывает постепенное увеличение в течение теста. Эта тенденция также отражается в распределении средней продолжительности боя(рисунок 3I), показывая постепенное увеличение с течением времени. Таким образом, кажется, что испытуемые проявляли любопытство в основном на ранних стадиях теста, в то время как позже они проявляли больше взаимодействий со стимулами. Следует отметить, что в последнюю минуту, есть присущий уклон анализа к коротким боям, потому что длинные поединки были искусственно прекращены в конце сессии. Поэтому, учитывая временной ход следственных схваток, последнюю минуту следует игнорировать.

Мы также проанализировали интервалы между последовательными приступами расследования к тому же стимулу (т.е. время, когда он взял предмет, чтобы вернуться к тому же стимулу после окончания каждого расследования бой). Этот параметр отражает стремление субъекта вернуться к тому же стимулу и исследовать. Здесь интервалы были также классифицированы на короткие (No 5 s), средние (No gt;5 s, 20 s) и длинные (Зgt;20 s) приступы, которые показаны вместе с общими интервалами времени для каждого стимула на рисунке 3J. Гистограмма интервалов в 1 с бункеров в отображается на рисунке 3K. Как показано на рисунке 3J,K, интервалы между исследованиями социального стимула были гораздо короче, чем между исследованиями объекта. Соответственно, значения RDI интервалов в долгосрочной перспективе дали самое высокое абсолютное значение(рисунок 3L); следовательно, они могут использоваться в качестве независимой от следствия переменной, оценивающей социальные предпочтения. Распределение по времени интервалов, отрисованных отдельно для каждой категории(рисунок 3M-O) предполагает постепенное сокращение коротких и средних интервалов и противоположное изменение длинных интервалов между следственными приступами, которые, скорее всего, отражают общее удлинение следственных поединков. Как и распределение следственных схваток, последняя минута интервалов смещена в сторону коротких значений и должна быть проигнорирована.

Мы также проанализировали переходы, наблюдаемые в субъектах от одного стимула к другому. Этот участок отображается на рисунке 3P, при котором каждый тайм-пойнт субъект начал исследовать новый стимул отмечен синей точкой, каждая строка представляет собой отдельную тему, а красная линия представляет средний коэффициент перехода. Как очевидно, скорость перехода была самой высокой (1,5 перехода/мин) в течение первых 2 минут теста и постепенно сводилась к менее чем 50% от пика. Та же тенденция проявляется и в распределении средней скорости перехода с течением времени(рисунок 3).

Наконец, тепловые карты расследования приступы к социальному стимулу(рисунок 3R) и объект(Рисунок 3S) в ходе теста для каждого предмета показаны, с цветами маркировки продолжительность боя (Рисунок 3S). В целом, результаты показывают, что в C57Bl/6J мышей, SP тест примерно делится на раннюю исследовательскую фазу (характеризуется высокой скоростью перехода и короткие приступы расследования) и поздней фазы взаимодействия (характеризуется низкой скоростью перехода и длительные исследования боев).

Анализ населения теста предпочтений социальной новизны у крыс SD
Рисунок 4 показывает тот же анализ, что и выше, для теста SNP, выполненного 59 Крысами SD. Как правило, предпочтение романа против. знакомые социальные стимулы слабее, чем предпочтение к новым социальным стимулом против. объект, выставленный мышами в тесте SP(рисунок 3). Тем не менее, предпочтение социальной новизны четко отражается по всем параметрам. Примечательно, что, как было заключено выше из теста SP на мышах, длительные исследования приступы и длительные интервалы являются параметрами, наиболее четко демонстрирующими различия между стимулами, о чем свидетельствуют их самые высокие абсолютные значения RDI(рисунок 4E,L; следует отметить, что значения RDI для теста SNP определяются как «знакомый роман»/«знакомый»).

Потеря усов ухудшает социальные предпочтения как у мышей C57BL/6J, так и у Крыс SD
Для оценки влияния соматосенсорных манипуляций на динамику социального поведения был проведен анализ SP-теста, завершенного 29 мышами C57BL/6J и 33 SD крысами после обрезки усов (проводится за 3-7 дней до тестирования). Затем эти результаты сравнивали с контролем над животными. Как показано на рисунке 5A-F, усы подстриженные мыши не предпочитают социальный стимул над объектом, о чем свидетельствует отсутствие разницы в времени расследования между двумя стимулами (сравните Рисунок 5А на рис 5D) и потеря длительных боев расследования к социальному стимулу (сравните Рисунок 5B на рисунке 5E). Интересно, что усы подстриженные мыши также показали повышенные темпы перехода по сравнению с контрольных мышей (сравните Рисунок 5C на рисунке 5F).

В целом, эти данные свидетельствуют о том, что усы подстриженные мыши заметно сократили продолжительность их взаимодействия с социальным стимулом. В отличие от мышей, крысы, подстриженные усами, не теряли своих социальных предпочтений(рисунок 5G-L). Тем не менее, они значительно изменили свое поведение в течение первой минуты теста, когда у них было меньше длительных схватой (сравните рисунок 5H до рисунка 5K)и еще много переходов (сравните рисунок 5I к рисунку 5L). Таким образом, обрезка усов значительно изменила поведение как крыс, так и мышей в тесте SP, но в совершенно иной манере между двумя видами. Эти результаты свидетельствуют о четкой роли для уса-зависимой соматосенсорной стимуляции в социальных взаимодействиях крыс и мышей.

Рисунок 1: Экспериментальная настройка. (A) Схематическое изображение экспериментальной арены, предназначенной для мышей с черным мехом. (B) Изображение арены сверху, используя тусклый красный свет, показывая C57BL/6J предмет мыши на арене. (C) Изображение, показывающее сетчатую область белой камеры, через которую субъект взаимодействует со стимулом (всет: изображение объекта стимула, используемого для мышей). (D-F) Как показано на панелях A-C, экспериментальная арена и камеры, предназначенные для мышей с ярким мехом. (G-I) Как показано на панелях A-C, экспериментальная арена и камеры, предназначенные для крыс с ярким мехом (всет в «Я»: изображение объекта стимула, используемого для крыс). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Программное обеспечение TrackRodent. (A) Экран компьютера под управлением trackRodent программного обеспечения. Слева: видеоизображение в начале анализируемого фильма (первый кадр, выбранный экспериментатором), показывающее области «стимулы» и отслеживаемый траекторию движения субъекта C57BL/6J. Справа: графический интерфейс программного обеспечения. (B) Список дополнительных кодов программного обеспечения, которые будут использоваться с графическим интерфейсом. Каждый из этих кодов соответствует определенному экспериментальному состоянию. (C) Анализ конкретного эксперимента, показанного в панели А, когда вариант исследования Стимулов вдоль сессии был выбран в разделе презентации результатов GUI. Этот сюжет показывает (на каждом кадре), был ли субъект был в контакте с "стимул 1" или "стимул 2". В представленном случае явное предпочтение "стимулу 2" проявляется в более высоком количестве и продолжительности следственных схваток, обнаруженных в отношении этого стимула. (D) Анализ эксперимента, показанного в группах A и C, когда вариант времени исследования раздражителей Total стимулов был выбран в разделе презентации результатов GUI. Здесь также, явное предпочтение к 'стимул 2' очевидно от более высокого уровня времени исследования к этому стимулу. (E) GUI Программного обеспечения TrackRodentPopulationSummary, которое позволяет анализировать и строить результаты от популяции животных, каждый из которых анализируется с помощью программного обеспечения TrackRodent (см. рисунок 3 для результатов такого анализа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Анализ поведения исследователей мышей C57BL/6J во время теста SP с использованием программного обеспечения TrackRodent. Эта цифра показывает различные участки всех факультативных анализов TrackRodentPopulationSummary программного обеспечения(рисунок 2E) используется для населения 58 C57BL/6J взрослых мышей мужского пола выполнения теста SP. Различные сюжеты отображаются в том же порядке и манере, как они появились на экране компьютера (см. раздел репрезентативных результатов для подробного объяснения каждого участка). (A) Общее время расследования стимулов,(B) Исследование стимулов по времени, (C) Короткие против длинных боев - общее время,(D) 1s бен гистограмма боев, (E) Короткие против длинных боев - RDI, (F) lt;6 sбои по времени, (G) 6'19 s бои по времени, (H) интервалы - RDI,(M) lt;5 s интервалы вдоль времени, (N) 5'20 s интервалы вдоль времени, (O) йgt;20 s интервалы вдоль времени, (P) Переходы между стимулами - raster участок, ( ) Переход между стимулами вдоль раз, (R) Тепло-карта продолжительности боя с социальными, (S) Тепло-карта продолжительности боя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Анализ поведения sD-крыс во время теста SNP с помощью программного обеспечения TrackRodent. Участки для всех факультативных анализов TrackRodentPopulationSummary программного обеспечения(Рисунок 2E) используется для населения 59 SD взрослых крыс мужского пола выполнения теста SNP. Различные сюжеты отображаются в том же порядке и манере, как они появились на экране компьютера (см. раздел репрезентативных результатов для подробного объяснения каждого участка). (А-Я) То же, что описано на рисунке 3. (R) Тепло-карта продолжительности боя с Знакомые, (S) Тепло-карта продолжительности боя с романом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5: Уискер-обрезки мышей и крыс диффереприративно ухудшает социальное поведение. (A) Участок среднего времени исследования (измеряется в 20 с бункеров) во время теста SP для мужчин C57BL/6J мышей (n No 58). (B) Распределение (1 мин бункеров) среднего общего времени долго (Зgt;19 s) расследования бои вдоль теста SP показано в панели А для социальных и объект стимулов. Обратите внимание на гораздо больше времени долгого расследования приступы к социальному стимулу по сравнению с объектом. (C) Распределение (1 мин бункеров) переходной скорости на время теста SP показано в (A). (D-F) Как показано на панелях A-C, 29 усов мышей были обрезаны примерно за 1 неделю до теста. Эти животные потеряли свои социальные предпочтения, как это отражено в (D) общее время исследования и (E) распределение длинных боев. Они также продемонстрировали более высокий общий уровень переходов (F), что свидетельствует о менее устойчивом взаимодействии с социальным стимулом. (G-I) Как показано на панелях A-C, 60 Крыс SD выполнили тест SP. Обратите внимание на различную динамику поведения крыс по сравнению с мышами, с более низкими темпами перехода и более длительные периоды длительных приступов исследования на ранней стадии (2 мин) теста. (J-L) Как показано на панелях G-H, 33 крысы были подстрижены усами. Обратите внимание, что в то время как крысы не теряют социальные предпочтения после усов обрезки, как мыши сделали, динамика их социального поведения в первые 2 мин теста была изменена, показывая больше переходов и меньше длинных боев. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Описанная здесь экспериментальная система, которая была разработана как альтернатива трехкамерного аппарата^2,5,позволяет выполнять те же тесты при решении некоторых из его ограничений. Использование треугольных камер, расположенных в двух противоположных углах прямоугольной арены, ограничивает область взаимодействия предмета-стимула четко определенной плоскости, что позволяет точно анализировать поведение исследования. Одним из преимуществ является использование программного обеспечения для анализа (TrackRodent) для расчета нескольких поведенческих параметров для каждого теста. Это также позволяет перепозиционировать камеры в случайных противоположных углах арены на различных этапах парадигмы, нейтрализуя любые эффекты пространственных навыков навигации.

Кроме того, два угла арены, которые остаются пустыми во время каждого этапа, предлагают субъекту удобное место для отдыха и ухода и оттягивают его от камер, минимизируя ложноположительные результаты. Таким образом, система позволяет непосредственно оценивать мотивацию субъекта для изучения каждого стимула во время тестов SP и SNP. Кроме того, поскольку поведенческий анализ видео осуществляется в автоматизированном порядке программным обеспечением TrackRodent, экспериментатор может загрузить несколько фильмов для анализа, определить правильные параметры для каждого, и позволить процессу программного обеспечения в одночасье, что экономит драгоценное время. Примечательно, что эта система может использоваться для проведения любых видов испытаний на социальную дискриминацию, таких, как дискриминация между социальными стимулами мужчин и женщин или стимулы различных штаммов. Кроме того, нет никаких ограничений (верхний/нижний) размера объектов, которые могут быть отслежены с помощью этой системы; таким образом, он может быть использован с несовершеннолетними или ожирением животных. Эта экспериментальная система является недорогим и простым в производстве, и компьютерные коды, используемые для анализа, общедоступны в качестве кодов с открытым исходным кодом, что позволяет любой лаборатории легко принять метод.

Автоматизированное обнаружение поведения исследования в системе основано на обнаружении физического контакта между контурами тела субъекта и каждой из областей, определенных экспериментатором как «стимулы». Таким образом, если объект касается области «стимулов» с его телом, а не головой, это событие считается следственным (т.е. ложным срабатыванием). Для этого был создан алгоритм на основе направления головы, который идентифицирует голову субъекта и учитывает только контакт между головой и «стимулами». Однако этот алгоритм работает значительно медленнее, чем алгоритмы, основанные на теле; следовательно, не рекомендуется для анализа большого количества фильмов, если экспериментальные условия этого не требуют.

Аналогичные результаты были отмечены (1,1% разница, no 11 экспериментов, 5 мин каждый, данные не показаны) между двумя алгоритмами; поэтому чаще всего использовались алгоритмы на основе тела. Следует отметить, что, хотя анализы больших групп животных представлены здесь, гораздо меньший размер группы необходим для наблюдения статистически значимой разницы между двумя стимулами, на основе общего времени исследования, измеренного системой. Например, расчеты мощности показали, что размеры выборки только пяти и восьми животных необходимы для испытаний НАИБолеей и SNP мышей, соответственно (0,05, мощность 0,8). Тем не менее, значительно большие группы животных были использованы здесь для обеспечения наблюдения за всеми динамики социального поведения.

Система требует, чтобы экспериментатор вручную определил порог обнаружения контуров тела субъекта. Поиск правильного порога для использования может потребовать некоторого опыта; следовательно, большинство алгоритмов, используемых в этой системе, имеют регулярные, более медленные версии. Эти версии представляют анализируемый фильм и обнаруживают события расследования в Интернете, в то время как их быстрые версии не позволяют онлайн-презентации. Рекомендуется, чтобы новые пользователи использовали обычные версии и контролировать анализы онлайн, чтобы убедиться, что он работает должным образом, и что они используют "быстрые" алгоритмы только после сбора опыта с процедурой анализа.

Одним из преимуществ этой системы по сравнению с трехкамерным тестом является то, что она измеряет несколько параметров поведения исследования, тем самым поддерживая более подробный анализ. Это преимущество двоякое. Во-первых, экспериментатор удается полагаться исключительно на общее время исследования для определения предпочтений. Было установлено, что длительные приступы расследования и длительные интервалы являются более чувствительными, чем общее время расследования при обнаружении предпочтения одного стимула над другим. Что касается этих параметров, то следует отметить, что их значения в последнюю минуту теста являются смещенными вниз, так как длительные следственные схватки и интервалы преждевременно прекращаются в конце 5-минутной сессии.

Во-вторых, многочисленные параметры позволяют обнаруживать тонкие изменения в динамике социального исследования после различных манипуляций. Например, было установлено, что мыши C57BL/6J потеряли свои социальные предпочтения после обрезки усов. В отличие от этого, SD крысы сохранили свои социальные предпочтения, но изменили динамику социального поведения, как показано на более короткие приступы исследования и более высокий уровень переходов на ранней стадии теста. В целом, эти данные свидетельствуют о снижении склонности крыс и мышей к социальным взаимодействиям после обрезки усов. Таким образом, эта система поддерживает строгий анализ динамики социального поведения, который может быть очень чувствительным к различным манипуляциям.

Таким образом, мы представили здесь новую, простую и доступную экспериментальную систему, которая поддерживает автоматизированный анализ динамики поведения социальных исследований. Эта система будет способствовать детальному анализу социально-поведенческих дефицитов различных штаммов и генетически модифицированных линий мелких грызунов. Кроме того, точное обнаружение следственных приступов, продемонстрированных здесь, в сочетании с способностью этой системы анализировать поведение в то время как субъекты подключены к электрическим кабелям или оптическим волокнам, позволяет использовать его в экспериментах, связанных с записью мозговой активности, связанной с социальным поведением.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flea3 1.3 MP Mono USB3 Vision	FLIR (formerly PointGrey)	FL3-U3-13Y3M-C	Monochromatic Camera
FlyCap 2.0	FLIR (formerly PointGrey)	FlyCapture 2.13.3.61X64	Video recording software
Home 5 minute Epoxy glue	Devocon	20845	For gluing the metal mesh to the Plexiglas stimuli chambers
Matlab 2014-2019	MathWorks	R2014a - R2019a	Programming environment
Plexiglas boards (6 mm thickBlack or white)	Melina (1990) LTD, Israel	NaN	For arena and stimuli chambers construction
Red led strips (60 leds per meter) connected to a 12 V power supply	2012topdeal eBay supplier	NaN	For illumination of the acoustic chamber