Un sistema para el seguimiento de la dinámica del comportamiento de las preferencias sociales en pequeños roedores

Summary

Aquí se describe un novedoso sistema experimental automatizado que ofrece una alternativa a la prueba de tres cámaras y también resuelve varias advertencias. Este sistema proporciona múltiples parámetros de comportamiento que permiten un análisis riguroso de la dinámica conductual de pequeños roedores durante las pruebas de preferencia social y preferencia de novedad social.

Abstract

Explorar los mecanismos neurobiológicos del comportamiento social requiere pruebas de comportamiento que se pueden aplicar a los modelos animales de una manera imparcial e independiente del observador. Desde principios del milenio, la prueba de tres cámaras ha sido ampliamente utilizada como paradigma estándar para evaluar la sociabilidad (preferencia social) y la preferencia de novedad social en pequeños roedores. Sin embargo, esta prueba sufre de múltiples limitaciones, incluyendo su dependencia de la navegación espacial y la negligencia de la dinámica conductual. Presentado y validado aquí es un novedoso sistema experimental que ofrece una alternativa a la prueba de tres cámaras, mientras que también resuelve algunas de sus advertencias. El sistema requiere un aparato experimental simple y asequible y un sistema de análisis de código abierto disponible públicamente, que mide y analiza automáticamente múltiples parámetros de comportamiento a nivel individual y de población. Permite un análisis detallado de la dinámica conductual de los pequeños roedores durante cualquier prueba de discriminación social. Demostramos la eficiencia del sistema en el análisis de la dinámica del comportamiento social durante las pruebas de preferencia social y novedad social realizadas por ratones machoadultos adultos y ratas. Además, validamos la capacidad del sistema para revelar la dinámica modificada del comportamiento social en roedores después de manipulaciones como el recorte de bigotes. Por lo tanto, el sistema permite una investigación rigurosa del comportamiento social y la dinámica en pequeños modelos de roedores y apoya comparaciones más precisas entre cepas, condiciones y tratamientos.

Introduction

Revelar los mecanismos biológicos subyacentes a los trastornos del neurodesarrollo (NDD) es uno de los principales desafíos en el campo de la neurociencia¹. Abordar este desafío requiere paradigmas de comportamiento y sistemas experimentales que tipifiquen el comportamiento de los roedores de una manera estándar e imparcial. Un influyente estudio publicado hace más de una década por Moy y sus colegas² presentó la prueba de tres cámaras. Desde entonces, esta prueba se ha utilizado ampliamente para investigar el comportamiento social en modelos de roedores de NDDs. Esta prueba evalúa dos tendencias innatas de los roedores: 1) permanecer en la proximidad de un estímulo social sobre un objeto (sociabilidad, también denominada preferencia social [SP]), y 2) para preferir la proximidad de un nuevo estímulo social a uno familiar (preferencia de novedad social [SNP])^3,4. Varios estudios posteriores sugirieron métodos de análisis automatizado de la prueba de tres cámaras utilizando métodos computarizados^5,6.

Esta prueba todavía sufre de varias advertencias. En primer lugar, examina principalmente la preferencia por el lugar social en lugar de la motivación del sujeto para interactuar directamente con un estímulo social, aunque algunos grupos también miden el tiempo de investigación olfativa (olfatear), ya sea manualmente⁷ o utilizando sistemas computarizados comerciales^8,9,10. En segundo lugar, la prueba de tres cámaras se utiliza principalmente para medir el tiempo total empleado por el sujeto en cada cámara, y descuida la dinámica conductual. Por último, se basa en un solo aspecto del comportamiento social, que es el tiempo que pasa el sujeto en cada cámara (o el tiempo de olfateo, si se mide).

Aquí presentamos un sistema experimental novedoso y asequible que es una alternativa al aparato de tres cámaras. También permite la realización de las mismas pruebas de comportamiento mientras se resuelven las advertencias antes mencionadas. El sistema conductual presentado mide de forma automática y directa el comportamiento de investigación de un roedor hacia dos estímulos. Además, analiza la dinámica de comportamiento de una manera independiente del observador. Además, este sistema mide múltiples parámetros de comportamiento y los analiza tanto a nivel individual como poblacional; por lo tanto, apoya un análisis riguroso del comportamiento social y su dinámica durante cada prueba. Además, el reposicionamiento aleatorio de las cámaras en esquinas opuestas de la arena durante las diversas etapas de prueba neutraliza cualquier efecto de la memoria espacial o preferencia. Este sistema también se puede utilizar para otras pruebas de discriminación, como la discriminación sexual. El aparato personalizado es fácil de producir, y el sistema de análisis es accesible públicamente como un código de código abierto, lo que permite su uso en cualquier laboratorio. Demostramos la capacidad de este sistema para medir múltiples parámetros de comportamiento social en cepas de roedores con colores de piel distintos durante las pruebas de preferencia social y preferencia de novedad social. También validamos la capacidad del sistema para revelar la dinámica modificada del comportamiento social en roedores después de manipulaciones, como el recorte de bigotes.

Software TrackRodent: tres algoritmos fueron escritos en MATLAB (2014a-2019a) para rastrear el sujeto experimental y sus interacciones con los estímulos. Todos los algoritmos se depositaron en GitHub, que se encuentran en . El objetivo principal de los cuatro algoritmos es rastrear los contornos del cuerpo del sujeto para detectar cualquier contacto directo con las áreas de estímulos.

Algoritmo basado en cuerpo: este algoritmo tiene tres versiones que rastrean los contornos de un ratón oscuro sin cable sobre un fondo blanco (BlackMouseBodyBased), un ratón blanco sobre un fondo oscuro (WhiteMouseBodyBased) o una rata blanca sobre un fondo oscuro (WhiteRatBodyBased ). La interfaz gráfica de usuario (GUI) del software requiere que el experimentador elija un experimento utilizando ratones o ratas y, a continuación, seleccione el código correcto. Para cada versión del algoritmo, hay dos códigos opcionales: uno que presenta el proceso de seguimiento en la pantalla mientras realiza el análisis, y otro que no (por lo tanto, se ejecuta más rápido y se denomina "rápido"). Por ejemplo, los nombres de los códigos relevantes para el algoritmo BlackMouseBodyBased son: "BlackMouseBodyBased23_7_14" y "BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast". Todos los algoritmos que terminan con "rápido" no muestran el seguimiento en línea, y los usuarios deben guardar directamente los datos en el archivo de resultados (archivo .mat). Todos los algoritmos basados en el cuerpo requieren establecer un único umbral ("umbral bajo" en la GUI del software) para detectar el cuerpo del sujeto.

Algoritmo basado en la direccionalidad de la cabeza: el segundo algoritmo, que está disponible sólo para ratones negros, se basa en el algoritmo basado en el cuerpo, además de determinar la direccionalidad de la cabeza. Este algoritmo detecta las interacciones de la cabeza del sujeto con las áreas de "estímulos", evitando así falsos positivos que pueden surgir de contactos aleatorios del sujeto' con estas áreas. Para este algoritmo, se definen dos umbrales de detección de contornos corporales del ratón: umbral alto, que incluye la cola más brillante de ratones negros, y umbral bajo, que incluye el cuerpo sin cola. A partir de entonces, el algoritmo ajusta un elipsoide a los límites detectados utilizando el umbral inferior y define la ubicación de la cabeza y la cola del ratón (sin distinción entre los dos). La discriminación final entre la cola y la cabeza se basa en los límites definidos por el umbral superior.

Algoritmo animal cableado: el tercer algoritmo tiene como objetivo minimizar los artefactos resultantes de cables (es decir, alambre eléctrico o fibra óptica) conectados al animal, permitiendo el análisis del comportamiento del animal mientras está conectado a un cable. Este algoritmo tiene códigos sólo para ratones negros y ratas blancas. El código para ratas requiere que el experimentador defina umbrales bajos y altos, mientras que el código del mouse solo requiere un umbral bajo.

Protocol

Todos los métodos descritos han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Haifa.

1. Configuración experimental

1. Arena
   1. Construir la arena experimental para ratones(Figura 1A,D) colocando una caja de plexiglás blanco o negro (dependiendo del color del animal) (37 cm x 22 cm x 35 cm) en medio de una cámara acústica (60 cm x 65 cm x 80 cm, hecha de madera de 2 cm de espesor recubierta en el interior con espuma de 2 cm de espesor). Para la luz, retire una tira (2 cm de ancho, 10 cm por debajo del techo de la cámara) de la espuma alrededor de la cámara acústica (además de la puerta), y conecte una tira LED con bombillas rojas o blancas. Asegúrese de que la luz sea lo más uniforme posible alrededor de la arena para evitar reflejos.
   2. Construir la arena para ratas de forma similar a la descrita anteriormente para ratones, con diferentes dimensiones que se ajustan adecuadamente al tamaño de las ratas Sprague-Dawley (SD)(Figura 1G). Coloque una caja de plexiglás negro (50 cm x 50 cm x 40 cm) en medio de una cámara acústica (90 cm x 60 cm x 85 cm, hecha de madera de 2 cm de espesor recubierta en el interior con espuma de 2 cm de espesor).
2. Cámaras
   1. Para ratones, cree dos cámaras triangulares blancas o negras (dependiendo del color del pelaje) (12 cm isósceles, 35 cm de altura, con los suelos cerrados) a partir de plexiglás de 6 mm de espesor. Localícelos en dos esquinas opuestas seleccionadas aleatoriamente de la arena(Figura 1B,E). Pegue una malla metálica (18 mm x 6 cm; agujeros de 1 cm x 1 cm) en la parte inferior de cada cámara utilizando pegamento epoxi para permitir interacciones directas con el estímulo a través de la malla(Figura 1C,F). Marque cada cámara de una manera que permita la discriminación de los demás en un video sin dar pistas a los sujetos (véase la Figura 1B,E para ver ejemplos).
      NOTA: Cada cámara eventualmente contendrá un estímulo social (ratón) u objeto (juguete plástico, 5 cm x 5 cm x 5 cm, con una forma y color distintivos; Figura 1C, I inserciones). Deje que el olor a pegamento epoxi se evapore durante al menos una semana antes de su uso.
   2. Para las ratas, cree dos cámaras triangulares negras (20,5 cm isósceles, 40 cm de altura, hechas de plexiglás de 6 mm de espesor, con los pisos cerrados) y colóquelas en dos esquinas opuestas seleccionadas aleatoriamente de la arena(Figura 1H),cada una con una malla metálica (25 cm x 7 cm; 2,5 cm x 1 cm agujeros) cubriendo su parte inferior(Figura 1I).
3. Coloque una cámara monocromática de alta calidad, equipada con una lente gran angular, en la parte superior de la cámara acústica y conéctela a un ordenador para permitir una visualización y grabación claras del comportamiento del sujeto utilizando software comercial (consulte la Tabla de Materiales para sugerencias).

2. Paradigma conductual

NOTA: Los pasos 2.1-2.7 describen el paradigma de comportamiento para los ratones. Consulte la sección 2.8 para obtener instrucciones específicas sobre ratas.

1. Asegúrese de que las jaulas de todos los animales (sujetos: ratones macho de 2-4 meses de edad; estímulos: 21-30 ratones juveniles de un día de edad) permanezcan en la sala experimental durante al menos 1 h antes de comenzar el experimento conductual.
2. Después del período de aclimatación, inserte dos cámaras vacías en la arena aleatoriamente en dos esquinas opuestas. Coloque el sujeto en el centro de la arena durante 15 minutos de habituación. Durante ese tiempo, coloque los dos estímulos sociales, cada uno en una cámara diferente situada fuera de la arena para la habituación. Coloque un objeto (un juguete de plástico, 5 cm x 5 cm x 5 cm, con una forma y color distintos) en otra cámara.
3. Para realizar la prueba de preferencias sociales (SP), inicie la grabación de vídeo y siga grabando hasta el final de la prueba.
4. Retire las dos cámaras vacías e inserte inmediatamente el objeto y uno de los estímulos sociales, cada uno en una cámara distinta. Localiza estas cámaras al azar en las esquinas opuestas de la arena que estaban vacías durante la habituación. Permita que el sujeto interactúe con los estímulos durante los 5 minutos de la prueba SP. Al final de la prueba, detenga la grabación.
5. Después de la prueba de SP, retire las cámaras que contienen estímulos de la arena y deje al sujeto en la arena vacía durante 15 minutos. Limpie las cámaras desde el exterior con toallitas de etanol al 10%.
6. Para realizar la prueba de preferencia de novedad social (SNP), iniciar la grabación de vídeo e insertar dos cámaras en la arena: una que contiene el mismo estímulo social utilizado para la prueba SP (estímulo familiar), y la otra que contiene el nuevo estímulo social. Coloque estas cámaras aleatoriamente en dos esquinas opuestas de la arena, asegurándose de que estas ubicaciones no se utilizaron para la prueba SP. Permita que el sujeto interactúe con los estímulos durante los 5 minutos de la prueba SNP.
7. Al final de la prueba SNP, detenga la grabación de vídeo, retire el sujeto y las cámaras de la arena, y coloque el sujeto de nuevo en su jaula de inicio. Deje los estímulos en las cámaras para el siguiente experimento (con otro sujeto) o devuélvalos a sus jaulas domésticas. Limpie la arena y las cámaras con agua corriente seguida de un 10% de etanol y deje secar.
8. Paradigma conductual para ratas
   1. Para las ratas, repita el paradigma conductual descrito en los pasos 2.1-2.7, con dos modificaciones: 1) manejar los sujetos de rata y habituatar los estímulos sociales a las cámaras durante 2 días (10 min cada día) antes del experimento; y 2) extender la prueba DE SP durante 15 minutos para dar a las ratas un período más largo de exposición a estímulos sociales. Más tarde, restrinja el análisis de la prueba SP a los 5 min iniciales.
      NOTA: Se necesita al menos una arena y cinco cámaras para ejecutar una sola sesión.

3. Uso de la GUI trackRodent para el análisis del comportamiento

NOTA: Consulte el panel superior de la Figura 2A para la GUI trackRodent.

1. Abra MATLAB (probado con 2014a-2019a) y elija la carpeta TrackRodent.
2. Agregue todas las subcarpetas a la ruta de trabajo haciendo clic con el botón derecho en cada carpeta y seleccionando Agregar a la ruta de acceso . Carpetas y subcarpetas seleccionadas.
3. Escriba TrackRodent en la ventana de comandos y pulse Intro.
4. Cargue un solo archivo o varios archivos de vídeo (formato AVI o MP4) seleccionando Cargar archivo de sesión (AVI).
5. Un inspector de películas, que permite la inspección del clip de vídeo fotograma a fotograma, se abrirá inmediatamente para el primer archivo de la lista(Figura 2A). Utilícelo para examinar el clip de vídeo y definir el primer y el último fotograma del segmento que se va a analizar. Registre los números de estos fotogramas, que serán necesarios más adelante. Cierre la ventana cuando haya terminado.
6. Para inspeccionar archivos de vídeo adicionales, abra el inspector de vídeo en cualquier momento pulsando Inspeccionar película y seleccionando un archivo de vídeo específico.
7. Seleccione las especies probadas (ratón o rata; ratón es el valor predeterminado).
8. Excluir todas las áreas que puedan interrumpir el seguimiento, de acuerdo con los colores del sujeto y la arena (blanco o negro).
   1. Para excluir un área determinada, pulse Excluir áreay, después de que el cursor cambie a una forma transversal, marque todas las esquinas del área para la exclusión. Cuando haya terminado, haga clic con el botón derecho en el ratón y, a continuación, haga doble clic con el botón izquierdo en el centro del área marcada. El área excluida se convertirá en un tono de rojo en la pantalla. Repita este procedimiento para excluir tantas áreas como sea necesario.
9. Para eliminar un área de la exclusión, pulse Eliminar área excluiday, a continuación, (con el cursor cruzado) haga clic en el área que desea eliminar de la exclusión.
10. Para definir cada cámara como un área de "estímulo", para la detección automática de su investigación por el sujeto, elija la forma del área de "estímulo" para que sea poligonal o elíptica marcando la casilla apropiada, luego presionando Estímulo X (donde "X" representa 1, 2 o 3). Marque las áreas de "estímulo" de forma similar a las áreas excluidas, que luego se convertirán en de color amarillo. Para cambiar la ubicación de un área de "estímulo" específica, pulse Estímulo X de nuevo y marque la nueva ubicación del área (esto actualizará automáticamente la ubicación).
    NOTA: Elija el número de estímulos diferente de una manera coherente para todos los archivos (es decir, objeto como estímulo 1 para todos los archivos de prueba SP).
11. Para realizar un seguimiento de la presencia del sujeto en un compartimento virtual específico dentro de la arena, elija la forma del área 'compartimento' (polígono o elíptica) y, a continuación, pulse Compartimiento X (donde "X" representa 1, 2, 3, 4 o 5). Marque las áreas 'compartimento' de forma similar a las áreas excluidas o de estímulos, que luego se convertirán en de color azul. Para cambiar la ubicación de un área específica de "compartimento", pulse el Compartimiento X de nuevo y marque la nueva ubicación del área (esto actualizará automáticamente la ubicación).
12. Elija el algoritmo deseado (BlackMouseBodyBased se utilizó para el vídeo) de la lista (consulte los algoritmos disponibles en la Figura 2B).
13. Escriba los números de fotogramas iniciales y finales para el análisis en los cuadros de edición correspondientes de la GUI.
14. Elija un umbral para detectar el cuerpo del sujeto.
    NOTA: La mayoría de los algoritmos utilizan el umbral "Bajo" solamente, mientras que los algoritmos basados en direccionalidad de la cabeza utilizan el umbral "Alto", también. Para el umbral "Bajo", elija un nivel que incluya el cuerpo del ratón/rata sin la cola (en la medida de lo posible), mientras que el umbral "Alto" también debe incluir la cola. En el caso de utilizar algoritmos basados en direccionalidad de la cabeza, el software determinará la ubicación de la cabeza como opuesta a la ubicación de la cola.
    NOTA: El software más adelante ignorará los objetos pequeños detectados utilizando el umbral elegido.
15. Para evaluar la detección automática de los bordes del sujeto para un umbral determinado, inserte un valor en el campo de umbral correspondiente y pulse Intro en el teclado.
16. Al elegir varios archivos, desplácese al siguiente archivo (mediante el botón Siguiente en la parte superior) y seleccione las definiciones adecuadas para cada archivo. Cuando haya terminado, verifique los parámetros y las ubicaciones de área para todos los archivos moviéndose entre cada uno, usando los botones Anterior y Siguiente en la parte superior de la GUI.
    NOTA: Las definiciones de todas las áreas y parámetros son específicas de un archivo determinado.
17. Para iniciar el análisis de comportamiento de todos los archivos seleccionados, desplácese al primer archivo y pulse Iniciar.
18. Al final del análisis, se guarda un archivo de resultados (archivo .mat) para cada película en el mismo directorio de los archivos de película.
    NOTA: Si se utiliza la versión lenta (no rápida) del algoritmo, también guardará una versión de la película con una cruz blanca del centro de la masa corporal, que cambia su color cada fotograma que se detecta como investigador, a menos que el botón Guardar película analizada de la GUI esté desmarcado. Esta versión de la película (guardada en el mismo directorio, con el mismo nombre que la película original, con el sufijo 'película analizada') se puede utilizar sin conexión para evaluar la calidad de la detección automática realizada por el sistema.

4. Uso de la GUI TrackRodent para la presentación de resultados

NOTA: Consulte el panel inferior de la Figura 2A para ver la presentación de los resultados.

1. Para inspeccionar los resultados de cada archivo de película, presione Cargar archivo de resultados y elija los archivos .mat generados por el análisis de comportamiento.
2. Mover entre los botones de alternancia para examinar en pantalla cualquiera de los siguientes análisis: Rastreo de ubicación del ratón(Figura 2A); Ocupación de compartimentos a lo largo de la sesión (si se definieron, no se han mostrado los "compartimentos"); Exploración de estímulos a lo largo de la sesión(Figura 2C); Tiempo total en compartimentos (si se han definido "compartimentos"); y el tiempo total de exploración de estímulos(Figura 2D).
   NOTA: Las áreas de "estímulo" son áreas en las que el software evalúa la interacción del sujeto, mientras que las áreas "Compartimiento" son áreas en las que el software rastrea la presencia del sujeto. Detener el análisis mediante el botón Detener análisis guardará automáticamente los resultados generados hasta el último fotograma analizado. Para la mayoría de los equipos, debe ser posible cargar y analizar hasta 20 películas a la vez (dependiendo del rendimiento del equipo).

5. Uso de la GUI TrackRodentPopulationSummary para el análisis de población (Figura 2E)

1. Abra MATLAB (probado con 2014a-2019a) y elija la carpeta TrackRodent.
2. Escriba TrackRodentPopulationSummary en la ventana de comandos y pulse Intro.
3. Cargue varios archivos de resultados TrackRodent (formato .mat) pulsando Elegir archivosde resultados .
4. Rellene los números de Apellido para análisis, Nombre de prueba, Nombre de estímulo 1y Nombre de estímulo 2.
5. Elija los análisis deseados de la lista de análisis opcionales marcando todas las casillas apropiadas.
6. Elija Exportar resultados a una hoja de cálculo marcando la casilla correspondiente para extraer todos los resultados de los análisis marcados como un único archivo de hoja de cálculo.
7. Pulse Iniciar y espere hasta que se complete el análisis.
   NOTA: Esto concluye el análisis. El software se puede utilizar para analizar los resultados de tantos archivos de película como desee, dado que todos fueron analizados de comportamiento utilizando el software TrackRodent. El análisis realizado por el software supone la grabación de vídeo a una velocidad de fotogramas de 30 Hz. En el caso de que se utilizara una velocidad de fotogramas diferente, multiplique el tiempo por 30 y divida por la velocidad de fotogramas utilizada para grabar para convertirla en el valor correcto (s).

Representative Results

Uso del sistema para la prueba de preferencias sociales en ratones C57BL/6J
La Figura 1 muestra tres versiones de la configuración experimental. La primera versión(Figura 1A-C) está diseñada para ratones con colores de piel oscura, como ratones C57BL/6J. La segunda(Figura 1D-F) está prevista para ratones con colores de piel brillante, como los ratones BALB/c o ICR (CD-1). El tercero es más grande(Figura 1G-I)y diseñado para ratas con colores de piel brillante, como ratas SD. Los primeros temas examinados fueron ratones machos machos C57BL/6J de adultos ingenuos (8-12 semanas de edad), alojados en grupos (de dos a cinco animales por jaula). Los estímulos sociales eran juveniles (21-30 días de edad), alojados en grupo (de dos a seis animales por jaula), machos C57BL/6J ratones. Los estímulos de objetos eran juguetes de plástico inodoros con colores distintos (inséste en la Figura 1C,I). Los archivos de vídeo de los experimentos se analizaron utilizando el software TrackRodent (algoritmo basado en el cuerpo, ver imagen de pantalla ejemplificada y GUI en la Figura 2A),que rastreó de forma automática y continua la ubicación del sujeto basado en 1) centro del cuerpo y 2) el contacto de sus contornos corporales con las cámaras que contienen estímulos.

El análisis implicó los siguientes procedimientos. Después de cargar un archivo de película y definir gráficamente las áreas que se excluirán del análisis, el experimentador definió gráficamente dos áreas, cada una de las cuales comprendía una cámara distinta, como 'stimuli'(Figura 2A,áreas amarillentas). Los usuarios también pueden definir hasta cinco áreas como "compartimentos" virtuales. A continuación, los usuarios eligen el algoritmo "BlackMouseBodyBased23_7_14_Fast" de la lista de algoritmos posibles(Figura 2B). Después de pulsar el botón Iniciar análisis, el software rastreó la ubicación del animal fotograma a fotograma y representó el seguimiento de la ubicación del ratón en la arena(Figura 2A,línea azul). Durante este análisis, el software también rastreó los contactos entre las áreas de 'estímulos' y el contorno corporal del sujeto(Figura 2C). Dichos eventos de contacto se definieron como investigadores y sirvieron para calcular el tiempo de investigación de cada estímulo y el tiempo durante el cual no se mostraba ningún comportamiento de investigación(Figura 2D). Como se desprende de la Figura 2C,D que muestra la película analizada, se observó un mayor tiempo de investigación para el "estímulo 2", que era el estímulo social, en comparación con el objeto, que en este caso se definió como "estímulo 1".

Análisis poblacional de la prueba de preferencias sociales en ratones C57BL/6J
Después de permitir que el software TrackRodent analizara todos los archivos de vídeo del grupo experimental, se realizó un análisis de población para este grupo utilizando la GUI "TrackRodentPopulationSummary"(Figura 2E),mientras que la elección de todos los análisis posibles de este software. Los resultados distintivos de estos análisis para la prueba SP realizada con 58 ratones macho adultos C57BL/6J se muestran en la Figura 3, exactamente como aparecieron en la pantalla del ordenador, con todas las barras de error que representan SEM. Los análisis estadísticos de estos resultados se publicaron previamente¹¹.

El tiempo medio total de investigación de la población de sujetos hacia cada uno de los dos estímulos (estímulo social juvenil del mismo sexo y un objeto) se muestra en la Figura 3A,que representa una clara preferencia del sujeto hacia el estímulo social. Aunque el algoritmo es simple, se observó una excelente correlación (r² a 0,91, p < 10^-6, correlación de Pearson) entre el tiempo de investigación medido manualmente por un observador entrenado y el valor calculado por el software. La dinámica de esta preferencia se puede ver en la Figura 3B, en la que el tiempo medio de investigación para cada estímulo se traza a lo largo del tiempo en contenedores de 20 s. Como se muestra, la preferencia social es mantenida por los sujetos durante toda la sesión, aunque parecía un poco más fuerte en las primeras etapas.

La Figura 3C muestra el tiempo de investigación de cada estímulo, categorizado según la duración de la pelea en breves (6 s), medio (>6 s, 19 s) y largos (>19 s) peleas, junto con el tiempo total de investigación. La distribución del tiempo de investigación para cada estímulo según la duración de la pelea en contenedores de 1 s se muestra en la Figura 3D. Como se muestra en la Figura 3C,D, no hubo diferencia entre los estímulos en los peleas cortas, mientras que los peleas medias y largas mostraron claras preferencias sociales. Estos resultados sugieren que en ratones C57BL/6J, los peleas cortas reflejan curiosidad, mientras que los peleas largas reflejan una interacción entre el sujeto y los estímulos. La duración relativa de la investigación (RDI, [social-object]/[social+object]) para cada categoría (breve, medio y largo), así como para el tiempo total de investigación, se muestran en la Figura 3E. Como se muestra, el valor rDI más alto se logra con los largos peleas, lo que sugiere que mejor reflejan las preferencias sociales de los sujetos.

Para analizar la dinámica de la pelea de investigación durante la prueba, las distribuciones a lo largo del tiempo para cada categoría se trazaron por separado. Las distribuciones a lo largo del tiempo de los informes de investigación cortos(figura 3F)y medios(figura 3G)sugieren una reducción gradual de estos peleas con el tiempo. Por el contrario, un análisis similar de los largos peleas(Figura 3H) muestra un aumento gradual en el transcurso de la prueba. Esta tendencia también se refleja en la distribución de la duración media de la pelea(Figura 3I),que muestra un aumento gradual con el tiempo. Por lo tanto, parece como si los sujetos mostraran curiosidad principalmente durante las primeras etapas de la prueba, mientras que más tarde mostraron más interacciones con los estímulos. Cabe señalar que durante el último minuto, hay un sesgo inherente del análisis hacia los peleas cortas, porque los largos peleas se terminaron artificialmente al final de la sesión. Por lo tanto, al considerar el curso de tiempo de los peleas de investigación, el último minuto debe ser ignorado.

También analizamos los intervalos entre los sucesivos conflictos de investigación hacia el mismo estímulo (es decir, el tiempo que tardó el sujeto en volver al mismo estímulo después del final de cada pelea de investigación). Este parámetro refleja el impulso del sujeto a volver al mismo estímulo e investigar. En este caso, los intervalos también se clasificaron en peleas cortas (5 s), medianas (>5 s, 20 s) y largas (>20 s), que se muestran junto con intervalos de tiempo totales para cada estímulo en la Figura 3J. El histograma de los intervalos en 1 s bins en se muestra en la Figura 3K. Como se muestra en la Figura 3J,K, los intervalos entre las investigaciones del estímulo social fueron mucho más cortos que los que se encuentran entre las investigaciones del objeto. En consecuencia, los valores RDI de los intervalos en el rango largo produjeron el valor absoluto más alto(Figura 3L); por lo tanto, pueden utilizarse como una variable de investigación independiente del tiempo que evalúa la preferencia social. Las distribuciones a lo largo del tiempo de los intervalos trazados por separado para cada categoría(figura 3M-O)sugieren una reducción gradual de los intervalos cortos y medios y un cambio opuesto en intervalos largos entre los enfrentamientos de investigación, que muy probablemente reflejan el alargamiento general de los enfrentamientos de investigación. Al igual que la distribución de los peleas de investigación, el último minuto de intervalos está sesgado hacia valores cortos y debe ignorarse.

También analizamos las transiciones observadas en sujetos de un estímulo a otro. Esta gráfica se muestra en la Figura 3P, en la que cada punto de tiempo que el sujeto comenzó a investigar un nuevo estímulo está marcado por un punto azul, cada fila representa un sujeto distinto y la línea roja representa la tasa de transición media. Como es evidente, la tasa de transición fue más alta (1,5 transiciones/min) durante los primeros 2 minutos de la prueba y se redujo gradualmente a menos del 50% del pico. La misma tendencia se desprende de la distribución de la tasa media de transición a lo largo del tiempo(Figura 3Q).

Por último, se muestran los mapas de calor de los ensayos de investigación hacia el estímulo social(Figura 3R) y el objeto (Figura 3S) durante el transcurso de la prueba para cada sujeto, con los colores marcando la duración de la pelea(Figura 3S). En conjunto, los resultados sugieren que en ratones C57Bl/6J, la prueba de SP se divide aproximadamente en una fase exploratoria temprana (caracterizada por una alta tasa de transición y breves efectos de investigación) y una fase de interacción tardía (caracterizada por una baja tasa de transición y largos efectos de investigación).

Análisis poblacional de la prueba de preferencia de novedad social en ratas SD
La Figura 4 muestra el mismo análisis que el anterior para la prueba SNP realizada por 59 ratas SD. Típicamente, la preferencia de novela vs. estímulos sociales familiares es más débil que la preferencia hacia un nuevo estímulo social vs. un objeto, exhibido por ratones en la prueba SP(Figura 3). Sin embargo, la preferencia de la novedad social se refleja claramente en todos los parámetros. En particular, como se ha concluido anteriormente de la prueba de SP en ratones, los largos destellos de investigación y los intervalos largos son los parámetros que muestran más claramente las diferencias entre los estímulos, como se refleja en sus valores absolutos más altos de IR(Figura 4E,L; debe señalarse que los valores de RDI para la prueba SNP se definen como [familiar-novel]/[familiar+novela]).

La pérdida de bigotes afecta la preferencia social tanto en ratones C57BL/6J como en ratas SD
Para evaluar los efectos de la manipulación somatosensorial en la dinámica del comportamiento social, se realizó un análisis de la prueba de SP completada por 29 ratones C57BL/6J y 33 ratas SD después del recorte del bigote (realizado 3-7 días antes de la prueba). Luego, estos resultados se compararon con los animales de control. Como se muestra en la Figura 5A-F, los ratones recortados por bigote no preferieron el estímulo social sobre el objeto, como se refleja en la falta de diferencia en el tiempo de investigación entre los dos estímulos (comparar la Figura 5A con la Figura 5D)y la pérdida de largos efectos de investigación hacia el estímulo social (comparar la Figura 5B con la Figura 5E). Curiosamente, los ratones recortados por bigotes también mostraron mayores tasas de transición en comparación con los ratones de control (comparar la Figura 5C con la Figura 5F).

En conjunto, estos datos sugieren que los ratones recortados con bigote redujeron notablemente la duración de sus interacciones con el estímulo social. A diferencia de los ratones, las ratas recortadas por bigote no perdieron sus preferencias sociales(Figura 5G-L). Sin embargo, cambiaron significativamente su comportamiento durante el primer minuto de la prueba, cuando tuvieron menos peleas de investigación largas (comparar la figura 5H con la figura 5K)y muchas más transiciones (comparar la figura 5I con la figura 5L). Por lo tanto, el recorte de bigotes modificó significativamente el comportamiento de ratas y ratones en la prueba SP, pero de una manera muy diferente entre las dos especies. Estos resultados sugieren un papel distinto para la estimulación somatosensorial dependiente del bigote en las interacciones sociales de ratas y ratones.

Figura 1: Configuración experimental. (A) Una representación esquemática de la arena experimental diseñada para ratones con pelaje negro. (B) Una imagen de la arena desde arriba, utilizando una luz roja tenue, mostrando un ratón sujeto C57BL/6J en la arena. (C) Una imagen que muestra el área mallada de una cámara blanca, a través de la cual el sujeto interactúa con un estímulo (inset: una imagen de un estímulo de objeto utilizado para ratones). (D-F) Como se muestra en los paneles A-C, una arena experimental y cámaras diseñadas para ratones con pelaje brillante. (G-I) Como se muestra en los paneles A-C, una arena experimental y cámaras diseñadas para ratas con pelaje brillante (inserción en [I]: imagen de un estímulo de objeto utilizado para ratas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Software TrackRodent. (A) Una pantalla de un ordenador que ejecuta el software TrackRodent. Izquierda: la imagen de vídeo al principio de la película analizada (primer fotograma elegido por el experimentador), que muestra las áreas etiquetadas 'stimuli' y la ruta de movimiento rastreada del sujeto C57BL/6J. Derecha: la GUI del software. (B) La lista de códigos opcionales del software que se utilizará con la GUI. Cada uno de estos códigos se ajusta a una condición experimental distinta. (C) El análisis del experimento específico que se muestra en el panel A, cuando se seleccionó la opción de exploración de estímulos a lo largo de la sesión en la sección Presentación de resultados de la GUI. Esta gráfica muestra (en cada fotograma) si el sujeto estaba en contacto con 'estímulo 1' o 'estímulo 2'. En el caso presentado, una clara preferencia hacia el "estímulo 2" es evidente por el mayor número y duración de los trabajos de investigación detectados hacia este estímulo. (D) El análisis del experimento mostrado en los paneles A y C, cuando se seleccionó la opción de Tiempo total de exploración de estímulos en la sección Presentación de resultados de la GUI. También aquí, una clara preferencia hacia el "estímulo 2" es evidente desde el mayor nivel de investigación hacia este estímulo. (E) La GUI del software TrackRodentPopulationSummary que permite el análisis y el trazado de los resultados de una población de animales, cada uno de los cuales se analiza utilizando el software TrackRodent (consulte la figura 3 para ver los resultados de dicho análisis). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Análisis del comportamiento de investigación de ratones C57BL/6J durante la prueba SP utilizando el software TrackRodent. Esta figura muestra las diversas gráficas de todos los análisis opcionales del software TrackRodentPopulationSummary(Figura 2E)empleado para una población de 58 ratones machoadultos adultos C57BL/6J que realizan la prueba SP. Las distintas gráficas se muestran de forma y orden similar es a como aparecían en la pantalla del ordenador (consulte la sección de resultados representativos para obtener una explicación detallada de cada parcela). (A) Tiempo total de investigación de estímulos, (B) Investigación de estímulos a lo largo del tiempo, (C) Peleas cortas vs largas - tiempo total, (D) 1s bin histograma de bouts, (E) Short vs long bouts - RDI, (F) <6 s bouts a lo largo del tiempo, (G) 6 x 19 s bouts a lo largo del tiempo, (H) >19 s bouts a lo largo del tiempo, (I) Duración media de la pelea a lo largo del tiempo, (J) Intervalos cortos vs largos - tiempo total, (( Intervalos - Intervalos RDI, (M) <5 s intervalos a lo largo del tiempo, (N) 5 a 20 s intervalos a lo largo del tiempo, (O) >20 s intervalos a lo largo del tiempo, (P) Transiciones entre estímulos - trazado ráster, (Q) Transición entre estímulos a lo largo de los tiempos, (R) Mapa de calor de la duración de la pelea con social, (S) Mapa de calor de duración de la pelea con el objeto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Análisis del comportamiento de investigación de ratas SD durante la prueba SNP utilizando el software TrackRodent. Parcelas para todos los análisis opcionales del software TrackRodentPopulationSummary(Figura 2E)empleado para una población de 59 ratas macho adultas SD que realizan la prueba SNP. Las distintas gráficas se muestran de forma y orden similar es a como aparecían en la pantalla del ordenador (consulte la sección de resultados representativos para obtener una explicación detallada de cada parcela). (A-Q) Lo mismo se describe en la Figura 3. (R) Mapa de calor de la duración de la pelea con Familiar, (S) Mapa de calor de la duración de la pelea con Novela. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: El recorte de bigotes de ratones y ratas afecta diferencialmente el comportamiento social. (A) Gráfica del tiempo medio de investigación (medido en 20 s bins) durante la prueba SP para ratones machoC57BL/6J (n.o 58). (B) Distribución (1 min bins) del tiempo total medio de los ensayos de investigación largos (>19 s) a lo largo de la prueba SP que se muestra en el panel A para estímulos sociales y objetos. Tenga en cuenta el tiempo mucho más largo de largas investigaciones se descuenta hacia el estímulo social en comparación con el objeto. (C) Distribución (1 min bins) de la tasa de transición a lo largo del tiempo de la prueba SP que se muestra en (A). (D-F) Como se muestra en los paneles A-C, 29 bigotes de ratones fueron recortados aproximadamente 1 semana antes de la prueba. Estos animales perdieron su preferencia social, como se refleja en el tiempo de investigación general(D)y(E)la distribución de largas peleas. También mostraron una mayor tasa general de transiciones (F), lo que sugiere interacciones menos sostenidas con el estímulo social. (G-I) Como se muestra en los paneles A-C, 60 ratas SD realizaron la prueba SP. Tenga en cuenta la diferente dinámica del comportamiento de las ratas en comparación con los ratones, con tasas de transición más bajas y períodos más largos de largos peleas de investigación en la fase temprana (2 min) de la prueba. (J-L) Como se muestra en los paneles G-H, 33 ratas fueron recortadas por bigote. Tenga en cuenta que mientras que las ratas no perdieron preferencia social después de un recorte de bigotes como lo hicieron los ratones, la dinámica de su comportamiento social en los primeros 2 minutos de la prueba cambió, mostrando más transiciones y menos peleas largas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El sistema experimental descrito aquí, que fue diseñado como una alternativa al aparato de tres cámaras^2,5, permite la realización de las mismas pruebas mientras se resuelven algunas de sus limitaciones. El uso de cámaras triangulares, que se encuentran en dos esquinas opuestas de la arena rectangular, limita el área de interacción sujeto-estímulo a un plano bien definido, lo que permite un análisis automatizado preciso del comportamiento de la investigación. Una ventaja es el uso del software de análisis (TrackRodent) para calcular múltiples parámetros de comportamiento para cada prueba. También permite el reposicionamiento de las cámaras en esquinas opuestas aleatorias de la arena durante las diversas etapas del paradigma, neutralizando cualquier efecto de las habilidades de navegación espacial.

Además, los dos rincones de la arena, que se dejan vacíos durante cada etapa, ofrecen al sujeto un lugar conveniente para descansar y acicalar y alejarlo de las cámaras, minimizando los resultados falsos positivos. Por lo tanto, el sistema permite la evaluación directa de la motivación del sujeto para investigar cada estímulo durante las pruebas SP y SNP. Además, como el análisis del comportamiento de los videos se realiza de forma automatizada por el software TrackRodent, un experimentador puede cargar varias películas para su análisis, definir los parámetros correctos para cada uno, y dejar que el proceso de software durante la noche, lo que ahorra un tiempo precioso. En particular, el sistema puede utilizarse para cualquier tipo de prueba de discriminación social, como la discriminación entre estímulos sociales masculinos y femeninos o estímulos de cepas distintas. Además, no hay límites (superior/inferior) al tamaño de los sujetos que se pueden rastrear utilizando este sistema; por lo tanto, puede ser utilizado con juveniles u animales obesquesos. Este sistema experimental es barato y fácil de producir, y los códigos informáticos utilizados para el análisis están disponibles públicamente como códigos de código abierto, lo que permite a cualquier laboratorio adoptar fácilmente el método.

La detección automatizada del comportamiento de la investigación en el sistema se basa en la detección del contacto físico entre los contornos corporales de un sujeto y cada una de las áreas definidas por el experimentador como 'estímulos'. Por lo tanto, si el sujeto toca el área de 'estímulos' con su cuerpo en lugar de la cabeza, este evento se considera investigador (es decir, un falso positivo). Para ello, se generó el algoritmo basado en la direccionalidad de la cabeza, que identifica la cabeza del sujeto y sólo tiene en cuenta el contacto entre la cabeza y los 'estímulos'. Sin embargo, este algoritmo se ejecuta significativamente más lento que los algoritmos basados en el cuerpo; por lo tanto, no se recomienda para el análisis de un gran número de películas, a menos que las condiciones experimentales lo requieran.

Se observaron resultados similares (diferencia del 1,1%, n a 11 experimentos, 5 min cada uno, datos no mostrados) entre los dos algoritmos; por lo tanto, los algoritmos basados en el cuerpo se utilizaban con mayor frecuencia. Cabe señalar que aunque aquí se presentan análisis de grandes grupos de animales, se necesita un tamaño de grupo mucho menor para observar una diferencia estadísticamente significativa entre dos estímulos, basándose en el tiempo total de investigación medido por el sistema. Por ejemplo, los cálculos de potencia revelaron que sólo se requieren tamaños de muestra de cinco y ocho animales para las pruebas de SP y SNP de ratones, respectivamente (a 0,05, potencia, 0,8). Sin embargo, aquí se utilizaron grupos de animales significativamente más grandes para asegurar la observación de todas las dinámicas del comportamiento social.

El sistema requiere que el experimentador defina manualmente el umbral para la detección de los contornos corporales del sujeto. Encontrar el umbral adecuado para ser utilizado puede requerir cierta experiencia; por lo tanto, la mayoría de los algoritmos utilizados en este sistema tienen versiones regulares y más lentas. Estas versiones presentan la película analizada y detectan eventos de investigación en línea, mientras que sus versiones rápidas no permiten la presentación en línea. Se recomienda que los nuevos usuarios utilicen las versiones regulares y monitoreen los análisis en línea para asegurarse de que funciona correctamente y que utilizan los algoritmos "rápidos" solo después de recopilar experiencia con el procedimiento de análisis.

Una ventaja de este sistema sobre la prueba de tres cámaras es que mide múltiples parámetros del comportamiento de la investigación, apoyando así análisis más detallados. Esta ventaja es doble. En primer lugar, el experimentador no tiene que basarse únicamente en el tiempo total de investigación para determinar la preferencia. Se encontró que los largos ataques de investigación y los intervalos largos son más sensibles que el tiempo total de investigación al detectar una preferencia de un estímulo sobre otro. Con respecto a estos parámetros, cabe señalar que sus valores durante el último minuto de la prueba están sesgados hacia abajo, ya que los largos eventos e intervalos de investigación se terminan prematuramente al final de la sesión de 5 minutos.

En segundo lugar, los múltiples parámetros permiten detectar cambios sutiles en la dinámica de la investigación social después de diversas manipulaciones. Por ejemplo, se encontró que los ratones macho C57BL/6J perdieron su preferencia social después del recorte de bigotes. Por el contrario, las ratas macho SD mantuvieron su preferencia social, pero cambiaron la dinámica de comportamiento social como lo demuestran los peleas de investigación más cortas y el nivel más alto de transiciones en la fase temprana de la prueba. En general, estos datos sugieren una reducción en la tendencia de ratas y ratones para las interacciones sociales después del recorte del bigote. Por lo tanto, este sistema apoya un análisis riguroso de la dinámica del comportamiento social, que puede ser altamente sensible a diversas manipulaciones.

En resumen, presentamos aquí un sistema experimental novedoso, simple y asequible que soporta el análisis automatizado de la dinámica del comportamiento de la investigación social. Este sistema facilitará análisis detallados de los déficits de comportamiento social en diversas cepas y líneas modificadas genéticamente de pequeños roedores. Además, la detección precisa de los ensayos de investigación que se demuestran aquí, combinados con la capacidad de este sistema para analizar el comportamiento mientras los sujetos están conectados a cables eléctricos o fibras ópticas, permite su uso en experimentos que implican la grabación actividad cerebral asociada con el comportamiento social.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Flea3 1.3 MP Mono USB3 Vision	FLIR (formerly PointGrey)	FL3-U3-13Y3M-C	Monochromatic Camera
FlyCap 2.0	FLIR (formerly PointGrey)	FlyCapture 2.13.3.61X64	Video recording software
Home 5 minute Epoxy glue	Devocon	20845	For gluing the metal mesh to the Plexiglas stimuli chambers
Matlab 2014-2019	MathWorks	R2014a - R2019a	Programming environment
Plexiglas boards (6 mm thickBlack or white)	Melina (1990) LTD, Israel	NaN	For arena and stimuli chambers construction
Red led strips (60 leds per meter) connected to a 12 V power supply	2012topdeal eBay supplier	NaN	For illumination of the acoustic chamber