Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

החבלה פגיעה בחוט השדרה באמצעות כריתת למינציה מיקרוכירורגית ב הרגנרציה הנרטיבית

Published: October 20, 2019 doi: 10.3791/60337
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 1
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University, 2Department of Neurosurgery, Aarhus University Hospital

Summary

כתב יד זה מציג פרוטוקולים לגרימת כירורגית מבוקרת פציעות בחוט השדרה החדה בצורה בוטה התחדשות משובי (Ambystoma מקסינום).

Abstract

מטרת מחקר זה היא להקים מודל משובי התחדשות מתוקננת בחוט השדרה בוטה בתוך האקסון (אמייסטומה מקסינום). רוב הפציעות הקליניות בעמוד השדרה מתרחשות בתור טראומות אנרגיה מאוד גבוהות, ומגרימת פציעות חבלה. עם זאת, רוב המחקרים בחוט השדרה האקאואלי נערכו עם טראומות חדות. מכאן, מחקר זה נועד לייצר מודל משובי קלינית יותר רלוונטי. בשל היכולת המרשימה שלהם להתחדש כמעט כל רקמה, axo, משמשים באופן נרחב כמודלים במחקרים רגנרטיבית, שימשו בהרחבה במהלך פגיעה בחוט השדרה (SCI) לימודי. בפרוטוקול זה, האקנויום מורדם באמצעות שאיפה בתמיסה של בנזוקיין. תחת המיקרוסקופ, חתך זוויתי נעשה בקיעים ברמה רק caudal אל הגפיים האחוריות. מחתך זה ניתן לנתח ולחשוף את התהליכים הספיציתיים. באמצעות מלקחיים ומספריים, כריתת למינציה דו-הרמה מבוצעת, חשיפת חוט השדרה. מכשיר טראומה מותאם אישית המורכב מוט נופל בצילינדר נבנה, והמכשיר הזה משמש כדי לגרום לפציעה החבלה בחוט השדרה. ואז החיה מתאוששת מהרדמה. הגישה הכירורגית מצליחה לחשוף את חוט השדרה. מנגנון הטראומה יכול ליצור פציעות חבלה לחוט השדרה, כפי שאושר על ידי היסטולוגיה, MRI, ובדיקה נוירולוגית. לבסוף, חוט השדרה מחדש מן הפציעה. השלב הקריטי של הפרוטוקול מסיר את התהליכים הספיציתיים מבלי לגרום נזק לחוט השדרה. שלב זה דורש הכשרה כדי להבטיח הליך בטוח. יתרה מזאת, סגירת הפצע תלויה מאוד בגרימת נזק מיותר לעור במהלך החיתוך. הפרוטוקול בוצע במחקר אקראי של 12 בעלי חיים.

Introduction

המטרה הכוללת של מחקר זה היה להקים שיטה מיקרוכירורגית מבוקרת ולאחר לגרימת SCI בוטה חדה לבין axoלוטאני (Ambystoma מקסינום), הפקת מודל פגיעה בחוט השדרה התחדשות.

SCI הוא מצב חמור, כי, בהתאם לרמה ובמידה, גורם נכות נוירולוגית לגפיים יחד עם שלפוחית השתן לקויה בקרת מעיים1,2,3. המדע הבדיוני ביותר הם תוצאה של טראומה בוטה באנרגיה גבוהה כגון תאונות דרכים, נופל4,5. . פציעות חדות הן מאוד נדירות לפיכך, סוג הפציעה המקסקופי השכיח ביותר הוא חבורות.

מערכת העצבים המרכזית של היונקים (cn) היא רקמה לא משובי, ולכן אין שחזור של רקמות נוירולוגיות לאחר SCI הוא ראה6,7,8. מצד שני, בעלי חיים מסוימים הם בעלי יכולת מרתקת לחדש רקמות, כולל רקמת ה-CN. . אחת מהחיות הללו היא האקאוסול הוא משמש רבות למחקרים של ביולוגיה רגנרטיבית והוא מתעניין התחדשות חוט השדרה, כי הוא בעלי חוליות9,10,11,12.

רוב לימודי המדע באקסון מבוצעים כקטיעה של הזנב כולו או אבלציה של חלק גדול יותר של חוט השדרה9,10,11,12. לאחרונה, מחקר חדש התפרסם על פציעות קהה13 כי לאחר מחקה מצבים קליניים טוב יותר. הואיל והשלמת התוספת כריתה בתוצאות axol התחדשות מלאה, כמה תופעות משובי שאינן מבוססות קטיעה תלויות פגם בגודל קריטי (csd)14,15. משמעות הדבר היא שפציעות החורגות מסף קריטי אינן נוצרות מחדש. כדי לפתח מודל משובי עם ערך מעבר קליני גבוה יותר, מחקר זה חקר אם טראומה בוטה 2 מ"מ יעלה על הגבול CSD.

שיטה זו רלוונטית עבור חוקרים העובדים על התחדשות חוט השדרה במודלים של בעלי חיים קטנים, במיוחד בצורת axol. יתר על כן, זה עשוי להיות עניין כללי יותר, כי הוא מציג דרך להשתמש בציוד מעבדה סטנדרטיים כדי לפתח מנגנון טראומה קהה המתאים לשימוש בחיות קטנות בכלל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל התקנות המוסדיות והממשלתיות הישימות הנוגעות לשימוש האתי בבעלי חיים הופעלו במהלך מחקר זה. המחקר נערך תחת אישור מזהה: 2015-15-0201-0061 על ידי Inspectorate ניסוי בעלי חיים דנמרק. בעלי חיים היו axo, מקסיקני (Ambystoma מקסימפנון), מתכוון מסת הגוף ± STD: 12.12 g ± 1.25 g).

1. הכנה

  1. . הכן את האקאוסול להרדמה
    1. להשתמש באיכות גבוהה ללא כימית טיפול מי ברז. אם לא זמין, השתמש בפתרון של 40% הולטסטר.
    2. התמוססות 200 מ ג של אתיל 4-אמינבזואט (בנזוקאין) ב -3 מ ל של אצטון. התמוססות פתרון זה ב 1 L של מי ברז או 40% הפתרון של הולטסטר.
  2. השתמש בצלחת פטרי סטנדרטית (100 מ"מ בקוטר) הממוקמת תחת מיקרוסקופ סטריאו כשולחן ניתוחי. מניחים בד טקסטיל כירורגי על צלחת פטרי.
    הערה: שימוש בצלחת פטרי כאזור כירורגי מאפשר הנעה וסיבוב של בעל החיים מבלי לגעת בו, תוך הקפדה על יציבות עמוד השדרה במהלך הניתוח.
  3. הכן את כל כלי הניתוח המיקרוכירורגיה הסטריליים (כלומר, מספריים ומלקחיים אנטומיים).

2. הרדמה

  1. מניחים את האקסון במיכל עם פתרון בנזוקיין עבור כ 45 דקות כדי להבטיח הרדמה עמוקה ויציבה.
    הערה: הריכוז הנתון של בנזוקאין יגרום להרדמה בכל הגדלים.
  2. בדוק סימנים של הרדמה כללית בתוך 30-45 דקות. אלה כוללים חוסר מוחלט של תנועות זימים, רפלקס הצתה, או תגובה לגירויים מישוש או כואבים (התכווצות עדינה של הבוהן באינטרנט).
  3. כדי לשמור על הרדמה, לעטוף את בעלי החיים מגבות נייר הושבו בתמיסה הרדמה. רטוב אלה באופן קבוע עם פתרון זה במהלך ההליך כירורגי כדי להבטיח את העור והזימים נשמרים לח.
  4. לשחזר את החיה לאחר הניתוח על ידי הצבת אותו במיכל המכיל מי ברז טרי. שימו לב לסימנים של התאוששות, כגון תנועת הגיל והחזרה רפלקס, בתוך 1 h16.

3. כריתת למינציה מיקרוכירורגית

הערה: כריתת למינציה מבוצעת תחת stereomicroscope.

  1. מניחים את החיה בתנוחה הנוטה על צלחת פטרי. עטפו אותו במגבות נייר כך שהזנב ייחשף.
    הערה: מגבות נייר מצוינות להבטחת יציבות במהלך ההליך.
  2. . זהה את הגפיים האחוריות לעשות את החתך הראשון פשוט לקדל אותם.
    1. עם זוג מיקרו-מספריים, יש לבצע חתך אנכי מתוך הסירה עד שהגדולה הגרתית של התהליכים הספירטיתיים מורגשת.
      הערה: להיות זהיר מאוד כאשר אוחז את הסירה ואת העור עם מלקחיים, כי אלה בקלות לגרום נזק לעור עדין.
    2. הארך את החתך, כך שהחיתוך משתרע על פני כל רוחב הזנב.
    3. לתפוס את התהליך spinous עם מלקחיים כדי להבטיח את העומק הנכון.
    4. הארך את החתכים האנכיים 1 מ"מ מתחת לתהליך spinous משני הצדדים.
  3. הנח את החיה בצד אחד כדי לבצע חתכים הגחיים ואופקיים כאמור להלן.
    1. עם זוג של מיקרו מספריים, החל מהנקודה הגקית של החתך האנכי, לעשות חתך אופקי של כ 15 מ"מ עבור בעלי חיים 10-20 g במשקל. הפוך את החתך לארוך יותר עבור בעלי חיים גדולים יותר, וקצר יותר עבור חיות קטנות יותר.
    2. באמצעות המספריים, לנתח באופן מיידי דרך החתך האופקי עד העמודה החוליות הוא חש באמצע הדרך.
    3. חזור על שלבים 3.3, 3.3.1 ו3.3.2 בצד השני של בעל החיים.
  4. לאחר בגזור במישור המדיאלי עמוק משני הצדדים, לנתח דרך קו האמצע, ובכך חיבור שני חתכים אופקיים.
    1. הזז את פיסת הזנב החופשית ושוב לצד אחד, תוך חשיפת התהליכים הspinous (איור 1).
    2. מתידף את הזנב באמצעות מגבות נייר רטובות.
  5. מניחים את החיה בתנוחה הנוטה שוב עם הראש מול הצד הלא דומיננטי של המנתח.
    1. עם זוג מלקחיים, לתפוס את התהליכים spinous רק caudal הגפיים האחוריות. החילו את המעלית העדינה למעלה ולכיוון ראש החיה.
    2. הניחו את הלהבים של זוג מספריים אופקיים סביב התהליך וחתכו אותו בעדינות. המעלית בתהליך מבטיחה שהיא תוסר כעת, ותחשוף את חוט השדרה.
    3. לתפוס את התהליך spinous רק caudal אחד זה רק הוסר ולחזור על צעדים 3.5.1 ו 3.5.2.
      הערה: זה אמור להשאיר חוט השדרה חשוף המתאים שתי רמות החוליות. כשאתה מבצע כריתת למינציה, מופיע לעתים קרובות הפרשה לבנה. חוט השדרה מזוהה בקלות על ידי ברק הייחודי שלה, יחד עם כלי רץ לאורך קו האמצע.
    4. בהתאם לגודל של בעל החיים, השטח החשוף לא יכול להיות רחב מספיק. באמצעות שני זוגות של מלקחיים, לתפוס את למינציה משני צידי חוט השדרה ולסובב את הצדדי עם תנועה עדינה.

4. החדרת פציעת סוג החבורה (איור 2)

  1. . שמור על החיה בתנוחה הנוטה
  2. השתמש בצלחת פטרי כדי להעביר את החיה ליחידת הטראומה.
  3. יש עוזר שיאיר פנס. על חוט השדרה
  4. מניחים את גליל יחידת טראומה של החבלה מעל חוט השדרה החשוף באמצעות מיקרו-שפיטה ביחידה. . כווני דרך הצילינדר
  5. הנמך את הצילינדר עד שהוא יהיה ברמה עם המילמינציה.
  6. . חברו את המוט הנופל לאלקטרומגנט מניחים את הצילינדר הרצוי התאמת גובה על יחידת טראומה.
  7. מניחים את המוט נופל בצילינדר.
    הערה: עבור מחקר עיוור, המנתח צריך עכשיו לעזוב את החדר בלי לדעת אם החיה יהיה מוקצה לפציעה או קבוצה ניתוח מזויף.
  8. . תכבה את האלקטרומגנט המוט נופל אל חוט השדרה החשוף.
  9. השתמש בורג התאמת גובה להרים את המוט מן חוט השדרה.
  10. לאשר את הפציעה על ידי התבוננות בחוט השדרה דרך המיקרוסקופ. האתר הפצוע ייראה כהה יותר, והדימום מכלי האמצע יהיה גלוי.

5. החדרת פציעה חדה

הערה: בצע שלבים אלה לאחר 3.5.4.

  1. עם זוג מיקרו מספריים חותכים את חוט השדרה בחתך אנכי מושלם.
  2. לחזור על חתך 2 מ"מ אל הצד caudal של הגוף.
    הערה: אורך פיסת חוט השדרה הוסר ניתן לכוונן לפי דרישת המחקר. עם זאת, חיתוך 2 מ"מ יהיה מחדש10.
  3. ודא כי החתכים הושלמו. עם סיום הטיפול, הרגישו את הלהבים של המספריים מגרדים לאורך החלק הגחוני של תעלת השדרה.
  4. הרם את פיסת חוט השדרה 2 מ"מ מתעלת השדרה.

6. סגירת הפצע הכירורגי

  1. החזר את החיה לשולחן הכירורגי. במחקר עיוור, למקם מחדש את הסירה כך חוט השדרה לא נראה למנתח.
  2. . שמור על החיה בתנוחה הנוטה
    1. בגין הצבת 10.0 ניילון תפרים מהחלק הכי caudal של החתך האופקי. סגרו את הפצעים בשכבה אחת.
      הערה: אל תופסים את העור חזק מדי, כי זה יגרום נמק.
    2. לעבוד לקראת החלק האנכי של החתך.
    3. כשמגיעים לזווית, סובבו את צלחת פטרי ותפר את החתך האופקי השני.
    4. הגדר תפרים על החתכים האנכיים.
    5. אין להניח תפרים בחלק העליון של הסירה, כי העור כאן לא יוכל להחזיק.

7. החזרת החיה לתמיסה נטולת ההרדמה

  1. הרימו את צלחת הפטרי עם בעל החיים והחליקו בעדינות לתוך מים מתוקים רק 5 ס מ עמוק ותן לחיה להחליק.
    הערה: עומק המים הרדודים מבטיח שהחיה לא תנסה לשחות אל פני השטח כדי לנשום.
  2. אל תשנו את המים במהלך השבוע הראשון.
  3. כאשר מאכילים את החיות, יש לוודא שהאוכל ממוקם בסמוך לראש החיה.
    הערה: מטרת הצעדים הללו היא להימנע מתנועה רבה ככל האפשר במהלך השבוע הראשון.

8. אולטראסאונד שלאחר הניתוח

  1. לפני סיום ההרדמה, השתמש במערכת אולטרסאונד בתדר גבוה כדי לרכוש תמונות של הפציעה שניתן להשתמש בהם לבניית תמונות תלת ממדיות של אתר SCI.
  2. הצמד את מתמר למיקרומניפולציה, רצוי על-ידי ג'ויסטיק מרחוק.
  3. לטבול את החיה מורדם במצב נוטה לתוך מיכל קטן מלא בתמיסה הרדמה.
    הערה: לתקן את החיה עם שקי חול זעירים או ציוד אחר כדי למנוע תנועה במהלך רצף הסריקה.
  4. יישר את קצה המתמר עם ציר האורך של בעל החיים והגבר אותו לתוך התמיסה בנזוקיין עד שהוא רק מילימטרים ספורים מעל הסירה מאחורי הגפיים האחוריות של החיה.
  5. זהה את אתר SCI.
    הערה: אתר הפציעה ניתן לזיהוי בקלות בשל תהליכי הספילי החסרים הנמצאים ישירות מעל המדע.
  6. מיטוב התמונה על-ידי כוונון הגדרות האולטרסאונד. ודא שאתר ה-SCI נמצא במרכז התמונה. כוונן את שדה התצוגה (כלומר, עומק התמונה, היסט העומק ורוחב התמונה) כדי לכסות את אתר SCI ורקמות בריאות סמוכות. כוונן את הרווח הדו-ממדי כדי למטב את הניגודיות של התמונה.
  7. על ידי ניקוי מתמר אולטרסאונד ברחבי האתר SCI עם מיקרומניפולציה אלקטרונית, לרכוש תמונות במצב B המכסה את אתר SCI במיקומים מרובים משונן cross-חתך, עם פרוסות רצופות עם מרווח בין הפרוסות של 50 μm. לרכוש cine-תמונות המכילות 500 מסגרות עם קצב מסגרת של ~ 50 מסגרות/s ותדירות מתמר של 40 MHz.
    הערה: התקנה זו מחייבת מיקרומניפולציה אלקטרונית הנשלטת על-ידי ג'ויסטיק מרוחק (שלב 8.2).
  8. לאחר סיום רצף הסריקה לחזור לשלב 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מטרת הפרוטוקול היא לייצר SCI כי יהיה לשתק את המנוע פונקציות חישה caudal לפציעה. בגלל האקסון הוא התחדשות-מוסמך זה משחזר את הפונקציה בתוך שבועות, ומאפשר לחוקרים ללמוד התחדשות ה-CN במהלך זמן קצר.

הרדמה סופקה עבור 45 דקות לכל בעלי החיים, ולא היו מקרים של שחזור טרום לטווח היו מנוסים. כל החיות שנמצאו בתוך שעה ולא הראו סימני נזק מההרדמה בשבועות הבאים13,16.

כריתת המילמינציה הצליחה בכל בעלי החיים. עם זאת, וריאציה אנטומית ברוחב של תעלת השדרה קרא להרחיב את התעלה באמצעות מלקחיים וטוויסט אצל אנשים מסוימים. יתר על כן, שיורית למינציה אצל אנשים מסוימים מנעו את המוט נופל מלהגיע היעד שלה, ולכן זה הכרחי כי המנתח לנקות את השדה מן העצם שיורית וprominences.

סגירת החתכים היה קשור לקשיים מסוימים, במיוחד במהלך שלב הטיס של המחקר. התפרים בחלק העליון של הסירה לא יחזיקו והביאו סגר מספיק. הסגר על חיה אחת בחדר העבודה לא החזיק מעמד, וכתוצאה מכך הוא נקרע, הזיהום העוקב והמוות. זה מדגיש את הצורך הזהיר מפני לאורך החתכים כולו.

הפציעות המכאניות הראשוניות. היו ברורות במהלך הניתוח במהלך פיתוח המודל, בעלי חיים פצועים ומזויפים הוכתמו במטאוקסילין ובאאוזין לאמת את הפציעה. תוצאות מייצגות של כל קבוצה מוצגות באיור 3A1,A2 ואיור 3c1,c2. התחדשות אושרה על ידי סעיפים היסטולוגיים ההכנות שנעשו לאחר תשעה שבועות (איור 3B1,B2 ואיור 3D1,D2), אשר הראו חיבור חוט השדרה מתחדשת בבעלי חיים SCI.

ניתן לעקוב אחר פציעה והתחדשות באמצעות בחינת תפקוד נוירולוגי. מגרה את הזנב עם מגע האור צובט מ מלקחיים יגלה אם פונקציות חושי מישוש ו nociceptive אבדו, פוטנציאל מתחדשת. הציון הנוירולוגי הוגדר על בסיס תגובת החיה: 0 נקודה = אין תגובה, 1 נקודה = מקומי התנועה הזנב, 2 נקודות = התנועה עזרתי, 3 נקודות = תנועה מתואמת של הגפיים ו/או הראש לצד התנועה עזרתי, 4 נקודות = בעלי חיים עם תנועה מהירה מתואמת מיידית. בשש בעלי חיים של SCI לעומת חמישה בעלי חיים מזויפים, הפסד של תפקוד נוירולוגי שלושה שבועות לאחר הפגיעה נמצאה, ושחזור הדרגתי בתוך תשעה שבועות (איור 4 ווידאו משלים 1).

תמונות אולטרה-סאונד של חוט השדרה הפצוע ניתן להשיג באמצעות הפרוטוקול הנ ל. המחשה של האתר הבדיוני הייתה אפשרית עקב חוסר ברור של תהליכים מהספידי הגרמי (איור 5). יתר על כן, שימוש במצב B העורק הפנימי של חוט השדרה הבלתי נפגע יכול להיות דמיינו, מניב סמן של שלמות הספינה.

ניתן לבחון את בעלי החיים מיד עם האפשרות. עם זאת, בעלי חיים מסוימים הביעו משרעת קטנה ומקומית, שחוזרת על עצמה ותנועת הזנב הקצבית על גירוי הדומה לתופעת הקלברית שנצפתה במדע האנושי. תנועות אלה עשוי לייצג קלונוס או חוסר הדיכוי רפלקס מרכזי והוא עלול לגרום נזק נוסף לחוט השדרה שנפגע החדש. לכן, בדיקת בעלי החיים אינה מומלצת לפני פציעה של שבוע אחד.

מהתבוננות האיכותית והפשוטה של בעלי החיים, ניכר כי הזנב משותק, ושחייה מעוכבים באופן משמעותי, והופכים את החיות לתלויות לחלוטין בהזזת איבריהם. תצפיות אלה מאמתים גם את הצלחת הפרוטוקול.

סריקות MRI של השדה הגבוה (9.4 T) בוצעו מיד לאחר הפגיעה כדי להמחיש את הפציעה בvivo (איור 6). עם זאת, הסריקות היו נמוכות בדרך כלל ביחס אות אל הרעש בהשוואה לאלה של בעלי חיים שאינם מופעלים, כנראה עקב דימום ו-הומוסיוב. מכאן, המסקנה היא כי MRI היה שיטה תת אופטימלית כדי לאמת את הפציעה ואת ההצלחה של הפרוטוקול.

Figure 1
איור 1: שרטוט סכמטי של כריתת למינציה מיקרוכירורגית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: רישום סכמטי של מנגנון טראומת החבלה. (א) כל הכיוונון, מראה את המוט הנופל מעל החיה. (ב) המנגנון הניתן לניתוק, המראה כיצד המוט מנותק מהאלקטרומגנט. (ג) המטה הנופל מקושר לאלקטרומגנט. גליל התאמת גובה נופל מותקן, ואת האלקטרומגנט ואת מוט טעון לתוך הצילינדר. התאמת גובה של המערכת כולה נשלטת על ידי גלגל התאמה. (ד) כיבוי האלקטרומגנט יגרום למוט ליפול ללא המפעיל הנוגע במערכת. הדמות פורסמה במקור על ידי תיגסן ואח '13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: סעיפים היסטלוגיים המטאוקסילין ו אאוזין מוכתם מיד ותשעה שבועות לאחר הפציעה. (A1) בעלי חיים של SCI מיד לאחר הפציעה. (B1) . חיה בSCI בתשעה שבועות (C1) בעלי חיים בניתוח. מיד לאחר הפציעה (D1) . חיה מזויפת בתשעה שבועות ריבוע אדום = מסמן את הפגיעה בחיות המדע ואת כריתת הלמינציה של החיה המזויפת. איור 2א, איור2ב, איור 2ג הינם מגניזים של אזורים אלה ב 5x. חץ כחול = חוט השדרה נפגע. דמות זו פורסמה במקור על ידי תיגבסן ואח '13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: גרף התגובה לגירויים מישוש. תגובת קבוצות ה-SCI נמוכה לאחר שלושה שבועות, בהשוואה לקבוצה המזויפת. WPI = שבועות פציעה שלאחר, קו שחור = SCI, צבע אפור = מזויף. שאם n = 5, SCI n = 6. הדמות פורסמה במקור על ידי תיגסן ואח '13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: תמונה באולטרסאונד מראה את חוט השדרה בסעיף משונן. קווים צהובים לסמן את חוט השדרה, מעגל צהוב האתר פציעה, וחצים לבנים לסמן את החוליות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: סריקות MRI בנקודות זמן שונות לאחר פציעה או ניתוח מזויף. נוזל שדרתי המקיף את חוט השדרה חסר, במיוחד בשלוש WPI עבור בעלי חיים SCI, המציין נפיחות של חוט השדרה. הכהות של חוט השדרה מצביע גם על בצקת. שים לב כיצד נעלמים שינויים אלה כאשר התחדשות מתקדמת. חץ צהוב = אזור כריתת הלמינציה. הדמות פורסמה במקור על ידי תיגסן ואח '13. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו משלים 1: וידאו מראה את הפונקציה נוירולוגית לאחר גירויים מישוש ומאוחר יותר גירוי nociceptive. , קודם חיה בעלת שליטה בריאה. ולאחר מכן חיה הסובלת מ-SCI אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מכיוון שהסיכון לפגיעה בחוט השדרה משמעותי, הצעדים הקריטיים של הפרוטוקול מסירים את התהליכים הספיציתיים ואת הרחבת הגישה הגרמית לתעלת השדרה במידת הצורך. כפי שהוזכר בפרוטוקול, הסרת התהליך הגולגולתית ביותר הראשונה מומלצת מאוד. זה אומר כי תהליכים caudal יותר להגן על חוט השדרה מפני פגיעה על ידי המספריים. מומלץ להבטיח גישה כירורגית מספיק, כלומר לא לעשות קטן מדי חיתוך העיקרי. כמו כן, כאשר אוחז כל דבר עם מלקחיים, כיוון המשיכה שהוחל חייב תמיד להיחשב. החלת משיכה עדינה מן חוט השדרה יגן עליו במקרה של כשל האחיזה ופליטת המכשיר.

ההליך הכירורגי באקסון אינו שונה מבעלי חיים אחרים. עם זאת, הבדלים חשובים מסוימים קיימים, המיוחס בעיקר הרכב הרקמה גודל של החיה. העור מאוד שברירי, והאופן פרדוקסאלי אינו מחלים היטב על נזקים קטנים שנגרמו במהלך החיתוך. זהירות יש לנקוט, במיוחד על החתכים העיקריים, כי נזק יהיה לסבך באופן משמעותי את התפירה. העצמות של האקאוולס הצעירות מאוד רכות. משמעות הדבר היא כי לעתים קרובות מלקחיים אנטומיים בסיסיים עשוי להספיק הסרת עצם. זה מציג עוד אלמנט של זהירות, כי צובט את התהליכים spinous יכול לגרום נזק משמעותי. שכבות תת עורית fascia שרירים אינם זמינים עבור suturing, בשל קומפוזיציות שברירי רקמה שלהם. זה הכרחי להבטיח שבוע. הפוסט-פעיל הרגוע ייתכן שהחיות לא ינוחו מספיק לאחר הניתוח. מכאן, הם עשויים לגרום נזק משני לעמוד השדרה שלהם בשיתוף פעולה. האנטומיה הקטנה שלהם אינה מאפשרת קיבעון פנימי או לא שורת.

משקל וגובה נפילה של מערכת המוט הנופל חיונית לגרימת פציעה החבלה. במהלך הטיס נרחב עבור מחקר מוקדם יותר, מוט משקל וגובה נופל הנדרש היה להיות 25 גרם ו 3 ס"מ13. זה היה מספיק כדי לגרום שיתוק ב 12 גרם מבלי לחתוך או התפוררות חוט השדרה. משקל נוסף או גובה נופל עשוי להיות נחוץ בעלי חיים גדולים יותר. יתרה מזאת, קוטר המוט הנופל עשוי להזדקק לגדול יותר במקרה של בעלי חיים גדולים יותר וקצרים יותר לבעלי חיים קטנים יותר.

למודל יש כמה מגבלות. מכיוון שאין משתמשים בהם ללימודי התנהגות שנלמדו, לא ניתן לבדוק פונקציות נוירולוגיות מורכבות. הפציעה הוכנסה caudal לגפיים, חוסך את הגפיים האחוריות, המעיים ושלפוחית השתן מלהיות משותק. הסיבה לכך הייתה אתית, להפחית את ההשפעה על בעל החיים למינימום. עם זאת, הוא מגביל את ההזדמנות ללמוד את ההשפעות על תנועות גפיים, אשר עשוי להיות קל יותר לתאר ולסווג. חלק גדול של התחלואה SCI-הקשורים נובעת אובדן שליטה של המעיים ושלפוחית השתן. מודל זה אינו מאפשר מחקר עתידי בתחומים אלה. גרימת נזק rostral הגפיים האחוריות יהיה אפשרי, אבל זה לא היה ניסיון.

לימוד SCI במודל התחדשות כגון axo, מאפשר גישה שונה במחקר SCI. מכיוון שמודל החי יכול להתחדש, מחקרי חיסול יוכלו לחשוף גורמים קריטיים של התחדשות. מחקרים קונבנציונליים על SCI מבוצעים מודלים שאינם משובי, כלומר אחד יהיה צורך להתערב על כל הגורמים הקריטיים כדי לגרום תגובת התחדשות.

מודל זה והפרוטוקול הם בקונקורדנציה עם העיקרון של Krogh הקובע כי: "בשביל מספר גדול של בעיות תהיה איזו חיה של בחירה או כמה בעלי חיים כאלה שבהם ניתן ללמוד באופן הנוח ביותר"17. התחדשות היונקים מעכבות במספר גורמים. עיכוב אלה במודל היונקים בדרך כלל אינו משפיע על כל האפקטים. עם זאת, רמות הגדלת של מעכבי באקסון צריך לחסל התחדשות, ובכך לגלות אם מעכב זה הוא קריטי או לא10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

מיכאל פדרסן, אוניברסיטת אורהוס, לצורך התמחותו והזמן בפיתוח פרוטוקולי MRI והקמת הפרויקט כולו. פיטר אגגר, אוניברסיטת ארהוס, מתמחה בפיתוח פרוטוקולי MRI. שטייר רינגגארד, אוניברסיטת אורהוס, לצורך התמחותו והזמן בפיתוח פרוטוקולי ה-MRI. התפתחות המודל הבדיוני באקסון הייתה נתמכת באדיבות קרן מייולר מארסק, קרן רימספורט, קרן Linex וקרן אלרו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25 g custom falling rod custom home made
30 mm PVC pipe custom home made
Acetone Sigma-Aldrich 67-64-1 Propanone
Axolotl (Ambystoma mexicanum) Exoterra GmbH N/A 12-22 cm and 10 g - 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP)
Benzocain Sigma-Aldrich 94-09-7 ethyl 4-aminobenzoate
Electromaget custom home made
Excel 2010 Microsoft N/A Excel 2010 or newer
ImageJ National Institutes of Health ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Kimwipes
Microsurgical instruments N/A N/A Forceps and scissors
MS550s Fujifilm, Visualsonics MS550s 40 MHz center frequency, transducer
MS700 Fujifilm, Visualsonics MS700 50 MHz center frequency, transducer
Petri dish any maker
Soft cloth N/A N/A Any piece of soft cloth measuring approximately 70 x 55 cm2 e.g. a dish towel
Stereo microscope
Vevo 2100 Fujifilm, Visualsonics Vevo 2100 High frequency ultrasound system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shavelle, R. M., DeVivo, M. J., Brooks, J. C., Strauss, D. J., Paculdo, D. R. Improvements in Long-Term Survival After Spinal Cord Injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96 (4), 645-651 (2015).
  2. Hicken, B. L., Putzke, J. D., Richards, J. S. Bladder management and quality of life after spinal cord injury. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 80 (12), 916-922 (2001).
  3. Levi, R., Hultling, C., Nash, M. S., Seiger, A. The Stockholm spinal cord injury study: 1. Medical problems in a regional SCI population. Paraplegia. 33 (6), 308-315 (1995).
  4. Bjornshave Noe, B., Mikkelsen, E. M., Hansen, R. M., Thygesen, M., Hagen, E. M. Incidence of traumatic spinal cord injury in Denmark, 1990-2012: a hospital-based study. Spinal Cord. 53 (6), 436-440 (2015).
  5. Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A., Fehlings, M. G. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clinical Epidemiology. 6, 309-331 (2014).
  6. Aguayo, A. J., et al. Degenerative and regenerative responses of injured neurons in the central nervous system of adult mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 331 (1261), 337-343 (1991).
  7. Aguayo, A. J., Bjorklund, A., Stenevi, U., Carlstedt, T. Fetal mesencephalic neurons survive and extend long axons across peripheral nervous system grafts inserted into the adult rat striatum. Neuroscience Letters. 45 (1), 53-58 (1984).
  8. Richardson, P. M., Issa, V. M., Aguayo, A. J. Regeneration of long spinal axons in the rat. Journal of Neurocytology. 13 (1), 165-182 (1984).
  9. Butler, E. G., Ward, M. B. Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae. Journal of Experimental Zoology. 160 (1), 47-65 (1965).
  10. Diaz Quiroz, J. F., Tsai, E., Coyle, M., Sehm, T., Echeverri, K. Precise control of miR-125b levels is required to create a regeneration-permissive environment after spinal cord injury: a cross-species comparison between salamander and rat. Disease Model Mechanisms. 7 (6), 601-611 (2014).
  11. Clarke, J. D., Alexander, R., Holder, N. Regeneration of descending axons in the spinal cord of the axolotl. Neuroscience Letters. 89 (1), 1-6 (1988).
  12. McHedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the central nervous system during salamander tail regeneration from the implanted neurospheres. Methods of Molecular Biology. 916, 197-202 (2012).
  13. Thygesen, M. M., et al. A clinically relevant blunt spinal cord injury model in the regeneration competent axolotl (Ambystoma mexicanum) tail. Experimental Therapeutic Medicine. 17 (3), 2322-2328 (2019).
  14. Goss, R. J. Principles of Regeneration. , Academic Press. New York. (1969).
  15. Hutchison, C., Pilote, M., Roy, S. The axolotl limb: a model for bone development, regeneration and fracture healing. Bone. 40 (1), 45-56 (2007).
  16. Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration (Oxford). 4 (3), 124-131 (2017).
  17. Krogh, A. The Progress of Physiology. The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).

Tags

רפואה סוגיה 152 פגיעה בחוט השדרה טראומה התחדשות אקסון מיקרוניתוח בדיקת אולטרה סאונד
החבלה פגיעה בחוט השדרה באמצעות כריתת למינציה מיקרוכירורגית ב הרגנרציה הנרטיבית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thygesen, M. M.,… More

Thygesen, M. M., Guldbæk-Svensson, F., Rasmussen, M. M., Lauridsen, H. Contusion Spinal Cord Injury via a Microsurgical Laminectomy in the Regenerative Axolotl. J. Vis. Exp. (152), e60337, doi:10.3791/60337 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter