Summary
Данная рукопись представляет протоколы для хирургически inflicting контролируемые туповые и острые повреждения спинного мозга к регенеративному аксолоту(Ambystoma mexicanum).
Abstract
Цель этого исследования заключается в создании стандартизированных и воспроизводимых регенеративных тупой спинного мозга травмы модели в аксолотле (Ambystoma mexicanum). Большинство клинических травм спинного мозга происходят как высокая энергия тупые травмы, вызывая ушиб травмы. Тем не менее, большинство исследований в аксолотле спинного мозга были проведены с острыми травмами. Таким образом, это исследование направлено на создание более клинически регенеративной модели. Из-за их впечатляющей способности регенерировать почти любую ткань, аксолотлы широко используются в качестве моделей в регенеративных исследованиях и широко использовались в исследованиях травм спинного мозга (SCI). В этом протоколе аксолотлы обезболиваются путем погружения в раствор бензокаина. Под микроскопом, угловой разрез делается на двусторонней основе на уровне только caudal к задним конечностям. Из этого разреза можно вскрыть и разоблачить спиннородные процессы. Используя щипцы и ножницы, проводится двухуровневая ламинэктомия, обнажая спинной мозг. Изготовлено специальное травматическое устройство, состоящее из падающего стержня в цилиндре, и это устройство используется для индуцирования ушиба спинного мозга. Затем разрезы зашиваются, и животное восстанавливается после наркоза. Хирургический подход успешно в разоблачении спинного мозга. Травматический механизм может привести к ушибу спинного мозга, что подтверждается гистологией, МРТ и неврологическим обследованием. Наконец, спинной мозг регенерирует от травмы. Критическим шагом протокола является удаление спинномозговых процессов без нанесения повреждений спинного мозга. Этот шаг требует обучения для обеспечения безопасной процедуры. Кроме того, закрытие раны в высокой степени зависит от не нанесения ненужного повреждения коже во время разреза. Протокол был выполнен в рандомизированном исследовании 12 животных.
Introduction
Общая цель этого исследования заключается в создании контролируемого и воспроизводимого микрохирургического метода для нанесения тупой и резкий SCI аксолотл (Ambystoma mexicanum), производя регенеративной модели травмы спинного мозга.
SCI является тяжелым состоянием, которое, в зависимости от уровня и степени, наносит неврологическую инвалидность конечностей наряду с нарушениями мочевого пузыря и кишечника управления1,2,3. Большинство SCI являются результатом высокой энергии тупой травмы, такие как дорожно-транспортных происшествий и падает4,5. Острые травмы очень редки. Таким образом, наиболее распространенным макроскопическим типом травмявляется контуция.
Центральная нервная система млекопитающих (ЦНС) является нерегенеративной ткани, следовательно, не восстановление неврологических тканей после SCI видел6,7,8. С другой стороны, некоторые животные обладают интригующей способностью к регенерации тканей, в том числе тканей ЦНС. Одним из таких животных является аксолотль. Он широко используется в исследованиях регенеративной биологии и представляет интерес в регенерации спинного мозга, потому что это позвоночный9,10,11,12.
Большинство исследований SCI в аксолотле выполняются как либо ампутация всего хвоста или абляции большей части спинного мозга9,10,11,12. Недавно было опубликовано новое исследование о тупых травмах13, которое лучше имитирует клинические ситуации. В то время как полная ампутация придатка в аксолле приводит к полной регенерации, некоторые регенеративные явления, не связанные с ампутацией, зависят от дефекта критического размера (CSD)14,15. Это означает, что травмы, превышающие критический порог, не регенерируются. Для разработки регенеративной модели с более высоким клиническим переводческим значением, это исследование исследовало ли 2 мм тупой травмы будет превышать предел CSD.
Этот метод актуален для исследователей, работающих над регенерацией спинного мозга в небольших моделях животных, особенно в аксолотле. Кроме того, он может представлять более общий интерес, поскольку он демонстрирует способ использования стандартного лабораторного оборудования для разработки механизма тупой травмы, который подходит для использования в мелких животных в целом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
В ходе этого исследования были приняты все применимые институциональные и правительственные нормы, касающиеся этического использования животных. Исследование проводилось в соответствии с идентификатором одобрения: 2015-15-0201-0061 Датской инспекцией по эксперименту на животных. Звери были мексиканскими аксолотлами(Ambystoma mexicanum,средняя масса тела и ЗППП: 12,12 г и 1,25 г).
1. Подготовка
-
Приготовьте аксолотл к анестезии.
- Используйте высококачественную нехимически обработанную водопроводную воду. Если он недоступен, используйте 40% решения Holtfreter.
- Растворите 200 мг этилового 4-аминобензоата (бензокаина) в 3 мл ацетона. Растворите этот раствор в 1 л водопроводной воды или 40% раствора Holtfreter.
- Используйте стандартное блюдо Петри (100 мм в диаметре), помещенное под стереомикроскоп в качестве хирургического стола. Поместите хирургическую текстильную ткань на блюдо Петри.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование чашки Петри в качестве хирургической области позволяет двигаться и вращение животного, не касаясь его, обеспечивая устойчивость позвоночника во время операции. - Приготовьте все стерильные микрохирургические инструменты (т.е. ножницы и анатомические щипцы).
2. Анестезия
- Поместите аксолотл в контейнер с раствором бензокаина примерно на 45 мин, чтобы обеспечить глубокую и стабильную анестезию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Данная концентрация бензокаина вызовет анестезию во всех размерах аксолотлов. - Проверьте наличие признаков общей анестезии в течение 30-45 мин. К ним относятся полное отсутствие жаберных движений, исправления рефлекс, или ответ на либо тактильные или болезненные раздражители (мягкий щипать палец паутины).
- Для поддержания анестезии оберните животных бумажными полотенцами, смачиваемыми в анестезируемом растворе. Влажные эти регулярно с этим раствором во время хирургической процедуры, чтобы убедиться, что кожа и жабры остаются влажными.
- Восстановить животное после операции, поместив его в контейнер, содержащий пресную водопроводную воду. Наблюдайте признаки восстановления, такие как движение жаберных и восстановленный испуг рефлекс, в пределах 1 ч16.
3. Микрохирургическая ламинэктомия
ПРИМЕЧАНИЕ: Ламинэктомия проводится под стереомикроскопом.
- Поместите животное в склонное положение на чашку Петри. Оберните его в бумажные полотенца так, чтобы хвост подвергается.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бумажные полотенца отлично подходят для обеспечения стабильности на протяжении всей процедуры. -
Определите задние конечности. Сделать первый разрез просто caudal к ним.
- С парой микроскиссоров, выполнять вертикальный разрез от киля, пока костлявые известность спинных процессов ощущаются.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте очень осторожны при захвате киля и кожи с щипками, потому что они легко нанести ущерб нежной кожи. - Расширьте разрез боковой, чтобы разрез пересекал всю ширину хвоста.
- Возьмитесь за спинной процесс с щипками, чтобы обеспечить правильную глубину.
- Расширьте вертикальные разрезы на 1 мм ниже спинное процесса с обеих сторон.
- С парой микроскиссоров, выполнять вертикальный разрез от киля, пока костлявые известность спинных процессов ощущаются.
-
Поместите животное на одну сторону для выполнения брюшных и горизонтальных разрезов, как указано ниже.
- С парой микросциссоров, начиная с брюшной точки вертикального разреза, делают горизонтальный разрез примерно 15 мм для животных весом 10-20 г. Сделайте разрез длиннее для более крупных животных и короче для мелких животных.
- Используя ножницы, вскрыть среднесрочный через горизонтальный разрез, пока позвоночный столб ощущается в средней линии.
- Повторите шаги 3.3, 3.3.1 и 3.3.2 на другой стороне животного.
-
Рассечение в глубокой медиальной плоскости с обеих сторон, вскрыть через среднюю линию, тем самым соединяя два горизонтальных разреза.
- Переместите свободный кусок хвоста и киля в одну сторону, подвергая спинное процессы(рисунок 1).
- Зафиксировать кусок хвоста с помощью мокрых бумажных полотенец.
-
Поместите животное в положение склонного снова с головой перед хирургом не доминирующей стороны.
- С парой щипцы, понять спиннородные процессы просто caudal к задним конечностям. Нанесите нежный лифт как вверх, так и к голове животного.
- Поместите лопасти пары микроскиссоров горизонтально вокруг процесса и аккуратно разрежьте его. Подъемник на процессе гарантирует, что он теперь удаляется, подвергая спинного мозга.
- Возьмитесь за спинной процесс просто caudal к тому, который был только что удален и повторить шаги 3.5.1 и 3.5.2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это должно оставить открытый спинной мозг, соответствующий двум уровням позвоночника. При выполнении ламинэктомии, белый пенистый секреции часто появляется. Спинной мозг легко идентифицируется по его отличительной блеск, наряду с сосудом, идущим вдоль средней линии. - В зависимости от размера животного, облучение области не может быть достаточно широким. Используя две пары щипцы, схватить ламинас с обеих сторон спинного мозга и крутить их боковой с нежным движением.
4. Введение ушиба типа контузии(рисунок 2)
- Держите животное в положении склонного.
- Используйте чашку Петри, чтобы перевести животное в травматологическое отделение.
- У помощника светит фонарик на спинном мозге.
- Поместите контузионный блок травмы цилиндра над открытым спинным мозгом с помощью микрорегуляторов на устройство. Цель через цилиндр.
- Опустите цилиндр до тех пор, пока он не сравняется с ламинами.
- Прикрепите падающий стержень к электромагниту. Поместите желаемый цилиндр регулировки высоты падения на травматический блок.
- Поместите падающий стержень в цилиндр.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для ослепленного исследования, хирург должен теперь покинуть комнату, не зная, если животное будет назначенна травма или фиктивной группы хирургии. - Выключите электромагнит. Удилище падает на открытый спинной мозг.
- Используйте винт регулировки высоты, чтобы поднять стержень из спинного мозга.
- Подтвердите травму, глядя на спинной мозг через микроскоп. Поврежденный участок будет выглядеть темнее, и кровотечение из средней линии судна будет очевидно.
5. Введение резкой травмы
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните эти шаги после 3.5.4.
- С парой микросциссоров вырезать спинной мозг в идеальный вертикальный разрез.
- Повторите разрез 2 мм на каудальной стороне тела.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длина удаленного куска спинного мозга может быть скорректирована в рамках требования исследования. Тем не менее, 2 мм разрез будет regenerable10. - Убедитесь, что разрезы завершены. По завершении, почувствовать лезвия ножниц соскабливания вдоль брюшной части позвоночного канала.
- Поднимите 2 мм кусок спинного мозга из позвоночного канала.
6. Закрытие хирургической раны
- Верните животное на хирургический стол. В ослепленном исследовании, изменить положение киля, чтобы спинной мозг не виден хирургу.
-
Держите животное в положении склонного.
- Начните размещение 10,0 нейлоновых швов из самой хвостальной части горизонтального разреза. Закройте раны одним слоем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не схватить кожу слишком туго, потому что это нанесет некроз. - Работайте в направлении вертикальной части разреза.
- Достигнув угла, поверните чашку Петри и шов другой горизонтальный разрез.
- Установите швы на вертикальные разрезы.
- Не помещайте швы в верхнюю часть киля, так как кожа здесь не сможет удержаться.
- Начните размещение 10,0 нейлоновых швов из самой хвостальной части горизонтального разреза. Закройте раны одним слоем.
7. Возвращение животного к безанестезиозному решению
- Поднимите чашку Петри с животным и погрузите обоих очень осторожно в пресную воду только 5 см глубиной и дайте животному соскользнуть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина мелкой воды гарантирует, что животное не будет пытаться выплыть на поверхность, чтобы дышать. - Не меняйте воду в течение первой недели.
- При кормлении животных убедитесь, что пища находится рядом с головой животного.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этих мер состоит в том, чтобы избежать как можно больше движения в течение первой недели.
8. Послеоперационное УЗИ
- До прекращения анестезии используйте высокочастотную ультразвуковую систему для получения изображений травмы, которые могут быть использованы для построения трехмерных изображений сайта SCI.
- Прикрепите преобразователь к микроманипулятору, предпочтительно управляемый дистанционным джойстиком.
- Погрузите обезожнее в положение лежа в небольшой контейнер, наполненный анестезируемым раствором.
ПРИМЕЧАНИЕ: Исправьте животное миниатюрными мешками с песком или другим оборудованием, чтобы избежать движения во время сканирующей последовательности. - Выровняйте кончик преобразователя с оси длины животного и погрузите его в раствор бензокаина, пока он не будет всего на несколько миллиметров выше киля за задними конечностями животного.
- Определите сайт SCI.
ПРИМЕЧАНИЕ: Место травмы легко узнаваемо из-за отсутствующих спинеобразных процессов непосредственно над SCI. - Оптимизируйте изображение, регулируя настройки ультразвука. Убедитесь, что сайт SCI находится в центре изображения. Отрегулируйте поле зрения (т.е. глубину изображения, смещение глубины и ширину изображения) для покрытия участка SCI и прилегающей здоровой ткани. Отрегулируйте двухмерный выигрыш, чтобы оптимизировать контрастность изображения.
- Путем подметать преобразователь ультразвука через место SCI с электронны управляемым микроманипулятором, приобретаете изображения B-режима покрывая место SCI на множественных sagittal поперечных местах ломтика, с последовательными ломтиками с межслойным интервалом 50 мкм. Приобрести cine-изображения, содержащие 500 кадров со скоростью кадров 50 кадров/с и частотой преобразователя 40 МГц.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой установки требуется электронный микроманипулятор, управляемый дистанционным джойстиком (шаг 8.2). - После окончания сканирующей последовательности вернитесь к шагу 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Цель протокола заключается в том, чтобы произвести SCI, который будет парализовать двигатель и сенсорные функции caudal к травме. Поскольку аксолотл является регенерационным, он восстанавливает функцию в течение нескольких недель, что позволяет исследователям изучать регенерацию ЦНС в течение короткого промежутка времени.
Анестезия была предоставлена для 45 мин для всех животных, и никаких эпизодов доносного восстановления не испытывали. Все животные восстановились в течение часа и не показали никаких признаков повреждения от анестезии в последующие недели13,16.
Ламинэктомия была успешной у всех животных. Тем не менее, анатомические изменения в ширине позвоночного канала призвал к расширению канала с помощью щипки и поворот в некоторых лиц. Кроме того, остаточные ламина в некоторых людей предотвратить падение стержня от достижения своей цели, что делает необходимым, чтобы хирург очистить поле от остаточной кости и известность.
Закрытие разрезов было связано с некоторыми трудностями, особенно на этапе пилотирования исследования. Швы в верхней части киля не выдержали и привели к недостаточному замыканию. Закрытие одного животного в исследовании не выдержало, в результате чего киль был разорван, последующая инфекция и смерть. Это подчеркивает необходимость тщательного зашивания вдоль всех разрезов.
Первоначальные механические повреждения были очевидны во время процедуры. Во время разработки модели, раненых и фиктивных животных были окрашены гематоксилин и эозин для проверки травмы. Репрезентативные результаты каждой группы показаны на рисунке 3A1,A2 и Рисунке 3C1,C2. Регенерация была подтверждена гистологических разделов препаратов, сделанных после девяти недель(Рисунок 3B1,B2 и Рисунок 3D1,D2), который показал восстановленный спинного мозга связи в SCI животных.
Травмы и регенерация могут сопровождаться изучением неврологической функции. Стимулирование хвоста легким прикосновением и щипать от щипцы покажет, были ли потеряны тактильные и ноцицептивные сенсорные функции и потенциально восстановлены. Неврологический балл был определен на основе реакции животного: 0 точка - нет ответа, 1 точка - локальное движение хвоста, 2 точки - усеченное движение, 3 балла - скоординированное движение конечностей и/или головы вместе с усеченным движением, 4 точки - животные с немедленное скоординированное быстрое движение. В шести SCI животных по сравнению с пятью фиктивными животными потеря неврологической функции три недели после травмы было обнаружено, и постепенное восстановление в течение девяти недель(Рисунок 4 и дополнительное видео 1).
Ультрасонографические изображения поврежденного спинного мозга можно получить с помощью вышеуказанного протокола. Визуализация сайта SCI стала возможной из-за очевидного отсутствия костлявых спиннинговых процессов(рисунок 5). Кроме того, с помощью B-режима можно визуализировать спинную артерию спинного мозга, что дает маркер целостности сосуда.
Проверить животных можно сразу после пробуждения. Тем не менее, некоторые животные выразили местную небольшую амплитуду, повторяющиеся и ритмические движения хвоста при стимуляции, сравнимые с явлениями клонуса, наблюдаемыми в ТЦ человека. Эти движения могут представлять собой клонус или отсутствие центрального подавления рефлекса и потенциально может привести к большему ущербу для вновь поврежденного спинного мозга. Таким образом, тестирование животных не рекомендуется до одной недели после травмы.
Из простого качественного наблюдения за животными станет очевидно, что хвост парализован, а плавание значительно тормозится, что делает животных полностью зависимыми от перемещения конечностей. Эти наблюдения также подтверждают успех протокола.
Высокополевой МРТ (9,4 Т) были выполнены сразу после травмы, чтобы визуализировать травму in vivo(рисунок 6). Тем не менее, сканирование, как правило, низкий в соотношении сигнала к шуму по сравнению с неработающих животных, вероятно, из-за кровотечения и гемосайдрина. Таким образом, был сделан вывод о том, что МРТ является неоптимальным методом проверки травматизма и успеха протокола.
Рисунок 1: Схематический рисунок микрохирургической ламинэктомии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Схематический рисунок механизма ушиба травмы. (A) Вся установка, показывая падающий стержень над животным. (B) Разобранный механизм, показывающий, как стержень отключен от электромагнита. (C) Падающий стержень подключен к электромагниту. Устанавливается цилиндр регулировки падающей высоты, а электромагнит и стержень загружаются в цилиндр. Регулировка высоты всей системы управляется регулирующим колесом. (D) Выключение электромагнита приведет к удочке упасть без оператора касаясь системы. Рисунок был первоначально опубликован Thygesen и др.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Гематоксилин гематоксилин и эозин окрашенных сразу и девять недель после травмы. (A1) SCI животное сразу после травмы. (B1) SCI животных на девять недель. (C1) Шам хирургии животных сразу после травмы. (D1) Шам животное на девять недель. Красный квадрат - отмечает травму животных SCI, и ламинэктомии фиктивного животного. Рисунок 2A, Рисунок 2B, Рисунок 2C являются увеличениями этих областей в 5x. Голубая стрелка и неповрежденный спинной мозг. Эта цифра была первоначально опубликована Thygesen и др.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: График реакции на тактильные раздражители. Реакция групп SCI ниже после трех недель, по сравнению с фиктивной группой. WPI - недели после травмы, Черная линия - SCI, Серый цвет и обман. Шам н No 5, SCI n No 6. Рисунок был первоначально опубликован Thygesen и др.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Ультрасонографическое изображение, показывающее спинной мозг в сагитальной секции. желтые линии отмечают спинной мозг, желтый круг травмы сайта, и белые стрелы знак позвонков. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: МРТ в разных точках времени после травмы или фиктивной хирургии. CSF окружающих спинного мозга не хватает, особенно в трех WPI для SCI животных, что свидетельствует о отеке спинного мозга. Потемнение спинного мозга указывает на отек, а также. Обратите внимание, как эти изменения исчезают по мере регенерации. желтая стрелка - область ламинэктомии. Рисунок был первоначально опубликован Thygesen и др.13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительное видео 1: Видео, показывающее неврологическую функцию после тактильных стимулов, а затем ноцицептивный стимул. Сначала здоровое животное контроля, а затем животное, страдающее от SCI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Поскольку риск повреждения спинного мозга является значительным, критические шаги протокола удаления спинномозговых процессов и расширения костного доступа к спинному каналу, если это необходимо. Как уже упоминалось в протоколе, удаление наиболее черепного процесса в первую очередь настоятельно рекомендуется. Это будет означать, что более каудаальные процессы защищают спинной мозг от попадания ножниц. Рекомендуется обеспечить достаточное хирургическое участие, что означает не делать слишком маленький первичный разрез. Кроме того, при захвате что-либо с щипками, направление тянуть применяется всегда должны быть рассмотрены. Применение нежный тянуть от спинного мозга будет защищать его в случае захвата отсутствии и скольжения инструмента.
Хирургическая процедура в аксолотле ничем не отличается от других животных. Тем не менее, некоторые важные различия существуют, в первую очередь связано с составом тканей и размер омичи. Кожа аксолоцла очень хрупкая, и, как это ни парадоксально, не заживает хорошо при небольших повреждениях, нанесенных во время разреза. Следует проявлять осторожность, особенно при первичных разрезах, поскольку ущерб существенно осложнит зашивание. Кости очень молодых аксолотлов очень мягкие. Это означает, что часто основные анатомические щипцы могут быть достаточно в удалении костей. Это представляет собой еще один элемент осторожности, потому что щипать спиннородные процессы могут нанести существенный ущерб. Подкожные и мышечные фасции слои не доступны для зашивания, из-за их хрупкие составы тканей. Крайне важно обеспечить спокойную послеоперационную неделю. После операции животные могут не отдыхать достаточно. Следовательно, они могут нанести вторичный ущерб спинному мозгу после операции. Их небольшая анатомия не допускает ни внутренней, ни сплайнской фиксации.
Вес и падение высоты падающей системы стержня имеет решающее значение для нанесения ушиба. Во время обширного пилотирования для более раннего исследования, вес стержня и падение высоты необходимо было установлено, 25 г и 3 см13. Этого было достаточно, чтобы вызвать паралич в 12 г аксолотлов без резки или распада спинного мозга. Дополнительный вес или падение высоты может потребоваться в больших животных. Кроме того, диаметр падающего стержня, возможно, потребуется быть больше в случае больших животных и короче для мелких животных.
Модель имеет некоторые ограничения. Поскольку аксолотлы не используются для изучения поведения, нельзя проверить сложные неврологические функции. Травма была введена каудальный к конечностям, щадя задние конечности и кишечника и мочевого пузыря от паралича. Причиной этого было этично, чтобы свести воздействие на животное к минимуму. Тем не менее, это ограничивает возможность изучить влияние на движения конечностей, которые могут быть легче описать и классифицировать. Большая часть SCI связанных заболеваемости происходит от потери контроля кишечника и мочевого пузыря. Эта модель не позволяет проводить будущие исследования в этих областях. Повреждение ростраля на задние конечности было бы возможно, но это не было предпринято.
Изучение SCI в регенеративной модели, такой как аксолотл позволяет другой подход в исследованиях SCI. Поскольку модель животного происхождения может регенерировать, ликвидационные исследования смогут выявить критические факторы регенерации. Обычные исследования по SCI проводятся в нерегенеративных моделях, а это означает, что нужно будет вмешаться на все критические факторы, чтобы вызвать регенеративную реакцию.
Эта модель и протокол соответствуют принципу Крога, заявляя, что: «Для такого большого количества проблем будет какое-то животное выбора или несколько таких животных, на которых его можно наиболее удобно изучить»17. Регенерация млекопитающих тормозится несколькими факторами. Ингибирование их в модели млекопитающих обычно не вызывает никаких эффектов. Тем не менее, повышение уровня ингибиторов в аксолотле должно устранить регенерацию, и тем самым выявить ли этот ингибитор имеет решающее значение или нет10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Майкл Педерсен (Michael Pedersen), Орхусский университет, за его опыт и время разработки протоколов МРТ и создания всего проекта. Питер Аггер (Peter Agger), Орхусский университет, за его опыт и время разработки протоколов МРТ. Штеффен Ринггард (Steffen Ringgard), Орхусский университет за его опыт и время разработки протоколов МРТ. Разработка модели SCI в аксолотле была любезно поддержана Фондом А.П. Мюллера Maersk, Фондом Рийсфорта, Фондом Линекса и Фондом ELRO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g - 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| Electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Kimwipes | |||
| Microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring approximately 70 x 55 cm2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
References
- Shavelle, R. M., DeVivo, M. J., Brooks, J. C., Strauss, D. J., Paculdo, D. R. Improvements in Long-Term Survival After Spinal Cord Injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96 (4), 645-651 (2015).
- Hicken, B. L., Putzke, J. D., Richards, J. S. Bladder management and quality of life after spinal cord injury. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 80 (12), 916-922 (2001).
- Levi, R., Hultling, C., Nash, M. S., Seiger, A. The Stockholm spinal cord injury study: 1. Medical problems in a regional SCI population. Paraplegia. 33 (6), 308-315 (1995).
- Bjornshave Noe, B., Mikkelsen, E. M., Hansen, R. M., Thygesen, M., Hagen, E. M. Incidence of traumatic spinal cord injury in Denmark, 1990-2012: a hospital-based study. Spinal Cord. 53 (6), 436-440 (2015).
- Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A., Fehlings, M. G. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clinical Epidemiology. 6, 309-331 (2014).
- Aguayo, A. J., et al. Degenerative and regenerative responses of injured neurons in the central nervous system of adult mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 331 (1261), 337-343 (1991).
- Aguayo, A. J., Bjorklund, A., Stenevi, U., Carlstedt, T. Fetal mesencephalic neurons survive and extend long axons across peripheral nervous system grafts inserted into the adult rat striatum. Neuroscience Letters. 45 (1), 53-58 (1984).
- Richardson, P. M., Issa, V. M., Aguayo, A. J. Regeneration of long spinal axons in the rat. Journal of Neurocytology. 13 (1), 165-182 (1984).
- Butler, E. G., Ward, M. B. Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae. Journal of Experimental Zoology. 160 (1), 47-65 (1965).
- Diaz Quiroz, J. F., Tsai, E., Coyle, M., Sehm, T., Echeverri, K. Precise control of miR-125b levels is required to create a regeneration-permissive environment after spinal cord injury: a cross-species comparison between salamander and rat. Disease Model Mechanisms. 7 (6), 601-611 (2014).
- Clarke, J. D., Alexander, R., Holder, N. Regeneration of descending axons in the spinal cord of the axolotl. Neuroscience Letters. 89 (1), 1-6 (1988).
- McHedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the central nervous system during salamander tail regeneration from the implanted neurospheres. Methods of Molecular Biology. 916, 197-202 (2012).
- Thygesen, M. M., et al. A clinically relevant blunt spinal cord injury model in the regeneration competent axolotl (Ambystoma mexicanum) tail. Experimental Therapeutic Medicine. 17 (3), 2322-2328 (2019).
- Goss, R. J. Principles of Regeneration. , Academic Press. New York. (1969).
- Hutchison, C., Pilote, M., Roy, S. The axolotl limb: a model for bone development, regeneration and fracture healing. Bone. 40 (1), 45-56 (2007).
- Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration (Oxford). 4 (3), 124-131 (2017).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
