Summary
Dit manuscript presenteert protocollen voor het chirurgisch toebrengen van gecontroleerde bot en scherpe ruggenmergletsels aan een regeneratieve Axolotl (Ambystoma mexicanum).
Abstract
Het doel van deze studie is het vaststellen van een gestandaardiseerd en reproduceerbaar regeneratief botte ruggenmergletsel model in de axolotl (Ambystoma mexicanum). De meeste klinische ruggenmergletsels optreden als hoge energie botte trauma's, inducerende contusie verwondingen. Echter, de meeste studies in het ruggenmerg van Axolotl zijn uitgevoerd met scherpe trauma's. Vandaar dat deze studie bedoeld is om een meer klinisch relevant regeneratief model te produceren. Vanwege hun indrukwekkende vermogen om bijna elk weefsel te regenereren, worden Axolotls veel gebruikt als modellen in regeneratieve studies en zijn ze intensief gebruikt in ruggenmergletsel (SCI) studies. In dit protocol wordt de Axolotls verdoiliseerd door onderdompeling in een benzocaïne oplossing. Onder de Microscoop wordt een hoekige incisie bilateraal gemaakt op een niveau dat net caudal is voor de achterpoten. Vanuit deze incisie is het mogelijk om de spineuze processen te ontleden en bloot te leggen. Met behulp van een tang en een schaar wordt een laminectomie op twee niveaus uitgevoerd, waardoor het ruggenmerg wordt blootgesteld. Een aangepaste trauma-apparaat bestaande uit een vallende staaf in een cilinder is geconstrueerd, en dit apparaat wordt gebruikt voor het induceren van een contusie letsel aan het ruggenmerg. De incisies worden vervolgens gehecht, en het dier herstelt van anesthesie. De chirurgische aanpak is succesvol in het blootstellen van het ruggenmerg. Het trauma mechanisme kan contusie verwondingen veroorzaken aan het ruggenmerg, zoals bevestigd door histologie, MRI en neurologisch onderzoek. Ten slotte regenereert het ruggenmerg van het letsel. De kritieke stap van het protocol is het verwijderen van de stekelige processen zonder schade aan het ruggenmerg. Deze stap vereist opleiding om een veilige procedure te waarborgen. Bovendien is wondsluiting sterk afhankelijk van het niet toebrengen van onnodige schade aan de huid tijdens incisie. Het protocol werd uitgevoerd in een gerandomiseerde studie van 12 dieren.
Introduction
Het algemene doel van deze studie was het vaststellen van een gecontroleerde en reproduceerbare microchirurgische methode voor het toebrengen van bot en scherp SCI aan de axolotl (Ambystoma mexicanum), het produceren van een regeneratief ruggenmergletsel model.
SCI is een ernstige aandoening die, afhankelijk van het niveau en de omvang, neurologische handicaps aan de extremiteiten veroorzaakt, samen met een verminderde blaas-en darm controle1,2,3. De meeste Sci zijn het resultaat van High Energy Blunt trauma zoals verkeersongevallen en vallen4,5. Scherpe verwondingen zijn zeer zeldzaam. Daarom is het meest voorkomende macroscopische letsel type contusies.
Het centrale zenuwstelsel van zoogdieren (CNS) is een niet-regeneratief weefsel, vandaar dat er geen herstel van neurologische weefsels na Sci wordt gezien6,7,8. Aan de andere kant, sommige dieren hebben een intrigerende vermogen om te regenereren weefsels, met inbegrip van CNS weefsel. Een van deze dieren is de axolotl. Het wordt veel gebruikt in studies van regeneratieve biologie en is van belang in het ruggenmerg regeneratie, omdat het een gewervelde9,10,11,12.
De meeste Sci-onderzoeken in de axolotl worden uitgevoerd als amputatie van de gehele staart of ablatie van een groter deel van het ruggenmerg9,10,11,12. Onlangs werd een nieuwe studie gepubliceerd over Blunt blessures13 die klinische situaties beter nabootst. Terwijl complete amputatie van het aanhangsel in de axolotl resulteert in volledige regeneratie, zijn sommige niet-amputatie-gebaseerde regeneratieve verschijnselen afhankelijk van het kritische grootte defect (CSD)14,15. Dit betekent dat verwondingen die een kritische drempel overschrijden niet worden geregenereerd. Om een regeneratief model met een hogere klinische translationele waarde te ontwikkelen, onderzocht deze studie of een botte trauma van 2 mm de CSD-limiet zou overschrijden.
Deze methode is relevant voor onderzoekers die werken aan ruggenmerg regeneratie in kleine diermodellen, vooral in de axolotl. Bovendien kan het van meer algemeen belang zijn, omdat het een manier vertoont om standaard laboratoriumapparatuur te gebruiken om een stompe trauma mechanisme te ontwikkelen dat geschikt is voor gebruik bij kleine dieren in het algemeen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle toepasselijke institutionele en overheidsverordeningen betreffende het ethisch gebruik van dieren werden tijdens deze studie gevolgd. De studie werd uitgevoerd onder de goedkeurings-id: 2015-15-0201-0061 door de Deense Animal experiment inspectie. Dieren waren Mexicaanse Axolotls (Ambystoma mexicanum, gemiddelde lichaamsmassa ± STD: 12,12 g ± 1,25 g).
1. voorbereiding
-
Bereid Axolotl voor anesthesie.
- Gebruik hoogkwalitatief niet-chemisch behandeld kraanwater. Gebruik, indien niet beschikbaar, de oplossing van 40% Holtfreter.
- Los 200 mg ethyl 4-aminobenzoaat (benzocaïne) op in 3 mL aceton. Los deze oplossing op in 1 liter kraanwater of 40% Holtfreter's oplossing.
- Gebruik een standaard Petri schaaltje (100 mm in diameter) geplaatst onder een stereomicroscoop als een chirurgische tafel. Plaats een chirurgische textiel doek op de Petri schaal.
Opmerking: Het gebruik van een Petri schaal als chirurgisch gebied maakt het mogelijk om het dier te bewegen en te roteren zonder het aan te raken, zodat de ruggengraat stabiel is tijdens de operatie. - Bereid alle steriele microchirurgische instrumenten (d.w.z. een schaar en een anatomisch Tang).
2. anesthesie
- Plaats de axolotl in een container met benzocaïne oplossing voor ongeveer 45 min om een diepe en stabiele anesthesie te garanderen.
Opmerking: De gegeven concentratie van benzocaïne zal anesthesie veroorzaken in alle maten van Axolotls. - Controleer op tekenen van narcose binnen 30-45 min. Deze omvatten een volledig gebrek aan Kieuw bewegingen, rechtse reflex of reactie op tactiele of pijnlijke stimuli (zachte knijpen van Teen web).
- Om anesthesie te handhaven, wikkel de dieren in papieren handdoeken bevoafd in de verdovings oplossing. Bevochtig deze regelmatig met deze oplossing tijdens de chirurgische ingreep om ervoor te zorgen dat de huid en de kieuwen vochtig worden gehouden.
- Herstel het dier na de ingreep door het in een bakje met vers kraanwater te plaatsen. Observeer de tekenen van herstel, zoals Gill Movement en herwonnen rechts reflex, binnen 1 h16.
3. microchirurgische laminectomie
Opmerking: De laminectomie wordt uitgevoerd onder een stereomicroscoop.
- Plaats het dier in de liggende positie op de Petri schaal. Wikkel het in papieren handdoeken zodat de staart wordt blootgesteld.
Opmerking: De papieren handdoeken zijn uitstekend geschikt voor het garanderen van stabiliteit gedurende de hele procedure. -
Identificeer de achterpoten. Maak de eerste incisie gewoon caudal voor hen.
- Met een paar micro schaar, voer een verticale incisie van de kiel totdat de benige prominentie van de stekelige processen worden gevoeld.
Opmerking: Wees heel voorzichtig bij het grijpen van de kiel en de huid met een tang, omdat deze gemakkelijk schade toebrengen aan de delicate huid. - Strek de snede lateraal, zodat de incisie doorloopt de gehele breedte van de staart.
- Pak het stekelige proces met de tang om de juiste diepte te garanderen.
- Strek de verticale incisies 1 mm onder het stekelige proces aan beide zijden uit.
- Met een paar micro schaar, voer een verticale incisie van de kiel totdat de benige prominentie van de stekelige processen worden gevoeld.
-
Plaats het dier aan de ene kant om ventrale en horizontale incisies uit te voeren zoals hieronder vermeld.
- Met een paar micro schaar, beginnend vanaf het ventrale punt van de verticale incisie, maak een horizontale incisie van ongeveer 15 mm voor dieren 10-20 g in gewicht. Maak de incisie langer voor grotere dieren, en korter voor kleinere dieren.
- Met behulp van de schaar, ontleden mediaal door de horizontale incisie totdat de wervelkolom wordt gevoeld in de middenlijn.
- Herhaal de stappen 3,3, 3.3.1 en 3.3.2 aan de andere zijde van het dier.
-
Na ontleed in het diepe mediale vlak van beide zijden, ontleden door de middellijn, waardoor de twee horizontale incisies verbinden.
- Verplaats het vrije stuk van de staart en de Kiel naar één kant, waardoor de stekelige processen worden blootgesteld (Figuur 1).
- Fixeren het staartstuk met natte papieren handdoeken.
-
Plaats het dier opnieuw in de liggende positie met het hoofd naar de niet-dominante kant van de chirurg.
- Met een paar tang, pak de stekelige processen net caudal aan de achterpoten. Breng een zachte lift aan, zowel omhoog als naar het hoofd van het dier.
- Plaats de messen van een paar microscissors horizontaal rond het proces en knip het voorzichtig af. De lift op het proces zorgt ervoor dat het nu wordt verwijderd, waardoor het ruggenmerg wordt blootgesteld.
- Pak het stekelige proces net caudal aan degene die net is verwijderd en herhaal stap 3.5.1 en 3.5.2.
Opmerking: Dit moet een blootgestelde ruggenmerg die overeenkomt met twee wervel niveaus achterlaten. Bij het uitvoeren van de laminectomie verschijnt er vaak een witte schuimige afscheiding. Het ruggenmerg wordt gemakkelijk geïdentificeerd door zijn kenmerkende glans, samen met een schip dat langs de middenlijn loopt. - Afhankelijk van de grootte van het dier, kan het blootgestelde gebied niet breed genoeg zijn. Gebruik twee paar tang, pak de laminaten aan beide zijden van het ruggenmerg en draai deze lateraal met een zachte beweging.
4. het introduceren van een contusie type letsel (Figuur 2)
- Houd het dier in de liggende positie.
- Gebruik de Petri schaal om het dier over te brengen naar de trauma-eenheid.
- Laat een assistent een zaklamp schijnen op het ruggenmerg.
- Plaats de contusie trauma unit cilinder boven het blootgestelde ruggenmerg met behulp van de micro-adjusters op het apparaat. Richt door de cilinder.
- Verlaag de cilinder tot het niveau met de laminae.
- Bevestig de vallende staaf aan de elektromagneet. Plaats de gewenste dalende hoogteverstelling cilinder op de trauma unit.
- Plaats de vallende staaf in de cilinder.
Opmerking: Voor een geblindeerde studie moet de chirurg nu de kamer verlaten zonder te weten of het dier zal worden toegewezen aan een blessure of een schijn operatie groep. - Schakel de elektromagneet uit. De staaf valt aan het blootgestelde ruggenmerg.
- Gebruik de hoogteverstelling schroef om de stang van het ruggenmerg te tillen.
- Bevestig het letsel door te kijken naar het ruggenmerg door de Microscoop. De geblesseerde plaats zal donkerder lijken, en bloeden uit het middenlijnvat zal duidelijk zijn.
5. Maak kennis met een scherp letsel
Opmerking: Voer deze stappen uit na 3.5.4.
- Met een paar micro schaar snijd het ruggenmerg in een perfecte verticale snede.
- Herhaal de snede 2 mm naar de caudale kant van het lichaam.
Opmerking: De lengte van het verwijderde stukje ruggenmerg kan worden aangepast volgens de vereiste van de studie. Echter, een 2 mm snede zal worden regenereerbaar10. - Zorg ervoor dat de sneden compleet zijn. Na voltooiing, voel de messen van de schaar schrapen langs het ventrale deel van het wervelkanaal.
- Til het 2 mm-stukje ruggenmerg van het wervelkanaal.
6. sluiten van de chirurgische wond
- Keer het dier terug naar de chirurgische tafel. In een geblindeerde studie, herpositioneer de kiel zodat het ruggenmerg niet zichtbaar is voor de chirurg.
-
Houd het dier in de liggende positie.
- Begin met het plaatsen van 10,0 nylon hechtingen van het meest caudale deel van de horizontale incisie. Sluit de wonden in één laag.
Opmerking: De huid niet te strak te vatten, want het zal het toebrengen van necrose. - Werken naar het verticale deel van de incisie.
- Bij het bereiken van de hoek, draai de Petri schaal en hechting van de andere horizontale incisie.
- Stel hechtingen op de verticale incisies.
- Plaats geen hechtingen in het bovenste deel van de Kiel, omdat de huid hier niet in staat zal zijn om vast te houden.
- Begin met het plaatsen van 10,0 nylon hechtingen van het meest caudale deel van de horizontale incisie. Sluit de wonden in één laag.
7. retourneren van het dier naar de Verdovings vrije oplossing
- Til de Petri schaal met het dier en Dompel beide zeer zachtjes in zoet water slechts 5 cm diep en laat het dier eraf glijden.
Opmerking: De ondiepe waterdiepte zorgt ervoor dat het dier niet zal proberen te zwemmen naar het oppervlak om te ademen. - Verander het water tijdens de eerste week niet.
- Zorg er bij het voederen van de dieren voor dat het voedsel in de buurt van het hoofd van het dier wordt geplaatst.
Opmerking: Het doel van deze maatregelen is om zoveel mogelijk beweging te vermijden tijdens de eerste week.
8. postoperatieve echografie
- Voorafgaand aan de beëindiging van de anesthesie, gebruik maken van een hoge frequentie echografie systeem om beelden van de verwonding die kan worden gebruikt voor de bouw van driedimensionale beelden van de SCI-site te verwerven.
- Bevestig de transducer aan een micro manipulator die bij voorkeur bestuurd wordt door een externe joystick.
- Dompel de verdoving dier in de liggende positie in een kleine container gevuld met anesthetische oplossing.
Opmerking: Bevestig het dier met miniatuur zandzakken of andere apparatuur om beweging te voorkomen tijdens de scan volgorde. - Lijn de punt van de transducer uit met de lengte-as van het dier en dompel het in de benzocaïne oplossing totdat het slechts een paar millimeter boven de kiel achter de achterpoten van het dier ligt.
- Identificeer de SCI-site.
Opmerking: De wond site is gemakkelijk herkenbaar als gevolg van de ontbrekende stekelige processen direct boven het Sci. - Optimaliseer de afbeelding door de echografie-instellingen aan te passen. Zorg ervoor dat de SCI-site zich in het midden van de afbeelding bevindt. Pas het gezichtsveld aan (d.w.z. de beeld diepte, de diepte verschuiving en de breedte van de afbeelding) om de SCI-site en het aangrenzende gezonde weefsel te bedekken. Pas de tweedimensionale versterking aan om het beeldcontrast te optimaliseren.
- Door de ultrasone transducer over de SCI-site te vegen met een elektronisch bediende micro manipulator, verkrijgt u B-modus beelden die de SCI-site bedekken op meerdere cross-sectionele segment locaties van het sagittale, met opeenvolgende segmenten met een interslice-interval van 50 μm. Verkrijg Cine-images met 500 frames met een framesnelheid van ~ 50 frames/s en een transducer frequentie van 40 MHz.
Opmerking: Deze instelling vereist een elektronische micromanipulator bestuurd door een externe joystick (stap 8,2). - Na het afronden van de scan sequentie keert u terug naar stap 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het doel van het protocol is om een SCI te produceren dat de motorische en sensorische functies van de verwonding zal verlamen. Omdat de axolotl regeneratie-competent is, herstelt de functie binnen enkele weken, waardoor onderzoekers CNS regeneratie kunnen bestuderen tijdens een korte tijdspanne.
Anesthesie werd verstrekt voor 45 min aan alle dieren, en geen afleveringen van premature herstel werden ervaren. Alle dieren hersteld binnen een uur en toonde geen tekenen van schade door anesthesie in de volgende weken13,16.
De laminectomie was succesvol bij alle dieren. Echter, anatomische variatie in de breedte van het wervelkanaal opgeroepen voor de verbreding van het kanaal met behulp van een tang en een twist in sommige individuen. Bovendien, residuele laminaten in sommige individuen verhinderde de vallende staaf zijn doelwit te bereiken, waardoor het absoluut noodzakelijk dat de chirurg het veld van het resterende bot en prominenties schoonmaken.
Het sluiten van de incisies werd geassocieerd met een aantal moeilijkheden, vooral tijdens de proeffase van de studie. Hechtingen in het bovenste deel van de kiel zouden niet vasthouden en resulteerden in onvoldoende sluitingen. De sluiting van een dier in de studie hield niet, resulterend in de kiel werd gescheurd, daaropvolgende infectie, en de dood. Dit benadrukt de noodzaak van zorgvuldige hechten langs de hele incisies.
De initiële mechanische verwondingen waren duidelijk tijdens de procedure. Tijdens de modelontwikkeling werden geblesseerde en schijn dieren bevlekt met hematoxyline en eosine om de verwonding te valideren. Representatieve resultaten van elke groep worden weergegeven in Figuur 3a1,a2 en Figuur 3C1,C2. Regeneratie werd bevestigd door histologische secties die na negen weken werden gemaakt (Figuur 3B1,B2 en Figuur 3D1,D2), die een hervestigde ruggenmerg verbinding in de Sci-dieren vertoonden.
Letsel en regeneratie kan worden gevolgd door het onderzoeken van neurologische functie. Het stimuleren van de staart met een lichte aanraking en knijpen van de Tang zal onthullen of tactiele en Nociceptieve zintuiglijke functies zijn verloren en potentieel opnieuw vastgesteld. Een neurologische score werd gedefinieerd op basis van de reactie van het dier: 0 punt = geen reactie, 1 punt = lokale staart beweging, 2 punten = romp beweging, 3 punten = gecoördineerde beweging van ledematen en/of kop naast met romp beweging, 4 punten = dieren met directe gecoördineerde snelle beweging. In zes SCI-dieren versus vijf schijn dieren was het verlies van neurologische functie drie weken na letsel gevonden, en een geleidelijke restauratie binnen negen weken (Figuur 4 en aanvullende video 1).
Ultrasonografische beelden van het gewonde ruggenmerg kunnen worden verkregen met behulp van het bovenstaande protocol. Het visualiseren van de SCI-site was mogelijk door het duidelijke gebrek aan bonige spineuze processen (Figuur 5). Bovendien kan het gebruik van de B-modus de rugader van het onbeschadigde ruggenmerg worden gevisualiseerd, wat een marker van de integriteit van het vat oplevert.
Het is mogelijk om de dieren onmiddellijk te testen na het herontwaken. Echter, sommige dieren uitgedrukt lokale kleine amplitude, repetitieve en ritmische staart beweging op stimulatie vergelijkbaar met de Clonus verschijnselen waargenomen in menselijke SCI. Deze bewegingen kunnen Clonus of een gebrek aan centrale reflex onderdrukking vertegenwoordigen en kunnen mogelijk meer schade toebrengen aan het nieuw gewonde ruggenmerg. Daarom is het testen van de dieren niet aan te bevelen voor een week na letsel.
Van eenvoudige kwalitatieve observatie van de dieren, het zal duidelijk zijn dat de staart is verlamd, en zwemmen is aanzienlijk geremd, waardoor de dieren volledig afhankelijk van het verplaatsen van hun ledematen. Deze waarnemingen zullen ook het succes van het protocol valideren.
Hoogveld MRI-scans (9,4 T) werden onmiddellijk na het letsel uitgevoerd om het letsel in vivo te visualiseren (Figuur 6). Echter, de scans waren over het algemeen laag in signaal-ruis verhouding in vergelijking met die van niet-bediende dieren, waarschijnlijk als gevolg van bloeden en hemosiderin. Daarom werd geconcludeerd dat MRI een suboptimale methode was om de verwonding en het succes van het protocol te valideren.
Figuur 1: schematische tekening van de microchirurgische laminectomie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: schematische tekening van de contusie trauma mechanisme. A) de gehele installatie, waarbij de vallende staaf boven het dier wordt weergegeven. B) het gedemonteerde mechanisme, waaruit blijkt hoe de stang is losgekoppeld van de elektromagneet. C) de vallende staaf is aangesloten op de elektromagneet. De dalende hoogteverstelling cilinder is geïnstalleerd, en de elektromagneet en staaf in de cilinder geladen. Hoogteverstelling van het gehele systeem wordt geregeld door een instelwiel. (D) door het uitschakelen van de elektromagneet zal de stang vallen zonder dat de bediener het systeem aanraakt. Figuur werd oorspronkelijk uitgegeven door Thygesen et al.13. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: histologische secties hematoxyline en eosine onmiddellijk gekleurd en negen weken na letsel. (A1) SCI-dier onmiddellijk na het letsel. (B1) SCI dier op negen weken. (C1) Schijn chirurgie dier onmiddellijk na letsel. (D1) Sham dier op negen weken. Rood vierkant = markeert het letsel van de SCI-dieren en de laminectomie van het schijn dier. Figuur 2A, Figuur 2B, Figuur 2C zijn vergroingen van deze gebieden op 5x. Blauwe pijl = ongeblesseerd ruggenmerg. Dit cijfer werd oorspronkelijk uitgegeven door Thygesen et al.13. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: grafiek van respons op tactiele stimuli. De reactie van de SCI-groepen is na drie weken lager, vergeleken met de Sham-groep. WPI = weken na letsel, zwarte lijn = SCI, grijze kleur = Sham. Sham n = 5, SCI n = 6. Figuur werd oorspronkelijk uitgegeven door Thygesen et al.13. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Afbeelding 5: Ultrasonografisch beeld dat het ruggenmerg in een Sagittaal gedeelte weergeeft. Gele lijnen markeren het ruggenmerg, gele cirkel de wond plaats, en witte pijlen markeren de wervels. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: MRI-scans op verschillende tijdstippen na letsel of schijn chirurgie. CSF rond het ruggenmerg ontbreekt, met name bij drie WPI voor het SCI-dier, wat wijst op zwelling van het ruggenmerg. Verduisteren van het ruggenmerg geeft ook oedeem aan. Merk op hoe deze veranderingen verdwijnen naarmate de regeneratie vordert. Gele pijl = het gebied van laminectomie. Figuur werd oorspronkelijk uitgegeven door Thygesen et al.13. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullende video 1: Video toont de neurologische functie na tactiele stimuli en later een Nociceptieve stimulus. Eerst een gezonde controle dier, en dan een dier lijden van SCI. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Omdat het risico op letsel aan het ruggenmerg significant is, verwijderen de kritische stappen van het protocol de spineuze processen en verbreding van de benige toegang tot het Ruggenmergkanaal indien nodig. Zoals vermeld in het Protocol, het verwijderen van de meest craniale proces eerst wordt sterk aanbevolen. Dit zal betekenen dat de meer caudale processen het ruggenmerg beschermen tegen het raken van de schaar. Het wordt aanbevolen om te zorgen voor voldoende chirurgische toegang, wat betekent dat niet te klein een primaire incisie te maken. Ook bij het grijpen van iets met een tang, moet de richting van de pull toegepast altijd worden overwogen. Het aanbrengen van een zachte trek weg van het ruggenmerg zal het beschermen in het geval van de greep falen en een slip van het instrument.
De chirurgische ingreep in de axolotl verschilt niet van andere dieren. Er bestaan echter enkele belangrijke verschillen, voornamelijk toe te schrijven aan de weefsel samenstelling en de grootte van het dier. De axolotl Kiel huid is zeer kwetsbaar en paradoxaal genoeg geneest niet goed bij kleine beschadigingen toegebracht tijdens incisie. Voorzichtigheid moet worden betracht, vooral op de primaire incisies, omdat de schade aanzienlijk compliceren de suturing. De botten van zeer jonge Axolotls zijn erg zacht. Dit betekent dat vaak basis anatomische Tang kan volstaan bij het verwijderen van de botten. Dit geeft een ander element van voorzichtigheid, omdat het knijpen van de stekelige processen aanzienlijke schade kan toebrengen. De subcutane en spier fascia lagen zijn niet beschikbaar voor het suturing, vanwege hun fragiele weefsel composities. Het is noodzakelijk om te zorgen voor een kalme postoperatieve week. De dieren mogen na de operatie niet voldoende rusten. Vandaar, ze kunnen secundaire schade toebrengen aan hun ruggenmerg postoperatief. Hun kleine anatomie is niet toegestaan voor noch interne noch spline fixatie.
Gewicht en dalende hoogte van de Falling rod systeem is cruciaal voor het toebrengen van een contusie letsel. Tijdens uitgebreide loodsen voor een eerdere studie, was het gewicht van de hengel en de dalende hoogte die nodig waren 25 g en 3 cm13. Dit was genoeg om verlamming in 12 g Axolotls te induceren zonder het ruggenmerg te snijden of te desinmeerend. Extra gewicht of dalende hoogte kan nodig zijn bij grotere dieren. Bovendien moet de diameter van de vallende staaf groter zijn in het geval van grotere dieren en korter voor kleinere dieren.
Het model heeft enkele beperkingen. Omdat Axolotls niet worden gebruikt voor geleerde gedrags studies, kan men complexe neurologische functies niet testen. De verwonding werd caudal aan de ledematen geïntroduceerd, waardoor de achterpoten en de darm en blaas werden verlamd. De reden hiervoor was ethisch, om de impact op het dier tot een minimum te beperken. Het beperkt echter wel de mogelijkheid om de effecten op bewegingen van de ledematen te bestuderen, wat gemakkelijker te beschrijven en categoriseren kan zijn. Een groot deel van de SCI-geassocieerde morbiditeit vloeit voort uit het verlies van controle van de darm en de blaas. Dit model is niet toegestaan voor toekomstig onderzoek op deze gebieden. Het toebrengen van schade rostrale migratoire aan de achterpoten zou mogelijk zijn, maar het werd niet geprobeerd.
Het bestuderen van SCI in een regeneratief model zoals de axolotl zorgt voor een andere aanpak in SCI-onderzoek. Omdat het diermodel kan regenereren, zal eliminatie studies in staat zijn om kritische factoren van regeneratie te onthullen. Conventionele studies over SCI worden uitgevoerd in niet-regeneratieve modellen, wat betekent dat men moet ingrijpen op alle kritische factoren om een regeneratieve respons te induceren.
Dit model en protocol zijn in overeenstemming met het principe van Krogh waarin staat: "voor zo'n groot aantal problemen zal er een dier van keuze zijn of een paar van dergelijke dieren waarop het het meest gunstig kan worden bestudeerd"17. De zoogdier regeneratie wordt geremd door meerdere factoren. Remming van deze in een zoogdier model meestal geen effecten induceren. Het verhogen van remmers in de axolotl moet echter de regeneratie elimineren en daardoor onthullen of die remmer kritisch is of niet10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Michael Pedersen, Universiteit van Aarhus voor zijn expertise en tijd bij het ontwikkelen van MRI-protocollen en het opzetten van het hele project. Peter Agger, Universiteit van Aarhus voor zijn expertise en tijd bij het ontwikkelen van de MRI-protocollen. Steffen ring Gard, Universiteit van Aarhus voor zijn expertise en tijd bij het ontwikkelen van de MRI-protocollen. De ontwikkeling van het SCI-model in de axolotl werd vriendelijk ondersteund door de A.P. Møller Maersk Foundation, de Riisfort Foundation, de linex Foundation en de ELRO Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g - 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| Electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Kimwipes | |||
| Microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring approximately 70 x 55 cm2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
References
- Shavelle, R. M., DeVivo, M. J., Brooks, J. C., Strauss, D. J., Paculdo, D. R. Improvements in Long-Term Survival After Spinal Cord Injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96 (4), 645-651 (2015).
- Hicken, B. L., Putzke, J. D., Richards, J. S. Bladder management and quality of life after spinal cord injury. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 80 (12), 916-922 (2001).
- Levi, R., Hultling, C., Nash, M. S., Seiger, A. The Stockholm spinal cord injury study: 1. Medical problems in a regional SCI population. Paraplegia. 33 (6), 308-315 (1995).
- Bjornshave Noe, B., Mikkelsen, E. M., Hansen, R. M., Thygesen, M., Hagen, E. M. Incidence of traumatic spinal cord injury in Denmark, 1990-2012: a hospital-based study. Spinal Cord. 53 (6), 436-440 (2015).
- Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A., Fehlings, M. G. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clinical Epidemiology. 6, 309-331 (2014).
- Aguayo, A. J., et al. Degenerative and regenerative responses of injured neurons in the central nervous system of adult mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 331 (1261), 337-343 (1991).
- Aguayo, A. J., Bjorklund, A., Stenevi, U., Carlstedt, T. Fetal mesencephalic neurons survive and extend long axons across peripheral nervous system grafts inserted into the adult rat striatum. Neuroscience Letters. 45 (1), 53-58 (1984).
- Richardson, P. M., Issa, V. M., Aguayo, A. J. Regeneration of long spinal axons in the rat. Journal of Neurocytology. 13 (1), 165-182 (1984).
- Butler, E. G., Ward, M. B. Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae. Journal of Experimental Zoology. 160 (1), 47-65 (1965).
- Diaz Quiroz, J. F., Tsai, E., Coyle, M., Sehm, T., Echeverri, K. Precise control of miR-125b levels is required to create a regeneration-permissive environment after spinal cord injury: a cross-species comparison between salamander and rat. Disease Model Mechanisms. 7 (6), 601-611 (2014).
- Clarke, J. D., Alexander, R., Holder, N. Regeneration of descending axons in the spinal cord of the axolotl. Neuroscience Letters. 89 (1), 1-6 (1988).
- McHedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the central nervous system during salamander tail regeneration from the implanted neurospheres. Methods of Molecular Biology. 916, 197-202 (2012).
- Thygesen, M. M., et al. A clinically relevant blunt spinal cord injury model in the regeneration competent axolotl (Ambystoma mexicanum) tail. Experimental Therapeutic Medicine. 17 (3), 2322-2328 (2019).
- Goss, R. J. Principles of Regeneration. , Academic Press. New York. (1969).
- Hutchison, C., Pilote, M., Roy, S. The axolotl limb: a model for bone development, regeneration and fracture healing. Bone. 40 (1), 45-56 (2007).
- Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration (Oxford). 4 (3), 124-131 (2017).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
