Summary
Ce manuscrit présente des protocoles pour infliger chirurgicalement des lésions de la moelle épinière émoussées et pointues contrôlées à un axolotl régénérateur (Ambystoma mexicanum).
Abstract
Le but de cette étude est d'établir un modèle normalisé et reproductible de lésions médullaires émoussées régénératrices dans l'axolotl (Ambystoma mexicanum). La plupart des dommages cliniques de moelle épinière se produisent comme traumas émoussés d'énergie élevée, induisant des dommages de contusion. Cependant, la plupart des études dans la moelle épinière axolotl ont été menées avec des traumatismes pointus. Par conséquent, cette étude vise à produire un modèle régénérateur plus pertinent sur le plan clinique. En raison de leur capacité impressionnante à régénérer presque n'importe quel tissu, les axolotls sont largement utilisés comme modèles dans les études régénératives et ont été largement utilisés dans les études sur les lésions de la moelle épinière (SCI). Dans ce protocole, les axolotls sont anesthésiés par submersion dans une solution de benzocaïne. Sous le microscope, une incision angulaire est faite bilatéralement à un niveau juste caudal aux membres postérieurs. De cette incision, il est possible de disséquer et d'exposer les processus spinous. À l'aide de forceps et de ciseaux, une laminctomie à deux niveaux est effectuée, exposant la moelle épinière. Un dispositif de trauma sur mesure composé d'une tige tombante dans un cylindre est construit, et ce dispositif est utilisé pour induire une blessure de contusion à la moelle épinière. Les incisions sont ensuite sutures, et l'animal se remet de l'anesthésie. L'approche chirurgicale réussit à exposer la moelle épinière. Le mécanisme de trauma peut produire des dommages de contusion à la moelle épinière, comme confirmé par l'histologie, L'IRM, et l'examen neurologique. Enfin, la moelle épinière se régénère à partir de la blessure. L'étape critique du protocole est d'enlever les processus de pieux sans infliger des dommages à la moelle épinière. Cette étape nécessite une formation pour assurer une procédure sûre. En outre, la fermeture des plaies dépend fortement de ne pas infliger de dommages inutiles à la peau pendant l'incision. Le protocole a été exécuté dans une étude randomisée de 12 animaux.
Introduction
L'objectif global de cette étude était d'établir une méthode microchirurgicale contrôlée et reproductible pour infliger le SCI émoussé et pointu à l'axolotl (Ambystoma mexicanum), produisant un modèle régénérateur de lésions de la moelle épinière.
SCI est une condition grave qui, selon le niveau et l'étendue, inflige une incapacité neurologique aux extrémités ainsi que la vessie altérée et le contrôle de l'intestin1,2,3. La plupart des SCI sont le résultat de traumatismes émoussés à haute énergie tels que les accidents de la circulation et les chutes4,5. Les blessures graves sont très rares. Par conséquent, le type de blessure macroscopique le plus commun est contusions.
Le système nerveux central des mammifères (SNC) est un tissu non régénérateur, donc aucune restauration de tissu neurologique suivant SCI est vu6,7,8. D'autre part, certains animaux ont une capacité intrigante de régénérer les tissus, y compris les tissus du SNC. L'un de ces animaux est l'axolotl. Il est largement utilisé dans les études de biologie régénérative et est d'intérêt dans la régénération de la moelle épinière, parce qu'il est un vertébré9,10,11,12.
La plupart des études SCI dans l'axolotl sont effectuées soit comme l'amputation de la queue entière ou l'ablation d'une plus grande partie de la moelle épinière9,10,11,12. Récemment, une nouvelle étude a été éditée sur des dommages émoussés13 qui imite mieux des situations cliniques. Alors que l'amputation complète de l'appendice dans l'axolotl entraîne une régénération complète, certains phénomènes régénératifs non basés sur l'amputation dépendent du défaut critique de taille (CSD)14,15. Cela signifie que les blessures dépassant un seuil critique ne sont pas régénérées. Pour développer un modèle régénérateur avec une valeur translationnelle clinique plus élevée, cette étude a étudié si un traumatisme émoussé de 2 mm dépasserait la limite de CSD.
Cette méthode est pertinente pour les chercheurs travaillant sur la régénération de la moelle épinière chez les petits modèles animaux, en particulier dans l'axolotl. En outre, il peut être d'intérêt plus général, car il montre une façon d'utiliser l'équipement de laboratoire standard pour développer un mécanisme de traumatisme contondant qui est approprié pour une utilisation chez les petits animaux en général.
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Protocol
Tous les règlements institutionnels et gouvernementaux applicables concernant l'utilisation éthique des animaux ont été suivis au cours de cette étude. L'étude a été menée sous l'autorisation id: 2015-15-0201-0061 par l'Inspection danoise des expériences animales. Les animaux étaient des axolotls mexicains(Ambystoma mexicanum, masse corporelle moyenne - MST : 12,12 g et 1,25 g).
1. Préparation
-
Préparer l'axolotl pour l'anesthésie.
- Utilisez de l'eau du robinet non traitée chimiquement de haute qualité. Si vous n'êtes pas disponible, utilisez la solution Holtfreter de 40 %.
- Dissoudre 200 mg d'éthyle 4-aminobenzoate (benzocaïne) dans 3 ml d'acétone. Dissoudre cette solution dans 1 L d'eau du robinet ou 40% de la solution de Holtfreter.
- Utilisez un plat Petri standard (100 mm de diamètre) placé sous un microscope stéréo comme table chirurgicale. Placez un tissu textile chirurgical sur le plat Petri.
REMARQUE: L'utilisation d'un plat Petri comme zone chirurgicale permet le déplacement et la rotation de l'animal sans le toucher, assurant la stabilité de la colonne vertébrale pendant la chirurgie. - Préparer tous les instruments microchirurgicaux stériles (c.-à-d. ciseaux et forceps anatomiques).
2. Anesthésie
- Placer l'axolotl dans un récipient avec une solution de benzocaïne pendant environ 45 min pour assurer une anesthésie profonde et stable.
REMARQUE: La concentration donnée de benzocaïne provoquera une anesthésie dans toutes les tailles d'axolotls. - Vérifiez s'il y a des signes d'anesthésie générale dans les 30-45 minutes. Il s'agit notamment d'un manque total de mouvements branchiaux, réflexe de redressement, ou la réponse à des stimuli tactiles ou douloureux (pincement doux de la toile d'orteil).
- Pour maintenir l'anesthésie, enveloppez les animaux dans des essuie-tout mouillés dans la solution anesthésique. Mouillez-les régulièrement avec cette solution pendant la procédure chirurgicale pour s'assurer que la peau et les branchies sont maintenues humides.
- Récupérer l'animal après la chirurgie en le plaçant dans un récipient contenant de l'eau du robinet fraîche. Observez les signes de rétablissement, tels que le mouvement des branchies et le réflexe de redressement retrouvé, dans un délai de 1 h16.
3. Laminectomy microchirurgical
REMARQUE: La laminectomie est réalisée sous un stéréomicroscope.
- Placer l'animal en position couchée sur le plat Petri. Enveloppez-le dans des essuie-tout afin que la queue soit exposée.
REMARQUE: Les serviettes en papier sont excellentes pour assurer la stabilité tout au long de la procédure. -
Identifiez les membres postérieurs. Faire la première incision juste caudal pour eux.
- Avec une paire de microscissors, effectuer une incision verticale de la quille jusqu'à ce que la proéminence osseuse des processus spinous se font sentir.
REMARQUE: Soyez très prudent lorsque vous saisissez la quille et la peau avec des forceps, car ceux-ci infligent facilement des dommages à la peau délicate. - Étendre la coupe latéralement, de sorte que l'incision traverse toute la largeur de la queue.
- Saisissez le processus de pointe avec des forceps pour assurer la bonne profondeur.
- Étendre les incisions verticales 1 mm au-dessous du processus de pointe des deux côtés.
- Avec une paire de microscissors, effectuer une incision verticale de la quille jusqu'à ce que la proéminence osseuse des processus spinous se font sentir.
-
Placez l'animal d'un côté pour effectuer des incisions ventrales et horizontales comme indiqué ci-dessous.
- Avec une paire de microscissors, à partir du point ventral de l'incision verticale, faire une incision horizontale d'environ 15 mm pour les animaux 10-20 g de poids. Rendre l'incision plus longue pour les animaux plus grands, et plus courte pour les petits animaux.
- À l'aide des ciseaux, disséquer médialement à travers l'incision horizontale jusqu'à ce que la colonne vertébrale soit ressentie dans la ligne médiane.
- Répétez les étapes 3.3, 3.3.1 et 3.3.2 de l'autre côté de l'animal.
-
Après avoir disséqué dans le plan médial profond des deux côtés, disséquer à travers la ligne médiane, reliant ainsi les deux incisions horizontales.
- Déplacez le morceau libre de la queue et de la quille d'un côté, exposant les processus pieux (Figure 1).
- Fixer le morceau de queue à l'aide d'essuie-tout humide.
-
Placez l'animal dans la position couchée à nouveau avec la tête face au côté non dominant du chirurgien.
- Avec une paire de forceps, saisissez les processus spinous juste caudal aux membres postérieurs. Appliquer un léger ascenseur à la fois vers le haut et vers la tête de l'animal.
- Placez les lames d'une paire de microscissors horizontalement autour du processus et coupez-le doucement. L'ascenseur sur le processus assure qu'il est maintenant enlevé, exposant la moelle épinière.
- Saisissez le processus spinous juste caudal à celui qui vient d'être enlevé et répéter les étapes 3.5.1 et 3.5.2.
REMARQUE: Ceci devrait laisser une moelle épinière exposée correspondant à deux niveaux vertébraux. Lors de l'exécution de la laminectomy, une sécrétion mousseuse blanche apparaît souvent. La moelle épinière est facilement identifiée par son éclat distinctif, avec un vaisseau qui longe la ligne médiane. - Selon la taille de l'animal, la zone exposée peut ne pas être assez large. À l'aide de deux paires de forceps, saisissez les lamelles des deux côtés de la moelle épinière et les tordez latéralement avec un mouvement doux.
4. Introduction d'une blessure de type de contusion (figure 2)
- Gardez l'animal en position couchée.
- Utilisez le plat Petri pour transférer l'animal à l'unité de traumatologie.
- Demandez à un assistant de faire briller une lampe de poche sur la moelle épinière.
- Placez le cylindre de l'unité de traumatologie de contusion au-dessus de la moelle épinière exposée à l'aide des micro-ajusteurs de l'unité. Visez à travers le cylindre.
- Abaissez le cylindre jusqu'à ce qu'il soit à niveau avec le laminage.
- Fixez la tige tombante à l'électroaimant. Placez le cylindre d'ajustement de la hauteur de chute désiré sur l'unité de traumatologie.
- Placez la tige qui tombe dans le cylindre.
REMARQUE: Pour une étude aveugle, le chirurgien doit maintenant quitter la pièce sans savoir si l'animal sera affecté à une blessure ou à un groupe de chirurgie fictive. - Éteignez l'électroaimant. La tige tombe sur la moelle épinière exposée.
- Utilisez la vis d'ajustement de hauteur pour soulever la tige de la moelle épinière.
- Confirmez la blessure en regardant la moelle épinière à travers le microscope. Le site blessé apparaîtra plus sombre, et des saignements du vaisseau de la ligne médiane seront apparents.
5. Présentation d'une blessure brutale
REMARQUE: Effectuez ces étapes après 3.5.4.
- Avec une paire de microscissors couper la moelle épinière dans une coupe verticale parfaite.
- Répéter la coupe de 2 mm sur le côté caudal du corps.
REMARQUE: La longueur du morceau de moelle épinière enlevé peut être ajustée selon l'exigence de l'étude. Cependant, une coupe de 2 mm sera régenerable10. - Assurez-vous que les coupures sont terminées. Une fois terminé, sentir les lames des ciseaux gratter le long de la partie ventrale du canal rachidien.
- Soulevez le morceau de moelle épinière de 2 mm du canal rachidien.
6. Fermeture de la plaie chirurgicale
- Remettre l'animal à la table chirurgicale. Dans une étude aveuglée, repositionner la quille de sorte que la moelle épinière n'est pas visible pour le chirurgien.
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Gardez l'animal en position couchée.
- Commencez à placer 10,0 sutures en nylon de la partie la plus caudale de l'incision horizontale. Fermez les plaies en une seule couche.
REMARQUE: Ne saisissez pas la peau trop serrée, car elle infligera la nécrose. - Travaillez vers la partie verticale de l'incision.
- Lorsque vous atteignez l'angle, tournez le plat Petri et suturez l'autre incision horizontale.
- Définir des sutures sur les incisions verticales.
- Ne placez pas les sutures dans la partie supérieure de la quille, parce que la peau ici ne sera pas en mesure de tenir.
- Commencez à placer 10,0 sutures en nylon de la partie la plus caudale de l'incision horizontale. Fermez les plaies en une seule couche.
7. Retour de l'animal à la solution sans anesthésie
- Soulevez le plat Petri avec l'animal et plongez les deux très doucement dans l'eau douce à seulement 5 cm de profondeur et laissez l'animal glisser.
REMARQUE: La faible profondeur de l'eau garantit que l'animal ne tentera pas de nager jusqu'à la surface pour respirer. - Ne changez pas l'eau pendant la première semaine.
- Lorsque vous nourrissez les animaux, assurez-vous que la nourriture est placée près de la tête de l'animal.
REMARQUE: Le but de ces mesures est d'éviter autant de mouvement que possible au cours de la première semaine.
8. Ultrasons postopératoires
- Avant la fin de l'anesthésie, utilisez un système d'échographie à haute fréquence pour acquérir des images de la blessure qui peuvent être utilisées pour la construction d'images tridimensionnelles du site SCI.
- Attachez le transducteur à un micromanipulateur de préférence régi par un joystick à distance.
- Immerger l'animal anesthésié en position couchée dans un petit récipient rempli de solution anesthésique.
REMARQUE: Fixez l'animal avec des sacs de sable miniatures ou d'autres équipements pour éviter le mouvement pendant la séquence de balayage. - Alignez la pointe du transducteur avec l'axe de longueur de l'animal et plongez-le dans la solution de benzocaïne jusqu'à ce qu'elle ne soit qu'à quelques millimètres au-dessus de la quille derrière les membres postérieurs de l'animal.
- Identifier le site SCI.
REMARQUE: Le site de la blessure est facilement reconnaissable en raison des processus de pieux manquants directement au-dessus de la SCI. - Optimisez l'image en ajustant les réglages de l'échographie. Assurez-vous que le site SCI est au centre de l'image. Ajuster le champ de vision (c.-à-d. profondeur d'image, décalage de profondeur et largeur d'image) pour couvrir le site SCI et les tissus sains adjacents. Ajustez le gain bidimensionnel pour optimiser le contraste d'image.
- En balayant le transducteur d'ultrasons à travers le site SCI avec un micromanipulateur à commande électronique, acquérir des images en mode B couvrant le site SCI à plusieurs emplacements de tranches transversales sagittales, avec des tranches consécutives avec un intervalle intertranche de 50 m. Acquérir des images ciné contenant 500 images avec un taux d'image de 50 images/s et une fréquence de transducteur de 40 MHz.
REMARQUE: Cette configuration nécessite un micromanipulateur électronique régi par un joystick à distance (étape 8.2). - Après avoir terminé la séquence de numérisation retour à l'étape 7.
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Representative Results
Le but du protocole est de produire un SCI qui paralysera le moteur et les fonctions sensorielles caudales à la blessure. Parce que l'axolotl est régénération-compétent, il restaure la fonction en quelques semaines, permettant aux chercheurs d'étudier la régénération du SNC pendant une courte période de temps.
L'anesthésie a été fournie pour 45 min à tous les animaux, et aucun épisode de rétablissement prématuré n'a été éprouvé. Tous les animaux récupérés dans l'heure et n'a montré aucun signe de dommages de l'anesthésie dans les semaines suivantes13,16.
La laminectomie a été couronnée de succès chez tous les animaux. Cependant, la variation anatomique dans la largeur du canal spinal a appelé à l'élargissement du canal utilisant des forceps et une torsion dans quelques individus. En outre, lalame résiduelle chez certaines personnes a empêché la tige tombante d'atteindre sa cible, ce qui rend impératif que le chirurgien nettoyer le champ de l'os résiduel et les proéminences.
La fermeture des incisions a été associée à certaines difficultés, en particulier pendant la phase pilote de l'étude. Les sutures dans la partie supérieure de la quille ne tiendraient pas et ont entraîné des fermetures insuffisantes. La fermeture d'un animal dans l'étude n'a pas tenu, ayant pour résultat la quille étant déchirée, l'infection suivante, et la mort. Cela souligne la nécessité de sutures soigneuse le long des incisions entières.
Les blessures mécaniques initiales étaient évidentes pendant la procédure. Pendant le développement du modèle, des animaux blessés et fictifs ont été tachés d'hématoxylin et d'éosine pour valider la blessure. Les résultats représentatifs de chaque groupe sont présentés à la figure 3A1,A2 et figure 3C1,C2. La régénération a été confirmée par des sections histologiques préparations effectuées après neuf semaines (Figure 3B1,B2 et Figure 3D1,D2), qui a montré une connexion rétablie de la moelle épinière chez les animaux SCI.
Les blessures et la régénération peuvent être suivies par l'examen de la fonction neurologique. Stimuler la queue avec un léger toucher et pincer des forceps révélera si les fonctions sensorielles tactiles et nociceptives ont été perdues et potentiellement rétablies. Un score neurologique a été défini en fonction de la réaction de l'animal : 0 point , pas de réponse, 1 point , mouvement de la queue locale, 2 points , mouvement tronqueux, 3 points - mouvement coordonné des membres et/ou de la tête à côté du mouvement tronqueux, 4 points - animaux avec mouvement rapide coordonné immédiat. Chez six animaux SCI contre cinq animaux fictifs, la perte de la fonction neurologique trois semaines après les blessures a été constatée, et une restauration graduelle dans les neuf semaines(figure 4 et vidéo supplémentaire 1).
Des images ultrasonographiques de la moelle épinière blessée peuvent être obtenues en utilisant le protocole ci-dessus. La visualisation du site SCI a été possible en raison de l'absence évidente de processus osseux et spieux (figure 5). En outre, en utilisant le mode B, l'artère dorsal de la moelle épinière non blessée pourrait être visualisée, donnant un marqueur de l'intégrité du vaisseau.
Il est possible de tester les animaux immédiatement après le réveil. Cependant, quelques animaux ont exprimé la petite amplitude locale, le mouvement répétitif, et rythmique de queue sur la stimulation comparable aux phénomènes de clonus observés dans SCI humain. Ces mouvements pourraient représenter le clonus ou un manque de suppression réflexe centrale et pourraient potentiellement causer plus de dommages à la moelle épinière nouvellement blessée. Par conséquent, le dépistage des animaux n'est pas recommandé avant une semaine après la blessure.
D'après une simple observation qualitative des animaux, il sera évident que la queue est paralysée, et la natation est considérablement inhibée, ce qui rend les animaux complètement dépendants du déplacement de leurs membres. Ces observations valideront également le succès du protocole.
Les IRM de champ élevé (9,4 T) ont été effectuées immédiatement après une blessure pour visualiser la blessure in vivo (figure 6). Cependant, les balayages étaient généralement bas dans le rapport signal-bruit comparé à ceux des animaux non opérés, probablement en raison du saignement et de l'hémosiderin. Par conséquent, il a été conclu que l'IRM était une méthode sous-optimale pour valider la blessure et le succès du protocole.
Figure 1 : Dessin schématique de la laminectomie microchirurgicale. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Dessin schématique du mécanisme de trauma de contusion. (A) L'ensemble de la configuration, montrant la tige tombante au-dessus de l'animal. (B) Le mécanisme démonté, montrant comment la tige est déconnectée de l'électroaimant. (C) La tige tombante est reliée à l'électroaimant. Le cylindre d'ajustement de la hauteur de chute est installé, et l'électroaimant et la tige chargés dans le cylindre. L'ajustement de hauteur de l'ensemble du système est contrôlé par une roue d'ajustement. (D) L'arrêt de l'électroaimant fera tomber la tige sans que l'opérateur ne touche le système. Figure a été initialement publié par Thygesen et al.13. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Sections histologiques hematoxylin et éosin esin souillé immédiatement et neuf semaines après blessure. (A1) SCI animal immédiatement après la blessure. (B1) SCI animal à neuf semaines. (C1) Sham chirurgie animal immédiatement après la blessure. (D1) Sham animal à neuf semaines. Le carré rouge marque la blessure des animaux SCI, et la laminectomy de l'animal faux. Figure 2A, Figure 2B, Figure 2C sont des grossissements de ces zones à 5x. Flèche bleue et moelle épinière non blessée. Ce chiffre a été initialement publié par Thygesen et al.13. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Graphique de la réponse aux stimuli tactiles. La réponse des groupes SCI est plus faible après trois semaines, par rapport au groupe fictif. WPI - semaines après la blessure, ligne noire - SCI, couleur grise - simulacre. Sham n 5, SCI n 6. Figure a été initialement publié par Thygesen et al.13. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Image ultrasonographique montrant la moelle épinière dans une section sagittale. Les lignes jaunes marquent la moelle épinière, le cercle jaune du site de la blessure et les flèches blanches marquent les vertèbres. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : Irm scanne à différents moments après une blessure ou une chirurgie fictive. CSF entourant la moelle épinière manque, particulièrement à trois WPI pour l'animal de SCI, indiquant le gonflement de la moelle épinière. L'assombrissement de la moelle épinière indique également un œdème. Remarquez comment ces changements disparaissent au fur et à mesure que la régénération progresse. Flèche jaune - la zone de laminectomy. Figure a été initialement publié par Thygesen et al.13. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Vidéo supplémentaire 1: Vidéo montrant la fonction neurologique après des stimulus tactiles et plus tard un stimulus nociceptif. D'abord un animal témoin sain, puis un animal souffrant de SCI. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Puisque le risque de blessure à la moelle épinière est significatif, les étapes critiques du protocole sont enlevant les processus pieux et l'élargissement de l'accès osseux au canal spinal si nécessaire. Comme mentionné dans le protocole, l'élimination du processus le plus crânien d'abord est fortement recommandé. Cela signifie que plus les processus caudaux protègent la moelle épinière contre les ciseaux. Il est recommandé d'assurer un accès chirurgical suffisant, c'est-à-dire de ne pas faire une incision primaire trop petite. En outre, lors de la saisie de quoi que ce soit avec des forceps, la direction de la traction appliquée doit toujours être considérée. L'application d'une légère traction de la moelle épinière la protégera en cas de défaillance de la prise et d'un glissement de l'instrument.
La procédure chirurgicale dans l'axolotl n'est pas différente des autres animaux. Cependant, certaines différences importantes existent, principalement attribuables à la composition tissulaire et à la taille de l'animal. La peau de quille d'axolotl est très fragile, et paradoxalement ne guérit pas bien sur de petits dommages infligés pendant l'incision. La prudence doit être prise, en particulier sur les incisions primaires, parce que les dommages compliqueront considérablement la suture. Les os des très jeunes axolotls sont très doux. Cela signifie que souvent les forceps anatomiques de base peuvent suffire dans l'ablation osseuse. Cela présente un autre élément de prudence, parce que pincer les processus spinous pourrait infliger des dommages substantiels. Les couches de fascia sous-cutanée et musculaire ne sont pas disponibles pour la suture, en raison de leurs compositions tissulaires fragiles. Il est impératif d'assurer une semaine postopératoire calme. Les animaux peuvent ne pas se reposer suffisamment après l'opération. Par conséquent, ils peuvent infliger des dommages secondaires à leur moelle épinière postopératoirement. Leur petite anatomie ne permet ni la fixation interne ni spline.
Le poids et la hauteur de chute du système de tige tombant e sont cruciaux pour infliger une blessure de contusion. Au cours d'un pilotage approfondi pour une étude antérieure, le poids de la tige et la hauteur de chute nécessaires se sont avérés être de 25 g et 3 cm13. Cela suffisait à induire la paralysie en axolotls de 12 g sans couper ou désintégrer la moelle épinière. Un poids supplémentaire ou une hauteur de chute peut être nécessaire chez les gros animaux. En outre, le diamètre de la tige tombante pourrait devoir être plus grand dans le cas des plus grands animaux et plus court pour de plus petits animaux.
Le modèle a quelques limites. Puisque les axolotls ne sont pas employés pour des études de comportement apprises, on ne peut pas tester des fonctions neurologiques complexes. La blessure a été introduite caudale aux membres, épargnant les membres postérieurs et l'intestin et la vessie d'être paralysés. La raison en était éthique, de réduire l'impact sur l'animal à un minimum. Cependant, il limite la possibilité d'étudier les effets sur les mouvements des membres, qui peuvent être plus faciles à décrire et à catégoriser. Une grande partie de la morbidité associée à l'ICS provient de la perte de contrôle de l'intestin et de la vessie. Ce modèle ne permet pas de faire des recherches futures dans ces domaines. Il serait possible d'infliger des dommages rostral aux membres postérieurs, mais il n'a pas été tenté.
L'étude de l'ICS dans un modèle régénérateur tel que l'axolotl permet une approche différente dans la recherche SCI. Parce que le modèle animal peut se régénérer, les études d'élimination seront en mesure de révéler des facteurs critiques de régénération. Les études conventionnelles sur l'ICS sont effectuées dans des modèles non régénérateurs, ce qui signifie qu'il faudra intervenir sur tous les facteurs critiques pour induire une réponse régénératrice.
Ce modèle et ce protocole sont en concordance avec le principe de Krogh selon lequel : « Pour un si grand nombre de problèmes, il y aura un animal de choix ou quelques-uns de ces animaux sur lesquels il pourra être étudié le plus commodément »17. La régénération des mammifères est inhibée par de multiples facteurs. L'inhibition de ceux-ci dans un modèle de mammifères n'induit généralement aucun effet. Cependant, l'augmentation des niveaux d'inhibiteurs dans l'axolotl devrait éliminer la régénération, et ainsi révéler si cet inhibiteur est critique ou non10.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Michael Pedersen, Université d'Aarhus pour son expertise et son temps sur l'élaboration de protocoles d'IRM et la mise en place de l'ensemble du projet. Peter Agger, Université d'Aarhus pour son expertise et son temps sur l'élaboration des protocoles d'IRM. Steffen Ringgard, Université d'Aarhus pour son expertise et son temps sur l'élaboration des protocoles d'IRM. Le développement du modèle SCI dans l'axolotl a été aimablement soutenu par la Fondation A.P. Meller Maersk, la Fondation Riisfort, la Fondation Linex et la Fondation ELRO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g - 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| Electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Kimwipes | |||
| Microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring approximately 70 x 55 cm2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
References
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