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अपक्षयी Axolotl में एक Microsurgical Laminectomy के माध्यम से भ्रम स्पाइनल कॉर्ड चोट

Published: October 20, 2019 doi: 10.3791/60337
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 1
1Department of Clinical Medicine, Aarhus University, 2Department of Neurosurgery, Aarhus University Hospital

Summary

इस पांडुलिपि शल्य चिकित्सा नियंत्रित कुंद और तेज रीढ़ की हड्डी एक पुनर्योजी axolotl(Ambystoma mexicanum) को चोट पहुँचाने के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है.

Abstract

इस अध्ययन का उद्देश्य एक्सोटोलट (एम्बीस्टोमा मैक्सिकनम )में एक मानकीकृत और पुन: उत्पादन योग्य कुंद रीढ़ की हड्डी की चोट मॉडल स्थापित करना है। अधिकांश नैदानिक रीढ़ की हड्डी की चोटों उच्च ऊर्जा कुंद आघात के रूप में होते हैं, contusion चोटों को प्रेरित. हालांकि, axolotl रीढ़ की हड्डी में सबसे अधिक अध्ययन तेज आघात के साथ आयोजित किया गया है. इसलिए, इस अध्ययन के लिए एक और अधिक चिकित्सकीय प्रासंगिक पुनर्योजी मॉडल का उत्पादन करना है. लगभग किसी भी ऊतक पुनर्जीवित करने के लिए उनके प्रभावशाली क्षमता के कारण, axolotls व्यापक रूप से पुनर्योजी अध्ययन में मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है और रीढ़ की हड्डी की चोट (SCI) अध्ययन में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है. इस प्रोटोकॉल में, एक्सोलोट्स एक बेंजोकेन समाधान में पनडुब्बी द्वारा एनेस्थेटाइज किए जाते हैं। सूक्ष्मदर्शी के अंतर्गत, एक कोणीय चीरा द्विपक्षीय रूप से पिछले अंगों के लिए केवल पुच्छ स्तर पर किया जाता है। इस चीरा से, यह विच्छेदन और spinous प्रक्रियाओं को बेनकाब करने के लिए संभव है. संद-शिलाऔर का उपयोग करना, एक दो स्तरीय लेमिनेक्टॉमी की जाती है, जो रीढ़ की हड्डी को उजागर करती है। एक सिलेंडर में एक गिरने रॉड से मिलकर एक कस्टम आघात डिवाइस का निर्माण किया है, और इस उपकरण रीढ़ की हड्डी के लिए एक भ्रम चोट प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। चीरों तो सीवन कर रहे हैं, और जानवर संज्ञाहरण से ठीक हो. शल्य चिकित्सा दृष्टिकोण रीढ़ की हड्डी को उजागर करने में सफल होता है। आघात तंत्र रीढ़ की हड्डी के लिए भ्रम चोटों का उत्पादन कर सकते हैं, के रूप में ऊतक विज्ञान, एमआरआई, और तंत्रिका विज्ञान परीक्षा द्वारा की पुष्टि की. अंत में, रीढ़ की हड्डी चोट से पुनर्जीवित करती है। प्रोटोकॉल का महत्वपूर्ण कदम रीढ़ की हड्डी को नुकसान पहुँचाए बिना स्पिनस प्रक्रियाओं को हटा रहा है। इस चरण के लिए एक सुरक्षित प्रक्रिया सुनिश्चित करने के लिए प्रशिक्षण की आवश्यकता है। इसके अलावा, घाव बंद करने के लिए चीरा के दौरान त्वचा को अनावश्यक नुकसान नहीं देने पर अत्यधिक निर्भर है. प्रोटोकॉल 12 जानवरों की एक यादृच्छिक अध्ययन में किया गया था.

Introduction

इस अध्ययन के समग्र लक्ष्य के लिए एक नियंत्रित और reproduible microsurgical विधि axolotl(Ambystoma mexicanum)को कुंद और तेज एससीआई दण्ड के लिए स्थापित किया गया था, एक पुनर्योजी रीढ़ की हड्डी की चोट मॉडल का उत्पादन.

एससीआई एक गंभीर स्थिति है कि, स्तर और सीमा के आधार पर, बिगड़ा मूत्राशय और आंत्र नियंत्रण1,2,3के साथ हिस्सों के लिए तंत्रिका संबंधी विकलांगता infects . अधिकांश एससीआई उच्च ऊर्जा कुंद आघात का परिणाम है जैसे कि यातायात दुर्घटनाएं और गिर जाती है4,5. तेज चोटों बहुत दुर्लभ हैं. इसलिए, सबसे आम स्थूल चोट प्रकार contusions है.

स्तनधारी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) एक गैर-पुनर्योजी ऊतक है, इसलिए एससीआई के बाद स्नायविक ऊतक की कोई बहाली6,7,8देखी जाती है । दूसरी ओर, कुछ जानवरों के ऊतकों को पुनर्जीवित करने के लिए एक पेचीदा क्षमता है, सीएनएस ऊतक सहित. इन जानवरों में से एक एक्सोलोटल है। यह व्यापक रूप से पुनर्योजी जीव विज्ञान के अध्ययन में प्रयोग किया जाता है और रीढ़ की हड्डी के पुनर्जनन में रुचि का है, क्योंकि यह एक कशेरुकी9,10,11,12है .

एक्सोलोटल में अधिकांश एससीआई अध्ययन या तो पूरी पूंछ के विच्छेदन या रीढ़ की हड्डी9,10,11,12के एक बड़े हिस्से के ablation के रूप में प्रदर्शन कर रहे हैं . हाल ही में, एक नया अध्ययन कुंद चोटों पर प्रकाशित किया गया था13 कि नैदानिक स्थितियों बेहतर नकल करता है. जबकि अक्षलोक में पूर्ण परिशिष्ट विच्छेदन पूर्ण पुनर्जनन में परिणाम है, कुछ गैर-एम्प्यूटेशन-आधारित पुनर्योजी घटनाएं महत्वपूर्ण आकार दोष (सीएसडी)14,15पर निर्भर हैं। इसका मतलब यह है कि एक महत्वपूर्ण सीमा से अधिक चोटों पुनर्जीवित नहीं कर रहे हैं. एक उच्च नैदानिक अनुवाद मूल्य के साथ एक पुनर्योजी मॉडल विकसित करने के लिए, इस अध्ययन की जांच की कि क्या एक 2 मिमी कुंद आघात CSD सीमा से अधिक होगा.

इस विधि छोटे पशु मॉडल में रीढ़ की हड्डी पुनर्जनन पर काम कर रहे शोधकर्ताओं के लिए प्रासंगिक है, विशेष रूप से axolotl में. इसके अलावा, यह अधिक सामान्य हित का हो सकता है, क्योंकि यह मानक प्रयोगशाला उपकरण का उपयोग करने के लिए एक कुंद आघात तंत्र है कि सामान्य रूप में छोटे जानवरों में उपयोग के लिए उपयुक्त है विकसित करने का एक तरीका दर्शाती है.

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Protocol

इस अध्ययन के दौरान पशुओं के नैतिक उपयोग से संबंधित सभी लागू संस्थागत और सरकारी विनियमों का पालन किया गया। यह अध्ययन डेनिश पशु प्रयोग निरीक्षक द्वारा अनुमोदन आईडी के तहत किया गया: 2015-15-0201-0061. पशु मैक्सिकन एक्सोलोट्स थे(एम्बीस्टोमा मैक्सिकनम ,मतलब शरीर द्रव्यमान ] एसटीडी: 12.12 ग्राम - 1.25 ग्राम)।

1. तैयारी

  1. संज्ञाहरण के लिए एक्सोलोटल तैयार करें।
    1. उच्च गुणवत्ता वाले गैर रासायनिक इलाज नल के पानी का प्रयोग करें। यदि अनुपलब्ध है, तो 40% Holtfreter के समाधान का उपयोग करें।
    2. एसीटोन के 3 एमएल में एथिल 4-एमिनोबेन्जोएट (बेंजोकेन) की 200 मिलीग्राम घोलें। नल के पानी या 40% Holtfreter के समाधान के 1 एल में इस समाधान को भंग।
  2. एक मानक पेट्री डिश (100 मिमी व्यास में) एक शल्य चिकित्सा तालिका के रूप में एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत रखा का प्रयोग करें। पेट्री डिश पर एक सर्जिकल कपड़ा कपड़ा रखें।
    नोट: एक शल्य क्षेत्र के रूप में एक पेट्री डिश का उपयोग इसे छूने के बिना चलती है और जानवर के रोटेशन में सक्षम बनाता है, सर्जरी के दौरान रीढ़ की हड्डी में स्थिरता सुनिश्चित करने.
  3. सभी बाँझ microsurgical उपकरणों (यानी, कैंची और शारीरिक संदंश) तैयार करें।

2. संज्ञाहरण

  1. गहरी और स्थिर संज्ञाहरण सुनिश्चित करने के लिए लगभग 45 मिनट के लिए बेंजोकेन समाधान के साथ एक कंटेनर में एक्सोलोटल रखें।
    नोट: बेंजोकेन की दी गई एकाग्रता एक्सोलोटॉल के सभी आकारों में संज्ञाहरण का कारण बनेगी।
  2. 30-45 मिनट के भीतर सामान्य संज्ञाहरण के संकेत के लिए जाँच करें. इनमें गिल आंदोलनों की पूरी कमी, सही पलटा, या या तो स्पर्श या दर्दनाक उत्तेजनाओं (पैर की अंगुली वेब की कोमल pinching) की प्रतिक्रिया शामिल है।
  3. संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए, संवेदनाहारी समाधान में गीला कागज तौलिए में जानवरों को लपेटो। शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के दौरान इस समाधान के साथ नियमित रूप से इन गीला करने के लिए सुनिश्चित करें कि त्वचा और gills नम रखा जाता है.
  4. ताजा नल का पानी युक्त एक कंटेनर में रखकर सर्जरी के बाद जानवर को पुनर्प्राप्त करें। वसूली के संकेतों का निरीक्षण करें, जैसे गिल आंदोलन और 1 ज16के भीतर सही पलटा, फिर से प्राप्त किया।

3. माइक्रोसर्जिकल लेमिनेक्टॉमी

नोट: लेमिनेक्टॉमी एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत किया जाता है।

  1. पेट्री डिश पर प्रवण स्थिति में जानवर रखें। इसे कागज के तौलिए में लपेटें ताकि पूंछ को उजागर किया जा सके।
    नोट: कागज तौलिए प्रक्रिया के दौरान स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए उत्कृष्ट हैं।
  2. पिछले अंगों की पहचान करें। पहला चीरा सिर्फ उन्हें caudal बनाओ.
    1. माइक्रोसिकर्स की एक जोड़ी के साथ, कील से एक ऊर्ध्वाधर चीरा प्रदर्शन जब तक spinous प्रक्रियाओं की बोनी प्रमुखता महसूस कर रहे हैं.
      नोट: बहुत सावधान रहना जब forceps के साथ कील और त्वचा को समझ, क्योंकि इन आसानी से नाजुक त्वचा को नुकसान दण्ड.
    2. बाद में कटौती का विस्तार करें, इसलिए चीरा पूंछ की पूरी चौड़ाई को पार करता है।
    3. सही गहराई सुनिश्चित करने के लिए संदंश के साथ स्पिनस प्रक्रिया को ग्राप करें।
    4. ऊर्ध्वाधर चीरों का विस्तार 1 मिमी दोनों पक्षों पर spinous प्रक्रिया के नीचे.
  3. नीचे बताए गए अनुसार अधर और क्षैतिज चीरों को करने के लिए जानवर को एक तरफ रखें।
    1. माइक्रोसिसर की एक जोड़ी के साथ, ऊर्ध्वाधर चीरा के अधर बिंदु से शुरू, वजन में 10-20 ग्राम जानवरों के लिए लगभग 15 मिमी की एक क्षैतिज चीरा बनाते हैं। बड़े जानवरों के लिए अब चीरा बनाओ, और छोटे जानवरों के लिए कम.
    2. कैंची का उपयोग करके, क्षैतिज चीरा के माध्यम से मध्यस्थता को विभाजित करें जब तक कि मध्य रेखा में कशेरुक स्तंभ महसूस नहीं किया जाता है।
    3. 3.3, 3.3.1, और 3.3.2 जानवर के दूसरी ओर कदम दोहराएँ.
  4. दोनों ओर से गहरे मध्य तल में विच्छेदन करने के बाद, मिडलाइन के माध्यम से विच्छेदन, जिससे दो क्षैतिज चीरों को जोड़ने.
    1. पूंछ और कील के मुक्त टुकड़े को एक तरफ ले जाएं, स्पिनस प्रक्रियाओं को उजागर करें (चित्र 1)।
    2. गीले कागज तौलिए का उपयोग कर पूंछ टुकड़ा ठीक करें।
  5. सर्जन के गैर प्रमुख पक्ष का सामना करना पड़ सिर के साथ फिर से प्रवण स्थिति में जानवर प्लेस.
    1. बलप्स की एक जोड़ी के साथ, स्पिनस प्रक्रियाओं को सिर्फ पिछले अंगों को कारण समझें। दोनों ऊपर और जानवर के सिर की ओर एक कोमल लिफ्ट लागू करें.
    2. प्रक्रिया के चारों ओर क्षैतिज microscissors की एक जोड़ी के ब्लेड प्लेस और धीरे से यह कटौती. प्रक्रिया पर लिफ्ट सुनिश्चित करता है कि यह अब हटा दिया जाता है, रीढ़ की हड्डी को उजागर.
    3. स्पिनस प्रक्रिया को सिर्फ एक है कि सिर्फ हटा दिया गया था और दोहराने के कदम 3.5.1 और 3.5.2 करने के लिए पुच्छ.
      नोट: यह एक उजागर रीढ़ की हड्डी दो कशेरुक के स्तर के लिए इसी छोड़ देना चाहिए. जब laminectomy प्रदर्शन, एक सफेद झागदार स्राव अक्सर प्रकट होता है. रीढ़ की हड्डी आसानी से अपनी विशिष्ट चमक से पहचान की है, एक पोत के साथ मिडलाइन के साथ चल रहा है.
    4. जानवर के आकार पर निर्भर करता है, उजागर क्षेत्र काफी व्यापक नहीं हो सकता है. बलप्स के दो जोड़े का उपयोग करके, रीढ़ की हड्डी के दोनों ओर लेमिना को समझें और बाद में एक सौम्य आंदोलन के साथ इन मोड़ लें।

4. एक भ्रम प्रकार चोट का परिचय (चित्र 2)

  1. पशु को प्रवण स्थिति में रखें।
  2. आघात इकाई के लिए पशु हस्तांतरण करने के लिए पेट्री पकवान का प्रयोग करें।
  3. एक सहायक रीढ़ की हड्डी पर एक टॉर्च चमक है।
  4. इकाई पर microadusters का उपयोग कर उजागर रीढ़ की हड्डी के ऊपर contusion आघात इकाई सिलेंडर रखें. सिलेंडर के माध्यम से निशाना लगाओ.
  5. सिलेंडर को तब तक कम करें जब तक कि यह लेमिना के साथ स्तर न हो जाए।
  6. गिरने की छड़ को विद्युत चुंबक से संलग्न करें। आघात इकाई पर वांछित गिरने ऊंचाई समायोजन सिलेंडर रखें।
  7. सिलेंडर में गिरने वाली छड़ रखें।
    नोट: एक अंधे अध्ययन के लिए, सर्जन अब अगर जानवर एक चोट या एक शर्म सर्जरी समूह को सौंपा जाएगा जानने के बिना कमरे में छोड़ देना चाहिए.
  8. विद्युत चुंबक बंद करें. छड़ उजागर रीढ़ की हड्डी पर गिर जाता है।
  9. रीढ़ की हड्डी से छड़ी उठाने के लिए ऊंचाई समायोजन पेंच का उपयोग करें।
  10. माइक्रोस्कोप के माध्यम से रीढ़ की हड्डी को देखकर चोट की पुष्टि करें। घायल स्थल गहरा दिखाई देगा, और मिडलाइन पोत से खून बह रहा स्पष्ट हो जाएगा।

5. एक तेज चोट का परिचय

नोट: 3.5.4 के बाद इन चरणों को पूरा करें।

  1. माइक्रोसिकर्स की एक जोड़ी के साथ एक सही ऊर्ध्वाधर कटौती में रीढ़ की हड्डी में कटौती.
  2. शरीर के पुच्छ पक्ष के लिए कटौती 2 मिमी दोहराएँ.
    नोट: रीढ़ की हड्डी के हटाए गए टुकड़े की लंबाई को अध्ययन आवश्यकता के अनुसार समायोजित किया जा सकता है। हालांकि, एक 2 मिमी कटौती regenerable10हो जाएगा.
  3. सुनिश्चित करें कि कटौती पूरी हो गई है। पूरा होने पर, रीढ़ की हड्डी की नहर के अधर भाग के साथ स्क्रैप कैंची के ब्लेड लग रहा है।
  4. रीढ़ की हड्डी से रीढ़ की हड्डी के 2 मिमी टुकड़ा लिफ्ट.

6. सर्जिकल घाव बंद करना

  1. शल्य चिकित्सा मेज पर जानवर वापस. एक अंधे अध्ययन में, कील की स्थिति तो रीढ़ की हड्डी सर्जन को दिखाई नहीं देता है।
  2. पशु को प्रवण स्थिति में रखें।
    1. क्षैतिज चीरा के सबसे पुच्छ भाग से 10.0 नायलॉन टांके रखने शुरू करें। एक परत में घावबंद करें।
      नोट: त्वचा बहुत तंग समझ नहीं है, क्योंकि यह परिगलन दण्ड होगा.
    2. चीरा के ऊर्ध्वाधर भाग की दिशा में कार्य करें।
    3. कोण तक पहुँचने पर, पेट्री डिश की बारी है और अन्य क्षैतिज चीरा सीवन।
    4. ऊर्ध्वाधर चीरों पर टांके सेट करें।
    5. कील के ऊपरी हिस्से में टांके न रखें, क्योंकि यहां की त्वचा पकड़ नहीं पाएगी।

7. एनेस्थेटिक मुक्त समाधान के लिए पशु रिटर्निंग

  1. पशु के साथ पेट्री पकवान लिफ्ट और दोनों बहुत धीरे से ताजा पानी में डूब केवल 5 सेमी गहरी और जानवर बंद स्लाइड.
    नोट: उथले पानी की गहराई यह सुनिश्चित करती है कि जानवर साँस लेने के लिए सतह पर तैरने का प्रयास नहीं करेगा।
  2. पहले सप्ताह के दौरान पानी न बदलें।
  3. जानवरों को खिलाते समय, यह सुनिश्चित करें कि भोजन जानवर के सिर के पास रखा गया है।
    नोट: इन उपायों का उद्देश्य पहले सप्ताह के दौरान जितना संभव हो उतना आंदोलन से बचने के लिए है।

8. पोस्टऑपरेटिव अल्ट्रासाउंड

  1. संज्ञाहरण की समाप्ति से पहले, चोट है कि SCI साइट के तीन आयामी छवियों के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की छवियों को प्राप्त करने के लिए एक उच्च आवृत्ति अल्ट्रासाउंड प्रणाली का उपयोग करें।
  2. एक micromanipulator अधिमानतः एक दूरस्थ जॉयस्टिक द्वारा नियंत्रित करने के लिए ट्रांसड्यूसर संलग्न करें।
  3. एनेस्थेटिक समाधान से भरे एक छोटे कंटेनर में प्रवण स्थिति में एनेस्थेटाइज्ड जानवर को जलमग्न करें।
    नोट: स्कैनिंग अनुक्रम के दौरान आंदोलन से बचने के लिए लघु sandbags या अन्य उपकरणों के साथ जानवर को ठीक करें।
  4. पशु की लंबाई अक्ष के साथ ट्रांसड्यूसर की नोक संरेखित करें और इसे बेंजोकेन समाधान में डुबोएं जब तक कि यह जानवर के पिछले अंगों के पीछे कील के ऊपर केवल कुछ मिलीमीटर है।
  5. SCI साइट की पहचान करें.
    नोट: चोट साइट आसानी से SCI के ऊपर सीधे लापता spinous प्रक्रियाओं के कारण पहचानने योग्य है.
  6. अल्ट्रासाउंड सेटिंग्स का समायोजन करके छवि का अनुकूलन। सुनिश्चित करें कि SCI साइट छवि के केंद्र में है. एससीआई साइट और आसन्न स्वस्थ ऊतक को कवर करने के लिए दृश्य (यानी, छवि गहराई, गहराई ऑफसेट, और छवि चौड़ाई) के क्षेत्र को समायोजित करें। छवि कंट्रास्ट ऑप्टिमाइज़ करने के लिए द्वि-आयामी लाभ समायोजित करें.
  7. एक इलेक्ट्रॉनिक संचालित micromanipulator के साथ SCI साइट भर में अल्ट्रासाउंड ट्रांसड्यूसर व्यापक करके, एक interslice अंतराल के साथ लगातार स्लाइस के साथ, कई sagital पार अनुभागीय टुकड़ा स्थानों पर SCI साइट को कवर बी-मोड छवियों प्राप्त 50 डिग्री उ का चित्र प्राप्त करें जिसमें 500 फ्रेमों की फ्रेम दर और 40 मेगाहर्ट्ज की ट्रांसड्यूसर आवृत्ति होती है।
    नोट: इस सेटअप एक इलेक्ट्रॉनिक micromanipulator एक दूरस्थ जॉयस्टिक (चरण 8.2) द्वारा नियंत्रित की आवश्यकता है.
  8. स्कैनिंग अनुक्रम चरण 7 पर लौटने के बाद।

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Representative Results

प्रोटोकॉल का उद्देश्य एक एससीआई का उत्पादन करना है जो चोट के लिए मोटर और संवेदी कार्यों को कैडल को पंगु कर देगा। क्योंकि axolotl पुनर्जनन-सक्षम है यह सप्ताह के भीतर समारोह restores, शोधकर्ताओं को एक कम समय अवधि के दौरान सीएनएस पुनर्जनन का अध्ययन करने की अनुमति.

संज्ञाहरण सभी जानवरों के लिए 45 मिनट के लिए प्रदान की गई थी, और अपरिपक्व वसूली का कोई एपिसोड अनुभव किया गया. सभी जानवरों को एक घंटे के भीतर ठीक हो गया और अगले सप्ताह13,16में संज्ञाहरण से कोई नुकसान नहीं हुआ .

laminectomy सभी जानवरों में सफल रहा था. तथापि, रीढ़ की हड्डी की चौड़ाई में शारीरिक भिन्नता ने बलप्स का उपयोग करके नहर को चौड़ा करने और कुछ व्यक्तियों में एक मोड़ का आह्वान किया। इसके अलावा, कुछ व्यक्तियों में अवशिष्ट लेमिना ने गिरने वाली छड़ को अपने लक्ष्य तक पहुंचने से रोका, इसलिए यह जरूरी हो गया कि सर्जन अवशिष्ट हड्डी और प्रमुखता से क्षेत्र को साफ करे।

चीरों को बंद करना कुछ कठिनाइयों के साथ जुड़ा हुआ था, विशेष रूप से अध्ययन के संचालन चरण के दौरान। कील के शीर्ष भाग में Sutures पकड़ नहीं होगा और अपर्याप्त closures के परिणामस्वरूप. अध्ययन में एक जानवर के बंद होने पर रोक नहीं लगा, जिसके परिणामस्वरूप कील फटी जा रही थी, बाद में संक्रमण हुआ था, और मृत्यु हो गई थी। यह पूरे चीरों के साथ सावधान suturing के लिए की जरूरत पर जोर दिया.

प्रक्रिया के दौरान प्रारंभिक यांत्रिक चोटों स्पष्ट थे. मॉडल विकास के दौरान, घायल और शर्म जानवरों hematoxylin और eosin के साथ दाग के लिए चोट को मान्य किया गया. प्रत्येक समूह के प्रतिनिधि परिणाम चित्र 3ए1,ए2 और चित्र 3सी1,सी2में दिखाए गए हैं। पुनर्जनन की पुष्टि हिस्टोलॉजिकल सेक्शन की तैयारी द्वारा नौ सप्ताह के बाद की गई थी (चित्र 3बी 1 ,बी2 और चित्र 3डी 1, डी2) जो एससीआई जानवरों में रीढ़ की हड्डी का एक पुन: स्थापित संबंध दिखाता है।

चोट और पुनर्जनन स्नायविक समारोह की जांच द्वारा पीछा किया जा सकता है. एक हल्के स्पर्श के साथ पूंछ उत्तेजक और संदंश से pinching पता चलता है कि क्या स्पर्श और nociceptive संवेदी कार्यों खो दिया है और संभावित रूप से स्थापित किया गया है. एक स्नायविक स्कोर जानवर की प्रतिक्रिया के आधार पर परिभाषित किया गया था: 0 बिंदु - कोई प्रतिक्रिया नहीं, 1 अंक - स्थानीय पूंछ आंदोलन, 2 अंक - truncal आंदोलन, 3 अंक - अंगों के समन्वित आंदोलन और / तत्काल समन्वित तेजी से आंदोलन. छह SCI जानवरों बनाम पांच शर्म जानवरों में स्नायविक समारोह के नुकसान तीन सप्ताह के बाद चोट पाया गया था, और नौ सप्ताह के भीतर एक क्रमिक बहाली (चित्र 4 और अनुपूरक वीडियो 1) .

उपरोक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करके घायल रीढ़ की हड्डी की अल्ट्रासोनोग्राफिक छवियों को प्राप्त किया जा सकता है। SCI साइट को विज़ुअलाइज़ करना बोनी स्पिनस प्रक्रियाओं की स्पष्ट कमी के कारण संभव था (चित्र 5) । इसके अलावा, बी-मोड का उपयोग करunized रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय धमनी कल्पना की जा सकती है, पोत अखंडता के एक मार्कर उपज.

यह reawakening पर तुरंत जानवरों का परीक्षण करने के लिए संभव है। तथापि, कुछ जंतुओं ने मानव SCI में पाई जाने वाली क्लोनस परिघटनाओं की तुलना उत्तेजना पर स्थानीय छोटे आयाम, दोहराव, और लयबद्ध पुच्छ गति को व्यक्त किया। इन आंदोलनों क्लोनस या केंद्रीय पलटा दमन की कमी का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं और संभावित रूप से नए घायल रीढ़ की हड्डी को और अधिक नुकसान हो सकता है. इसलिए, जानवरों का परीक्षण एक सप्ताह के बाद चोट से पहले की सिफारिश नहीं है.

जानवरों के सरल गुणात्मक अवलोकन से, यह स्पष्ट हो जाएगा कि पूंछ लकवाग्रस्त है, और तैराकी काफी बाधित है, जिससे जानवर पूरी तरह से उनके अंगों को हिलाने पर निर्भर हैं। इन अवलोकनों को भी प्रोटोकॉल की सफलता मान्य होगी।

उच्च क्षेत्र एमआरआई स्कैन (9.4 टी) विवो में चोट की कल्पना करने के लिए चोट के तुरंत बाद प्रदर्शन किया गया(चित्र 6)। हालांकि, स्कैन आम तौर पर गैर संचालित जानवरों के उन लोगों की तुलना में संकेत करने के लिए शोर अनुपात में कम थे, खून बह रहा है और hemosiderin के कारण होने की संभावना. इसलिए, यह निष्कर्ष निकाला गया था कि एमआरआई चोट और प्रोटोकॉल की सफलता को मान्य करने के लिए एक suboptimal विधि थी.

Figure 1
चित्रा 1: माइक्रोसर्जिकल लेमिनेक्टॉमी का योजनाबद्ध ड्राइंग। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: contusion आघात तंत्र के Schematic ड्राइंग. (ए) पूरी व्यवस्था, जानवर के ऊपर गिरने की छड़ी दिखा. (इ)विसंयोजित तंत्र, यह दर्शाता है कि छड़ को विद्युतचुंबक से किस प्रकार काट दिया जाता है। (ग) गिरने वाली छड़ विद्युत चुंबक से जुड़ी होती है। गिरने ऊंचाई समायोजन सिलेंडर स्थापित किया गया है, और विद्युत चुंबक और रॉड सिलेंडर में भरी हुई है। पूरे सिस्टम की ऊंचाई समायोजन एक समायोजन पहिया द्वारा नियंत्रित किया जाता है. (घ) विद्युत चुंबक को बंद करने से छड़ बिना प्रचालक के बिना गिर जाएगी। चित्रा मूल रूप से Thygesen एट अल द्वारा प्रकाशित किया गया था13. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: हिस्टोलॉजिकल वर्गों hematoxylin और eosin तुरंत दाग और नौ सप्ताह के बाद चोट. (ए 1) चोट के तुरंत बाद एससीआई जानवर। (बी 1) नौ सप्ताह में SCI जानवर. (C1) चोट के तुरंत बाद शाम सर्जरी जानवर। (डी 1) नौ सप्ताह में शाम जानवर. लाल वर्ग - SCI जानवरों की चोट के निशान, और शर्म जानवर के laminectomy. चित्र 2ए, चित्र 2ठ, चित्र 2ब् इन क्षेत्रों के 5x पर आवर्धन हैं। नीला तीर - unnizured रीढ़ की हड्डी. यह आंकड़ा मूल रूप से Thygesen एट अल13द्वारा प्रकाशित किया गया था . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: स्पर्श उद्दीपकों की अनुक्रिया का ग्राफ। एससीआई समूहों की प्रतिक्रिया तीन सप्ताह के बाद कम है, शर्म समूह की तुलना में. WPI - सप्ताह के बाद चोट, काली रेखा - SCI, ग्रे रंग - शर्म. शम द ] 5, SCI n ] 6. चित्रा मूल रूप से Thygesen एट अल द्वारा प्रकाशित किया गया था13. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: Ultrasonographic छवि एक sagittal अनुभाग में रीढ़ की हड्डी दिखा. पीले रंग की रेखाएं रीढ़ की हड्डी, पीले वृत्त को चोट स्थल के रूप में चिह्नित करती हैं, और सफेद तीर रीढ़ की हड्डी को चिह्नित करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: एमआरआई चोट या शर्म सर्जरी के बाद अलग अलग समय अंक पर स्कैन करता है। रीढ़ की हड्डी के आसपास सीएसएफ की कमी है, विशेष रूप से SCI जानवर के लिए तीन डब्ल्यूपीआई पर, रीढ़ की हड्डी की सूजन का संकेत. रीढ़ की हड्डी का गहरा होने से एडीमा भी संकेत मिलता है। सूचना कैसे इन परिवर्तनों के रूप में पुनर्जनन की प्रगति गायब हो जाते हैं. पीला तीर - laminectomy के क्षेत्र. चित्रा मूल रूप से Thygesen एट अल द्वारा प्रकाशित किया गया था13. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक वीडियो 1: वीडियो स्पर्श उत्तेजनाओं के बाद तंत्रिका संबंधी समारोह दिखा रहा है और बाद में एक nociceptive उत्तेजना. पहले एक स्वस्थ नियंत्रण जानवर, और फिर एक जानवर SCI से पीड़ित. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

क्योंकि रीढ़ की हड्डी में चोट का खतरा महत्वपूर्ण है, प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण कदम spinous प्रक्रियाओं को हटा रहे हैं और रीढ़ की हड्डी के लिए बोनी का उपयोग को चौड़ा अगर जरूरत है. प्रोटोकॉल में उल्लेख के रूप में, सबसे कपाल प्रक्रिया को हटाने पहले अत्यधिक की सिफारिश की है. इसका मतलब यह होगा कि अधिक पुच्छ प्रक्रियाएं रीढ़ की हड्डी को कैंची से प्रभावित होने से बचाती हैं। यह पर्याप्त शल्य चिकित्सा का उपयोग सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की है, जिसका अर्थ है बहुत छोटा एक प्राथमिक चीरा नहीं बनाने के लिए. इसके अलावा, जब forceps के साथ कुछ भी समझ, लागू पुल की दिशा हमेशा विचार किया जाना चाहिए. रीढ़ की हड्डी से दूर एक कोमल पुल लागू समझ असफल होने और साधन की एक पर्ची की स्थिति में यह रक्षा करेगा.

एक्सोलोटल में शल्य चिकित्सा प्रक्रिया अन्य जानवरों से अलग नहीं है। हालांकि, कुछ महत्वपूर्ण मतभेद मौजूद हैं, मुख्य रूप से ऊतक संरचना और जानवर के आकार के कारण। एक्सोलोटल कील त्वचा बहुत नाजुक है, और विडंबना यह है कि चीरा के दौरान दिए गए छोटे नुकसान पर अच्छी तरह से ठीक नहीं होता है। सावधानी, विशेष रूप से प्राथमिक चीरों पर लिया जाना चाहिए, क्योंकि नुकसान काफी हद तक suturing जटिल हो जाएगा. बहुत युवा एक्सोलोट्स की हड्डियां बहुत नरम होती हैं। इसका मतलब यह है कि अक्सर बुनियादी शारीरिक संदंश हड्डी हटाने में पर्याप्त हो सकता है. यह सावधानी का एक और तत्व प्रस्तुत करता है, क्योंकि spinous प्रक्रियाओं pinching काफी नुकसान हो सकता है. उनके नाजुक ऊतक रचनाओं के कारण, subcutaneous और मांसपेशी फासिया परतों suturing के लिए उपलब्ध नहीं हैं. यह एक शांत पश्चात सप्ताह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है. ऑपरेशन के बाद जानवर पर्याप्त रूप से आराम नहीं कर सकते हैं। इसलिए, वे बाद में अपनी रीढ़ की हड्डी को माध्यमिक क्षति दे सकते हैं। उनके छोटे शरीर रचना विज्ञान न तो आंतरिक और न ही spline निर्धारण के लिए अनुमति नहीं है.

वजन और गिरने रॉड प्रणाली के गिरने ऊंचाई एक भ्रम चोट पहुँचाने के लिए महत्वपूर्ण है. पहले के अध्ययन के लिए व्यापक संचालन के दौरान छड़ के वजन और गिरने की ऊंचाई 25 ग्राम और 3 बउ13पाई गई। यह रीढ़ की हड्डी को काटने या बिखर के बिना 12 ग्राम axolotls में पक्षाघात प्रेरित करने के लिए पर्याप्त था। जोड़ा वजन या गिरने ऊंचाई बड़ा जानवरों में की जरूरत हो सकती है. इसके अलावा, गिरने रॉड के व्यास के लिए बड़ा जानवरों के मामले में बड़ा और छोटे जानवरों के लिए छोटे होने की आवश्यकता हो सकती है.

मॉडल की कुछ सीमाएँ हैं। क्योंकि axolotls सीखा व्यवहार अध्ययन के लिए उपयोग नहीं कर रहे हैं, एक जटिल तंत्रिका विज्ञान कार्यों का परीक्षण नहीं कर सकते. चोट को अंगों में पुच्छ ाला दिया गया था, जिससे पिछले अंगों और आंत और मूत्राशय को लकवा मार जाने से बचा जा सकता था। इस के लिए कारण नैतिक था, एक न्यूनतम करने के लिए पशु पर प्रभाव को कम करने के लिए. हालांकि, यह अंग आंदोलनों पर प्रभाव का अध्ययन करने के अवसर को सीमित करता है, जो वर्णन और वर्गीकृत करने के लिए आसान हो सकता है। SCI-संबद्ध रुग्णता का एक बड़ा हिस्सा आंत्र और मूत्राशय के नियंत्रण के नुकसान से उपजी है. यह मॉडल इन क्षेत्रों में भावी शोध के लिए अनुमति नहीं देता है. पिछले अंगों को नुकसान रोस्ट्रल को नुकसान पहुंचाना संभव होगा, लेकिन यह प्रयास नहीं किया गया था।

इस तरह के एक्सालोटल के रूप में एक पुनर्योजी मॉडल में एससीआई का अध्ययन SCI अनुसंधान में एक अलग दृष्टिकोण के लिए अनुमति देता है. क्योंकि पशु मॉडल पुनर्जीवित कर सकते हैं, उन्मूलन अध्ययन पुनर्जनन के महत्वपूर्ण कारकों को प्रकट करने में सक्षम हो जाएगा. SCI पर पारंपरिक अध्ययन गैर-पुनर्योजी मॉडल में प्रदर्शन कर रहे हैं, जिसका अर्थ है कि एक एक पुनर्योजी प्रतिक्रिया प्रेरित करने के लिए सभी महत्वपूर्ण कारकों पर हस्तक्षेप करने की आवश्यकता होगी.

इस मॉडल और प्रोटोकॉल Krogh के सिद्धांत के साथ सामंजस्य में हैं बताते हुए कि: "समस्याओं की इतनी बड़ी संख्या के लिए वहाँ पसंद के कुछ जानवर या कुछ ऐसे जानवरों जिस पर यह सबसे आसानी से अध्ययन किया जा सकता है"17. मैमलेशियन पुनर्जनन कई कारकों से बाधित है। एक स्तनधारी मॉडल में इन बाधा आमतौर पर किसी भी प्रभाव पैदा नहीं करता है. हालांकि, एक्सालोटोल में अवरोधकों के बढ़ते स्तर को पुनर्जनन को समाप्त करना चाहिए, और इस प्रकार यह पता चलता है कि अवरोधक महत्वपूर्ण है या नहीं10।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

माइकल Pedersen, अपनी विशेषज्ञता और एमआरआई प्रोटोकॉल के विकास और पूरी परियोजना की स्थापना पर समय के लिए Aarhus विश्वविद्यालय. पीटर Agger, अपनी विशेषज्ञता और एमआरआई प्रोटोकॉल के विकास पर समय के लिए Aarhus विश्वविद्यालय. Steffen Ringgard, अपनी विशेषज्ञता और एमआरआई प्रोटोकॉल के विकास पर समय के लिए Aarhus विश्वविद्यालय. Axolotl में SCI मॉडल के विकास कृपया A.P. M$ller Maersk फाउंडेशन, Riisfort फाउंडेशन, Linex फाउंडेशन, और ELRO फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25 g custom falling rod custom home made
30 mm PVC pipe custom home made
Acetone Sigma-Aldrich 67-64-1 Propanone
Axolotl (Ambystoma mexicanum) Exoterra GmbH N/A 12-22 cm and 10 g - 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP)
Benzocain Sigma-Aldrich 94-09-7 ethyl 4-aminobenzoate
Electromaget custom home made
Excel 2010 Microsoft N/A Excel 2010 or newer
ImageJ National Institutes of Health ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Kimwipes
Microsurgical instruments N/A N/A Forceps and scissors
MS550s Fujifilm, Visualsonics MS550s 40 MHz center frequency, transducer
MS700 Fujifilm, Visualsonics MS700 50 MHz center frequency, transducer
Petri dish any maker
Soft cloth N/A N/A Any piece of soft cloth measuring approximately 70 x 55 cm2 e.g. a dish towel
Stereo microscope
Vevo 2100 Fujifilm, Visualsonics Vevo 2100 High frequency ultrasound system

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References

  1. Shavelle, R. M., DeVivo, M. J., Brooks, J. C., Strauss, D. J., Paculdo, D. R. Improvements in Long-Term Survival After Spinal Cord Injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96 (4), 645-651 (2015).
  2. Hicken, B. L., Putzke, J. D., Richards, J. S. Bladder management and quality of life after spinal cord injury. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 80 (12), 916-922 (2001).
  3. Levi, R., Hultling, C., Nash, M. S., Seiger, A. The Stockholm spinal cord injury study: 1. Medical problems in a regional SCI population. Paraplegia. 33 (6), 308-315 (1995).
  4. Bjornshave Noe, B., Mikkelsen, E. M., Hansen, R. M., Thygesen, M., Hagen, E. M. Incidence of traumatic spinal cord injury in Denmark, 1990-2012: a hospital-based study. Spinal Cord. 53 (6), 436-440 (2015).
  5. Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A., Fehlings, M. G. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clinical Epidemiology. 6, 309-331 (2014).
  6. Aguayo, A. J., et al. Degenerative and regenerative responses of injured neurons in the central nervous system of adult mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 331 (1261), 337-343 (1991).
  7. Aguayo, A. J., Bjorklund, A., Stenevi, U., Carlstedt, T. Fetal mesencephalic neurons survive and extend long axons across peripheral nervous system grafts inserted into the adult rat striatum. Neuroscience Letters. 45 (1), 53-58 (1984).
  8. Richardson, P. M., Issa, V. M., Aguayo, A. J. Regeneration of long spinal axons in the rat. Journal of Neurocytology. 13 (1), 165-182 (1984).
  9. Butler, E. G., Ward, M. B. Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae. Journal of Experimental Zoology. 160 (1), 47-65 (1965).
  10. Diaz Quiroz, J. F., Tsai, E., Coyle, M., Sehm, T., Echeverri, K. Precise control of miR-125b levels is required to create a regeneration-permissive environment after spinal cord injury: a cross-species comparison between salamander and rat. Disease Model Mechanisms. 7 (6), 601-611 (2014).
  11. Clarke, J. D., Alexander, R., Holder, N. Regeneration of descending axons in the spinal cord of the axolotl. Neuroscience Letters. 89 (1), 1-6 (1988).
  12. McHedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the central nervous system during salamander tail regeneration from the implanted neurospheres. Methods of Molecular Biology. 916, 197-202 (2012).
  13. Thygesen, M. M., et al. A clinically relevant blunt spinal cord injury model in the regeneration competent axolotl (Ambystoma mexicanum) tail. Experimental Therapeutic Medicine. 17 (3), 2322-2328 (2019).
  14. Goss, R. J. Principles of Regeneration. , Academic Press. New York. (1969).
  15. Hutchison, C., Pilote, M., Roy, S. The axolotl limb: a model for bone development, regeneration and fracture healing. Bone. 40 (1), 45-56 (2007).
  16. Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration (Oxford). 4 (3), 124-131 (2017).
  17. Krogh, A. The Progress of Physiology. The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).

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चिकित्सा अंक 152 रीढ़ की हड्डी की चोट आघात पुनर्जनन एक्सोलोटल माइक्रोसर्जरी अल्ट्रासोनोग्राफी
अपक्षयी Axolotl में एक Microsurgical Laminectomy के माध्यम से भ्रम स्पाइनल कॉर्ड चोट
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Thygesen, M. M.,… More

Thygesen, M. M., Guldbæk-Svensson, F., Rasmussen, M. M., Lauridsen, H. Contusion Spinal Cord Injury via a Microsurgical Laminectomy in the Regenerative Axolotl. J. Vis. Exp. (152), e60337, doi:10.3791/60337 (2019).

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