Summary
Questo manoscritto presenta protocolli per infliggere chirurgicamente le lesioni del midollo spinale smussate e taglienti controllate ad un axolotl rigenerativo (Ambystoma mexicanum).
Abstract
Lo scopo di questo studio è quello di stabilire un modello di lesione del midollo spinale smussato rigenerativo standardizzato e riproducibile nell'axolotl (Ambystoma mexicanum). La maggior parte delle lesioni cliniche del midollo spinale si verificano come traumi contundenti ad alta energia, inducendo lesioni da contusione. Tuttavia, la maggior parte degli studi nel midollo spinale axolotl sono stati condotti con traumi acuti. Pertanto, questo studio mira a produrre un modello rigenerativo più rilevante dal punto di vista clinico. A causa della loro impressionante capacità di rigenerare quasi tutti i tessuti, gli axolotl sono ampiamente utilizzati come modelli negli studi rigenerativi e sono stati ampiamente utilizzati negli studi sulle lesioni del midollo spinale (SCI). In questo protocollo, gli assilotls sono anestesizzati da un'immersione in una soluzione di benzocaina. Al microscopio, un'incisione angolare viene fatta bilateralmente ad un livello semplicemente caudale agli arti posteriori. Da questa incisione, è possibile sezionare ed esporre i processi spinosi. Utilizzando pinze e forbici, viene eseguita una laminectomia a due livelli, esponendo il midollo spinale. Viene costruito un dispositivo traumatologico personalizzato costituito da una canna che cade in un cilindro, e questo dispositivo viene utilizzato per indurre una lesione di contusione al midollo spinale. Le incisioni vengono poi suturate e l'animale recupera dall'anestesia. L'approccio chirurgico è riuscito a esporre il midollo spinale. Il meccanismo del trauma può produrre lesioni da contusione al midollo spinale, come confermato da istologia, risonanza magnetica, ed esame neurologico. Infine, il midollo spinale si rigenera dalla lesione. La fase critica del protocollo è la rimozione dei processi spinosi senza infliggere danni al midollo spinale. Questo passaggio richiede una formazione per garantire una procedura sicura. Inoltre, la chiusura delle ferite dipende fortemente dal non infliggere danni inutili alla pelle durante l'incisione. Il protocollo è stato eseguito in uno studio randomizzato di 12 animali.
Introduction
L'obiettivo generale di questo studio era quello di stabilire un metodo microchirurgico controllato e riproducibile per infliggere SCI contundente e tagliente all'axolotl (Ambystoma mexicanum), producendo un modello di lesione del midollo spinale rigenerativo.
La SCI è una condizione grave che, a seconda del livello e dell'estensione, infligge disabilità neurologiche alle estremità insieme a un controllo alterato della vescica e dell'intestino1,2,3. La maggior parte delle SCI sono il risultato di traumi contundenti ad alta energia come incidenti stradali e cadute4,5. Le lesioni taglienti sono molto rare. Pertanto, il tipo di lesione macroscopica più comune è contusioni.
Il sistema nervoso centrale dei mammiferi (CNS) è un tessuto non rigenerativo, quindi nessun ripristino del tessuto neurologico seguito a SCI è visto6,7,8. D'altra parte, alcuni animali hanno un'intrigante capacità di rigenerare i tessuti, tra cui il tessuto CNS. Uno di questi animali è l'axolotl. È ampiamente usato negli studi di biologia rigenerativa ed è di interesse nella rigenerazione del midollo spinale, perché è un vertebrato9,10,11,12.
La maggior parte degli studi SCI nell'axolotl vengono eseguiti come amputazione dell'intera coda o ablazione di una parte più grande del midollo spinale9,10,11,12. Recentemente, è stato pubblicato un nuovo studio sulle lesioni contundenti13 che imitano meglio le situazioni cliniche. Mentre l'amputazione completa dell'appendice nell'axolotl comporta una rigenerazione completa, alcuni fenomeni rigenerativi non basati sull'amputazione dipendono dal difetto di dimensione critica (CSD)14,15. Ciò significa che le lesioni che superano una soglia critica non vengono rigenerate. Per sviluppare un modello rigenerativo con un valore traslazionale clinico più elevato, questo studio ha studiato se un trauma contundente di 2 mm supererebbe il limite di CSD.
Questo metodo è rilevante per i ricercatori che lavorano sulla rigenerazione del midollo spinale in piccoli modelli animali, in particolare nell'axolotl. Inoltre, può essere di interesse più generale, perché presenta un modo di utilizzare attrezzature di laboratorio standard per sviluppare un meccanismo di trauma contundente che è adatto per l'uso in piccoli animali in generale.
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Protocol
Nel corso dello studio sono state seguite tutte le normative istituzionali e governative applicabili relative all'uso etico degli animali. Lo studio è stato condotto con l'id di approvazione: 2015-15-0201-0061 dall'Ispettorato danese per gli esperimenti sugli animali. Gli animali erano assolotl messicani (Ambystoma mexicanum, massa corporea media : STD: 12,12 g 1,25 g).
1. Preparazione
-
Preparare axolotl per l'anestesia.
- Utilizzare acqua del rubinetto non trattata chimicamente di alta qualità. Se non è disponibile, utilizzare la soluzione di 40% Holtfreter.
- Sciogliere 200 mg di etilo 4-aminobenzoato (benzocaina) in 3 mL di acetone. Sciogliere questa soluzione in 1 L di acqua di rubinetto o al 40% di quella di Holtfreter.
- Utilizzare un piatto Petri standard (100 mm di diametro) posto sotto un microscopio stereo come tavolo chirurgico. Posizionare un panno tessile chirurgico sul piatto Petri.
NOT: L'utilizzo di una parabola Petri come area chirurgica consente lo spostamento e la rotazione dell'animale senza toccarlo, garantendo la stabilità spinale durante l'intervento chirurgico. - Preparare tutti gli strumenti microchirurgici sterili (ad esempio, forbici e pinze anatomiche).
2. Anestesia
- Mettere l'axolotl in un contenitore con soluzione di benzocaina per circa 45 min per garantire un'anestesia profonda e stabile.
NOT: La concentrazione data di benzocaina causerà anestesia in tutte le dimensioni di axolotls. - Verificare la presenza di segni di anestesia generale entro 30-45 min. Questi includono una completa mancanza di movimenti branchiali, rettidamento riflesso, o risposta a stimoli tattili o dolorosi (pizzicamento delicato della tela delle dita dei piedi).
- Per mantenere l'anestesia, avvolgere gli animali in asciugamani di carta bagnati nella soluzione anestetica. Seccoli regolarmente con questa soluzione durante la procedura chirurgica per garantire che la pelle e le branchie siano mantenute umide.
- Recuperare l'animale dopo l'intervento mettendolo in un contenitore contenente acqua di rubinetto fresca. Osservare i segni di recupero, come il movimento delle branchie e il riflesso di radderamento riacquistato, entro 1 h16.
3. Microchirurgica Laminectomia
NOT: La laminectomia viene eseguita sotto uno stereoscopio.
- Posizionare l'animale in posizione prona sul piatto Petri. Avvolgerlo in asciugamani di carta in modo che la coda sia esposta.
NOT: Gli asciugamani di carta sono eccellenti per garantire la stabilità durante tutta la procedura. -
Identificare gli arti posteriori. Fare la prima incisione appena caudale a loro.
- Con un paio di microscisors, eseguire un'incisione verticale dalla chiglia fino a quando si avverte la prominenza ossea dei processi spinosi.
NOT: Fare molta attenzione quando si afferra la chiglia e la pelle con pinze, perché questi infliggono facilmente danni alla pelle delicata. - Estendere il taglio lateralmente, in modo che l'incisione attraversi l'intera larghezza della coda.
- Afferra il processo spinoso con pinze per garantire la giusta profondità.
- Estendere le incisioni verticali di 1 mm sotto il processo spinoso su entrambi i lati.
- Con un paio di microscisors, eseguire un'incisione verticale dalla chiglia fino a quando si avverte la prominenza ossea dei processi spinosi.
-
Posizionare l'animale su un lato per eseguire incisioni ventrali e orizzontali come indicato di seguito.
- Con un paio di microscissori, a partire dal punto ventrale dell'incisione verticale, fare un'incisione orizzontale di circa 15 mm per gli animali 10-20 g di peso. Rendere l'incisione più lunga per gli animali più grandi e più breve per gli animali più piccoli.
- Usando le forbici, sezionare mediamente attraverso l'incisione orizzontale fino a quando la colonna vertebrale si sente nella linea mediana.
- Ripetere i passaggi 3.3, 3.3.1 e 3.3.2 sull'altro lato dell'animale.
-
Dopo aver sezionato nel piano mediale profondo da entrambi i lati, sezionare attraverso la linea mediana, collegando così le due incisioni orizzontali.
- Spostare il pezzo libero di coda e chiglia su un lato, esponendo i processi spinosi (Figura 1).
- Fissare il pezzo di coda con asciugamani di carta bagnati.
-
Posizionare nuovamente l'animale nella posizione prona con la testa rivolta verso il lato non dominante del chirurgo.
- Con un paio di pinze, afferrare i processi spinosi semplicemente caudale agli arti posteriori. Applicare un sollevamento delicato sia verso l'alto che verso la testa dell'animale.
- Posizionare le lame di un paio di microscissorri orizzontali intorno al processo e tagliarlo delicatamente. L'ascensore sul processo assicura che sia ora rimosso, esponendo il midollo spinale.
- Afferrare il processo spinoso appena caudale a quello che è stato appena rimosso e ripetere i passaggi 3.5.1 e 3.5.2.
NOT: Questo dovrebbe lasciare un midollo spinale esposto corrispondente a due livelli vertebrali. Quando si esegue la laminectomia, appare spesso una secrezione bianca schiumosa. Il midollo spinale è facilmente identificabile dalla sua lucentezza distintiva, insieme a un recipiente che corre lungo la linea mediana. - A seconda delle dimensioni dell'animale, l'area esposta potrebbe non essere abbastanza ampia. Utilizzando due coppie di pinze, afferrare le lamine su entrambi i lati del midollo spinale e ruotarle lateralmente con un movimento delicato.
4. Introduzione di un infortunio di tipo contusione (Figura 2)
- Mantenere l'animale in posizione prona.
- Utilizzare il piatto Petri per trasferire l'animale all'unità trauma.
- Chiedi a un assistente di far brillare una torcia sul midollo spinale.
- Posizionare il cilindro dell'unità trauma di contusione sopra il midollo spinale esposto utilizzando i microregolatori sull'unità. Puntare attraverso il cilindro.
- Abbassare il cilindro fino a quando non è in piano con la laminae.
- Attaccare l'asta cadente all'elettromagnete. Posizionare il cilindro di regolazione dell'altezza di caduta desiderato sull'unità traumatizzato.
- Posizionare l'asta cadente nel cilindro.
NOT: Per uno studio cieco, il chirurgo dovrebbe ora lasciare la stanza senza sapere se l'animale sarà assegnato a una lesione o a un gruppo di chirurgia fittizia. - Spegnere l'elettromagnete. L'asta cade al midollo spinale esposto.
- Utilizzare la vite di regolazione dell'altezza per sollevare l'asta dal midollo spinale.
- Confermare la lesione osservando il midollo spinale al microscopio. Il sito ferito apparirà più scuro, e sanguinamento dal vaso di linea mediana sarà evidente.
5. Introduzione di una lesione acuta
NOT: Eseguire questi passaggi dopo la 3.5.4.
- Con un paio di microscissori tagliare il midollo spinale in un taglio verticale perfetto.
- Ripetere il taglio 2 mm sul lato caudale del corpo.
NOT: La lunghezza del pezzo rimosso del midollo spinale può essere regolata in base al requisito dello studio. Tuttavia, un taglio di 2 mm sarà rigenerabile10. - Assicurarsi che i tagli siano completi. Al termine, senti le lame delle forbici che raschiano lungo la parte ventrale del canale spinale.
- Sollevare il pezzo di midollo spinale da 2 mm dal canale spinale.
6. Chiusura della ferita chirurgica
- Riportare l'animale al tavolo chirurgico. In uno studio cieco, riposizionare la chiglia in modo che il midollo spinale non sia visibile al chirurgo.
-
Mantenere l'animale in posizione prona.
- Iniziare a posizionare 10.0 suture di nylon dalla parte più caudale dell'incisione orizzontale. Chiudi le ferite in uno strato.
NOT: Non afferrare la pelle troppo stretta, perché infliggerà necrosi. - Lavorare verso la parte verticale dell'incisione.
- Quando si raggiunge l'angolo, ruotare la piastra Petri e suturare l'altra incisione orizzontale.
- Impostare suture sulle incisioni verticali.
- Non posizionare le suture nella parte superiore della chiglia, perché la pelle qui non sarà in grado di tenere.
- Iniziare a posizionare 10.0 suture di nylon dalla parte più caudale dell'incisione orizzontale. Chiudi le ferite in uno strato.
7. Restituire l'animale alla soluzione senza anestesia
- Sollevare il piatto Petri con l'animale e immergere entrambi molto delicatamente in acqua dolce solo 5 cm di profondità e lasciare che l'animale scivolare via.
NOT: La profondità dell'acqua poco profonda assicura che l'animale non tenterà di nuotare verso la superficie per respirare. - Non cambiare l'acqua durante la prima settimana.
- Quando si nutrono gli animali, assicurarsi che il cibo sia posizionato vicino alla testa dell'animale.
NOT: Lo scopo di queste misure è quello di evitare il maggior movimento possibile durante la prima settimana.
8. Ultrasuoni postoperatori
- Prima della terminazione dell'anestesia, utilizzare un sistema a ultrasuoni ad alta frequenza per acquisire immagini della lesione che possono essere utilizzate per la costruzione di immagini tridimensionali del sito SCI.
- Attaccare il trasduttore a un micromanipolatore preferibilmente regolato da un joystick remoto.
- Immergere l'animale anestetizzato nella posizione prona in un piccolo contenitore riempito con soluzione anestetica.
NOT: Fissare l'animale con sacchi di sabbia in miniatura o altre attrezzature per evitare il movimento durante la sequenza di scansione. - Allineare la punta del trasduttore con l'asse di lunghezza dell'animale e immergerlo nella soluzione di benzocaina fino a poco più millimetri sopra la chiglia dietro gli arti posteriori dell'animale.
- Identificare il sito SCI.
NOT: Il sito di lesioni è facilmente riconoscibile a causa dei processi spinosi mancanti direttamente sopra la SCI. - Ottimizzare l'immagine regolando le impostazioni degli ultrasuoni. Assicurarsi che il sito SCI si trova al centro dell'immagine. Regolare il campo visivo (ad esempio, profondità dell'immagine, scostamento della profondità e larghezza dell'immagine) per coprire il sito SCI e il tessuto sano adiacente. Regolare il guadagno bidimensionale per ottimizzare il contrasto dell'immagine.
- Spazzando il trasduttore ad ultrasuoni attraverso il sito SCI con un micromanipolatore azionato elettronicamente, acquisire immagini in modalità B che coprono il sito SCI in più posizioni sagittali trasversali, con fette consecutive con un intervallo trasversale acquisire immagini cine contenenti 500 fotogrammi con una frequenza fotogrammi di 50 fotogrammi/s e una frequenza di trasduttore di 40 MHz.
NOT: Questa configurazione richiede un micromanipolatore elettronico governato da un joystick remoto (passaggio 8.2). - Dopo aver terminato la sequenza di scansione tornare al punto 7.
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Representative Results
Lo scopo del protocollo è quello di produrre una SCI che paralizzerà le funzioni motorie e sensoriali caudale alla lesione. Poiché l'axolotl è competente per la rigenerazione, ripristina la funzione in poche settimane, consentendo ai ricercatori di studiare la rigenerazione del SNC per un breve lasso di tempo.
L'anestesia è stata fornita per 45 min a tutti gli animali, e non sono stati sperimentati episodi di recupero pretermine. Tutti gli animali si sono ripresi entro un'ora e non hanno mostrato segni di danni da anestesia nelle settimane successive13,16.
La laminectomia ha avuto successo in tutti gli animali. Tuttavia, la variazione anatomica nella larghezza del canale spinale ha richiesto l'allargamento del canale utilizzando pinze e una torsione in alcuni individui. Inoltre, laminae residue in alcuni individui ha impedito alla caduta di raggiungere il suo obiettivo, rendendo quindi imperativo che il chirurgo pulisca il campo dall'osso residuo e dalle prominenze.
La chiusura delle incisioni è stata associata ad alcune difficoltà, soprattutto durante la fase pilota dello studio. Le suture nella parte superiore della chiglia non si terrebbero e provocavano chiusure insufficienti. La chiusura di un animale nello studio non ha tenuto, con conseguente laceratura della chiglia, conseguente infezione e morte. Questo sottolinea la necessità di un'attenta sutura lungo le incisioni intere.
Le lesioni meccaniche iniziali erano evidenti durante la procedura. Durante lo sviluppo del modello, gli animali feriti e farsi sono stati macchiati di ematossitale ed eosina per convalidare la lesione. I risultati rappresentativi di ciascun gruppo sono riportati nella figura 3A1,A2 e Figura 3C1,C2. La rigenerazione è stata confermata dai preparati delle sezioni istologiche effettuati dopo nove settimane (Figura 3B1,B2 e Figura 3D1,D2), che hanno mostrato una connessione ristabilita del midollo spinale negli animali SCI.
Lesione e la rigenerazione possono essere seguite esaminando la funzione neurologica. Stimolare la coda con un tocco leggero e pizzicare da pinze rivelerà se le funzioni sensoriali tattili e nocicettive sono state perse e potenzialmente ristabilite. È stato definito un punteggio neurologico in base alla reazione dell'animale: 0 punti - nessuna risposta, 1 punto , movimento della coda locale, 2 punti , movimento troncchino, 3 punti , movimento coordinato degli arti e/o testa a fianco con movimento troncale, 4 punti - animali con movimento rapido coordinato immediato. In sei animali SCI contro cinque animali farsi è stata riscontrata la perdita della funzione neurologica tre settimane dopo l'infortunio e un graduale ripristino entro nove settimane(Figura 4 e Video supplementare 1).
Le immagini ultrasonografiche del midollo spinale ferito possono essere ottenute utilizzando il protocollo di cui sopra. La visualizzazione del sito SCI è stata possibile a causa dell'evidente mancanza di processi spinosi ossei (Figura 5). Inoltre, utilizzando la modalità B, l'arteria dorsale del midollo spinale illeso potrebbe essere visualizzata, producendo un indicatore di integrità del vaso.
È possibile testare gli animali immediatamente dopo il risveglio. Tuttavia, alcuni animali esprimevano un piccolo grado locale di ampiezza, ripetitivo e ritmico movimento della coda dopo la stimolazione paragonabile ai fenomeni di clonusosservati nella SCI umana. Questi movimenti potrebbero rappresentare clonus o una mancanza di soppressione del riflesso centrale e potrebbero potenzialmente causare ulteriori danni al midollo spinale appena ferito. Pertanto, il test degli animali non è raccomandato prima di una settimana dopo l'infortunio.
Dalla semplice osservazione qualitativa degli animali, sarà evidente che la coda è paralizzata e il nuoto è significativamente inibito, rendendo gli animali completamente dipendenti dallo spostamento degli arti. Queste osservazioni convalideranno anche il successo del protocollo.
Le scansioni RM ad alto campo (9,4 T) sono state eseguite immediatamente dopo l'infortunio per visualizzare l'infortunio in vivo(Figura 6). Tuttavia, le scansioni erano generalmente basse nel rapporto segnale-rumore rispetto a quelle degli animali non azionati, probabilmente a causa di sanguinamento ed emosiderina. Quindi, si è concluso che la risonanza magnetica era un metodo non ottimale per convalidare l'infortunio e il successo del protocollo.
Figura 1: disegno schematico della laminectomia microchirurgica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Disegno schematico del meccanismo del trauma da contusione. (A) L'intera configurazione, che mostra l'asta che cade sopra l'animale. (B) Il meccanismo smontato, che mostra come l'asta viene scollegata dall'elettromagnete. (C) L'asta cadente è collegata all'elettromagnete. Viene installato il cilindro di regolazione dell'altezza di caduta e l'elettromagnete e l'asta caricati nel cilindro. La regolazione dell'altezza dell'intero sistema è controllata da una ruota di regolazione. (D) Lo spegnimento dell'elettromagnete farà cadere l'asta senza che l'operatore tocchi il sistema. La figura è stata originariamente pubblicata da Thygesen etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Sezioni istologiche ematossialina ed eosina macchiate immediatamente e nove settimane dopo l'infortunio. (A1) Animale SCI subito dopo la lesione. (B1) Animale SCI a nove settimane. (C1) Animale di chirurgia di Ham subito dopo l'infortunio. (D1) Animale di sham a nove settimane. Quadrato rosso - segna la lesione degli animali SCI, e la laminectomia dell'animale farsa. Figura 2A, Figura 2B, Figura 2C sono ingrandimenti di queste aree a 5x. Freccia blu: midollo spinale non ferito. Questa cifra è stata originariamente pubblicata da Thygesen etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Grafico della risposta agli stimoli tattili. La risposta dei gruppi SCI è inferiore dopo tre settimane, rispetto al gruppo farsi. WPI - settimane dopo l'infortunio, linea nera - SCI, colore grigio e farsa. Sham n - 5, SCI n La figura è stata originariamente pubblicata da Thygesen etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Immagine ultrasonografica che mostra il midollo spinale in una sezione sagittale. Le linee gialle segnano il midollo spinale, il cerchio giallo del sito della lesione e le frecce bianche indicano le vertebre. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Scansioni RM in diversi momenti dopo lesioni o finta chirurgia. CsF che circonda il midollo spinale è carente, soprattutto a tre WPI per l'animale SCI, che indica il gonfiore del midollo spinale. L'oscuramento del midollo spinale indica anche l'edema. Si noti come questi cambiamenti scompaiono con l'avanzamento della rigenerazione. Freccia gialla: l'area della laminectomia. La figura è stata originariamente pubblicata da Thygesen etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video supplementare 1: Video che mostra la funzione neurologica dopo stimoli tattili e successivamente uno stimolo nocicettivo. Prima un animale di controllo sano, e poi un animale che soffre di SCI. Si prega di fare clic qui per scaricare questo video.
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Discussion
Poiché il rischio di lesioni al midollo spinale è significativo, le fasi critiche del protocollo sono la rimozione dei processi spinosi e l'allargamento dell'accesso osseo al canale spinale, se necessario. Come accennato nel protocollo, si raccomanda vivamente di rimuovere il processo più cranico. Ciò significa che i processi più caudali proteggono il midollo spinale da essere colpiti dalle forbici. Si raccomanda di garantire un accesso chirurgico sufficiente, il che significa non fare troppo piccolo un'incisione primaria. Inoltre, quando si afferra qualsiasi cosa con pinze, la direzione della trazione applicata deve sempre essere considerata. L'applicazione di una leggera spinta dal midollo spinale lo proteggerà in caso di guasto della presa e di uno slittamento dello strumento.
La procedura chirurgica nell'axolotl non è diversa dagli altri animali. Tuttavia, esistono alcune differenze importanti, principalmente attribuibili alla composizione e alle dimensioni dell'animale. La pelle della chiglia axolotl è molto fragile, e paradossalmente non guarisce bene su piccoli danni inflitti durante l'incisione. Prestare attenzione, soprattutto sulle incisioni primarie, perché il danno complicherà sostanzialmente la sutura. Le ossa di axolotls molto giovani sono molto morbide. Ciò significa che spesso le pinze anatomiche di base possono essere sufficienti nella rimozione ossea. Questo presenta un altro elemento di cautela, perché pizzicare i processi spinosi potrebbe infliggere danni sostanziali. Gli strati sottocutanei e della fascia muscolare non sono disponibili per la sutura, a causa delle loro fragili composizioni tissutali. È imperativo garantire una settimana tranquilla postoperatoria. Gli animali non possono riposare sufficientemente dopo l'operazione. Quindi, possono infliggere danni secondari al midollo spinale postoperatorio. La loro piccola anatomia non consente né fissazione interna né spline.
Il peso e l'altezza di caduta del sistema di aste che cadono sono fondamentali per infliggere una lesione da contusione. Durante un lungo pilotaggio per uno studio precedente, il peso dell'asta e l'altezza di caduta necessari sono stati trovati per essere 25 g e 3 cm13. Questo è stato sufficiente per indurre la paralisi in 12 g axolotls senza tagliare o disintegrare il midollo spinale. Un peso aggiunto o un'altezza di caduta potrebbero essere necessari negli animali più grandi. Inoltre, il diametro dell'asta che cade potrebbe dover essere maggiore nel caso di animali più grandi e più breve per gli animali più piccoli.
Il modello presenta alcune limitazioni. Poiché gli axolotl non vengono utilizzati per gli studi sul comportamento appreso, non è possibile testare funzioni neurologiche complesse. La lesione è stata introdotta caudale agli arti, risparmiando agli arti posteriori e all'intestino e alla vescica di essere paralizzati. La ragione di ciò era etica, per ridurre al minimo l'impatto sull'animale. Tuttavia, limita l'opportunità di studiare gli effetti sui movimenti degli arti, che possono essere più facili da descrivere e classificare. Gran parte della morbilità associata alla SCI deriva dalla perdita di controllo dell'intestino e della vescica. Questo modello non consente ricerche future in questi settori. Infliggere danni rostral agli arti posteriori sarebbe possibile, ma non è stato tentato.
Lo studio della SCI in un modello rigenerativo come l'axolotl consente un approccio diverso nella ricerca SCI. Poiché il modello animale può rigenerarsi, gli studi di eliminazione saranno in grado di rivelare fattori critici di rigenerazione. Gli studi convenzionali sulla SCI vengono eseguiti in modelli non rigenerativi, il che significa che sarà necessario intervenire su tutti i fattori critici per indurre una risposta rigenerativa.
Questo modello e protocollo sono in accordo con il principio di Krogh affermando che: "Per un numero così elevato di problemi ci sarà qualche animale di scelta o alcuni di questi animali su cui può essere più convenientemente studiato"17. La rigenerazione dei mammiferi è inibita da molteplici fattori. Inibire questi in un modello di mammifero di solito non induce alcun effetto. Tuttavia, l'aumento dei livelli di inibitori nell'axolotl dovrebbe eliminare la rigenerazione, e quindi rivelare se tale inibitore è critico o meno10.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Michael Pedersen, Università di Aarhus per la sua esperienza e il tempo sullo sviluppo di protocolli di risonanza magnetica e la creazione dell'intero progetto. Peter Agger, Università di Aarhus per la sua esperienza e il tempo sullo sviluppo dei protocolli di risonanza magnetica. Steffen Ringgard, Università di Aarhus per la sua esperienza e il tempo sullo sviluppo dei protocolli di risonanza magnetica. Lo sviluppo del modello SCI nell'axolotl è stato gentilmente sostenuto dalla Fondazione A.P. Maersk, dalla Fondazione Riisfort, dalla Fondazione Linex e dalla Fondazione ELRO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g - 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| Electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Kimwipes | |||
| Microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring approximately 70 x 55 cm2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
References
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