Summary
Detta manuskript presenterar protokoll för kirurgiskt tillfogar kontrollerade trubbiga och skarpa ryggmärgsskador till en regenerativ axolotl (Ambystoma mexicanum).
Abstract
Syftet med denna studie är att etablera en standardiserad och reproducerbar regenerativ trubbig ryggmärgsskada modell i axolotl (Ambystoma mexicanum). De flesta kliniska ryggmärgsskador uppstår som hög energi trubbiga trauman, inducera kontusion skador. Emellertid, de flesta studier i axolotl ryggmärgen har utförts med vassa trauman. Därför syftar denna studie till att producera en mer kliniskt relevant regenerativ modell. På grund av deras imponerande förmåga att regenerera nästan alla vävnader, axolotien används ofta som modeller i regenerativ studier och har använts i stor utsträckning i ryggmärgsskada (SCI) studier. I detta protokoll är axolotien sövda genom nedsänkning i en bensokain lösning. Under mikroskopet, ett vinkel snitt görs bilateralt på en nivå bara caudal till bakbenen. Från detta snitt, är det möjligt att dissekera och exponera spinösa processer. Med hjälp av pincett och sax, en två-nivå laminektomi utförs, utsätta ryggmärgen. En anpassad trauma enhet bestående av en fallande stav i en cylinder är konstruerad, och denna enhet används för att framkalla en kontusion skada på ryggmärgen. Snitten sys sedan, och djuret återhämtar sig från anestesi. Den kirurgiska metoden är framgångsrik i att exponera ryggmärgen. Den trauma mekanismen kan ge kontusion skador på ryggmärgen, som bekräftas av histologi, MRI, och neurologiska undersökning. Slutligen, ryggmärgen regenererar från skadan. Det kritiska steget i protokollet är att avlägsna spinösa processer utan att orsaka skador på ryggmärgen. Detta steg kräver utbildning för att säkerställa ett säkert förfarande. Dessutom är såret stängning mycket beroende av att inte tillfoga onödig skada på huden under snittet. Protokollet utfördes i en randomiserad studie av 12 djur.
Introduction
Det övergripande målet med denna studie var att etablera en kontrollerad och reproducerbar mikrokirurgisk metod för att tillfoga trubbig och skarp SCI till axolotl (Ambystoma mexicanum), som producerar en regenerativ ryggmärgsskada modell.
Sci är ett allvarligt tillstånd som, beroende på nivån och omfattningen, tillfogar neurologiska funktionshinder till extremiteterna tillsammans med nedsatt urinblåsa och tarm kontroll1,2,3. De flesta Sci är resultatet av hög energi trubbiga trauma såsom trafikolyckor och faller4,5. Skarpa skador är mycket sällsynta. Därför, den vanligaste makroskopisk skada typ är kontusioner.
Den däggdjurs centralanervsystemet (CNS) är en icke-regenerativ vävnad, därav ingen restaurering av neurologisk vävnad efter Sci ses6,7,8. Å andra sidan, vissa djur har en spännande förmåga att regenerera vävnader, inklusive CNS vävnad. Ett av dessa djur är axolotl. Det används ofta i studier av regenerativ biologi och är av intresse för ryggmärgs förnyelse, eftersom det är en ryggradsdjur9,10,11,12.
De flesta Sci studier i axolotl utförs som antingen amputation av hela svansen eller ablation av en större del av ryggmärgen9,10,11,12. Nyligen publicerades en ny studie om trubbiga skador13 som härmar kliniska situationer bättre. Medan fullständig bihang amputation i axolotl resulterar i fullständig förnyelse, vissa icke-amputation-baserade regenerativ fenomen är beroende av den kritiska storleks fel (CSD)14,15. Detta innebär att skador som överskrider en kritisk tröskel inte regenereras. För att utveckla en regenerativ modell med ett högre kliniskt translationell värde undersökte denna studie om ett 2 mm trubbigt trauma skulle överskrida gränsvärdet för CSD.
Denna metod är relevant för forskare som arbetar med ryggmärgs förnyelse i små djurmodeller, särskilt i axolotl. Dessutom kan det vara av mer allmänt intresse, eftersom det uppvisar ett sätt att använda standard laboratorieutrustning för att utveckla en trubbig trauma mekanism som är lämplig för användning i små djur i allmänhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla tillämpliga institutionella och statliga bestämmelser om etisk användning av djur följdes under denna studie. Studien utfördes under godkännande-ID: 2015-15-0201-0061 av det danska djur experiment inspektionen. Djur var mexikanska axolotien (Ambystoma mexicanum, genomsnittlig kroppsvikt ± std: 12,12 g ± 1,25 g).
1. förberedelser
-
Förbered axolotl för anestesi.
- Använd icke-kemiskt behandlat kranvatten av hög kvalitet. Om otillgänglig, Använd 40% Holtfreter lösning.
- Lös 200 mg etyl4-aminobenzoat (Benzocaine) i 3 mL aceton. Lös denna lösning i 1 liter kranvatten eller 40% Holtfreters lösning.
- Använd en vanlig petriskål (100 mm i diameter) placerad under ett stereomikroskop som ett kirurgiskt bord. Placera en kirurgisk textil trasa på petriskål.
Anmärkning: Använda en petriskål som ett kirurgiskt område möjliggör förflyttning och rotation av djuret utan att röra den, att säkerställa spinal stabilitet under operationen. - Förbered alla sterila mikrokirurgiska instrument (dvs., sax och anatomiska pinps).
2. anestesi
- Placera Axolotl i en behållare med bensokain lösning för ca 45 min för att säkerställa djup och stabil anestesi.
Anmärkning: Den givna koncentrationen av bensokain kommer att orsaka anestesi i alla storlekar av axolotls. - Kontrollera om det finns tecken på narkos inom 30-45 min. Dessa inkluderar en total avsaknad av Gill rörelser, rätande reflex, eller svar på antingen taktila eller smärtsamma stimuli (mild nypa tå webben).
- För att bibehålla anestesi, Linda djuren i pappershanddukar fuktade i bedövningsmedel lösning. Blöt dessa regelbundet med denna lösning under det kirurgiska ingreppet för att säkerställa att huden och gälarna hålls fuktiga.
- Återvinna djuret efter operationen genom att placera den i en behållare som innehåller färskt kranvatten. Observera tecken på återhämtning, såsom Gill rörelse och återfått rätande reflex, inom 1 h16.
3. mikrokirurgiska laminektomi
Anmärkning: Laminektomi utförs under ett stereomikroskop.
- Placera djuret i liggande ställning på petriskål. Linda in den i pappershanddukar så att svansen är exponerad.
Anmärkning: Pappershanddukar är utmärkta för att säkerställa stabiliteten under hela förfarandet. -
Identifiera bakbenen. Gör det första snittet bara caudal till dem.
- Med ett par microsax, utföra ett vertikalt snitt från kölen tills beniga framträdande av spinösa processer känns.
Anmärkning: Var mycket försiktig när du griper kölen och huden med pinpett, eftersom dessa lätt orsaka skador på den känsliga huden. - Utvidga snittet i sidled, så snittet korsar hela bredden av svansen.
- Ta tag i spinös processen med pinps för att säkerställa rätt djup.
- Förläng de vertikala snitt 1 mm under den spindiga processen på båda sidor.
- Med ett par microsax, utföra ett vertikalt snitt från kölen tills beniga framträdande av spinösa processer känns.
-
Placera djuret på ena sidan för att utföra ventrala och horisontella snitt som anges nedan.
- Med ett par mikrosax, med början från den ventrala punkten av det vertikala snittet, gör ett horisontellt snitt på ca 15 mm för djur 10-20 g i vikt. Gör snittet längre för större djur, och kortare för mindre djur.
- Använda saxen, dissekera medialt genom det horisontella snittet tills ryggraden känns i mittlinjen.
- Upprepa steg 3,3, 3.3.1 och 3.3.2 på den andra sidan av djuret.
-
Efter att ha dissekeras i den djupa mediala planet från båda sidor, dissekera genom mittlinjen, vilket förbinder de två horisontella snitt.
- Flytta den fria bit svans och köl till en sida, utsätta spinösa processer (figur 1).
- Fixera svansen pjäs med våta pappershanddukar.
-
Placera djuret i liggande läge igen med huvudet vänd mot kirurgens icke-dominerande sida.
- Med ett par tång, ta tag i spinösa processer bara caudal till bakbenen. Applicera en mild lyft både upp och mot huvudet av djuret.
- Placera bladen på ett par mikrosax horisontellt runt processen och försiktigt klippa den. Hissen på processen säkerställer att den nu avlägsnas, utsätta ryggmärgen.
- Ta tag i krabbornas mätras processen bara caudal till en som bara togs bort och upprepa steg 3.5.1 och 3.5.2.
Anmärkning: Detta bör lämna en exponerad ryggmärg motsvarande två vertebrala nivåer. När du utför laminektomi, en vit skummande sekretion visas ofta. Ryggmärgen är lätt identifieras genom sin distinkta glans, tillsammans med ett fartyg som löper längs mittlinjen. - Beroende på djurets storlek kanske det exponerade området inte är tillräckligt brett. Med hjälp av två par tång, greppa lameller på båda sidor av ryggmärgen och vrid dessa i sidled med en mild rörelse.
4. införande av en skada på kontusion (figur 2)
- Håll djuret i liggande ställning.
- Använd petriskål för att överföra djuret till trauma enheten.
- Ha en assistent lysa en ficklampa på ryggmärgen.
- Placera enheten för kontusion trauma-cylindern ovanför den exponerade ryggmärgen med mikrojusterarna på enheten. Sikta genom cylindern.
- Sänk cylindern tills den är i nivå med laminae.
- Fäst den fallande staven på elektromagnet. Placera önskad höjd justerings cylinder på trauma enheten.
- Placera den fallande staven i cylindern.
Anmärkning: För en blindad studie, kirurgen bör nu lämna rummet utan att veta om djuret kommer att tilldelas en skada eller en bluff kirurgi grupp. - Stäng av elektromagnet. Staven faller till den exponerade ryggmärgen.
- Använd skruven för höjdjustering för att lyfta staven från ryggmärgen.
- Bekräfta skadan genom att titta på ryggmärgen genom mikroskopet. Den skadade webbplatsen kommer att visas mörkare, och blödning från mittlinjen fartyget kommer att vara uppenbar.
5. att införa en skarp skada
Anmärkning: Utför dessa steg efter 3.5.4.
- Med ett par microsax klippa ryggmärgen i en perfekt vertikal snitt.
- Upprepa snittet 2 mm till den kaudala sidan av kroppen.
Anmärkning: Längden på den borttagna bit av ryggmärgen kan justeras enligt studiens krav. En 2 mm skär kommer dock att vara regenererbar10. - Se till att nedskärningarna är slutförda. Efter avslutad, känna bladen av saxen skrapning längs den ventrala delen av ryggmärgskanalen.
- Lyft upp 2 mm ryggmärgs delen från ryggmärgskanalen.
6. stängning av det kirurgiska såret
- Returnera djuret till operationsbordet. I en blindad studie, placera om kölen så att ryggmärgen inte är synlig för kirurgen.
-
Håll djuret i liggande ställning.
- Börja placera 10,0 nylon suturer från den mest kaudala delen av det horisontella snittet. Stäng såren i ett lager.
Anmärkning: Ta inte tag i huden för hårt, eftersom det kommer att orsaka nekros. - Arbeta mot den vertikala delen av snittet.
- När du når vinkeln, vrid petriskål och sutur det andra horisontella snittet.
- Ställ suturer på de vertikala snitt.
- Placera inte suturer i den översta delen av kölen, eftersom huden här inte kommer att kunna hålla.
- Börja placera 10,0 nylon suturer från den mest kaudala delen av det horisontella snittet. Stäng såren i ett lager.
7. returnering av djuret till en anestesi fri lösning
- Lyft petriskål med djuret och Dränk båda mycket försiktigt i sötvatten bara 5 cm djup och låt djuret glida av.
Anmärkning: Det grunda vattendjupet säkerställer att djuret inte kommer att försöka simma till ytan för att andas. - Byt inte vatten under den första veckan.
- Vid utfodring av djuren, se till att maten är placerad nära djurets huvud.
Anmärkning: Syftet med dessa åtgärder är att undvika så mycket rörelse som möjligt under den första veckan.
8. postoperativ ultraljud
- Före uppsägning av anestesi, använda ett högfrekvent ultraljud system för att förvärva bilder av skadan som kan användas för att bygga tredimensionella bilder av SCI webbplats.
- Fäst givaren på en micromanipulator som styrs av en fjärrstyrspak.
- Sänk det sövda djuret i den liggande positionen i en liten behållare fylld med bedövningsmedel lösning.
Anmärkning: Fixera djuret med miniatyr sandsäckar eller annan utrustning för att undvika rörelse under scanning sekvensen. - Rikta in spetsen på givaren med djurets längdaxel och dränka den i bensokain lösning tills det är bara några millimeter ovanför kölen bakom bakbenen av djuret.
- Identifiera SCI-webbplatsen.
Anmärkning: Skadan platsen är lätt att känna igen på grund av de saknade spinösa processer direkt ovanför SCI. - Optimera bilden genom att justera ultraljudsinställningarna. Se till att SCI-webbplatsen är i mitten av bilden. Justera synfältet (d.v.s. bild djupet, djup förskjutningen och bildens bredd) för att täcka SCI-platsen och angränsande frisk vävnad. Justera den tvådimensionella förstärkningen för att optimera bildens kontrast.
- Genom att sopa ultraljud givaren över SCI webbplats med en elektroniskt manövrerad micromanipulator, förvärva B-läge bilder som täcker SCI plats på flera sagittal tvärsnitts segment platser, med efterföljande skivor med en Interslice intervall 50 μm. förvärva Cine-bilder som innehåller 500 ramar med en bildhastighet på ~ 50 frames/s och en givar frekvens på 40 MHz.
Anmärkning: Denna inställning kräver en elektronisk micromanipulator styrd av en fjärrstyrspak (steg 8,2). - Efter avslutad skanning sekvens återgå till steg 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Syftet med protokollet är att producera en SCI som kommer att paralysera den motoriska och sensoriska funktioner caudal till skadan. Eftersom axolotl är Regeneration-kompetenta det återställer funktionen inom veckor, så att forskarna kan studera CNS-förnyelse under en kort tidsperiod.
Anestesi tillhandahölls för 45 min till alla djur, och inga episoder av prematura återhämtning upplevdes. Alla djur återhämtade sig inom en timme och visade inga tecken på skador från anestesi under de följande veckorna13,16.
Laminektomi var framgångsrik i alla djur. Men anatomisk variation i bredden av ryggradskanalen krävde breddning av kanalen med hjälp av pinpett och en twist hos vissa individer. Dessutom hindrade rester av vissa individer den fallande stången från att nå sitt mål, vilket gör det absolut nödvändigt att kirurgen rengör fältet från restbenet och prominenser.
Att stänga snitten förknippades med vissa svårigheter, särskilt under försöksfasen av studien. Suturer i den övre delen av kölen skulle inte hålla och resulterade i otillräckliga stängningar. Stängningen av ett djur i studien inte hålla, vilket resulterade i kölen slits, efterföljande infektion, och död. Detta understryker behovet av noggrann suturering längs hela snitt.
De initiala mekaniska skadorna var uppenbara under förfarandet. Under modell utvecklingen, skadades och bluff djur färgas med hematoxylin och eosin att validera skadan. Representativa resultat för varje grupp visas i figur 3a1,a2 och figur 3C1,C2. Regenerering bekräftades av histologiska avsnitt preparat gjorda efter nio veckor (figur 3B1,B2 och figur 3D1,D2), som visade en återetablerad ryggmärgs anslutning i Sci-djur.
Skada och förnyelse kan följas genom att undersöka neurologisk funktion. Stimulera svansen med en lätt beröring och klämmande från pinkoppar kommer att avslöja om taktila och nociceptiva sensoriska funktioner har försvunnit och potentiellt återupprättas. En neurologisk Poäng definierades baserat på reaktionen av djuret: 0 punkt = inget svar, 1 Poäng = lokal svans rörelse, 2 Poäng = truncal rörelse, 3 Poäng = koordinerad förflyttning av armar och ben och/eller huvudet tillsammans med truncal rörelse, 4 Poäng = djur med omedelbara samordnade snabba rörelser. I sex SCI djur kontra fem bluff djur förlusten av neurologisk funktion tre veckor efter skada hittades, och en gradvis restaurering inom nio veckor (figur 4 och kompletterande video 1).
Ultrasonografiska bilder av den skadade ryggmärgen kan erhållas med hjälp av ovanstående protokoll. Visualisera SCI platsen var möjligt på grund av den uppenbara avsaknaden av beniga spinösa processer (figur 5). Dessutom, med hjälp av B-läge den dorsala artären i den oskadade ryggmärgen kan visualiseras, vilket ger en markör för fartygets integritet.
Det är möjligt att testa djuren omedelbart efter uppvaknandet. Men vissa djur uttryckte lokal liten amplitud, repetitiva och rytmisk svans rörelse vid stimulering jämförbar med Klonus fenomen observerats i mänsklig sci. Dessa rörelser kan representera Klonus eller brist på Central reflex dämpning och kan potentiellt orsaka mer skada på den nyligen skadade ryggmärgen. Därför är att testa djuren inte rekommendera innan en vecka efter skada.
Från enkel kvalitativ observation av djuren, kommer det att vara uppenbart att svansen är förlamad, och simning är betydligt hämmade, vilket gör djuren helt beroende av att flytta sina armar och ben. Dessa observationer kommer också att validera protokollets framgång.
Hög fälts MRT (9,4 T) utfördes omedelbart efter skada för att visualisera skadan in vivo (figur 6). Men, skanningar var i allmänhet låg i signal-brus-förhållande jämfört med de icke-drivna djur, sannolikt på grund av blödning och hemosiderin. Därav drogs slutsatsen att MRT var en suboptimala metod för att validera skadan och framgången för protokollet.
Figur 1: Schematisk ritning av mikrokirurgisk laminektomi. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Schematisk ritning av kontusion trauma mekanismen. (A) hela installationen, som visar den fallande stången ovanför djuret. Bden demonterade mekanismen, som visar hur staven är frånkopplad från elektromagnet. Cden fallande stången är ansluten till elektromagnet. Den fallande höjden justeringscylindern är installerad, och elektromagnet och staven lastas i cylindern. Höjdjusteringen av hela systemet styrs av ett justeringshjul. (D) att stänga av elektromagnet kommer att leda till att staven faller utan att operatören vidrör systemet. Figuren publicerades ursprungligen av Thygesen et al.13. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: histologiska avsnitt hematoxylin och eosin färgade omedelbart och nio veckor efter skada. (A1) SCI djur omedelbart efter skada. (B1) SCI djur på nio vecken. (C1) Simulerad kirurgi djur omedelbart efter skada. (D1) Simulerad djur på nio veckor. Röda torget = markerar skadan av SCI djur, och laminektomi av bluff djuret. Figur 2A, figur2B, figur 2C är förstoringar av dessa områden vid 5x. Blå pil = oskadad ryggmärg. Denna siffra publicerades ursprungligen av Thygesen et al.13. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Graf över respons på taktila stimuli. Responsen från SCI-grupperna är lägre efter tre veckor, jämfört med den simulerade gruppen. WPI = veckor efter skada, svart linje = SCI, Grey Color = Sham. Sham n = 5, SCI n = 6. Figuren publicerades ursprungligen av Thygesen et al.13. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Ultrasonografisk bild som visar ryggmärgen i en sagittal sektion. Gula linjer Markera ryggmärgen, gul cirkel skadan platsen, och vita pilar Markera Kotor. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: MRI-skanningar vid olika tidpunkter efter skada eller simulerad kirurgi. CSF som omger ryggmärgen saknas, särskilt vid tre WPI för SCI djuret, indikerar svullnad av ryggmärgen. Mörkfärgning av ryggmärgen indikerar ödem också. Lägg märke till hur dessa förändringar försvinner allteftersom regenereringen fortskrider. Gul pil = området laminektomi. Figuren publicerades ursprungligen av Thygesen et al.13. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande video 1: Video som visar den neurologiska funktionen efter taktila stimuli och senare en nociceptiva stimulans. Först ett hälsosamt kontrolldjur, och sedan ett djur som lider av SCI. Klicka här för att ladda ner denna video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eftersom risken för skador på ryggmärgen är betydande, de kritiska stegen i protokollet tar bort spinösa processer och breddning av beniga tillgång till ryggmärgskanalen om det behövs. Som nämnts i protokollet, ta bort den mest kraniala processen först rekommenderas starkt. Detta kommer att innebära att de mer kaudala processer skydda ryggmärgen från att drabbas av saxen. Det rekommenderas att säkerställa tillräcklig kirurgisk tillgång, vilket innebär att inte göra för litet ett primärt snitt. Också, när greppa något med pinpett, riktningen av den pull tillämpas måste alltid övervägas. Tillämpa en mild dra bort från ryggmärgen kommer att skydda den i händelse av fattningsförmågan misslyckas och en slip av instrumentet.
Det kirurgiska ingreppet i axolotl skiljer sig inte från andra djur. Det finns dock vissa viktiga skillnader, främst hänförliga till djurets vävnadssammansättning och storlek. Axolotl köl huden är mycket bräcklig, och paradoxalt nog inte läker bra på små skador som tillfogats under incision. Försiktighet bör iakttas, särskilt på de primära snitt, eftersom skadan kommer att avsevärt försvåra suturering. Benen av mycket unga axolotien är mycket mjuka. Detta innebär att ofta grundläggande anatomiska pinps kan räcka i ben borttagning. Detta innebär en annan del av försiktighet, eftersom klämmande spinösa processer kan orsaka betydande skador. De subkutana och muskel fascian lagren är inte tillgängliga för suturering, på grund av deras bräckliga vävnad kompositioner. Det är absolut nödvändigt att säkerställa en lugn postoperativ vecka. Djuren får inte vila tillräckligt efter operationen. Därav, de kan orsaka sekundära skador på deras ryggmärgen postoperativt. Deras lilla anatomi tillåter inte varken invändig eller spline fixering.
Vikt och fallande höjd av fallande spö systemet är avgörande för att tillfoga en kontusion skada. Under omfattande pilotering för en tidigare studie, var stången vikt och fallande höjd som behövs vara 25 g och 3 cm13. Detta var tillräckligt för att inducera förlamning i 12 g axolotien utan att skära eller desincera ryggmärgen. Ökad vikt eller fallande höjd kan behövas hos större djur. Dessutom kan diametern på den fallande stången behöva vara större när det gäller större djur och kortare för mindre djur.
Modellen har vissa begränsningar. Eftersom axolotien inte används för inlärda beteendestudier, kan man inte testa komplexa neurologiska funktioner. Skadan infördes caudal i armar och ben, skonar bakbenen och tarmen och urinblåsan från att vara förlamad. Skälet till detta var etiskt, att minska påverkan på djuret till ett minimum. Emellertid, det begränsar möjligheten att studera effekterna på lem rörelser, som kan vara lättare att beskriva och kategorisera. En stor del av SCI-associerad sjuklighet härrör från förlusten av kontroll av tarm och urinblåsa. Denna modell tillåter inte för framtida forskning inom dessa områden. Tillfoga skador rostralt till bakbenen skulle vara möjligt, men det var inte försökt.
Studera SCI i en regenerativ modell som axolotl möjliggör en annan strategi i SCI forskning. Eftersom djur modellen kan regenerera, eliminering studier kommer att kunna avslöja kritiska faktorer för förnyelse. Konventionella studier på SCI utförs i icke-regenerativa modeller, vilket innebär att man kommer att behöva ingripa på alla kritiska faktorer för att framkalla ett regenerativt svar.
Denna modell och protokoll är i överensstämmelse med Kroghs princip om att: "för ett så stort antal problem kommer det att finnas några djur val eller några sådana djur som det kan vara mest bekvämt studerade"17. Föryngring av däggdjur hämmas av flera faktorer. Att hämma dessa i en däggdjurs modell vanligtvis inte inducera några effekter. Emellertid, ökande nivåer av hämmare i axolotl bör eliminera förnyelse, och därmed avslöja om denna hämmare är kritisk eller inte10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Michael Pedersen, Århus universitet för sin expertis och tid på att utveckla MRI-protokoll och inrätta hela projektet. Peter Agger, Århus universitet för sin expertis och tid på att utveckla MRI-protokollen. Steffen Ringgard, Århus universitet för sin expertis och tid på att utveckla MRI-protokollen. Utvecklingen av SCI-modellen i axolotl stöddes vänligt av A.P. Møller Maersk Foundation, Riisfort Foundation, linex Foundation och ELRO Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g - 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| Electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Kimwipes | |||
| Microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring approximately 70 x 55 cm2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
References
- Shavelle, R. M., DeVivo, M. J., Brooks, J. C., Strauss, D. J., Paculdo, D. R. Improvements in Long-Term Survival After Spinal Cord Injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96 (4), 645-651 (2015).
- Hicken, B. L., Putzke, J. D., Richards, J. S. Bladder management and quality of life after spinal cord injury. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 80 (12), 916-922 (2001).
- Levi, R., Hultling, C., Nash, M. S., Seiger, A. The Stockholm spinal cord injury study: 1. Medical problems in a regional SCI population. Paraplegia. 33 (6), 308-315 (1995).
- Bjornshave Noe, B., Mikkelsen, E. M., Hansen, R. M., Thygesen, M., Hagen, E. M. Incidence of traumatic spinal cord injury in Denmark, 1990-2012: a hospital-based study. Spinal Cord. 53 (6), 436-440 (2015).
- Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A., Fehlings, M. G. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clinical Epidemiology. 6, 309-331 (2014).
- Aguayo, A. J., et al. Degenerative and regenerative responses of injured neurons in the central nervous system of adult mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 331 (1261), 337-343 (1991).
- Aguayo, A. J., Bjorklund, A., Stenevi, U., Carlstedt, T. Fetal mesencephalic neurons survive and extend long axons across peripheral nervous system grafts inserted into the adult rat striatum. Neuroscience Letters. 45 (1), 53-58 (1984).
- Richardson, P. M., Issa, V. M., Aguayo, A. J. Regeneration of long spinal axons in the rat. Journal of Neurocytology. 13 (1), 165-182 (1984).
- Butler, E. G., Ward, M. B. Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae. Journal of Experimental Zoology. 160 (1), 47-65 (1965).
- Diaz Quiroz, J. F., Tsai, E., Coyle, M., Sehm, T., Echeverri, K. Precise control of miR-125b levels is required to create a regeneration-permissive environment after spinal cord injury: a cross-species comparison between salamander and rat. Disease Model Mechanisms. 7 (6), 601-611 (2014).
- Clarke, J. D., Alexander, R., Holder, N. Regeneration of descending axons in the spinal cord of the axolotl. Neuroscience Letters. 89 (1), 1-6 (1988).
- McHedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the central nervous system during salamander tail regeneration from the implanted neurospheres. Methods of Molecular Biology. 916, 197-202 (2012).
- Thygesen, M. M., et al. A clinically relevant blunt spinal cord injury model in the regeneration competent axolotl (Ambystoma mexicanum) tail. Experimental Therapeutic Medicine. 17 (3), 2322-2328 (2019).
- Goss, R. J. Principles of Regeneration. , Academic Press. New York. (1969).
- Hutchison, C., Pilote, M., Roy, S. The axolotl limb: a model for bone development, regeneration and fracture healing. Bone. 40 (1), 45-56 (2007).
- Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration (Oxford). 4 (3), 124-131 (2017).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
