Summary
Dette manuskript præsenterer protokoller for kirurgisk påføre kontrollerede stumme og skarpe rygmarvsskader til en regenerativ Axolotler (Ambystoma mexicanum).
Abstract
Formålet med denne undersøgelse er at etablere en standardiseret og reproducerbar regenerativ stump rygmarvsskade model i Axolotler (Ambystoma mexicanum). De fleste kliniske rygmarvsskader forekommer som høje energi stumme traumer, inducerende kontusion skader. Men, de fleste undersøgelser i Axolotler rygmarven er blevet udført med skarpe traumer. Derfor har denne undersøgelse til formål at producere en mere klinisk relevant regenerativ model. På grund af deres imponerende evne til at regenerere næsten alle væv, kendt er almindeligt anvendt som modeller i regenerativ undersøgelser og har været anvendt i udstrakt grad i rygmarvsskade (sci) undersøgelser. I denne protokol, er kendt bedøvet ved nedsænkning i en benzocain opløsning. Under mikroskopet er et vinkel snit lavet bilateralt på et niveau, der kun er hale til bagbenene. Fra denne Incision, er det muligt at dissekere og udsætte de spinøse processer. Ved hjælp af pincet og saks udføres en to-niveau laminektomi, der udsætter rygmarven. En brugerdefineret traume anordning bestående af en faldende stang i en cylinder er konstrueret, og denne anordning bruges til at fremkalde en kontusion skade på rygmarven. Indsnit er derefter sutureres, og dyret genindvinder fra anæstesi. Den kirurgiske tilgang er en succes i at udsætte rygmarven. Traume mekanismen kan producere kontusion skader på rygmarven, som bekræftet af histologi, MRI, og neurologisk undersøgelse. Endelig, rygmarven regenererer fra skaden. Det kritiske trin i protokollen er at fjerne de spinale processer uden at påføre rygmarven skade. Dette trin kræver uddannelse for at sikre en sikker procedure. Desuden er sårlukning meget afhængig af ikke at påføre huden unødvendig skade under indsnit. Protokollen blev udført i en randomiseret undersøgelse af 12 dyr.
Introduction
Det overordnede mål med denne undersøgelse var at etablere en kontrolleret og reproducerbar mikrokirurgisk metode til at påføre sløv og skarp SCI til Axolotler (Ambystoma mexicanum), der producerede en regenerativ rygmarvsskade model.
Sci er en alvorlig tilstand, at afhængigt af niveau og omfang, påfører neurologiske handicap til ekstremiteterne sammen med nedsat blære og tarm kontrol1,2,3. De fleste sci er resultatet af høj energi stumme traumer såsom trafikulykker og falder4,5. Skarpe skader er meget sjældne. Derfor er den mest almindeligt forekommende makroskopiske skadetype kontusioner.
Den pattedyrs centralnervesystemet (CNS) er en ikke-regenerativ væv, derfor ingen restaurering af neurologiske væv efter sci ses6,7,8. På den anden side, nogle dyr har en spændende evne til at regenerere væv, herunder CNS-væv. Et af disse dyr er Axolotl. Det er meget udbredt i undersøgelser af regenerativ biologi og er af interesse i rygmarven regenerering, fordi det er et hvirveldyr9,10,11,12.
De fleste sci-studier i Axolotler udføres enten som amputation af hele halen eller ablation af en større del af rygmarven9,10,11,12. For nylig blev en ny undersøgelse offentliggjort på stump skader13 , der efterligner kliniske situationer bedre. Der henviser til, at komplet vedhæng-amputation i Axolotler resulterer i fuld regenerering, er nogle ikke-amputations baserede regenerativ fænomener afhængige af den kritiske størrelses defekt (CSD)14,15. Det betyder, at skader, der overskrider en kritisk tærskel, ikke regenereres. For at udvikle en regenerativ model med en højere klinisk translationel værdi undersøgte denne undersøgelse, om et 2 mm stump traume ville overskride CSD-grænsen.
Denne metode er relevant for forskere, der arbejder på rygmarven regenerering i små dyremodeller, især i Axolotl. Desuden kan det være af mere almen interesse, fordi det udviser en måde at bruge standard laboratorium udstyr til at udvikle en stump traume mekanisme, der er egnet til brug i små dyr i almindelighed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle gældende institutionelle og statslige bestemmelser om etisk anvendelse af dyr blev fulgt i denne undersøgelse. Undersøgelsen blev udført under godkendelses-id: 2015-15-0201-0061 af det danske dyre eksperiment inspektorat. Dyr var mexicanske kendt (Ambystoma mexicanum, gennemsnitlig kropsmasse ± STD: 12,12 g ± 1,25 g).
1. forberedelse
-
Forbered Axolotler til anæstesi.
- Anvend ikke-kemisk behandlet ledningsvand af høj kvalitet. Hvis den ikke er tilgængelig, skal du bruge 40% Holtfreters opløsning.
- 200 mg ethyl-4-aminobenzoat (benzocain) opløses i 3 mL acetone. Opløsningen opløses i 1 liter vand fra hanen eller 40% Holtfreters opløsning.
- Brug en standard Petri skål (100 mm i diameter) placeret under et stereomikroskop som et kirurgisk bord. Anbring en kirurgisk tekstil klud på Petri skålen.
Bemærk: Ved hjælp af en Petri skål som et kirurgisk område muliggør flytning og rotation af dyret uden at røre det, hvilket sikrer spinal stabilitet under operationen. - Forbered alle sterile mikrokirurgiske instrumenter (dvs. sakse og anatomiske pincet).
2. anæstesi
- Placer Axolotler i en beholder med benzocain-opløsning i ca. 45 min for at sikre dyb og stabil anæstesi.
Bemærk: Den givne koncentration af benzocain vil forårsage anæstesi i alle størrelser af axolotls. - Kontroller for tegn på generel anæstesi inden for 30-45 min. Disse omfatter en komplet mangel på Gill bevægelser, oprettende refleks, eller respons på enten taktile eller smertefulde stimuli (blid klemning af tå web).
- For at opretholde anæstesi, wrap dyrene i papirhåndklæder befuvet i bedøvelsesmidlet opløsning. Våd disse regelmæssigt med denne løsning under den kirurgiske procedure for at sikre, at huden og gællerne holdes fugtige.
- Genopret dyret efter operationen ved at anbringe det i en beholder, der indeholder fersk ledningsvand. Observere tegn på nyttiggørelse, såsom Gill bevægelse og genvundet opretnings refleks, inden for 1 h16.
3. mikrokirurgisk laminectomy
Bemærk: Laminektomi udføres under et stereomicroskop.
- Anbring dyret i den udsatte position på Petri skålen. Pak det i papirhåndklæder, så halen er udsat.
Bemærk: Papirhåndklæder er fremragende til at sikre stabilitet under hele proceduren. -
Identificer bagbenene. Gør den første indsnit lige hale til dem.
- Med et par mikrosaks, udføre en lodret snit fra kølen, indtil knogle fremtrædende af de spinale processer mærkes.
Bemærk: Vær meget forsigtig, når du griber kølen og huden med pincet, fordi disse let påføre skade på den sarte hud. - Udvid snittet sideværts, så snittet krydser hele bredden af halen.
- Tag fat i den spinale proces med pincet for at sikre den rigtige dybde.
- Udvid de lodrette snit 1 mm under den spinale proces på begge sider.
- Med et par mikrosaks, udføre en lodret snit fra kølen, indtil knogle fremtrædende af de spinale processer mærkes.
-
Anbring dyret på den ene side for at udføre ventrale og horisontale snit som angivet nedenfor.
- Med et par mikrosaks, begyndende fra ventrale punkt af den lodrette indsnit, foretage en horisontal indsnit på ca 15 mm for dyr 10-20 g i vægt. Gør snittet længere for større dyr, og kortere for mindre dyr.
- Ved hjælp af saksen, dissekere medielt gennem den horisontale indsnit indtil rygsøjlen mærkes i midterlinjen.
- Gentag trin 3,3, 3.3.1 og 3.3.2 på den anden side af dyret.
-
Efter at have dissekeret i den dybe mediale plan fra begge sider, dissekere gennem midterlinjen, og dermed forbinde de to horisontale snit.
- Flyt det frie stykke hale og køl til den ene side, og Afslør de spinale processer (figur 1).
- Fixate hale stykket ved hjælp af våde papirhåndklæder.
-
Anbring dyret i den udsatte position igen med hovedet vendt mod kirurgens ikke-dominerende side.
- Med et par pincet skal du tage fat i de spinde processer, der kun er hale til bagbenene. Påfør en blid løft både op og mod hovedet af dyret.
- Placer knivene på et par mikrosaks vandret omkring processen og skær den forsigtigt. Elevatoren på processen sikrer, at det nu er fjernet, udsætter rygmarven.
- Tag fat i den spinale proces, der bare er blevet fjernet, og Gentag trin 3.5.1 og 3.5.2.
Bemærk: Dette bør efterlade en eksponeret rygmarv svarende til to vertebrale niveauer. Når du udfører laminektomi, en hvid skummende sekretion ofte vises. Rygmarven er let identificeres ved sin karakteristiske glans, sammen med et fartøj, der kører langs midterlinjen. - Afhængigt af dyrets størrelse kan det udsatte område ikke være bredt nok. Brug to par tang, tag fat i tynde på begge sider af rygmarven, og drej disse sidelæns med en blid bevægelse.
4. indførelse af en kontusion type skade (figur 2)
- Hold dyret i den udsatte position.
- Brug Petri skålen til at overføre dyret til traume enheden.
- Har en assistent skinne en lommelygte på rygmarven.
- Placer kontusion traume enhedens cylinder over den udsatte rygmarv ved hjælp af mikrojustererne på enheden. Mål gennem cylinderen.
- Sænk cylinderen, indtil den er i niveau med laminae.
- Fastgør den faldende stang til elektromagnet. Placer den ønskede faldende højde justerings cylinder på traume enheden.
- Placer den faldende stang i cylinderen.
Bemærk: For en blindet undersøgelse, bør kirurgen nu forlade rummet uden at vide, hvis dyret vil blive tildelt en skade eller en fingeret kirurgi gruppe. - Sluk for elektromagnet. Stangen falder til den udsatte rygmarv.
- Brug højden justeringsskruen til at løftestangen fra rygmarven.
- Bekræft skaden ved at se på rygmarven gennem mikroskop. Den skadede side vil fremstå mørkere, og blødning fra midterlinjen fartøj vil være tydelig.
5. indførelse af en skarp skade
Bemærk: Udfør disse trin efter 3.5.4.
- Med et par mikrosaks skæres rygmarven i en perfekt lodret snit.
- Gentag snittet 2 mm til den hale side af kroppen.
Bemærk: Længden af det fjernede stykke rygmarv kan justeres i forhold til undersøgelsens krav. Dog vil en 2 mm cut være regenererbar10. - Sørg for, at udskæringerne er komplette. Når du er færdig, føler du knivene i saksen skrabning langs den ventrale del af rygmarvskanalen.
- Løft 2 mm rygmarven fra rygmarvskanalen.
6. lukning af det kirurgiske sår
- Returner dyret til operationsbordet. I en blind undersøgelse, flytte kølen, så rygmarven ikke er synlig for kirurgen.
-
Hold dyret i den udsatte position.
- Begynd at placere 10,0 nylon suturer fra den mest hale del af den horisontale incision. Luk sårene i et lag.
Bemærk: Tag ikke fat i huden for stramt, fordi det vil påføre nekrose. - Arbejde hen imod den lodrette del af snittet.
- Når du når vinklen, drej Petri skålen og sutur den anden horisontale incision.
- Sæt suturer på de lodrette snit.
- Placer ikke suturer i den øverste del af kølen, fordi huden her ikke vil være i stand til at holde.
- Begynd at placere 10,0 nylon suturer fra den mest hale del af den horisontale incision. Luk sårene i et lag.
7. returnering af dyret til den Anæstetikfri løsning
- Løft Petri skålen med dyret og Nedsænk begge meget forsigtigt i ferskvand kun 5 cm dyb og lad dyret glide af.
Bemærk: Den lave vanddybde sikrer, at dyret ikke vil forsøge at svømme til overfladen for at trække vejret. - Du må ikke skifte vand i den første uge.
- Ved fodring af dyrene, sikre, at maden er placeret i nærheden af dyrets hoved.
Bemærk: Formålet med disse foranstaltninger er at undgå så megen bevægelse som muligt i den første uge.
8. postoperative ultralyd
- Før afslutningen af anæstesi, bruge en højfrekvent ultralyd system til at erhverve billeder af den skade, der kan anvendes til opførelse af tredimensionelle billeder af SCI site.
- Fastgør transduceren til en micromanipulator, der fortrinsvis styres af et fjernbetjenings joystick.
- Nedsænk det bedøvede dyr i den udsatte position i en lille beholder fyldt med bedøvelsesmiddel opløsning.
Bemærk: Fastgør dyret med miniature sand poser eller andet udstyr for at undgå bevægelse under scanningssekvensen. - Juster spidsen af transduceren med dyrets længdeakse og nedsænk den i benzocain-opløsningen, indtil den kun er et par millimeter over kølen bag dyrets baglemmer.
- Identificer SCI-webstedet.
Bemærk: Skaden site er let genkendelige på grund af de manglende torn processer direkte over sci. - Optimer billedet ved at justere ultralyds indstillingerne. Sørg for, at SCI-webstedet er i midten af billedet. Juster synsfeltet (dvs. billeddybde, dybde forskydning og billedbredde) for at dække SCI-stedet og tilstødende sundt væv. Juster den todimensionelle gevinst for at optimere billedets kontrast.
- Ved at feje ultralydtransduceren på tværs af SCI-stedet med en elektronisk betjent micromanipulator, erhverve B-mode billeder, der dækker SCI site på flere sagittale tværsnits udsnit steder, med fortløbende skiver med en Interslice interval på 50 μm. erhverve Cine-billeder, der indeholder 500 rammer med en frame rate på ~ 50 frames/s og en transducer frekvens på 40 MHz.
Bemærk: Denne opsætning kræver en elektronisk micromanipulator styret af en fjernbetjening joystick (trin 8,2). - Når scanningssekvensen er færdig, skal du vende tilbage til trin 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Formålet med protokollen er at producere en SCI, der vil lamme motoriske og sensoriske funktioner caudal til skaden. Da Axolotler er regenererings kompetent, genopretter det funktionen inden for uger, hvilket gør det muligt for forskerne at studere CNS-regenerering i løbet af et kort tidsrum.
Anæstesi blev fastsat for 45 min til alle dyr, og ingen episoder af præterm opsving blev oplevet. Alle dyr genvundet inden for en time og viste ingen tegn på skader fra anæstesi i de følgende uger13,16.
Laminektomi var vellykket i alle dyr. Men anatomiske variation i bredden af rygmarvskanalen opfordrede til udvidelse af kanalen ved hjælp af pincet og et twist i nogle individer. Desuden forhindrede resterende tynde i nogle individer den faldende stang i at nå sit mål, hvilket gør det bydende nødvendigt, at kirurgen Rengør feltet fra rest knoglen og produser.
Lukning af indsnit var forbundet med nogle vanskeligheder, især i pilotfasen af undersøgelsen. Suturer i den øverste del af kølen ville ikke holde og resulterede i utilstrækkelige lukninger. Lukningen af et dyr i studiet ikke holde, hvilket resulterede i kølen bliver revet, efterfølgende infektion, og død. Dette understreger behovet for omhyggelig suturering langs hele incisioner.
De første mekaniske skader var indlysende under proceduren. Undermodel udviklingen blev sårede og fingeret dyr plettet med hematoxylinlegemer og eosin for at validere skaden. Repræsentative resultater for hver gruppe er vist i figur 3a1,a2 og figur 3C1,C2. Regenerering blev bekræftet af histologiske afsnit præparater, der blev foretaget efter ni uger (figur 3B1,B2 og figur 3D1,D2), som viste en genetableret rygmarvs forbindelse i Sci-dyrene.
Skade og regenerering kan følges ved at undersøge neurologisk funktion. Stimulering af halen med en let berøring og klemning fra pincet vil afsløre, om taktile og nociceptive sensoriske funktioner er gået tabt og potentielt genetableret. En neurologisk score blev defineret baseret på reaktionen fra dyret: 0 point = intet respons, 1 point = lokal hale bevægelse, 2 point = alminde bevægelse, 3 point = koordineret bevægelse af lemmer og/eller hoved sammen med alminde bevægelse, 4 point = dyr med øjeblikkelig koordineret hurtig bevægelse. I seks SCI dyr versus fem fingdyr tab af neurologiske funktion tre uger efter skade blev fundet, og en gradvis restaurering inden for ni uger (figur 4 og supplerende video 1).
Ultrasonografiske billeder af den skadede rygmarv kan opnås ved hjælp af ovenstående protokol. Det var muligt at visualisere SCI-stedet på grund af den åbenlyse mangel på knogle spjættende processer (figur 5). Desuden, ved hjælp af B-mode rygmarven i den uforkrænkede rygmarv kunne visualiseres, hvilket giver en markør for skibets integritet.
Det er muligt at afprøve dyrene straks efter opvågning. Men nogle dyr udtrykte lokale små amplitude, gentagne og rytmiske hale bevægelse ved stimulation sammenlignelig med de klonus fænomener observeret i human sci. Disse bevægelser kan repræsentere klonus eller en mangel på central refleks undertrykkelse og kan potentielt forårsage mere skade på den nyligt tilskadekomne rygmarv. Derfor, testning af dyrene er ikke anbefale før en uge efter skade.
Fra simpel kvalitativ observation af dyrene, vil det være indlysende, at halen er lammet, og svømning er betydeligt hæmmet, hvilket gør dyrene helt afhængige af at flytte deres lemmer. Disse observationer vil også validere protokollens succes.
High-Field MRI-scanninger (9,4 T) blev udført umiddelbart efter skaden for at visualisere skaden in vivo (figur 6). Men, scanninger var generelt lav i signal-til-støj-forhold sammenlignet med de ikke-opererede dyr, sandsynligvis på grund af blødning og hemosiderin. Derfor blev det konkluderet, at MRI var en suboptimal metode til at validere den skade og succes af protokollen.
Figur 1: skematisk tegning af mikrokirurgisk laminektomi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk tegning af kontusion traume mekanismen. A) hele opsætningen, der viser den faldende stang over dyret. B) den afmonterede mekanisme, der viser, hvordan stangen er frakoblet elektromagnet nettet. C) den faldende stang er forbundet med elektromagnetisk nettet. Den faldende højdejustering cylinder er installeret, og elektromagnet og stang lastet i cylinderen. Højdejustering af hele systemet styres af et justeringshjul. (D) slukning af elektromagnet vil medføre, at stangen falder, uden at operatøren rører ved systemet. Figuren blev oprindelig udgivet af Thygesen et al.13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: histologiske sektioner hematoxylinlegemer og eosin farves straks og ni uger efter skade. (A1) Umiddelbart efter skaden. (B1) SCI Animal på ni uger. (C1) Sham kirurgi dyr umiddelbart efter skaden. (D1) Sham dyr på ni uger. Rød firkant = markerer skaden af de SCI dyr, og laminektomi af fingeret dyr. Figur2A, figur 2B, figur 2C , er forstørrelse af disse områder ved 5x. Blå pil = uskadet rygmarv. Dette tal blev oprindelig udgivet af Thygesen et al.13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: graf over respons på taktile stimuli. SCI-gruppernes respons er lavere efter tre uger sammenlignet med Sham-gruppen. WPI = uger efter skade, sort linje = SCI, grå farve = Sham. Sham n = 5, SCI n = 6. Figuren blev oprindelig udgivet af Thygesen et al.13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Ultrasonographic billede, der viser rygmarven i en sagittale sektion. Gule linjer markerer rygmarven, gul cirkel skadestedet, og hvide pile markere hvirvlerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: MRI-scanninger på forskellige tidspunkter efter skade eller fingeret kirurgi. CSF omkring rygmarven mangler, især på tre WPI for SCI dyret, hvilket indikerer hævelse af rygmarven. Mørkfarvning af rygmarven indikerer ødem så godt. Bemærk, hvordan disse ændringer forsvinder, når regenerering skrider frem. Gul pil = området for laminektomi. Figuren blev oprindelig udgivet af Thygesen et al.13. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende video 1: Video, der viser den neurologiske funktion efter taktile stimuli og senere en nociceptive stimulus. Først en sund kontrol dyr, og derefter et dyr, der lider af SCI. venligst klik her for at downloade denne video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordi risikoen for skader på rygmarven er signifikant, de kritiske trin i protokollen er at fjerne de spinale processer og udvidelse af knogle adgang til rygmarvskanalen, hvis det er nødvendigt. Som nævnt i protokollen, at fjerne den mest kranie proces først anbefales stærkt. Dette vil betyde, at jo mere hale processer beskytte rygmarven fra at blive ramt af saksen. Det anbefales at sikre tilstrækkelig kirurgisk adgang, hvilket betyder at ikke gøre for lille en primær incision. Også, når man griber noget med tang, skal retningen af pull anvendes altid tages i betragtning. Anvendelse af en blid træk væk fra rygmarven vil beskytte det i tilfælde af greb svigt og en slip af instrumentet.
Den kirurgiske procedure i Axolotler er ikke forskellig fra andre dyr. Der findes dog visse vigtige forskelle, som primært kan tilskrives dyrets vævs sammensætning og-størrelse. Den Axolotler Keel hud er meget skrøbelig, og paradoksalt nok ikke helbrede godt på små skader påført under incision. Der bør udvises forsigtighed, især på de primære incisioner, fordi skaden i væsentlig grad vil komplicere suturering. Knoglerne i meget unge kendt er meget bløde. Det betyder, at ofte grundlæggende anatomiske pincet kan være tilstrækkeligt i knogle fjernelse. Dette præsenterer et andet element af forsigtighed, fordi klemme de spinde processer kan påføre betydelige skader. De subkutane og muskel fascia lag er ikke tilgængelige for suturing, på grund af deres skrøbelige væv kompositioner. Det er bydende nødvendigt at sikre en rolig postoperative uge. Dyrene må ikke hvile tilstrækkeligt efter operationen. Derfor, de kan påføre sekundær skade på deres rygmarv postoperativt. Deres lille anatomi giver ikke mulighed for hverken intern eller spline fiksering.
Vægt og faldende højde af det faldende stang system er afgørende for at påføre en kontusion skade. Under omfattende pilotering for en tidligere undersøgelse, stang vægt og faldende højde nødvendig blev fundet at være 25 g og 3 cm13. Dette var nok til at inducere lammelse i 12 g kendt uden at skære eller desintegrere rygmarven. Ekstra vægt eller faldende højde kan være nødvendig i større dyr. Desuden skal diameteren af den faldende stang måske være større i tilfælde af større dyr og kortere for mindre dyr.
Modellen har nogle begrænsninger. Da kendt ikke anvendes til undersøgelser af lærde adfærd, kan man ikke teste komplekse neurologiske funktioner. Skaden blev introduceret caudal til lemmer, Skåne bagbenene og tarm og blære fra at blive lammet. Årsagen til dette var etisk, at reducere indvirkningen på dyret til et minimum. Men det begrænser muligheden for at studere virkningerne på lemmer bevægelser, som kan være lettere at beskrive og kategorisere. En stor del af den SCI-associerede sygelighed stammer fra tabet af kontrol af tarm og blære. Denne model giver ikke mulighed for fremtidig forskning på disse områder. Det ville være muligt at påføre skade rostral Columns på bagbenene, men det blev ikke forsøgt.
At studere SCI i en regenerativ model som Axolotler giver mulighed for en anden tilgang i SCI Research. Da dyremodellen kan regenerere, vil eliminations undersøgelser være i stand til at afsløre kritiske faktorer for regenerering. Konventionelle undersøgelser af Sci udføres i ikke-regenerativ modeller, hvilket betyder, at man bliver nødt til at gribe ind på alle kritiske faktorer for at fremkalde en regenerativ respons.
Denne model og protokol er i overensstemmelse med Kroghs princip om, at: "for et så stort antal problemer vil der være nogle dyr af valg eller et par af disse dyr, som det kan være mest bekvemt undersøgt"17. Regenerering af pattedyr hæmmes af flere faktorer. Hæmme disse i en pattedyr model normalt ikke fremkalde nogen virkninger. Men, stigende niveauer af hæmmere i Axolotler bør eliminere regenerering, og derved afsløre, om denne hæmmer er kritisk eller ikke10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Michael Pedersen, Aarhus Universitet for sin ekspertise og tid på at udvikle MRI-protokoller og oprette hele projektet. Peter Agger, Aarhus Universitet for sin ekspertise og tid på at udvikle MRI-protokollerne. Steffen Ringgard, Aarhus Universitet for sin ekspertise og tid på at udvikle MRI-protokollerne. Udviklingen af SCI-modellen i Axolotler blev venligt støttet af A.P. Møller Maersk Foundation, Riisfort Foundation, Linex Foundation og ELRO Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g - 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| Electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Kimwipes | |||
| Microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring approximately 70 x 55 cm2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
References
- Shavelle, R. M., DeVivo, M. J., Brooks, J. C., Strauss, D. J., Paculdo, D. R. Improvements in Long-Term Survival After Spinal Cord Injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96 (4), 645-651 (2015).
- Hicken, B. L., Putzke, J. D., Richards, J. S. Bladder management and quality of life after spinal cord injury. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 80 (12), 916-922 (2001).
- Levi, R., Hultling, C., Nash, M. S., Seiger, A. The Stockholm spinal cord injury study: 1. Medical problems in a regional SCI population. Paraplegia. 33 (6), 308-315 (1995).
- Bjornshave Noe, B., Mikkelsen, E. M., Hansen, R. M., Thygesen, M., Hagen, E. M. Incidence of traumatic spinal cord injury in Denmark, 1990-2012: a hospital-based study. Spinal Cord. 53 (6), 436-440 (2015).
- Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A., Fehlings, M. G. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clinical Epidemiology. 6, 309-331 (2014).
- Aguayo, A. J., et al. Degenerative and regenerative responses of injured neurons in the central nervous system of adult mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 331 (1261), 337-343 (1991).
- Aguayo, A. J., Bjorklund, A., Stenevi, U., Carlstedt, T. Fetal mesencephalic neurons survive and extend long axons across peripheral nervous system grafts inserted into the adult rat striatum. Neuroscience Letters. 45 (1), 53-58 (1984).
- Richardson, P. M., Issa, V. M., Aguayo, A. J. Regeneration of long spinal axons in the rat. Journal of Neurocytology. 13 (1), 165-182 (1984).
- Butler, E. G., Ward, M. B. Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae. Journal of Experimental Zoology. 160 (1), 47-65 (1965).
- Diaz Quiroz, J. F., Tsai, E., Coyle, M., Sehm, T., Echeverri, K. Precise control of miR-125b levels is required to create a regeneration-permissive environment after spinal cord injury: a cross-species comparison between salamander and rat. Disease Model Mechanisms. 7 (6), 601-611 (2014).
- Clarke, J. D., Alexander, R., Holder, N. Regeneration of descending axons in the spinal cord of the axolotl. Neuroscience Letters. 89 (1), 1-6 (1988).
- McHedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the central nervous system during salamander tail regeneration from the implanted neurospheres. Methods of Molecular Biology. 916, 197-202 (2012).
- Thygesen, M. M., et al. A clinically relevant blunt spinal cord injury model in the regeneration competent axolotl (Ambystoma mexicanum) tail. Experimental Therapeutic Medicine. 17 (3), 2322-2328 (2019).
- Goss, R. J. Principles of Regeneration. , Academic Press. New York. (1969).
- Hutchison, C., Pilote, M., Roy, S. The axolotl limb: a model for bone development, regeneration and fracture healing. Bone. 40 (1), 45-56 (2007).
- Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration (Oxford). 4 (3), 124-131 (2017).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
