Summary
Este manuscrito presenta protocolos para infligir quirúrgicamente lesiones de médula espinal controladas y afiladas a un axolotl regenerativo (Ambystoma mexicanum).
Abstract
El propósito de este estudio es establecer un modelo estandarizado y reproducible de lesión de la médula espinal contundente regenerativa en el axolotl (Ambystoma mexicanum). La mayoría de las lesiones clínicas de la médula espinal se producen como traumatismos contundentes de alta energía, lo que induce lesiones por contusión. Sin embargo, la mayoría de los estudios en la médula espinal axolotl se han realizado con traumas agudos. Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo producir un modelo regenerativo más relevante clínicamente. Debido a su impresionante capacidad para regenerar casi cualquier tejido, los axolotls son ampliamente utilizados como modelos en estudios regenerativos y se han utilizado ampliamente en estudios de lesión de la médula espinal (SCI). En este protocolo, los axolotls son anestesiados por inmersión en una solución de benzocaína. Bajo el microscopio, se realiza una incisión angular bilateralmente a un nivel justo caudal a las extremidades posteriores. A partir de esta incisión, es posible diseccionar y exponer los procesos espinosos. Usando fórceps y tijeras, se realiza una laminectomía de dos niveles, exponiendo la médula espinal. Se construye un dispositivo de trauma personalizado que consiste en una varilla que cae en un cilindro, y este dispositivo se utiliza para inducir una lesión de contusión en la médula espinal. Las incisiones se suturan y el animal se recupera de la anestesia. El enfoque quirúrgico es exitoso en la exposición de la médula espinal. El mecanismo de traumatismo puede producir lesiones por contusión en la médula espinal, como lo confirma la histología, la resonancia magnética y el examen neurológico. Finalmente, la médula espinal se regenera a partir de la lesión. El paso crítico del protocolo es eliminar los procesos espinosos sin infligir daño a la médula espinal. Este paso requiere capacitación para garantizar un procedimiento seguro. Además, el cierre de la herida depende en gran medida de no infligir daños innecesarios a la piel durante la incisión. El protocolo se realizó en un estudio aleatorizado de 12 animales.
Introduction
El objetivo general de este estudio fue establecer un método microquirúrgico controlado y reproducible para infligir SCI contundente y agudo al axolotl (Ambystoma mexicanum), produciendo un modelo de lesión regenerativa de la médula espinal.
El Lico de SCI es una afección grave que, dependiendo del nivel y la extensión, inflige discapacidad neurológica a las extremidades junto con deterioro de la vejiga y el control intestinal1,2,3. La mayoría de sCI son el resultado de traumas contundentes de alta energía como accidentes de tráfico y caídas4,5. Las lesiones bruscadas son muy raras. Por lo tanto, el tipo de lesión macroscópica más común son las contusiones.
El sistema nervioso central de los mamíferos (SNC) es un tejido no regenerativo, por lo tanto no se ve restauración del tejido neurológico después de SCI6,7,8. Por otro lado, algunos animales tienen una capacidad intrigante para regenerar tejidos, incluyendo el tejido del SNC. Uno de estos animales es el axolotl. Es ampliamente utilizado en estudios de biología regenerativa y es de interés en la regeneración de la médula espinal, ya que es un vertebrado9,10,11,12.
La mayoría de los estudios de SCI en el axolotl se realizan como amputación de toda la cola o ablación de una mayor parte de la médula espinal9,10,11,12. Recientemente, se publicó un nuevo estudio sobre lesiones contundentes13 que imita mejor las situaciones clínicas. Mientras que la amputación completa del apéndice en el axolotl da lugar a una regeneración completa, algunos fenómenos regenerativos no basados en la amputación dependen del defecto de tamaño crítico (CSD)14,15. Esto significa que las lesiones que superan un umbral crítico no se regeneran. Para desarrollar un modelo regenerativo con un mayor valor traslacional clínico, este estudio investigó si un traumatismo contundente de 2 mm superaría el límite de DSA.
Este método es relevante para los investigadores que trabajan en la regeneración de la médula espinal en modelos animales pequeños, especialmente en el axolotl. Además, puede ser de mayor interés general, ya que exhibe una forma de utilizar equipos de laboratorio estándar para desarrollar un mecanismo de trauma contundente que sea adecuado para su uso en animales pequeños en general.
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Protocol
Durante este estudio se siguieron todas las reglamentaciones institucionales y gubernamentales aplicables relativas al uso ético de los animales. El estudio fue realizado bajo el id de aprobación: 2015-15-0201-0061 por la Inspección Danesa de Experimentos Animales. Los animales eran axolotls mexicanos(Ambystoma mexicanum, masa corporal media : STD: 12.12 g a 1.25 g).
1. Preparación
-
Prepare axolotl para la anestesia.
- Utilice agua del grifo no tratada químicamente de alta calidad. Si no está disponible, utilice la solución de Holtfreter al 40%.
- Disolver 200 mg de etil 4-aminobenzoato (benzocaína) en 3 ml de acetona. Disolver esta solución en 1 L de agua del grifo o 40% de la solución de Holtfreter.
- Utilice una placa Petri estándar (100 mm de diámetro) colocada bajo un microscopio estéreo como mesa quirúrgica. Coloque un paño textil quirúrgico en el plato Petri.
NOTA: El uso de un plato de Petri como área quirúrgica permite el movimiento y la rotación del animal sin tocarlo, asegurando la estabilidad de la columna vertebral durante la cirugía. - Preparar todos los instrumentos microquirúrgicos estériles (es decir, tijeras y fórceps anatómicos).
2. Anestesia
- Colocar el axolotl en un recipiente con solución de benzocaína durante aproximadamente 45 minutos para garantizar una anestesia profunda y estable.
NOTA: La concentración dada de benzocaína causará anestesia en todos los tamaños de axolotls. - Compruebe si hay signos de anestesia general en un plazo de 30-45 min. Estos incluyen una falta completa de movimientos de las branquias, reflejo de enderece, o respuesta a estímulos táctiles o dolorosos (pellizco suave de la tela del dedo del dedo del dedo del dedo del tiempo).
- Para mantener la anestesia, envuelva los animales en toallas de papel humedecidas en la solución anestésica. Humedezca regularmente con esta solución durante el procedimiento quirúrgico para asegurarse de que la piel y las branquias se mantengan húmedas.
- Recuperar al animal después de la cirugía colocándolo en un recipiente que contiene agua fresca del grifo. Observar signos de recuperación, como movimiento de las branquias y reflejo de derecho recuperado, dentro de 1 h16.
3. Laminectomía microquirúrgica
NOTA: La laminectomía se realiza bajo un estereomicroscopio.
- Coloque el animal en posición propensa en el plato Petri. Envuélvalo en toallas de papel para que la cola quede expuesta.
NOTA: Las toallas de papel son excelentes para garantizar la estabilidad durante todo el procedimiento. -
Identifique las extremidades posteriores. Haz la primera incisión que sea caudal para ellos.
- Con un par de microtijeras, realice una incisión vertical desde la quilla hasta que se sienta la prominencia ósea de los procesos espinosos.
NOTA: Tenga mucho cuidado al agarrar la quilla y la piel con fórceps, ya que estos causan fácilmente daño a la delicada piel. - Extienda el corte lateralmente, de modo que la incisión atraviese todo el ancho de la cola.
- Sujete el proceso espinoso con fórceps para asegurar la profundidad correcta.
- Extienda las incisiones verticales 1 mm por debajo del proceso espinoso en ambos lados.
- Con un par de microtijeras, realice una incisión vertical desde la quilla hasta que se sienta la prominencia ósea de los procesos espinosos.
-
Coloque el animal en un lado para realizar incisiones ventrales y horizontales como se indica a continuación.
- Con un par de microtijeras, a partir del punto ventral de la incisión vertical, haga una incisión horizontal de aproximadamente 15 mm para animales de 10-20 g de peso. Haga la incisión más larga para los animales más grandes, y más corta para los animales más pequeños.
- Usando las tijeras, diseccione medialmente a través de la incisión horizontal hasta que la columna vertebral se sienta en la línea media.
- Repita los pasos 3.3, 3.3.1 y 3.3.2 en el otro lado del animal.
-
Habiendo diseccionado en el plano medio profundo de ambos lados, diseccionar a través de la línea media, conectando así las dos incisiones horizontales.
- Mueva la pieza libre de cola y quilla a un lado, exponiendo los procesos espínes(Figura 1).
- Fije la pieza de cola con toallas de papel húmedas.
-
Coloque el animal en la posición propensa de nuevo con la cabeza mirando hacia el lado no dominante del cirujano.
- Con un par de fórceps, agarra los procesos espinosos a solo caudal a las extremidades posteriores. Aplicar una elevación suave tanto hacia arriba como hacia la cabeza del animal.
- Coloque las cuchillas de un par de microtijeras horizontales alrededor del proceso y córtelo suavemente. La elevación en el proceso asegura que ahora se retira, exponiendo la médula espinal.
- Sujete el proceso espinoso simplemente caudal al que acaba de eliminar y repita los pasos 3.5.1 y 3.5.2.
NOTA: Esto debe dejar una médula espinal expuesta correspondiente a dos niveles vertebrales. Al realizar la laminectomía, a menudo aparece una secreción blanca espumosa. La médula espinal se identifica fácilmente por su brillo distintivo, junto con un recipiente que corre a lo largo de la línea media. - Dependiendo del tamaño del animal, el área expuesta puede no ser lo suficientemente ancha. Usando dos pares de fórceps, agarra las láminas a ambos lados de la médula espinal y gíralas lateralmente con un movimiento suave.
4. Introducción de una lesión de tipo de contusión (Figura 2)
- Mantenga al animal en posición propensa.
- Utilice el plato Petri para transferir al animal a la unidad de trauma.
- Pida a un asistente que encienda una linterna en la médula espinal.
- Coloque el cilindro de la unidad de trauma de contusión por encima de la médula espinal expuesta utilizando los microajustadores de la unidad. Apunta a través del cilindro.
- Baje el cilindro hasta que esté nivelado con las láminas.
- Fije la varilla que cae al electroimán. Coloque el cilindro de ajuste de altura de caída deseado en la unidad de trauma.
- Coloque la varilla que cae en el cilindro.
NOTA: Para un estudio ciego, el cirujano ahora debe salir de la habitación sin saber si el animal será asignado a una lesión o a un grupo de cirugía falsa. - Apague el electroimán. La varilla cae a la médula espinal expuesta.
- Utilice el tornillo de ajuste de altura para levantar la varilla de la médula espinal.
- Confirme la lesión mirando la médula espinal a través del microscopio. El sitio lesionado aparecerá más oscuro, y el sangrado del vaso de la línea media será evidente.
5. Introducción de una lesión aguda
NOTA: Realice estos pasos después de 3.5.4.
- Con un par de microtijeras cortar la médula espinal en un corte vertical perfecto.
- Repita el corte de 2 mm al lado caudal del cuerpo.
NOTA: La longitud de la pieza de la médula espinal extraída se puede ajustar según el requisito de estudio. Sin embargo, un corte de 2 mm será regenerado10. - Asegúrese de que los cortes estén completos. Al finalizar, siente las cuchillas de las tijeras raspando a lo largo de la parte ventral del canal espinal.
- Levante la pieza de 2 mm de la médula espinal del canal espinal.
6. Cierre de la herida quirúrgica
- Devuelva al animal a la mesa quirúrgica. En un estudio ciego, cambie la posición de la quilla para que la médula espinal no sea visible para el cirujano.
-
Mantenga al animal en posición propensa.
- Comience a colocar 10.0 suturas de nylon de la parte más caudal de la incisión horizontal. Cierre las heridas en una capa.
NOTA: No agarre la piel demasiado apretada, porque infligirá necrosis. - Trabajar hacia la parte vertical de la incisión.
- Al llegar al ángulo, gire la placa Petri y sutura la otra incisión horizontal.
- Ajuste las suturas en las incisiones verticales.
- No coloque suturas en la parte superior de la quilla, porque la piel aquí no será capaz de sostener.
- Comience a colocar 10.0 suturas de nylon de la parte más caudal de la incisión horizontal. Cierre las heridas en una capa.
7. Devolver el animal a la solución libre de anestesia
- Levante el plato Petri con el animal y sumerja ambos muy suavemente en agua dulce de sólo 5 cm de profundidad y deje que el animal se deslice.
NOTA: La profundidad de aguas poco profundas asegura que el animal no intentará nadar a la superficie para respirar. - No cambie el agua durante la primera semana.
- Cuando alimente a los animales, asegúrese de que el alimento se coloca cerca de la cabeza del animal.
NOTA: El propósito de estas medidas es evitar tanto movimiento como sea posible durante la primera semana.
8. Ultrasonido postoperatorio
- Antes de la terminación de la anestesia, utilice un sistema de ultrasonido de alta frecuencia para adquirir imágenes de la lesión que se pueden utilizar para la construcción de imágenes tridimensionales del sitio sCI.
- Conecte el transductor a un micromanipulador preferiblemente gobernado por un joystick remoto.
- Sumerja el animal anestesiado en la posición propensa en un recipiente pequeño lleno de solución anestésica.
NOTA: Fije al animal con sacos de arena en miniatura u otro equipo para evitar el movimiento durante la secuencia de escaneo. - Alinee la punta del transductor con el eje de longitud del animal y sumerja en la solución de benzocaína hasta que esté sólo unos pocos milímetros por encima de la quilla detrás de las extremidades posteriores del animal.
- Identifique el sitio de SCI.
NOTA: El sitio de lesiones es fácilmente reconocible debido a los procesos espinosos que faltan directamente por encima del SCI. - Optimice la imagen ajustando los ajustes de ultrasonido. Asegúrese de que el sitio SCI esté en el centro de la imagen. Ajuste el campo de visión (es decir, profundidad de la imagen, desplazamiento de profundidad y anchura de la imagen) para cubrir el sitio de SCI y el tejido sano adyacente. Ajuste la ganancia bidimensional para optimizar el contraste de la imagen.
- Al barrer el transductor de ultrasonido a través del sitio de SCI con un micromanipulador operado electrónicamente, adquiera imágenes en modo B que cubran el sitio de SCI en múltiples ubicaciones de cortes transversales sagitales, con rodajas consecutivas con un intervalo intercortado de 50 m. Adquirir imágenes cine-insituadas que contengan 500 fotogramas con una velocidad de fotogramas de 50 fotogramas/s y una frecuencia de transductor de 40 MHz.
NOTA: Esta configuración requiere un micromanipulador electrónico gobernado por un joystick remoto (paso 8.2). - Después de terminar la secuencia de escaneo, vuelva al paso 7.
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Representative Results
El propósito del protocolo es producir un SCI que paralizará las funciones motoras y sensoriales caudales a la lesión. Debido a que el axolotl es competente para la regeneración, restaura la función en cuestión de semanas, lo que permite a los investigadores estudiar la regeneración del SNC durante un corto período de tiempo.
Se proporcionó anestesia durante 45 minutos a todos los animales, y no se experimentaron episodios de recuperación prematura. Todos los animales se recuperaron en una hora y no mostraron signos de daño por anestesia en las semanas siguientes13,16.
La laminectomía tuvo éxito en todos los animales. Sin embargo, la variación anatómica en el ancho del canal espinal requería el ensanchamiento del canal usando fórceps y un giro en algunos individuos. Además, las láminas residuales en algunos individuos impidieron que la varilla que cayera alcanzara su objetivo, por lo que era imperativo que el cirujano limpiara el campo del hueso residual y las prominencias.
El cierre de las incisiones se asoció con algunas dificultades, especialmente durante la fase de pilotaje del estudio. Las suturas en la parte superior de la quilla no aguantaban y resultaron en cierres insuficientes. El cierre de un animal en el estudio no se atuvo, lo que resultó en la rotura de la quilla, infección posterior, y la muerte. Esto hace hincapié en la necesidad de suturar cuidadosamente a lo largo de todas las incisiones.
Las lesiones mecánicas iniciales fueron obvias durante el procedimiento. Durante el desarrollo del modelo, los animales heridos y falsos fueron manchados con hematoxilina y eosina para validar la lesión. Los resultados representativos de cada grupo se muestran en la Figura 3A1,A2 y Figura 3C1,C2. La regeneración fue confirmada por las preparaciones de las secciones histológicas realizadas después de nueve semanas(Figura 3B1,B2 y Figura 3D1,D2), que mostraron una conexión de la médula espinal restablecida en los animales sIC.
La lesión y la regeneración pueden ser seguidas por el examen de la función neurológica. Estimular la cola con un ligero toque y pellizcar se pellizcar de fórceps revelará si las funciones sensoriales táctiles y nociceptivas se han perdido y potencialmente restablecido. Se definió una puntuación neurológica en función de la reacción del animal: 0 puntos sin respuesta, 1 punto de movimiento de la cola local, 2 puntos de movimiento truncamiento, 3 puntos de movimiento coordinado de las extremidades y/o cabeza junto con el movimiento truncal, 4 puntos a animales con movimiento rápido coordinado inmediato. En seis animales de LiS frente a cinco animales falsos se encontró la pérdida de la función neurológica tres semanas después de la lesión, y una restauración gradual dentro de nueve semanas(Figura 4 y Video Suplementario 1).
Las imágenes ultrasonográficas de la médula espinal lesionada se pueden obtener utilizando el protocolo anterior. La visualización del sitio SCI fue posible debido a la evidente falta de procesos espinosos óseos(Figura 5). Además, utilizando el modo B, se podría visualizar la arteria dorsal de la médula espinal no lesionada, lo que produjo un marcador de integridad del vaso.
Es posible probar a los animales inmediatamente después de despertar. Sin embargo, algunos animales expresaron un movimiento local de pequeña amplitud, repetitivo y rítmico de la cola tras la estimulación comparable a los fenómenos clónicos observados en el LicoS humano. Estos movimientos pueden representar clonación o falta de supresión del reflejo central y potencialmente podrían causar más daño a la médula espinal recién lesionada. Por lo tanto, el ensayo de los animales no se recomienda antes de una semana después de la lesión.
A partir de la simple observación cualitativa de los animales, será evidente que la cola está paralizada, y la natación se inhibe significativamente, haciendo que los animales completamente dependientes de mover sus extremidades. Estas observaciones también validarán el éxito del protocolo.
Las resonancias magnéticas de campo alto (9,4 T) se realizaron inmediatamente después de una lesión para visualizar la lesión in vivo(Figura 6). Sin embargo, los escaneos fueron generalmente bajos en relación señal-ruido en comparación con los de animales no operados, probablemente debido al sangrado y la hemosiderina. Por lo tanto, se llegó a la conclusión de que la RMN era un método subóptimo para validar el daño y el éxito del protocolo.
Figura 1: Dibujo esquemático de la laminectomía microquirúrgica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Dibujo esquemático del mecanismo de trauma de contusión. (A) Toda la configuración, mostrando la varilla que cae por encima del animal. (B) El mecanismo desmontado, que muestra cómo se desconecta la varilla del electroimán. (C) La varilla de caída está conectada al electroimán. Se instala el cilindro de ajuste de altura de caída, y el electroimán y la varilla se cargan en el cilindro. El ajuste de altura de todo el sistema se controla mediante una rueda de ajuste. (D) Apagar el electroimán hará que la varilla se caiga sin que el operador toque el sistema. Figura fue publicado originalmente por Thygesen et al.13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Secciones histológicas hematoxilina y eosina manchadas inmediatamente y nueve semanas después de la lesión. (A1) SCI animal inmediatamente después de una lesión. (B1) Animal de SCI a las nueve semanas. (C1) Sham cirugía animal inmediatamente después de la lesión. (D1) Un animal sham a las nueve semanas. Cuadrado rojo: marca la lesión de los animales de SCI y la laminectomía del animal falso. Figura 2A, Figura 2B, Figura 2C son aumentos de estas áreas en 5x. Flecha azul: médula espinal no lesionada. Esta figura fue publicada originalmente por Thygesen et al.13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Gráfico de respuesta a estímulos táctiles. La respuesta de los grupos SCI es menor después de tres semanas, en comparación con el grupo falso. WPI - semanas después de la lesión, línea negra - SCI, color gris - falso. Sham n n 5, SCI n 6. Figura fue publicado originalmente por Thygesen et al.13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Imagen ultrasonográfica que muestra la médula espinal en una sección sagital. Las líneas amarillas marcan la médula espinal, el círculo amarillo en el sitio de la lesión y las flechas blancas marcan las vértebras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Exploraciones por RMN en diferentes momentos después de una lesión o cirugía falsa. Falta lifa que rodea la médula espinal, especialmente en tres WPI para el animal de SCI, lo que indica hinchazón de la médula espinal. El oscurecimiento de la médula espinal también indica edema. Observe cómo estos cambios desaparecen a medida que avanza la regeneración. Flecha amarilla: el área de la laminectomía. Figura fue publicado originalmente por Thygesen et al.13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Vídeo suplementario 1: Vídeo que muestra la función neurológica después de estímulos táctiles y más tarde un estímulo nociceptivo. Primero un animal de control saludable, y luego un animal que sufre de SCI. Por favor, haga clic aquí para descargar este video.
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Discussion
Debido a que el riesgo de lesión en la médula espinal es significativo, los pasos críticos del protocolo son la eliminación de los procesos espinosos y el ensanchamiento del acceso óseo al canal espinal si es necesario. Como se mencionó en el protocolo, se recomienda eliminar primero el proceso más craneal. Esto significará que cuantos más procesos caudales protejan la médula espinal de ser golpeada por las tijeras. Se recomienda asegurar suficiente acceso quirúrgico, lo que significa no hacer una incisión primaria demasiado pequeña. Además, al agarrar cualquier cosa con fórceps, siempre se debe considerar la dirección del tirón aplicado. La aplicación de un suave tirón de la médula espinal la protegerá en caso de que la sujeción falle y un resbalón del instrumento.
El procedimiento quirúrgico en el axolotl no es diferente de otros animales. Sin embargo, existen ciertas diferencias importantes, principalmente atribuibles a la composición del tejido y el tamaño del animal. La piel de la quilla de axolotl es muy frágil, y paradójicamente no sana bien sobre pequeños daños infligidos durante la incisión. Se debe tener precaución, especialmente en las incisiones primarias, porque el daño complicará sustancialmente la sutura. Los huesos de axolotls muy jóvenes son muy suaves. Esto significa que a menudo los fórceps anatómicos básicos pueden ser suficientes en la extracción ósea. Esto presenta otro elemento de precaución, porque pellizcar los procesos espinosos podría infligir un daño sustancial. Las capas de fascia subcutánea y muscular no están disponibles para suturar, debido a sus frágiles composiciones de tejido. Es imperativo asegurar una semana postoperatoria tranquila. Los animales pueden no descansar lo suficiente después de la operación. Por lo tanto, pueden infligir daño secundario a su médula espinal postoperatoria. Su pequeña anatomía no permite la fijación ni interna ni spline.
El peso y la altura de caída del sistema de varilla sin caídas es crucial para infligir una lesión por contusión. Durante el pilotaje extenso para un estudio anterior, se encontró que el peso de la varilla y la altura de caída necesaria sin 25 g y 3 cm13. Esto fue suficiente para inducir parálisis en axolotls de 12 g sin cortar o desintegrar la médula espinal. Es posible que se necesite un mayor peso o una altura de caída en animales más grandes. Además, el diámetro de la varilla que cae podría necesitar ser más grande en el caso de animales más grandes y más corto para los animales más pequeños.
El modelo tiene algunas limitaciones. Debido a que los axolotls no se utilizan para estudios de comportamiento aprendido, no se pueden probar funciones neurológicas complejas. La lesión se introdujo caudal en las extremidades, evitando que las extremidades posteriores y el intestino y la vejiga se paralizaban. La razón de esto fue ética, para reducir el impacto en el animal al mínimo. Sin embargo, limita la oportunidad de estudiar los efectos en los movimientos de las extremidades, que pueden ser más fáciles de describir y categorizar. Una gran parte de la morbilidad asociada al SCI proviene de la pérdida del control del intestino y la vejiga. Este modelo no permite futuras investigaciones en estos campos. Infligir daño rostral a las extremidades posteriores sería posible, pero no se intentó.
El estudio de SCI en un modelo regenerativo como el axolotl permite un enfoque diferente en la investigación de SCI. Debido a que el modelo animal puede regenerarse, los estudios de eliminación serán capaces de revelar factores críticos de regeneración. Los estudios convencionales sobre SCI se realizan en modelos no regenerativos, lo que significa que uno tendrá que intervenir en todos los factores críticos para inducir una respuesta regenerativa.
Este modelo y protocolo están en concordancia con el principio de Krogh que establece que: "Para un número tan grande de problemas habrá algún animal de elección o algunos de estos animales en los que se puede estudiar más convenientemente"17. La regeneración de mamíferos se inhibe por múltiples factores. Inhibir estos en un modelo de mamífero sin dumosen generalmente no induce ningún efecto. Sin embargo, el aumento de los niveles de inhibidores en el axolotl debe eliminar la regeneración, y así revelar si ese inhibidor es crítico o no10.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Michael Pedersen, de la Universidad de Aarhus por su experiencia y tiempo en el desarrollo de protocolos de RMN y la creación de todo el proyecto. Peter Agger, de la Universidad de Aarhus por su experiencia y tiempo en el desarrollo de los protocolos de RMN. Steffen Ringgard, de la Universidad de Aarhus por su experiencia y tiempo en el desarrollo de los protocolos de RMN. El desarrollo del modelo SCI en el axolotl fue apoyado amablemente por la Fundación A.P. M'ller Maersk, la Fundación Riisfort, la Fundación Linex y la Fundación ELRO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g - 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| Electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Kimwipes | |||
| Microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring approximately 70 x 55 cm2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
References
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