Summary
Este manuscrito apresenta protocolos para infestar cirùrgica ferimentos de medula espinal controlados e afiados a um Axolotl regenerativo (mexicanum de Ambystoma).
Abstract
O objetivo deste estudo é estabelecer um modelo de lesão medular sem corte regenerativa padronizada e reprodutível no Axolotl (Ambystoma mexicanum). A maioria das lesões clínicas da medula espinhal ocorrem como traumas contundentes de alta energia, induzindo lesões de contusão. Entretanto, a maioria de estudos na medula espinal do Axolotl foram conduzidos com traumas afiados. Assim, este estudo tem como objetivo produzir um modelo regenerativo mais clinicamente relevante. Devido à sua impressionante capacidade de regenerar quase todos os tecidos, axolotls são amplamente utilizados como modelos em estudos regenerativos e têm sido amplamente utilizados em estudos de lesão medular (SCI). Neste protocolo, os axolotls são anestesiados por submersão em solução de benzocaína. o microscópio, uma incisão angular é feita bilateralmente em um nível apenas caudal para os membros posteriores. A partir desta incisão, é possível dissecar e expor os processos espinhoso. Usando fórceps e tesouras, um laminectomy de dois níveis é executado, expondo a medula espinal. Um dispositivo feito encomenda do traumatismo que consiste em uma haste de queda em um cilindro é construído, e este dispositivo é usado para induzir um ferimento da contusão à medula espinal. As incisões são então suturadas, e o animal se recupera da anestesia. A aproximação cirúrgica é bem sucedida em expor a medula espinal. O mecanismo do traumatismo pode produzir os ferimentos da contusão à medula espinal, como confirmado pela histologia, pelo MRI, e pelo exame neurológico. Finalmente, a medula espinhal se regenera da lesão. A etapa crítica do protocolo é remover os processos espinhoso sem causar dano à medula espinal. Esta etapa requer treinamento para garantir um procedimento seguro. Além disso, o fechamento da ferida é altamente dependente de não infestar danos desnecessários à pele durante a incisão. O protocolo foi realizado em estudo randomizado de 12 animais.
Introduction
O objetivo geral deste estudo foi estabelecer um método microcirúrgico controlado e reprodutível para infestar o Sci Blunt e afiado ao Axolotl (mexicanum de Ambystoma), produzindo um modelo regenerativa da lesão da medula espinal.
A LM é uma condição grave que, dependendo do nível e da extensão, inflige incapacidade neurológica às extremidades, juntamente com comprometimento da bexiga e do controle intestinal1,2,3. A maioria de Sci são o resultado do traumatismo sem corte da alta energia tal como acidentes de tráfego e quedas4,5. Os ferimentos afiados são muito raros. Portanto, o tipo de lesão macroscópica mais comum é contusões.
O sistema nervoso central de mamíferos (SNC) é um tecido não regenerativo,portanto, nãoé observada restauração do tecido neurológico após a LM6,7,8. Por outro lado, alguns animais têm uma capacidade intrigante de regenerar os tecidos, incluindo o tecido do SNC. Um desses animais é o Axolotl. É amplamente utilizado em estudos de biologia regenerativa e é de interesse na regeneração da medulaespinhal, poisé um vertebrado9,10,11,12.
A maioria dos estudos de Sci no Axolotl são realizadas como amputação de toda a cauda ou ablação de uma parte maior da medula espinhal9,10,11,12. Recentemente, um novo estudo foi publicado em lesões contundentes13 que imita situações clínicas melhor. Considerando que a amputação completa do apêndice no Axolotl resulta em regeneração total, alguns fenômenos regenerativos não baseados na amputação dependem do defeitocrítico de tamanho(CSD)14,15. Isto significa que as lesões que excedem um limiar crítico não são regeneradas. Para desenvolver um modelo regenerativo com maior valor translacional clínico, este estudo investigou se um trauma contundente de 2 mm excederia o limite da CSD.
Este método é relevante para pesquisadores que trabalham na regeneração da medula espinhal em pequenos modelos animais, especialmente no Axolotl. Além disso, pode ser de interesse mais geral, porque apresenta uma maneira de usar o equipamento de laboratório padrão para desenvolver um mecanismo sem corte do traumatismo que seja apropriado para o uso em animais pequenos geralmente.
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Protocol
Todos os regulamentos institucionais e governamentais aplicáveis ao uso ético dos animais foram seguidos durante este estudo. O estudo foi conduzido o ID de aprovação: 2015-15-0201-0061 pela Inspetoria da experimentação animal dinamarquesa. Os animais foram axolotls mexicanos (Ambystoma mexicanum, massa corporal média ± dst: 12,12 g ± 1,25 g).
1. preparação
-
Prepare o Axolotl para a anestesia.
- Use água de torneira não-quimicamente tratada de alta qualidade. Se não estiver disponível, use 40% da solução de Holtfreter.
- Dissolver 200 mg de etil 4-aminobenzoato (Benzocaína) em 3 mL de acetona. Dissolva esta solução em 1 L de água da torneira ou 40% de solução de Holtfreter.
- Use um prato de Petri padrão (100 milímetros no diâmetro) coloc um microscópio estereofónico como uma tabela cirúrgica. Coloc um pano de matéria têxtil cirúrgico no prato de Petri.
Nota: Usar uma placa de Petri como uma área cirúrgica permite o movimento e a rotação do animal sem tocá-la, assegurando a estabilidade espinal durante a cirurgia. - Prepare todos os instrumentos microcirúrgicos estéreis (isto é, tesouras e fórceps anatômicos).
2. anestesia
- Coloc o Axolotl em um recipiente com solução do benzocaína por aproximadamente 45 minutos para assegurar a anestesia profunda e estável.
Nota: A concentração dada de benzocaína causará anestesia em todos os tamanhos de axolotls. - Verifique se há sinais de anestesia geral dentro de 30-45 min. Estes incluem uma completa falta de movimentos branquiais, reflexo de endireitando, ou resposta a estímulos táteis ou dolorosos (beliscar suave da teia do dedo do pé).
- Para manter a anestesia, envolva os animais em papel toalha umedtado na solução anestésica. Molhe estes regularmente com esta solução durante o procedimento cirúrgico para assegurar-se de que a pele e as brânquias sejam mantidas húmidas.
- Recupere o animal após a cirurgia, colocando-o em um recipiente contendo água da torneira fresca. Observe os sinais de recuperação, como o movimento das guelras e o reflexo de endireitando, dentro de 1 h16.
3. laminectomia microcirúrgica
Nota: O laminectomy é executado um stereomicroscope.
- Coloque o animal na posição prona na placa de Petri. Enrole-o em toalhas de papel de modo que a cauda é exposta.
Nota: As toalhas de papel são excelentes para assegurar a estabilidade durante todo o procedimento. -
Identifique os membros posteriores. Faça a primeira incisão apenas caudal para eles.
- Com um par de Microtesoura, realize uma incisão vertical da quilha até que a proeminência óssea dos processos espessas sejam sentidos.
Nota: Tenha muito cuidado ao agarrar a quilha e pele com fórceps, porque estes facilmente infligir danos à pele delicada. - Estender o corte lateralmente, de modo que a incisão atravessa toda a largura da cauda.
- Agarre o processo espinhoso com fórceps para assegurar a profundidade direita.
- Estenda as incisões verticais 1 mm abaixo do processo espícuo em ambos os lados.
- Com um par de Microtesoura, realize uma incisão vertical da quilha até que a proeminência óssea dos processos espessas sejam sentidos.
-
Coloc o animal em um lado para executar incisões ventral e horizontais como indicado abaixo.
- Com um par de Microtesoura, a partir do ponto ventral da incisão vertical, fazer uma incisão horizontal de aproximadamente 15 mm para os animais 10-20 g em peso. Faça a incisão mais longa para animais maiores, e menor para animais menores.
- Usando a tesoura, dissecar medialmente através da incisão horizontal até que a coluna vertebral é sentida na linha média.
- Repita os passos 3,3, 3.3.1 e 3.3.2 do outro lado do animal.
-
Tendo dissecado no plano medial profundo de ambos os lados, dissecar através da linha média, conectando assim as duas incisões horizontais.
- Mova o pedaço de cauda e a quilha livres para um lado, expondo os processos espívoros (Figura 1).
- Fixate a parte da cauda usando toalhas de papel molhadas.
-
Coloque o animal na posição propensa novamente com a cabeça virada para o lado não dominante do cirurgião.
- Com um par de fórceps, segure os processos espinhoso apenas caudal aos membros traseiros. Aplique um elevador suave tanto para cima como para a cabeça do animal.
- Coloque as lâminas de um par de Microtesoura horizontal ao redor do processo e gentilmente cortá-la. O elevador no processo assegura-se de que esteja removido agora, expondo a medula espinal.
- Agarre o processo espinhoso apenas caudal a esse que foi removido apenas e repita etapas 3.5.1 e 3.5.2.
Nota: Isso deve deixar uma medula espinhal exposta correspondente a dois níveis vertebrais. Ao executar o laminectomy, uma secreção espumosa branca aparece frequentemente. A medula espinhal é facilmente identificada pelo seu brilho distintivo, juntamente com uma embarcação que corre ao longo da linha média. - Dependendo do tamanho do animal, a área exposta pode não ser suficientemente larga. Usando dois pares de fórceps, segure as lâminas em ambos os lados da medula espinal e torça estes lateralmente com um movimento delicado.
4. introdução de um ferimento tipo contusão (Figura 2)
- Mantenha o animal na posição prona.
- Use o prato de Petri para transferir o animal para a unidade de trauma.
- Ter um assistente brilhar uma lanterna na medula espinhal.
- Coloc o cilindro da unidade do traumatismo da contusão acima da medula espinal expor usando os microajustadores na unidade. Mire no cilindro.
- Abaixe o cilindro até que esteja nivelado com os laminae.
- Prenda a haste de queda ao electroímã. Coloque o cilindro de ajuste de altura de queda desejado na unidade de trauma.
- Coloque a haste de queda no cilindro.
Nota: Para um estudo cego, o cirurgião deve agora sair da sala sem saber se o animal será atribuído a uma lesão ou um grupo de cirurgia Sham. - Desligue o eletroímã. A vara cai para a medula espinhal exposta.
- Use o parafuso de ajuste de altura para levantar a haste da medula espinhal.
- Confirme a lesão observando a medula espinhal através do microscópio. O local ferido aparecerá mais escuro, e o sangramento da embarcação da linha média será aparente.
5. apresentando um ferimento afiado
Nota: Execute estas etapas após 3.5.4.
- Com um par de Microtesoura cortar a medula espinhal em um corte vertical perfeito.
- Repita o corte 2 mm para o lado caudal do corpo.
Nota: O comprimento da parte removida da medula espinal pode ser ajustado como por a exigência do estudo. No entanto, um corte de 2 mm será regenerável10. - Assegure-se de que os cortes estejam completos. Após a conclusão, sentir as lâminas da tesoura raspando ao longo da parte ventral do canal espinhal.
- Levante o pedaço de medula espinhal de 2 mm do canal espinhal.
6. fechando a ferida cirúrgica
- Devolva o animal para a mesa cirúrgica. Em um estudo cego, reposicione a quilha para que a medula espinhal não seja visível para o cirurgião.
-
Mantenha o animal na posição prona.
- Começar a colocar 10,0 suturas de náilon da parte mais caudal da incisão horizontal. Feche as feridas em uma camada.
Nota: Não segure a pele muito apertado, porque ele vai infligir necrose. - Trabalhe para a parte vertical da incisão.
- Ao atingir o ângulo, gire a placa de Petri e sutura a outra incisão horizontal.
- Definir suturas nas incisões verticais.
- Não coloque suturas na parte superior da quilha, porque a pele aqui não será capaz de segurar.
- Começar a colocar 10,0 suturas de náilon da parte mais caudal da incisão horizontal. Feche as feridas em uma camada.
7. devolver o animal à solução livre de anestésico
- Levante o prato de Petri com o animal e mergulhe muito suavemente em água fresca apenas 5 cm de profundidade e deixe o animal deslizar.
Nota: A profundidade da água rasa assegura-se de que o animal não tentará nadar à superfície para respirar. - Não mude a água durante a primeira semana.
- Ao alimentar os animais, certifique-se de que o alimento é colocado perto da cabeça do animal.
Nota: O objetivo destas medidas é evitar o máximo de movimento possível durante a primeira semana.
8. ultrassonografia pós-operatória
- Antes da terminação da anestesia, use um sistema de ultra-som de alta freqüência para adquirir imagens da lesão que pode ser usado para a construção de imagens tridimensionais do site SCI.
- Fixe o transdutor a um micromanipulador, de preferência regido por um joystick remoto.
- Submergir o animal anestesiado na posição prona em um pequeno recipiente preenchido com solução anestésica.
Nota: Fixe o animal com sacos de areia em miniatura ou outro equipamento para evitar movimentos durante a sequência de digitalização. - Alinhe a ponta do transdutor com o eixo de comprimento do animal e mergulhe-o na solução de benzocaína até que seja apenas alguns milímetros acima da quilha atrás dos membros posteriores do animal.
- Identifique o site SCI.
Nota: O local do ferimento é facilmente reconhecível devido aos processos espinhoso faltantes diretamente acima do Sci. - Otimize a imagem ajustando as configurações de ultrassom. Assegure-se de que o site SCI esteja no centro da imagem. Ajuste o campo de visão (ou seja, a profundidade da imagem, o deslocamento de profundidade e a largura da imagem) para cobrir o local de SCI e o tecido saudável adjacente. Ajuste o ganho bidimensional para otimizar o contraste da imagem.
- Varrendo o transdutor do ultra-som através do local do Sci com um micromanipulador eletronicamente operado, adquira imagens do B-modo que cobrem o local do Sci em posições transversais sagital múltiplas da fatia, com fatias consecutivas com um intervalo do a de 50 μm. adquira Cine-imagens contendo 500 frames com uma taxa de quadros de ~ 50 frames/s e uma freqüência do transdutor de 40 megahertz.
Nota: Esta configuração requer um micromanipulador eletrônico regido por um joystick remoto (etapa 8,2). - Depois de terminar a sequência de digitalização, retorne para a etapa 7.
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Representative Results
O objetivo do protocolo é produzir uma SCI que irá paralisar as funções motoras e sensoriais caudais à lesão. Porque o Axolotl é regeneração-competente restaura a função dentro das semanas, permitindo que os investigadores estudem a regeneração do CNS durante um intervalo de tempo curto.
A anestesia foi fornecida para 45 min a todos os animais, e nenhum episódio de recuperação pré-termo foi experimentado. Todos os animais recuperados dentro de uma hora e não mostraram sinais de dano da anestesia nas semanas seguintes13,16.
A laminectomia foi bem-sucedida em todos os animais. Entretanto, a variação anatômica na largura do canal espinal chamou para o alargamento do canal usando o fórceps e uma torção em alguns indivíduos. Além disso, os lâminas residuais em alguns indivíduos impediram a haste de queda de alcangar seu alvo, daqui fazendo o imperativo que o cirurgião limpa o campo do osso residual e das proeminências.
O fechamento das incisões foi associado a algumas dificuldades, especialmente durante a fase de pilotagem do estudo. As suturas na parte superior da quilha não segurariam e resultaram em fechamentos insuficientes. O fechamento de um animal no estudo não segurou, resultando na quilha que está sendo rasgada, infecção subseqüente, e morte. Isto realça a necessidade para a sutura cuidadosa ao longo das incisões inteiras.
Os ferimentos mecânicos iniciais eram óbvios durante o procedimento. Durante o desenvolvimento do modelo, animais feridos e Sham foram corados com hematoxilina e eosina para validar a lesão. Os resultados representativos de cada grupo são mostrados na Figura 3a1,a2 e Figura 3C1,C2. A regeneração foi confirmada por seções histológicas preparações feitas após nove semanas (Figura 3B1,B2 e Figura 3D1,D2), que mostraram uma conexão restabelecida da medula espinal nos animais de Sci.
Ferimento e regeneração podem ser seguidos examinando a função neurológica. Estimular a cauda com um toque leve e beliscar de fórceps irá revelar se as funções sensoriais táteis e nociceptivas foram perdidas e potencialmente restabelecida. Um escore neurológico foi definido com base na reação do animal: 0 ponto = sem resposta, 1 ponto = movimento da cauda local, 2 pontos = movimento truncal, 3 pontos = movimento coordenado de membros e/ou cabeça ao lado de movimento truncal, 4 pontos = animais com movimento rápido coordenado imediato. Em seis animais SCI versus cinco animais Sham foi encontrada a perda da função neurológica três semanas após a lesão, e uma restauração gradual dentro de nove semanas (Figura 4 e vídeo complementar 1).
As imagens de Ultrasonographic da medula espinal ferida podem ser obtidas usando o protocolo acima. A visualização do site de SCI foi possível devido à óbvia falta de processos ósseos espessas (Figura 5). Além disso, usando o modo B, a artéria dorsal da medula espinhal não ferida pode ser visualizada, produzindo um marcador de integridade do vaso.
É possível testar os animais imediatamente após o redespertar. Entretanto, alguns animais expressaram a amplitude pequena local, o movimento repetitivo, e rítmico da cauda em cima da estimulação comparável aos fenômenos do Clônus observados no Sci humano. Estes movimentos puderam representar o Clônus ou uma falta da supressão reflexo central e poderiam potencialmente causar mais dano à medula espinal recentemente ferida. Portanto, testar os animais não é recomendável antes de uma semana de lesão pós.
Da simples observação qualitativa dos animais, será evidente que a cauda está paralisada, e a natação é significativamente inibida, tornando os animais completamente dependentes da movimentação de seus membros. Essas observações também validarão o sucesso do protocolo.
Exames de RM de alto campo (9,4 T) foram realizados imediatamente após a lesão para visualizar a lesão in vivo (Figura 6). Entretanto, as varreduras eram geralmente baixas na relação sinal-à-ruído comparada àquelas de animais não-operados, prováveis devido ao sangramento e ao hemosiderin. Assim, concluiu-se que a RM foi um método suboptimal para validar a lesão e o sucesso do protocolo.
Figura 1: desenho esquemático da laminectomia microcirúrgica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: desenho esquemático do mecanismo de trauma da contusão. (A) toda a configuração, mostrando a haste caindo acima do animal. (B) o mecanismo desmontado, mostrando como a haste é desligada do eletroímã. (C) a haste de queda é conectada ao electroímã. O cilindro de ajuste da altura de queda é instalado, e o electroímã e a haste carregados no cilindro. O ajuste de altura de todo o sistema é controlado por uma roda de ajuste. (D) desligar o electroímã fará com que a haste caia sem que o operador toque no sistema. A figura foi originalmente publicada por Thygesen et al.13. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: secções histológicas hematoxilina e eosina coradas imediatamente e nove semanas após lesão. (A1) SCI animal imediatamente após a lesão. (B1) Animal de SCI em nove semanas. (C1) Sham cirurgia animal imediatamente após a lesão. (D1) Animal Sham às nove semanas. Quadrado vermelho = marca o ferimento dos animais de SCI, e o laminectomy do animal Sham. AFigura 2 A , Figura 2B, figura 2C são amplificações destas áreas em 5x. Seta azul = medula espinhal não ferida. Este número foi originalmente publicado por Thygesen et al.13. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: gráfico de resposta a estímulos táteis. A resposta dos grupos SCI é menor após três semanas, em comparação com o grupo Sham. WPI = lesão pós semanas, linha preta = SCI, cor cinzenta = Sham. Sham n = 5, SCI n = 6. A figura foi originalmente publicada por Thygesen et al.13. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: imagem de Ultrasonographic que mostra a medula espinal em uma seção sagital. As linhas amarelas marcam a medula espinal, o círculo amarelo o local da lesão, e as setas brancas marcam as vértebras. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: exames de ressonância magnética em diferentes pontos de tempo pós-lesão ou cirurgia simulando. CSF que circunda a medula espinal está faltando, especial em três WPI para o animal de SCI, indicando o inchamento da medula espinal. Escurecimento da medula espinhal indica edema também. Observe como essas alterações desaparecem à medida que a regeneração progride. Seta amarela = a área de laminectomia. A figura foi originalmente publicada por Thygesen et al.13. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo suplementar 1: Vídeo mostrando a função neurológica após estímulos táteis e, posteriormente, um estímulo nociceptivo. Primeiro um animal de controle saudável, e depois um animal sofrendo de SCI. por favor clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
Porque o risco de ferimento à medula espinal é significativo, as etapas críticas do protocolo estão removendo os processos espinhoso e o alargamento do acesso ósseo ao canal espinal se necessário. Como mencionado no protocolo, a remoção do processo mais craniano primeiro é altamente recomendável. Isto significará que os processos mais caudais protegem a medula espinal de ser batido pela tesoura. Recomenda-se assegurar o suficiente acesso cirúrgico, significando não fazer demasiado pequeno uma incisão preliminar. Além disso, quando agarrando qualquer coisa com fórceps, a direção da tração aplicada deve sempre ser considerada. Aplicando uma tração suave longe da medula espinhal irá protegê-lo em caso de falha de aperto e um deslizamento do instrumento.
O procedimento cirúrgico no Axolotl não é diferente de outros animais. No entanto, existem algumas diferenças importantes, principalmente atribuíveis à composição tecidual e ao tamanho do animal. A pele da quilha do Axolotl é muito frágil, e paradoxalmente não cura bem em cima dos danos pequenos infligidos durante a incisão. Cuidado deve ser tomado, especialmente sobre as incisões primárias, porque o dano vai complicar substancialmente a sutura. Os ossos de axolotls muito jovens são muito suaves. Isto significa que frequentemente o fórceps anatômico básico pode suficiente na remoção do osso. Isto apresenta um outro elemento do cuidado, porque beliscar os processos espinhoso poderia infligir dano substancial. As camadas de fáscia subcutânea e muscular não estão disponíveis para sutura, devido às suas frágeis composições teciduais. É imperativo garantir uma semana de pós-operatório calmo. Os animais podem não descansar o suficiente após a operação. Daqui, podem infligir dano secundário a sua medula espinal postoperatively. Sua pequena anatomia não permite nenhuma fixação interna nem spline.
O peso e a altura de queda do sistema de haste de queda são cruciais para infestar um ferimento da contusão. Durante a pilotagem extensiva para um estudo mais adiantado, o peso da haste e a altura de queda necessários foram encontrados para ser 25 g e 3 cm13. Isto foi suficiente para induzir paralisia em 12 g de axolotls sem cortar ou desintegrar a medula espinhal. Peso adicionado ou altura de queda pode ser necessário em animais maiores. Além disso, o diâmetro da haste de queda pôde precisar de ser mais grande no caso de uns animais mais grandes e mais curtos para animais menores.
O modelo tem algumas limitações. Porque os axolotls não são usados para estudos de comportamento aprendidos, um não pode testar funções neurológicas complexas. O ferimento foi introduzido caudal aos membros, poupando os membros traseiros e as entranhas e a bexiga de ser paralisada. A razão para isso era ético, para reduzir o impacto sobre o animal ao mínimo. No entanto, limita a oportunidade de estudar os efeitos sobre os movimentos dos membros, o que pode ser mais fácil de descrever e categorizar. Uma grande parte da morbidade SCI-Associated decorre da perda de controle das entranhas e da bexiga. Este modelo não permite pesquisas futuras nesses campos. Causar dano rostral aos membros traseiros seria possível, mas não foi tentado.
Estudar SCI em um modelo regenerativo tal como o Axolotl permite uma aproximação diferente na pesquisa do SCI. Como o modelo animal pode se regenerar, os estudos de eliminação poderão revelar fatores críticos de regeneração. Estudos convencionais sobre SCI são realizados em modelos não regenerativos, o que significa que será necessário intervir em todos os fatores críticos para induzir uma resposta regenerativa.
Este modelo e protocolo estão em concordância com o princípio de Krogh afirmando que: "para um número tão grande de problemas, haverá algum animal de escolha ou alguns desses animais em que pode ser mais convenientemente estudado"17. A regeneração dos mamíferos é inibida por múltiplos fatores. Inibindo estes em um modelo de mamíferos geralmente não induz quaisquer efeitos. No entanto, o aumento dos níveis de inibidores no Axolotl deve eliminar a regeneração e, assim, revelar se esse inibidor é crítico ou não10.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Michael Pedersen, Universidade de Aarhus por sua experiência e tempo no desenvolvimento de protocolos de RM e criação de todo o projeto. Peter Agger, Universidade de Aarhus para sua perícia e tempo em desenvolver os protocolos de MRI. Steffen Ringgard, Universidade de Aarhus por sua perícia e tempo em desenvolver os protocolos de MRI. O desenvolvimento do modelo SCI no Axolotl foi gentilmente apoiado pela A.P. Møller Maersk Fundação, a Fundação Riisfort, a Fundação LinEx, ea Fundação ELRO.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g - 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| Electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Kimwipes | |||
| Microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring approximately 70 x 55 cm2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
References
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