Summary
Bu el yazması cerrahi bir rejeneratif aksiyom(Ambystoma mexicanum)kontrollü künt ve keskin omurilik yaralanmaları inflicting için protokoller sunar.
Abstract
Bu çalışmanın amacı axolotl(Ambystoma mexicanum)standart ve tekrarlanabilir rejeneratif omurilik yaralanması modeli oluşturmaktır. Klinik omurilik yaralanmalarının çoğu yüksek enerjili künt travmalar olarak ortaya çıkar, kontüzyon yaralanmaları indükleyen. Ancak, axolotl omurilik teki çalışmaların çoğu keskin travmalarla yapılmıştır. Bu nedenle, bu çalışma daha klinik olarak ilgili rejeneratif bir model üretmeyi amaçlamaktadır. Hemen hemen her türlü dokuyu yenileme yetenekleri sayesinde, axolotls rejeneratif çalışmalarda model olarak yaygın olarak kullanılır ve omurilik yaralanması (SCI) çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu protokolde, axolotls bir benzocaine çözeltisi daldırma tarafından anestezi edilir. Mikroskop altında, açısal bir kesi sadece arka ekstremitelere kaudal bir düzeyde ikili olarak yapılır. Bu kesiden, spinous süreçleri incelemek ve ortaya çıkarmak mümkündür. Forceps ve makas kullanılarak, iki seviyeli laminektomi yapılır, omurilik açığa. Bir silindir düşen çubuk oluşan özel bir travma cihazı inşa edilir, ve bu cihaz omurilik bir çürük yaralanması neden olmak için kullanılır. Kesikler daha sonra dikilir ve hayvan anesteziden kurtulur. Cerrahi yaklaşım omuriliği ortaya çıkarmada başarılıdır. Travma mekanizması, histoloji, MRG ve nörolojik muayene ile doğrulanan, omurilik kontüzyon yaralanmaları üretebilir. Son olarak, omurilik yaralanma dan yeniler. Protokolün kritik adımı, omurilikte hasar vermeden spinous süreçleri kaldırmaktır. Bu adım, güvenli bir yordam sağlamak için eğitim gerektirir. Ayrıca, yara kapanması son derece kesi sırasında cilde gereksiz hasar vermemebağlıdır. Protokol, 12 hayvan üzerinde yapılan randomize bir çalışmada gerçekleştirildi.
Introduction
Bu çalışmanın genel amacı, yenileyici omurilik yaralanması modeli üreten axolotl(Ambystoma mexicanum)künt ve keskin SCI vermek için kontrollü ve tekrarlanabilir bir mikrocerrahi yöntem oluşturmaktı.
SCI, düzeyi ve ölçüde bağlı olarak, bozulmuş mesane ve bağırsakkontrolü1 ile birlikte ekstremitelere nörolojik sakatlık inflicts ciddi bir durumdur,2,3. En SCI trafik kazaları gibi yüksek enerjik travma sonucu ve düşüyor4,5. Keskin yaralanmalar çok nadirdir. Bu nedenle, en sık görülen makroskopik yaralanma türü çürükler olduğunu.
Memeli merkezi sinir sistemi (CNS) non-rejeneratif doku, sci aşağıdaki nörolojik doku bu nedenle hiçbir restorasyon görülür6,7,8. Öte yandan, bazı hayvanların cns doku da dahil olmak üzere dokuları yenilemek için ilginç bir yeteneği var. Bu hayvanlardan biri axolotl. Bu yaygın rejeneratif biyoloji çalışmalarında kullanılan ve omurilik rejenerasyon ilgi, bir omurgalı olduğu için9,10,11,12.
Aksitotl en SCI çalışmaları ya tüm kuyruk ampütasyon veya omurilik9,10,11,12daha büyük bir bölümünün ablasyon olarak yapılır. Son zamanlarda, klinik durumları daha iyi taklit künt yaralanmalar13 yeni bir çalışma yayınlandı. Axolotl tam aparat amputasyonu tam rejenerasyon sonuçları ise, bazı non-ampütasyon tabanlı rejeneratif olaylar kritik boyut defekti bağlıdır (CSD)14,15. Bu, kritik eşiği aşan yaralanmaların yenilenolmadığı anlamına gelir. Daha yüksek klinik çevirideğerine sahip rejeneratif bir model geliştirmek için, bu çalışmada 2 mm künt travmanın CSD sınırını aşıp aşmayacağı araştırılmıştır.
Bu yöntem, özellikle axolotl küçük hayvan modellerinde omurilik rejenerasyonu üzerinde çalışan araştırmacılar için geçerlidir. Ayrıca, genel olarak küçük hayvanlarda kullanıma uygun bir künt travma mekanizması geliştirmek için standart laboratuvar ekipmanı kullanarak bir yol sergiler, çünkü daha genel ilgi olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada hayvanların etik kullanımına ilişkin tüm geçerli kurumsal ve resmi düzenlemeler izlenmiúve Çalışma, Danimarka Hayvan Deney Ii. Hayvanlar Meksika aksolotllarıydı (Ambystoma mexicanum, ortalama vücut kütlesi ± STD: 12.12 g ± 1.25 g).
1. Hazırlık
-
Anestezi için axolotl hazırlayın.
- Yüksek kaliteli kimyasal olarak arıtılmayan musluk suyu kullanın. Eğer kullanılamıyorsa, %40 Holtfreter'ın çözeltisini kullanın.
- Çözün 200 etil mg 4-aminobenzoat (benzocaine) aseton 3 mL içinde. Bu çözeltiyi 1 L musluk suyunda veya Holtfreter çözeltisinde çözün.
- Cerrahi tablo olarak stereo mikroskop altına yerleştirilen standart bir Petri kabı (100 mm çapında) kullanın. Petri kabına cerrahi bir tekstil bezi yerleştirin.
NOT: Petri kabının cerrahi alan olarak kullanılması, hayvanın dokunmadan hareket etmesini ve dönmesini sağlayarak ameliyat sırasında spinal stabiliteyi sağlar. - Tüm steril mikrocerrahi aletleri (örn. makas ve anatomik ensepsler) hazırlayın.
2. Anestezi
- Derin ve kararlı anestezi sağlamak için yaklaşık 45 dakika boyunca benzokain çözeltisi ile bir kap içine axolotl yerleştirin.
NOT: Benzokain verilen konsantrasyon axolotls tüm boyutlarda anestezi neden olacaktır. - 30-45 dk içinde genel anestezi belirtileri olup olmadığımı kontrol edin. Bu solungaç hareketleri tam bir eksikliği içerir, refleks düzeltme, ya da dokunsal veya ağrılı uyaranlara yanıt (ayak ağı nazik çimdikleme).
- Anesteziyi korumak için, anestezik çözeltide ıslak kağıt havlularla hayvanları sarın. Cilt ve solungaçların nemli tutulmasını sağlamak için cerrahi işlem sırasında bu solüsyonu düzenli olarak ıslatın.
- Ameliyattan sonra taze musluk suyu içeren bir kapta yerleştirerek hayvan kurtarmak. 1 saat16içinde solungaç hareketi ve yeniden sağlama refleksi gibi iyileşme belirtileri gözlemleyin.
3. Mikrocerrahi Laminektomi
NOT: Laminektomi stereomikroskop altında yapılır.
- Petri kabına eğilimli pozisyonda hayvan yerleştirin. Kuyruk maruz böylece kağıt havlu sarın.
NOT: Kağıt havlular, prosedür boyunca stabiliteyi sağlamak için mükemmeldir. -
Arka uzuvları tanımlayın. İlk kesiği onlara sadece kaudal yap.
- Mikrosksor bir çift ile, spinous süreçlerin kemik çıkıntı hissedilene kadar omurga dikey bir kesi gerçekleştirin.
NOT: Keel ve cildi forcep'lerle kavradığınızda çok dikkatli olun, çünkü bunlar hassas cilde kolayca zarar verir. - Kesiği yanal olarak uzatın, böylece kesi kuyruğun tüm genişliğini geçer.
- Doğru derinliği sağlamak için spinous işlemini forceps ile kavrayın.
- Her iki taraftaki spinous prosesin 1 mm altındaki dikey kesileri uzatın.
- Mikrosksor bir çift ile, spinous süreçlerin kemik çıkıntı hissedilene kadar omurga dikey bir kesi gerçekleştirin.
-
Aşağıda belirtildiği gibi ventral ve yatay kesiler gerçekleştirmek için bir tarafa hayvan yerleştirin.
- Bir çift mikrosikül ile, dikey kesinin ventral noktasından başlayarak, 10-20 g ağırlığındaki hayvanlar için yaklaşık 15 mm'lik yatay bir kesi yapın. Daha büyük hayvanlar için kesiyi daha uzun, küçük hayvanlar için daha kısa yapın.
- Makas kullanarak, vertebral kolon orta hatta hissedilene kadar yatay kesi ile medially inceleyin.
- Hayvanın diğer tarafında ki 3.3, 3.3.1 ve 3.3.2 adımlarını tekrarlayın.
-
Her iki taraftan derin medial düzlemde kesilen, orta hattan kesişen, bu nedenle iki yatay kesi ler bağlayan.
- Serbest kuyruk ve omurga parçasını bir tarafa taşıyarak spinous prosesleri ortaya çıkarır (Şekil 1).
- Islä±k kağıt havlular kullanarak kuyruk parçasını sabitle
-
Başı cerrahın baskın olmayan tarafına bakacak şekilde hayvanı tekrar yatkın konuma getirin.
- Bir çift forceps ile, sadece arka ekstremitelere kaudal süreçleri kavramak. Hem yukarı hem de hayvanın başına doğru hafif çehre uygulayın.
- Bir çift mikrosiyenin bıçaklarını sürecin etrafına yatay olarak yerleştirin ve yavaşça kesin. İşlemdeki asansör, omuriliğin açığa çıkarılmasını sağlar.
- Sadece kaldırıldı ve adımları 3.5.1 ve 3.5.2 tekrarlamak için spinous süreci kavramak.
NOT: Bu iki vertebral düzeylerine karşılık gelen bir maruz omurilik bırakmalıdır. Laminektomi yapılırken genellikle beyaz köpüklü bir salgı ortaya çıkar. Omurilik kolayca ayırt edici parlaklık ile tespit edilir, orta hat boyunca çalışan bir damar ile birlikte. - Hayvanın büyüklüğüne bağlı olarak, maruz kalan alan yeterince geniş olmayabilir. Forseps iki çift kullanarak, omuriliğin her iki tarafında lamina kavramak ve hafif bir hareket ile yanal büküm.
4. Kontüzyon Tipi Yaralanmanın Tanıtılması (Şekil 2)
- Hayvanı yatkın pozisyonda tutun.
- Hayvanı travma ünitesine aktarmak için Petri kabını kullan.
- Bir asistan omuriliğine el feneri yaksın.
- Kontüzyon travma ünitesi silindirini, ünitedeki mikro ayarlayıcıları kullanarak açıkta kalan omuriliğin üzerine yerleştirin. Silindirin içinden nişan ala.
- Lamina ile düz olana kadar silindiri indirin.
- Düşen çubuğu elektromıknatısa takın. Travma ünitesi üzerine istenilen düşen yükseklik ayarı silindirini yerleştirin.
- Düşen çubuğu silindire yerleştirin.
NOT: Kör bir çalışma için, cerrah şimdi hayvan bir yaralanma ya da sahte bir cerrahi gruba atanacak olup olmadığını bilmeden odadan çıkmalıdır. - Elektromıknatısı kapat. Çubuk açıkta kalan omuriliğine düşüyor.
- Omuriliğin çubuğunu kaldırmak için yükseklik ayarlama vidasını kullanın.
- Mikroskoptan omurilik bakarak yarayı doğrulayın. Yaralı bölge daha karanlık görünecek ve orta hat damarından kanama belirgin olacak.
5. Keskin Yaralanma Tanıtımı
NOT: 3.5.4'ten sonra bu adımları gerçekleştirin.
- Bir çift mikroskor ile mükemmel bir dikey kesim omuriliği kesti.
- Kesilen 2 mm'yi vücudun kaudal tarafına kadar tekrarlayın.
NOT: Omurilik kaldırılan parçanın uzunluğu çalışma gereksinimine göre ayarlanabilir. Ancak, 2 mm kesim regenerable10olacaktır. - Kesiklerin tamamlandığından emin olun. Tamamlandıktan sonra, spinal kanalın ventral kısmı boyunca kazınan makas bıçakları hissedin.
- Omurilik kanalından 2 mm'lik omurilik parçasını kaldırın.
6. Cerrahi Yaranın Kapatılması
- Hayvanı cerrahi masaya geri getir. Kör bir çalışmada, omurilik cerrah için görünür değil, böylece omurga yeniden konumlandırın.
-
Hayvanı yatkın pozisyonda tutun.
- Yatay kesien en kaudal kısmından 10.0 naylon dikiş yerleştirmeye başlayın. Yaraları tek bir katmanda kapatın.
NOT: Çok sıkı cilt kavramak etmeyin, nekroz neden olacak çünkü. - Kesiğin dikey kısmına doğru çalışın.
- Açıya ulaşırken, Petri kabını çevirin ve diğer yatay kesidik.
- Dik kesiler üzerine dikişler ayarlayın.
- Omurganın en üst kısmına dikiş koymayın, çünkü buradaki deri tutamaz.
- Yatay kesien en kaudal kısmından 10.0 naylon dikiş yerleştirmeye başlayın. Yaraları tek bir katmanda kapatın.
7. Hayvanı Anestezisiz Çözüme Döndürmek
- Petri kabını hayvanla birlikte kaldırın ve her ikisini de sadece 5 cm derinliğinde tatlı suya hafifçe batırın ve hayvanın kaymasını bırakın.
NOT: Sığ su derinliği, hayvanın nefes almak için yüzeye yüzmeye çalışmamasını sağlar. - İlk hafta boyunca suyu değiştirmeyin.
- Hayvanları beslerken, yiyeceğin hayvanın başının yakınına yerleştirildiğinden emin olun.
NOT: Bu önlemlerin amacı, ilk hafta boyunca mümkün olduğunca çok hareket önlemektir.
8. Postoperatif Ultrason
- Anestezinin sona erdirilmesinden önce, SCI sitesinin üç boyutlu görüntülerinin yapımında kullanılabilecek yaralanmanın görüntülerini elde etmek için yüksek frekanslı bir ultrason sistemi kullanın.
- Dönüştürücü, tercihen uzak bir joystick tarafından yönetilen bir mikromanipülatöre takın.
- Anesteziye ait hayvanı yatkın pozisyonda anestezik solüsyonla dolu küçük bir kapta batırın.
NOT: Tarama sırasında hareket önlemek için minyatür kum torbaları veya diğer ekipman ile hayvan düzeltin. - Dönüştürücünün ucunu hayvanın uzunluk ekseni ile hizalayın ve hayvanın arka ekstremitelerinin arkasındaki omurganın sadece birkaç milimetre yukarısına kadar benzocaine çözeltisine batırın.
- SCI sitesini tanımlayın.
NOT: Sci'nin hemen üstündeki eksik spinous süreçler nedeniyle yaralanma bölgesi kolayca tanınabilir. - Ultrason ayarlarını ayarlayarak görüntüyü optimize edin. SCI sitesinin görüntünün merkezinde olduğundan emin olun. SCI sitesini ve bitişik sağlıklı dokuyu kapsayacak şekilde görüş alanını (yani görüntü derinliği, derinlik ofset ve görüntü genişliği) ayarlayın. Görüntü kontrastını en iyi duruma getirmek için iki boyutlu kazancı ayarlayın.
- Ultrason transdüserini elektronik olarak işletilen bir mikromanipülatörle SCI alanı boyunca süpürerek, sci sitesini kapsayan B-modlu görüntüleri birden fazla sagittal kesit dilim lokasyonunda, dilimler arası aralıklı ardışık dilimlerle elde edin 50 m. ~50 kare/s kare hızı na ve 40 MHz'lik bir transdüser frekansına sahip 500 kare içeren sine görüntüleri edinin.
NOT: Bu kurulum, uzaktan kumanda çubuğu (adım 8.2) tarafından yönetilen bir elektronik mikromanipülatör gerektirir. - Tarama sırasını bitirdikten sonra adım 7'ye dönün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokolün amacı, motor ve duyusal fonksiyonları yaralanmak için kaudal felç edecek bir SCI üretmektir. Aksitotl rejenerasyon yetkin olduğu için birkaç hafta içinde işlevini geri yükler ve araştırmacıların kısa bir süre içinde CNS rejenerasyonunu incelemelerine olanak sağlar.
Tüm hayvanlara 45 dakika anestezi sağlandı ve erken iyileşme atakları yaşanmadı. Tüm hayvanlar bir saat içinde kurtarıldı ve sonraki haftalarda anestezi hasar belirtisi gösterdi13,16.
Laminektomi tüm hayvanlarda başarılı oldu. Ancak, spinal kanal genişliğinde anatomik varyasyon forseps ve bazı kişilerde bir bükülme kullanarak kanalın genişletilmesi için çağrıda bulundu. Ayrıca, bazı kişilerde artık lamina, düşen çubuğun hedefine ulaşmasını engelleyerek cerrahın alanı kemik ve çıkıntılardan temizlemesini zorunlu kılmaktadır.
Kesilerin kapatılması, özellikle çalışmanın pilot aşamasında bazı zorluklarla ilişkilendirildi. Omurganın üst kısmındaki dikişler tutmaz ve yetersiz kapanmalara neden olur. Çalışmada bir hayvanın kapatılması, omurga yırtılmış, sonraki enfeksiyon ve ölüm ile sonuçlanan tutmadı. Bu tüm kesiler boyunca dikkatli dikiş ihtiyacını vurgular.
İlk mekanik yaralanmalar işlem sırasında açıktı. Model geliştirme sırasında, yaralı ve sahte hayvanlar yaralanma doğrulamak için hematoksilin ve eozin ile boyandı. Her grubun temsil sonuçları Şekil 3A1,A2 ve Şekil 3C1,C2'degösterilmiştir. Rejenerasyon, SCI hayvanlarında yeniden kurulmuş bir omurilik bağlantısı gösteren dokuz hafta sonra yapılan histolojik kesit preparatları(Şekil 3B1,B2 ve Şekil 3D1,D2)ile doğrulandı.
Yaralanma ve rejenerasyon nörolojik fonksiyon inceleyerek takip edilebilir. Hafif bir dokunuşla kuyruğu uyararak ve forceps'lerden çimdikleme dokunsal ve nosiseptif duyusal fonksiyonların kaybolup olmadığını ve potansiyel olarak yeniden tesis edilip edilmediğini ortaya çıkaracaktır. Bir nörolojik skor hayvanın reaksiyonuna göre tanımlanmıştır: 0 puan = yanıt yok, 1 puan = yerel kuyruk hareketi, 2 puan = truncal hareket, 3 puan = truncal hareketi ile birlikte uzuvların ve/veya başın eşgüdümlü hareketi, 4 puan = hayvanlar hemen koordine hızlı hareket. Altı SCI hayvanlar karşı beş sahte hayvanlar nörolojik fonksiyon kaybı üç hafta sonrası yaralanma bulundu, ve dokuz hafta içinde kademeli bir restorasyon(Şekil 4 ve Ek Video 1).
Yukarıdaki protokol kullanılarak yaralı omuriliğin ultrasonografik görüntüleri elde edilebilir. SCI sitesinin görselleştirilmesi, kemikli spinous süreçlerin bariz eksikliği nedeniyle mümkün oldu(Şekil 5). Ayrıca, B-modu kullanılarak yaralanmamış omuriliğin dorsal arteri görüntülenebilir, damar bütünlüğü bir belirteç verim.
Yeniden uyandıktan hemen sonra hayvanları test etmek mümkündür. Ancak, bazı hayvanlar insan SCI gözlenen konus fenomeni karşılaştırılabilir uyarılma üzerine yerel küçük genlik, tekrarlayan ve ritmik kuyruk hareketi ifade. Bu hareketler clonus veya merkezi refleks bastırma eksikliği temsil edebilir ve potansiyel olarak yeni yaralı omurilik daha fazla hasara neden olabilir. Bu nedenle, hayvanların test bir hafta sonrası yaralanma önce tavsiye edilmez.
Hayvanların basit nitel gözlem itibaren, kuyruk felç olduğu belli olacak, ve yüzme önemli ölçüde inhibe, hayvanların tamamen uzuvlarını hareket bağlı hale. Bu gözlemler aynı zamanda protokolün başarısını da doğrulayacaktır.
Yüksek alan MRI taramaları (9.4 T) yaralanmadan hemen sonra vivo'da yaralanmayı görselleştirmek için yapıldı (Şekil 6). Ancak, taramalar genellikle sinyal-gürültü oranı, muhtemelen kanama ve hemosiderin nedeniyle, ameliyat olmayan hayvanların göre düşüktü. Bu nedenle, MRG'nin protokolün yarasını ve başarısını doğrulamak için en uygun olmayan yöntem olduğu sonucuna varıldı.
Şekil 1: Mikrocerrahi laminektominin şematik çizimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kontüzyon travma mekanizmasının şematik çizimi. (A) Hayvanın üzerinde düşen çubuğu gösteren tüm kurulum. (B) Çubuk'un elektromıknatıstan nasıl koptuğunu gösteren sökülen mekanizma. (C) Düşen çubuk elektromıknatısa bağlanır. Düşen yükseklik ayarlama silindiri takılır ve elektromıknatıs ve çubuk silindire yüklenir. Tüm sistemin yükseklik ayarı bir ayar tekerleği tarafından kontrol edilir. (D) Elektromıknatısın kapatılıp, operatÃ1/4m sisteme dokunmadan çubuğun dÃ1/4Å Ã1/4Å Ã1/4ne neden olur. Şekil ilk olarak Thygesen ve ark.13tarafından yayınlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Histolojik kesitler hematoksilin ve eozin hemen ve dokuz hafta sonrası yaralanma lekeli. (A1) SCI hayvan yaralanma hemen sonra. (B1) SCI hayvanı dokuz hafta sonra. (C1) Sham cerrahi hayvan yaralanma hemen sonra. (D1) Dokuz haftalık sham hayvanı. Kırmızı kare = SCI hayvanların yaralanma işaretleri ve sahte hayvan laminektomi. Şekil 2A, Şekil 2B, Şekil 2C bu alanların 5x'te büyütülmesidir. Mavi ok = yaralanmamış omurilik. Bu rakam ilk olarak Thygesen ve ark.13tarafından yayınlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Dokunsal uyaranlara yanıtın grafiği. SCI gruplarının tepkisi üç hafta sonra, sahte gruba göre daha düşüktür. WPI = hafta sonrası yaralanma, Siyah çizgi = SCI, Gri renk = sham. Şam n = 5, SCI n = 6. Şekil ilk olarak Thygesen ve ark.13tarafından yayınlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Sagital kesitte omuriliği gösteren ultrasonografik görüntü. Sarı çizgiler omuriliği, sarı daireyaralanma bölgesini ve beyaz oklar omurları işaretler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Yaralanma veya sahte cerrahi sonrası farklı zaman noktalarında MRI taraması yapılır. Bosomuromur çevreleyen eksik, SCI hayvan için özellikle üç WPI, omurilik şişmesi gösteren. Omuriliğin kararması da ödemi gösterir. Rejenerasyon ilerledikçe bu değişikliklerin nasıl kaybolduğuna dikkat edin. Sarı ok = laminektomi alanı. Şekil ilk olarak Thygesen ve ark.13tarafından yayınlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Video 1: Dokunsal uyaranve daha sonra nosiseptif uyarıcı sonra nörolojik fonksiyonu gösteren video. Önce sağlıklı bir kontrol hayvanı, sonra SCI.'den muzdarip bir hayvan lütfen bu videoyu indirmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Omurilik yaralanma riski önemli olduğundan, protokolün kritik adımları spinous süreçleri kaldırarak ve gerekirse omurilik kanalına kemik erişimi genişletilmesi. Protokolde belirtildiği gibi, ilk olarak en kafatası işleminin kaldırılması şiddetle tavsiye edilir. Bu daha kaudal süreçler makas tarafından vurulduktan omurilik korumak anlamına gelecektir. Bu yeterli cerrahi erişim sağlamak için tavsiye edilir, çok küçük bir birincil kesi yapmak anlamına gelir. Ayrıca, bir şeyi forceps ile kavradığınızda, uygulanan çekme nin yönü her zaman göz önünde bulundurulmalıdır. Omurilikten hafifçe bir çekme uygulamak, kavramanın başarısız olması ve aletin kayması durumunda onu koruyacaktır.
Aksitotl cerrahi işlem diğer hayvanlardan farklı değildir. Ancak, bazı önemli farklılıklar var, öncelikle doku kompozisyonu ve hayvanın büyüklüğü atfedilebilir. Aksitotl omurga cilt çok kırılgan, ve paradoksal olarak küçük hasarlar insizyon sırasında neden iyi iyileşmez. Özellikle birincil kesiler üzerine dikkatli olunmalıdır, çünkü hasar dikişi önemli ölçüde zorlaştıracaktır. Çok genç aksolotlların kemikleri çok yumuşaktır. Bu genellikle temel anatomik forceps kemik kaldırma yeterli olabilir anlamına gelir. Bu da başka bir uyarı unsuru sunar, çünkü spinous süreçleri çimdiklemek önemli hasarlara neden olabilir. Deri altı ve kas fasya tabakaları hassas doku bileşimleri nedeniyle dikiş için mevcut değildir. Bu sakin bir postoperatif hafta sağlamak için zorunludur. Hayvanlar operasyondan sonra yeterince dinlenmeyebilir. Bu nedenle, ameliyat sonrası omurilik ikincil hasar verebilir. Onların küçük anatomisi ne iç ne de spline fiksasyon için izin vermez.
Düşen çubuk sisteminin ağırlığı ve düşen yüksekliği çürük yaralanmasına neden olmak için çok önemlidir. Daha önceki bir çalışma için kapsamlı pilotluk sırasında, çubuk ağırlığı ve düşen yüksekliği 25 g ve 3 cm13olarak bulundu. Bu, omuriliği kesmeden veya parçalamadan 12 g aksolotls felç neden yeterli oldu. Daha büyük hayvanlarda daha fazla ağırlık veya düşen yükseklik gerekebilir. Ayrıca, düşen çubuk çapı büyük hayvanlar durumunda daha büyük ve küçük hayvanlar için daha kısa olması gerekebilir.
Modelin bazı sınırlamaları vardır. Aksiler öğrenilen davranış çalışmaları için kullanılmadığından, karmaşık nörolojik fonksiyonları test edemezsiniz. Yaralanma ekstremitelere kaudal olarak tanıtıldı, arka ekstremiteler ve bağırsak ve mesane felç olmaktan uzak. Bunun nedeni etikti, hayvan üzerindeki etkisini en aza indirgemekti. Ancak, bu tanımlamak ve kategorize etmek daha kolay olabilir uzuv hareketleri üzerindeki etkilerini çalışma fırsatı sınırlamak yok. SCI ilişkili morbiditenin büyük bir kısmı bağırsak ve mesane kontrolünün kaybedilmesinden kaynaklanmaktadır. Bu model, bu alanlarda gelecekteki araştırmalara izin vermez. Arka ekstremitelere hasar vermek mümkün olabilir, ama denenmedi.
Axolotl gibi rejeneratif bir modelde SCI eğitimi, SCI araştırmalarında farklı bir yaklaşım alabına olanak sağlar. Hayvan modeli yenilebildiği için, eleme çalışmaları rejenerasyonun kritik faktörlerini ortaya çıkarabilecektir. SCI üzerinde konvansiyonel çalışmalar rejeneratif olmayan modellerde yapılır, bir rejeneratif yanıt ikna etmek için tüm kritik faktörlere müdahale etmek gerekir anlamına gelir.
Bu model ve protokol Krogh prensibi ile uyum içinde olduğunu belirten: "Sorunların bu kadar çok sayıda için seçim bazı hayvan ya da en uygun çalışılabilir birkaç tür hayvan olacak"17. Memeli rejenerasyonu birden fazla faktör tarafından inhibe edilir. Bir memeli modelinde bu inhibe genellikle herhangi bir etkiye neden olmaz. Ancak, axolotl inhibitörleri artan düzeyleri rejenerasyon ortadan kaldırmak gerekir, ve bu nedenle bu inhibitörü kritik olup olmadığını ortaya çıkarmak10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Michael Pedersen, Aarhus Üniversitesi'nde mr protokolleri geliştirme ve tüm projekurma konusundaki uzmanlığı ve zamanı için. Peter Agger, Aarhus Üniversitesi'nde mr protokollerini geliştirmek için uzmanlığı ve zamanı için. Steffen Ringgard, Aarhus Üniversitesi'nde mr protokollerini geliştirmek için uzmanlığı ve zamanı için. Axolotl'daki SCI modelinin geliştirilmesi A.P. Møller Maersk Vakfı, Riisfort Vakfı, Linex Vakfı ve ELRO Vakfı tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 g custom falling rod | custom home made | ||
| 30 mm PVC pipe | custom home made | ||
| Acetone | Sigma-Aldrich | 67-64-1 | Propanone |
| Axolotl (Ambystoma mexicanum) | Exoterra GmbH | N/A | 12-22 cm and 10 g - 80 g, All strains (wildtype, melanoid, white, albino, transgenic white with GFP) |
| Benzocain | Sigma-Aldrich | 94-09-7 | ethyl 4-aminobenzoate |
| Electromaget | custom home made | ||
| Excel 2010 | Microsoft | N/A | Excel 2010 or newer |
| ImageJ | National Institutes of Health | ImageJ 1.5e or newer. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Kimwipes | |||
| Microsurgical instruments | N/A | N/A | Forceps and scissors |
| MS550s | Fujifilm, Visualsonics | MS550s | 40 MHz center frequency, transducer |
| MS700 | Fujifilm, Visualsonics | MS700 | 50 MHz center frequency, transducer |
| Petri dish | any maker | ||
| Soft cloth | N/A | N/A | Any piece of soft cloth measuring approximately 70 x 55 cm2 e.g. a dish towel |
| Stereo microscope | |||
| Vevo 2100 | Fujifilm, Visualsonics | Vevo 2100 | High frequency ultrasound system |
References
- Shavelle, R. M., DeVivo, M. J., Brooks, J. C., Strauss, D. J., Paculdo, D. R. Improvements in Long-Term Survival After Spinal Cord Injury. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 96 (4), 645-651 (2015).
- Hicken, B. L., Putzke, J. D., Richards, J. S. Bladder management and quality of life after spinal cord injury. American Journal of Physical Medicine & Rehabilitation. 80 (12), 916-922 (2001).
- Levi, R., Hultling, C., Nash, M. S., Seiger, A. The Stockholm spinal cord injury study: 1. Medical problems in a regional SCI population. Paraplegia. 33 (6), 308-315 (1995).
- Bjornshave Noe, B., Mikkelsen, E. M., Hansen, R. M., Thygesen, M., Hagen, E. M. Incidence of traumatic spinal cord injury in Denmark, 1990-2012: a hospital-based study. Spinal Cord. 53 (6), 436-440 (2015).
- Singh, A., Tetreault, L., Kalsi-Ryan, S., Nouri, A., Fehlings, M. G. Global prevalence and incidence of traumatic spinal cord injury. Clinical Epidemiology. 6, 309-331 (2014).
- Aguayo, A. J., et al. Degenerative and regenerative responses of injured neurons in the central nervous system of adult mammals. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 331 (1261), 337-343 (1991).
- Aguayo, A. J., Bjorklund, A., Stenevi, U., Carlstedt, T. Fetal mesencephalic neurons survive and extend long axons across peripheral nervous system grafts inserted into the adult rat striatum. Neuroscience Letters. 45 (1), 53-58 (1984).
- Richardson, P. M., Issa, V. M., Aguayo, A. J. Regeneration of long spinal axons in the rat. Journal of Neurocytology. 13 (1), 165-182 (1984).
- Butler, E. G., Ward, M. B. Reconstitution of the spinal cord following ablation in urodele larvae. Journal of Experimental Zoology. 160 (1), 47-65 (1965).
- Diaz Quiroz, J. F., Tsai, E., Coyle, M., Sehm, T., Echeverri, K. Precise control of miR-125b levels is required to create a regeneration-permissive environment after spinal cord injury: a cross-species comparison between salamander and rat. Disease Model Mechanisms. 7 (6), 601-611 (2014).
- Clarke, J. D., Alexander, R., Holder, N. Regeneration of descending axons in the spinal cord of the axolotl. Neuroscience Letters. 89 (1), 1-6 (1988).
- McHedlishvili, L., Mazurov, V., Tanaka, E. M. Reconstitution of the central nervous system during salamander tail regeneration from the implanted neurospheres. Methods of Molecular Biology. 916, 197-202 (2012).
- Thygesen, M. M., et al. A clinically relevant blunt spinal cord injury model in the regeneration competent axolotl (Ambystoma mexicanum) tail. Experimental Therapeutic Medicine. 17 (3), 2322-2328 (2019).
- Goss, R. J. Principles of Regeneration. , Academic Press. New York. (1969).
- Hutchison, C., Pilote, M., Roy, S. The axolotl limb: a model for bone development, regeneration and fracture healing. Bone. 40 (1), 45-56 (2007).
- Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration (Oxford). 4 (3), 124-131 (2017).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. The American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
