Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Productie, kristallisatie en structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO

Published: December 28, 2019 doi: 10.3791/60339
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Dartmouth College

Summary

We beschrijven protocollen voor de structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO door Röntgen kristallografie. De methoden omvatten eiwit expressie, zuivering en karakterisering, evenals strategieën voor succesvolle kristal optimalisatie en structuurbepaling van het eiwit in zijn ongebonden vorm.

Abstract

NEMO is een steiger eiwit dat een essentiële rol speelt in het NF-κB-traject door het IKK-complex samen te stellen met de kinases IKKα en IKKβ. Na activering fosforyleert het IKK-complex de IκB-moleculen die leiden tot de nucleaire translocatie van NF-κB en de activering van doel genen. Remming van de NEMO/IKK-interactie is een aantrekkelijk therapeutisch paradigma voor de modulatie van de NF-κB-pathway activiteit, waardoor NEMO een doelwit is voorontwerp en ontdekking van remmers. Om het proces van ontdekking en optimalisatie van NEMO-remmers te faciliteren, hebben we een verbeterde constructie van het IKK-bindende domein van NEMO ontworpen dat de structuurbepaling van het eiwit in de APO-vorm mogelijk maakt en terwijl het gebonden is aan kleine moleculair gewichts remmers. Hier presenteren we de strategie die wordt gebruikt voor het ontwerp, de expressie en de structurele karakterisering van het IKK-bindende domein van NEMO. Het eiwit wordt uitgedrukt in E. coli cellen, ontbindend onder denatureringcondities en gezuiverd door middel van drie chromatografische stappen. We bespreken de protocollen voor het verkrijgen van kristallen voor de bepaling van de structuur en beschrijven gegevens acquisitie en analyse strategieën. De protocollen zullen brede toepasbaarheid vinden voor de structuurbepaling van complexen van NEMO en kleine molecuul remmers.

Introduction

Het NF-κB-traject wordt geactiveerd als reactie op een verscheidenheid aan stimuli, waaronder cytokines, microbiële producten en stress, om de expressie van doel genen te reguleren die verantwoordelijk zijn voor inflammatoire en immuunrespons, celdood of overleving en proliferatie1. Pathologieën zoals inflammatoire en auto-immuunziekten en kanker2,3,4,5 zijn gecorreleerd aan hyperactivatie van het traject, die modulatie van NF-κb-activiteit heeft gemaakt tot een primair doelwit voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën6,7.

Met name het canonieke NF-κB-traject onderscheidt zich van het niet-canonieke traject, verantwoordelijk voor lymvengenese en B-cel activatie, door de afhankelijkheid van de voormalige steiger proteïne NEMO (NF-κB Essential modulator8) voor de assemblage van het IKK-complex met de kinases IKKα en IKKβ. Het IKK-complex is verantwoordelijk voor de fosforylering van iκbα (remmer van κb) die het voor afbraak richt, waardoor de NF-κb-Dimeren worden vrijgemaakt om te translokaliseren naar de Nucleus voor gentranscriptie1 en daarom een aantrekkelijk doelwit is voor de ontwikkeling van remmers om NF-κb-activiteit te moduleren.

Ons onderzoek richt zich op de karakterisering van de eiwit-eiwit interactie tussen NEMO en IKKβ, gericht op NEMO voor de ontwikkeling van kleine moleculen remmers van IKK complexe formatie. Het minimale bindende domein van NEMO, dat nodig is om IKKβ te binden, omvat residuen 44-111 en de structuur ervan is bepaald in complex met een peptide overeenkomend met IKKβ-sequentie 701-7459. NEMO en IKKβ vormen een vierhelix bundel waarbij de NEMO dimeer de twee helices van IKKβ (701-745) in een langwerpige open groef met een uitgebreide interactie-interface herbergt. IKKβ (734-742), ook bekend als het NEMO-bindende domein (NBD), definieert de belangrijkste hotspot voor binding, waarbij de twee essentiële tryptophans (739.741) diep begraven in de NEMO Pocket. De details van de complexe structuur kunnen helpen bij het ontwerp op basis van structuur en optimalisatie van kleine molecuul remmers gericht op NEMO. Tegelijkertijd is het moeilijk dat de binding van een kleine molecule of peptide in NEMO de volledige conformationele verandering zou herscheppen (d.w.z. uitgebreide opening van de NEMO spiraalvormige Coil dimer) veroorzaakt door binding van de lange IKKβ (701-745), zoals waargenomen in het kristal, en de structuur van ongebonden NEMO of NEMO gebonden aan een kleine molecuul remmer kan een beter doelwit voor structuur gebaseerde drug design en remmer optimalisatie vertegenwoordigen.

Volledige lengte Nemo en kleinere afkapping constructies die het IKK-bindende domein omvatten, hebben bewezen hardnekkige structuurbepaling in de ongebonden vorm via Röntgen kristallografie en nucleaire magnetische resonantie (NMR) methoden10, die ons ertoe aangezet om een verbeterde versie van het IKK-bindende domein van Nemo te ontwerpen. Inderdaad, NEMO (44-111) in de ongebonden vorm is slechts gedeeltelijk gevouwen en ondergaat conformationale uitwisseling en daarom zetten we ons in om zijn dimere structuur, spiraalvormige spiraal en stabiliteit te stabiliseren, terwijl de binding affiniteit voor IKKβ behouden blijft. Door het toevoegen van drie heptads van ideale dimeer spiraalvormige-Coil sequenties11 op de N-en C-Termini van het eiwit, en een reeks van vier puntmutaties, we genereerden Nemo-eeaa, een construct volledig dimeer en gevouwen in een spiraalvormige spoel, die IKK-bindende affiniteit voor de nanomolair bereik gered zoals waargenomen voor de volledige lengte Nemo12. Als bijkomend voordeel hoopten we dat de spiraalvormige spoel adapters (gebaseerd op de GCN4 sequentie) kristallisatie zouden vergemakkelijken en uiteindelijk hulp zouden kunnen verlenen bij de bepaling van de X-Ray structuur via moleculaire vervanging. Spiraalvormige spoel adapters zijn op dezelfde manier gebruikt om zowel de stabiliteit te verhogen, het gedrag van de oplossing te verbeteren en kristallisatie te vergemakkelijken voor trimere spiraalvormige spoelen en antilichaam fragmenten13,14. Nemo-eeaa wordt gemakkelijk uitgedrukt en gezuiverd uit Escherichia. coli cellen met een splijtbaar histidine tag, is oplosbaar, gevouwen in een stabiele dimeer spiraalvormige spoel en is gemakkelijk gekristalliseerd, met diffractie tot 1,9 Å. De aanwezigheid van de bestelde spiraalvormige spoel gebieden van GCN4 kan bovendien helpen bij het faseren van de gegevens van kristallen van NEMO-EEAA door moleculaire vervanging met behulp van de bekende structuur van GCN415.

Gezien de resultaten die zijn verkregen met APO-NEMO-EEAA, zijn wij van mening dat de hier beschreven protocollen ook kunnen worden toegepast op de kristallisatie van NEMO-EEAA in de aanwezigheid van kleine peptiden (zoals het NBD-peptide) of kleine molecuul remmers, met als doel de vereisten voor NEMO-remming en op structuur gebaseerde optimalisatie van initiële lood remmers te begrijpen. Gezien de plasticiteit en dynamische aard van veel spiraalvormige spoel domeinen16, het gebruik van de spiraalvormige-Coil adapters kan vinden meer algemene toepasselijkheid in medeplichtigheid van structurele bepaling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ontwerp van de constructie voor kristallografie

  1. Kloon de sequentie van NEMO-EEAA zoals in vorige publicatie12 in een vector voor expressie in E. coli met behulp van de T7 Promoter, inclusief een N-terminale Hexa-histidine tag en een protease decolleté site.
    Opmerking: in dit protocol gebruikten we een vector die is aangepast om een N-terminale Hexa-histidine-tag en een tabak etch-virus (TEV) decolleté op de site10op te nemen. Deze vector vergemakkelijkt het splijting van de zijn tag voor eiwit kristallisatie en laat alleen de korte verlenging van GSW residuen voor het begin van de gewenste eiwitsequentie. De vector waaruit dit is afgeleid, en alternatieve vectoren worden weergegeven in de tabel met materialen. In dit protocol werden latere wijzigingen van de oorspronkelijke NEMO (44-111)-sequentie stapsgewijs geïntroduceerd, zoals eerder beschreven10, met behulp van kant gerichte mutagenese. We probeerden in eerste instantie te stabiliseren de NEMO spiraalvormige-Coil dimeer toevoegen van de ideale spiraalvormige-Coil adapters (in een lengte van ten minste drie heptads) aan de N-terminal of C-Terminal einde of beide. De dubbele spiraalvormige spoel was de meest veelbelovende van eerdere kristallisatie proeven en het werd vervolgens gewijzigd met het introduceren van mutaties om kristallisatie te verbeteren, zoals eerder beschreven12.

2. grote schaal uitdrukking van zijn6 Tagged Nemo-eeaa

  1. Transformeer de constructie in BL21 (DE3) competente cellen. Bewaren bij-80 °C als een celglycerol kolf.
  2. Dag 1 – bereid een cel starter cultuur. Voeg in een erlenmeyer kolf van 125 mL 20 mL geweldige Bouillon oplossing en 20 μL van een 100 mg/mL voorraad Ampicillaire toe. Voeg een paar micro liters celglycerol kolf toe (van-80 °C opslag van BL21 (DE3) bevoegde cellen getransformeerd met vector).
  3. Schud de 10 mL starter cultuur 's nachts bij 37 °C, 220 rpm (ongeveer 15 uur).
  4. Dag 2 – vanaf de starter, Verdun tot een OD600 = 0,1 in 250 ml van geweldige Bouillon. Voeg ampicileen toe tot een eindconcentratie van 100 μg/mL. Groeien tot een OD600 = 0,8-1,0.
    1. Voeg Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) toe aan 500 μM en groei gedurende 4 uur bij 37 °C.
    2. Meet OD600 van de geïnduceerde cultuur na 4 h. cultuur moet een od600 = 6-10 bereiken.

3. zuivering van zijn6 Tagged Nemo-eeaa

  1. Spin celkweek tot 3.800 x g gedurende 20 minuten bij 4 °c.
  2. Sla de celpellet op en gooi het medium weg.
    Opmerking: de celpellet kan op dit punt worden opgeslagen en opgeslagen bij-20 °C, voor zuivering op een later tijdstip.
  3. Respendeer de cellen in 40 mL lysisbuffer met 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol, 2 mM MgCl2, 0,5 mm fenylmethylsulfonyl fluoride, 2 mm Dithiothreitol (DTT) en 3 ΜL Benzonase Nuclease.
    Opmerking: de door nikkel geïmmobiliseerde metalen Ion affinity chromatografie (IMAC) kolom gebruikt is compatibel met 2 mM DTT. Als alternatief kan 0,2 mM tris (2-carboxyethyl) Fosfine (TCEP) worden gebruikt.
  4. Splits de resuspendeerde cellen in twee 20-25 mL aliquots.
  5. Lyse de cellen met behulp van Franse pers (geschatte druk 25.000 psi), herhalen 2-3 keer voor elke aliquot (in de koude ruimte).
    Opmerking: als alternatief kunnen cellen worden gelyseerd door sonicatie (niet getest in dit Protocol).
  6. Voeg ureum toe aan de cel lysaat tot een uiteindelijke concentratie van 8 M, laat inbrokkelen op een schommel platform voor een minimum van 2 uur of tot 's nachts. Deze en alle volgende zuiveringsstappen, met uitzondering van de dialyse, kunnen bij kamertemperatuur worden uitgevoerd.
  7. Dag 3 – Breng het lysaat over naar ultracentrifuge tubes en weeg gewicht, zodat lysaat de buizen tot ten minste 3/4 vol vult. Draai het lysaat op 125.000 x g voor 45 min bij 25 °c. Decanterende het supernatant in een bekerglas van 100 mL voor het laden op de kolom.
    Opmerking: centrifugeren bij 4 °C zal leiden tot een crash van ureum.
  8. Verwijder op een snel vloeistofchromatografie systeem ethanol uit de iMac 5 ml kolom met 25 ml ultrapuur H2O bij 5 ml/min, gevolgd door 25 ml elutie buffer met 20 mm tris, 150 mm NaCl, 500 mm imidazol, 2 mm DTT, pH 8,0, vervolgens 25 ml bindings buffer met 20 mm tris, 150 mm NaCl, 10 mm imidazol, 2 mm DTT, 8 M ureum, pH 8,0.
  9. Laad ureum met supernatant bij 3 mL/min op de IMAC-kolom, waarbij de doorstroming wordt verzameld. Was de kolom voor 10 kolom volumes met bindende buffer bij 3 mL/min.
  10. Refold NEMO-EEAA construct op kolom door het wassen van kolom met refolding buffer voor 20 kolom volumes bij 3 mL/min, met 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 mM DTT, pH 8,0.
  11. Voer gradiënt elutie van NEMO-EEAA uit, van 10 tot 500 mM imidazol over een volume gradiënt van 12 kolommen, waarbij alle eluaat in breuk plaat wordt verzameld (fracties van 1 mL).
  12. Doorgaan met elutie op 500 mm imidazol voor twee kolom volumes, blijven verzamelen.
  13. Voer natriumdodecylsulfaat (SDS)-polyacrylamidegel elektroforese (pagina) van fracties uit om de aanwezigheid van NEMO-EEAA in elutie fracties te bepalen.
    Opmerking: we gebruikten 10% acrylamide, MES buffer.
  14. Pool fracties met zuiver doel proteïne.
  15. Meet de eiwitconcentratie door Bradford assay17.
    Opmerking: dit is nodig om de hoeveelheid protease voor tag decolleté te schatten.

4. zijn6 tag splijting en zuivering

  1. Voeg TeV toe in een 1:10 gewichtsverhouding van TeV: Nemo-eeaa proteïne om de zijn6 -tag te klieven. De TEV protease werd gezuiverd in huis.
    Opmerking: Optimaliseer de hoeveelheid TEV, tijd en temperatuur die nodig is voor een volledige decolleté afzonderlijk.
    1. Express TeV protease, S219V Mutant18 in BL21 (DE3)-RIL Cells en zuiveren zoals eerder beschreven19. Laat de cellen kort groeien zoals beschreven in stap 2, lyse door de Franse pers en zuiveren met behulp van een iMac-kolom. Bewaar het uiteindelijke eiwit in 25 mM natriumfosfaat buffer, pH 7,8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 20% v/v glycerol.
  2. Dialyseer het monster 's nachts (ongeveer 15 uur) in 4 L van 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0, om splijting mogelijk te maken en om overtollig imidazol uit het monster te verwijderen voor de daaropvolgende zuivering.
  3. Dag 4 – Verwijder het monster van dialyse. Voer een SDS-PAGE gel van het monster uit van TEV decolleté om ervoor te zorgen dat het splijting is voltooid.
  4. Op een snel vloeistofchromatografie systeem verwijdert u ethanol uit een iMac 5 ml kolom met 25 ml ultrapuur H2O bij 5 ml/min, gevolgd door 25 ml elutie buffer met 20 mm tris, 150 mm NaCl, 500 mm imidazol, 2 mm DTT, pH 8,0, dan bindende buffer met 20 mm tris, 150 mm NaCl, 10 mm imidazol, 2 mm DTT, pH 8,0.
  5. Laad de kolom bij 1 mL/min met TEV-cleaved NEMO-EEAA. Cleaved NEMO-EEAA zal in de doorstroom elzen: verzamelen in een 96 well fractie Verzamel plaat (1 mL fracties). Was de kolom voor vijf kolom volumes van 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazol bij 1 mL/min, en Verzamel ze in de verzamel plaat voor breuken.
  6. Elute TEV en uncleaved zijn6-Nemo-eeaa met drie kolom volumes van 20 mm Tris, 150 mm nacl, 500 mm imidazole, 2 mm DTT, pH 8,0, opvang van elutie in een kolf van 50 ml.
  7. Voer SDS-PAGE gel van doorstroom fracties uit om de aanwezigheid van gespleten NEMO-EEAA te bepalen.
  8. Pool doorstroom fracties met gesplitst Nemo-eeaa construct, en concentreer u met behulp van een stirred-Cell concentrator tot 5 ml. Cut-off membraan molecuulgewicht (MWCO) = 3 kDa.
  9. Met behulp van een 3 kDa MWCO membraan, dialyze geconcentreerd monster in 2 L van 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0 voor 2 h. Verander de dialyse buffer in 2 L verse dialyse buffer voor nachtelijke dialyse (ongeveer 15 uur), bij 4 °C.
  10. Dag 5 – laden 5 mL van het dialyzed monster op een grootte uitsluitings chromatografie (SEC) 16 mm x 60 cm kolom (34 μm gemiddelde deeltjesgrootte) bij 1 mL/min in 2 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0. Herhaal dit met extra kolommen, afhankelijk van het sample volume.
  11. Pool de fracties die overeenstemmen met dimeer Nemo-eeaa.
    Opmerking: Nemo-eeaa kolom tussen 60-65 ml, overeenkomend met een groter molecuulgewicht eiwit, vanwege de langwerpige aard van de dimeer spiraal spiraal.
  12. Concentraat met behulp van een stirred-Cell-concentrator en een MWCO = 3 kDa-membraan tot een eindconcentratie van 113 μM (1,65 mg/mL).
  13. Aliquot het eiwit en bewaren bij 4 °C (stabiel gedurende 1 maand).

5. Sparse matrix screening

Opmerking: het protocol voert kristallisatie proeven uit met behulp van commercieel beschikbare schermen en het instellen van Sit drop experimenten met behulp van een kristallisatie robot. Crystal-afbeeldingen worden automatisch verzameld door een Imager.

  1. Gebruik in de handel verkrijgbare Sparse matrix schermen (Zie tabel met materialen), pipetteer 60 μL Sparse matrix oplossing in elk van de 96 putjes van een 2 druppel kamer kristallisatie plaat voor zittende druppel damp diffusie (reservoir oplossing).
  2. Met behulp van een robot-druppel setter, doseren 100 nL eiwit oplossing bij 1,65 mg/mL in een 1:1 verhouding met reservoir oplossing in druppel 1 voor een eindvolume van 200 nL; dan 66 nL eiwit oplossing met 134 nL reservoir oplossing voor een eindvolume van 200 nL in drop 2 (1:2 ratio).
  3. Sluit de plaat direct na het doseren aan met een 3-inch afdichtingsband.
    Opmerking: druppels zullen uitdrogen als ze langer dan 2-3 min aan de atmosfeer worden blootgesteld.
  4. Bewaar de trays in de kristallisatie Imager-opslag bij 20 °C en controleer de beelden die automatisch worden verzameld voor Crystal Presence, beginnend na twee dagen.
    Opmerking: de kristallisatie screening verliep parallel met de construct optimalisatie. Initiële kristallen gevormd in de volgende omstandigheden (commerciële schermen vermeld in de tabel van de materialen): a) 0,1 M Tris, pH 8,0, 30% v/v POLYETHYLEENGLYCOL (PEG) Mme 550, 5% poly-γ-glutaminezuur, 200-400 kDa laag moleculair gewicht polymeer (PGA-LM); b) 0,1 M Tris, pH 7,8, 20% w/v PEG MME 2k, 5% PGA-LM; c) 0,1 M Tris, pH 7,8, 20% w/v PEG 3350, 5% PGA-LM. Sparse matrix scherm kristallen zal hebben slechte rooster uniformiteit; Daarom zullen ze er slecht uitzien met behulp van cross-gepolariseerde beeldvorming. Gebruik UV-beeldvorming om ervoor te zorgen dat de kristallen eiwitten bevatten. De volgende stap voor het genereren van zaad voorraden is noodzakelijk voor het verkrijgen van de uiteindelijke diffractie kwaliteits kristallen.

6. zaad voorraad opwekking

NB: wij verkrijgen in 0,1 M Tris pH 8,0, 5% PGA-LM, 3,6% w/v PEG 20k reproduceerbare kristallen voor zaad opwekking. Kristallen zullen echter een hoge mosaiciteit vertonen en zijn in dit stadium ongeschikt voor het verzamelen van gegevens.

  1. Gebruik een Kit voor zaad opwekking, bereid de zaad voorraad voor door de gehele druppel met kristal aanwezig te pipetteren en plaats in 50 μL kristallisatie voorwaarde oplossing in de meegeleverde injectieflacon.
  2. Vortex de zaden voorraad 3 min, pulserend 20 s aan en 10 s uit.
  3. Zaad voorraad wordt in 1:10 verhoogd tot 1:10000. Bewaar alle verdunningen bij 4 °C, voor verder gebruik.

7. fijne schermen

  1. Ontwerp fijne schermen, variërend van de voorwaarden voor Tris, PGA-LM en PEG. De lengte van de PEG varieert voor afzonderlijke trays.
    Opmerking: het fijne scherm dat het kristal heeft geproduceerd dat voor de structuurbepaling van NEMO-EEAA wordt gebruikt, heeft de volgende voorwaarden gehanteerd: 0,1 M Tris pH 8; PGA-LM varieerde van 8 tot 0% in kolommen 1-12. Rijen A-H screenen verschillende pinnen, met concentraties variërend in kolommen 1-12 als volgt. A: PEG 200 (0-40% v/v); B: PEG 400 (0-40% v/v); C: PEG MME 500 (0-40% v/v); D: PEG 1000 (0-30% w/v); E: PEG 3350 (0-30% w/v); F: PEG 6k (0-30% w/v); G: PEG 10k (0-20% w/v); H: PEG 20k (0-20% w/v). Het kristal verscheen in goed H4 (5,45% w/v PEG 20k, 5,8% w/v PGA-LM). In dit protocol werd een proteïne kristallography screen Builder Liquid handler gebruikt om de schermen te bouwen.
  2. Zaai een proteïne aandeel in een 1:25 volume ratio van 1:1000 zaad verdunning.
    Opmerking: de concentratie van NEMO-EEAA zal iets dalen, maar er zullen nog steeds kristallen vormen.
  3. Herhaal stap 2 met 1:10000 zaad verdunning, zelfde 1:25 volume ratio.
  4. Met behulp van de druppel setter, doseren 100 nL eiwit oplossing bij 1,65 mg/mL, met 1:1000 verdunning van de zaad voorraad in een 1:1 verhouding met reservoir oplossing in druppel 1 voor een eindvolume van 200 nL. Herhaal dit voor drop 2, maar met 1:10000 verdunning van zaad voorraad aanwezig.
  5. Sluit de plaat direct na het doseren aan met een 3-inch afdichtingsband.
    Opmerking: druppels zullen uitdrogen als ze langer dan 2-3 min aan de atmosfeer worden blootgesteld.
  6. Bewaar de trays in de imager-opslag bij 20 °C en controleer de beelden die na twee dagen zijn verzameld voor de aanwezigheid van kristallen.
  7. Controleer de kristallen met de cross-polarizer Imager voor de gelijkmatigheid van de rooster, om te selecteren voor enkele voorwaarden voor het instellen van de volgende trays.

8. generatie van kristallen voor het verzamelen van gegevens

  1. Ontwerp enkele conditie schermen rond Tris, PGA-LM en PEG condition, die uniforme kristallen produceerde zoals geanalyseerd doorkruis gepolariseerde beelden, en de grootste kristallen mogelijk.
    Opmerking: kristallen uit deze voorwaarden zijn onregelmatig van vorm, meestal rechthoekige dunne vellen. Het is de sleutel om een voorwaarde te selecteren waarbij de randen van het kristal goed gedefinieerd zijn en de grootst mogelijke dikte hebben.
  2. Maak 20 mL kristallisatie conditie met de hand.
  3. Gebruik een multi-channel pipettor, Doseer 60 μL per put in een 2 druppel kamer, 96 goed kristallisatie plaat voor zittende druppel damp diffusie.
  4. Bereid de zaad voorraad voor zoals beschreven in stap 6,2.
  5. Verdeel het eiwit zoals beschreven in stap 6,3.
  6. Sluit de plaat direct na het doseren aan met een 3-inch afdichtingsband.
    Opmerking: druppels zullen uitdrogen als ze langer dan 2-3 min aan de atmosfeer worden blootgesteld.
  7. Bewaar de trays in de imager bij 20 °C en controleer elke dag de beelden op de aanwezigheid van kristallen.
  8. Controleer kruislings gepolariseerde beelden van de kristallen voor de uniformiteit van het rooster, om kristallen te selecteren voor het verzamelen van gegevens.

9. bepaling van Cryo-Protectant

  1. Voor het testen van de Cryo-protectants, het creëren van stamoplossingen die overeenkomen met de kristallisatie omstandigheden, maar met 30%, 20%, 10%, en 5% hogere concentratie van elk onderdeel. De toevoeging van het Cryo-Protectant volume zal resulteren in een uiteindelijke concentratie van componenten die hetzelfde is als de kristallisatie omstandigheden.
    Opmerking: voor het testen van een Cryo-Protectant bij een 30%-concentratie op volume voor een kristallisatie voorwaarde van 0,1 M Tris, begint u met een stamoplossing van 0,143 M Tris, voordat u de Cryo-Protectant toevoegt.
  2. Maak van een Cryo-reagentia Kit 10 μL monster voor Cryo-Protectant test door het mengen van 30% volume Cryo conditie in 70% van de kristallisatie conditie stockoplossing, voor een uiteindelijke concentratie van 30% Cryo-Protectant in oorspronkelijke kristallisatie omstandigheden. Meng.
    1. Neem met een pipet van 10 μL 5 μL test-Cryo-beschermde oplossing en dompel de pipetpunt in vloeibare stikstof. Als ijs wordt waargenomen, gooi het dan weg.
    2. Test alle Cryo-protectants op 30%. Voor de succesvolle oplossingen, herhaal het proces op 20%, dan 10% en 5% van Cryo-Protectant.
    3. Gebruikmakend van de succesvolle Cryo-Protectant oplossing met het kleinste percentage Cryo-Protectant, Voeg 0,5 μL oplossing toe aan een test druppel met aanwezige kristallen. Observeren onder Microscoop, timing hoe lang kristal duurt in de voorwaarde, indien niet onbepaalde tijd.
      Opmerking: deze kristallen zijn alleen voor test en zullen worden weggegooid. Voor NEMO-EEAA is 12% 1,2-propanediol de optimale Cryo-Protectant oplossing. 12% rekeningen voor de verdunning de Cryo-Protectant oplossing zal ervaren wanneer toegevoegd aan de kristallen druppel van ongeveer 100 nL, voor een geschatte eindconcentratie van 1,2-propanediol van 10%.

10. kristallen looping

  1. Lus kristallen 1-2 dagen voor verzending naar Synchrotron.
    Opmerking: kristallen zullen ongeveer 60-100 μm in diameter zijn: 0,05-0,10 mm lussen zijn ideaal voor looping.
  2. Knip de tape van de bovenkant van de put.
  3. Voeg 0,5 μL kristallisatie oplossing met 12% 1,2-propanediol Cryo-Protectant rechtstreeks toe aan de put.
    NB: de uiteindelijke concentratie van 1,2-propanediol is nu ongeveer 10%, als gevolg van verdunning met 100 nL druppel oplossing (bij benadering daling Volume reductie vanaf de eerste 200 nL, als gevolg van damp diffusie).
  4. Loop het kristal van de put.
    Let op: kristallen groeien vaak op de bodem van de put, maar zullen vergaan met een zachte duwtje van de lus. Eenmaal ontbonden, lus.
  5. Bewaar het kristal met Cryo-loops in pucks ondergedompeld in vloeistof N2.
  6. Bewaar deze pucks in vloeistof N2 in de Dewar kolf totdat ze klaar zijn voor verzending voor röntgendiffractie bij de Synchrotron.

11. verzamelen van gegevens

  1. Verzamel X-Ray diffractie-gegevens. Gebruik in dit protocol AMX beamline (ID: 17-ID-1), National Synchrotron Light Source II.
    Opmerking: gegevens zijn verzameld op de site, maar kunnen op afstand worden verzameld. Verzamel gegevens in de regio van het kristal die de uniformiteit van de rooster in cross-gepolariseerde beelden toonde. Plaats de kristallen in de lus zodat de gegevensverzameling geen "arme" gebieden van het kristal omvat terwijl het kristal in de goniometer draait. Gegevens die de beste resolutie hadden, kwamen van verzameling op de rand van een uitbreiding van een kristal ongeveer 5 x 5 μm groot. Gebruik een rastering om de beste gebieden op het kristal te identificeren om20te verzamelen.

12. X-Ray gegevensverwerking

  1. Verwerk gegevensset naar de hoogste resolutie die is verzameld (1,8 Å) met XDS IDXREF-programma om de ruimtegroep, eenheidcel en oplosmiddel inhoud te bepalen.
  2. Integreer data met behulp van XDS Integreer programma.
  3. Proces geschaalde intensiteiten van XDS XSCALE programma met behulp van STARANISO-server, met behulp van I/σI cutoff gemiddelde van 1,2 voor diffractie-limiet oppervlak voor de gegevens.
    Opmerking: gegevens worden niet in True ellipsoid gesneden. Bewaar alle gegevens boven de I/σI van 1,2 cutoff. De statistieken over de gegevens die worden berekend voor sferische volledigheid zullen slecht zijn, vanwege de niet-sferische truncation. De elliptische volledigheid was 88% met de hoogste resoluties van respectievelijk: 1,88 Å, 2,10 Å en 2,55 Å langs de a *, b * en c-as.

13. structuur oplossing

  1. Gebruik de Röntgen structuur van GCN4 (PDB: 4DMD)15 als Zoek model voor moleculaire vervanging met behulp van mrage21 in Phenix22. De 4dmd-structuur werd gedefinieerd in mrage als een "Ensemble", en de mrage-oplossing bouwde met succes het structuur gedeelte dat overeenkomt met de N-terminale spiraalvormige spoel adapter van Nemo-eeaa, homologe aan het zoek model, voor beide kettingen in de Dimer.
    Opmerking: anisotropie-correctie in PHASER uitschakelen of gegevens worden verder geschaald.
  2. Gebruik opeenvolgende rondes van autobuild23 in Phenix en Manual Building (met behulp van 2Fo-fc en fo-fc Maps, in Coot24) om de rest van de structuur te bouwen.
  3. Bouw handmatig de resten die nog ontbreken in het model op basis van 2Fo-fc en fo-fc kaarten, met behulp van Coot24.
    NB: de laatste fase betrof de bouw van de 4 N-terminale residuen en 4 C-terminale residuen voor elk monomeer. De plaatsing van de sidechain werd indien nodig ook handmatig aangepast.
  4. Bereken een samengestelde weglaten kaart met behulp van PHENIX en een 10% omissie van de structuur.

14. structuur verfijning

  1. Verfijn de structuren met PHENIX verfijnen. Voer de initiële verfijningen tegen bulk-oplosmiddel en stereochemie gewichten, ontspannende RMSbond en RMSangle beperkingen 0,01 en 1,0, respectievelijk. Ga verder met verfijning op individuele B-factoren, TLS-parameters en bewerkers.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Klonen, expressie en zuivering van het IKK-bindende domein van NEMO.
Het protocol gevolgd in deze studie om de definitieve sequentie van NEMO-EEAA (Figuur 1A), die produceerde diffractie kwaliteit kristallen, betrokken de uitdrukking en de karakterisering van alle tussenliggende constructies, met inbegrip van de toevoeging van de spiraalvormige Coil adapters op N-en of C-Terminus, de mutaties C76A, C95S en de mutaties E56A, E57A. Figuur 1B geeft een SDS-page gel weer van monsters die tijdens de zuiverings procedure worden verzameld, zoals beschreven in de regeling in Figuur 1C. Het eiwit wordt overgedruct in E. coli en verschijnt als een band ongeveer op de 14 kDa MW gewichts markering op de SDS-page gel (Lane 3, cellen verzameld bij de oogst en Gelyseerd in Laemmli monster buffer aangevuld met 8 M ureum). Het eiwit verschijnt puur na de eerste IMAC-kolom en toont een monomeer en een dimeer band op het niveau van de 14 en 28 kDa MW markeringen op de SDS-PAGE gel (Lane 9). Het decolleté van de TeV is vrijwel volledig na het protocol en de proteïne-kolom met de doorstroming tijdens de tweede iMac-kolom bijna volledig als dimeer, op het verwachte MW (band onder 28 kDa). De grootte van de uitsluitings chromatografie toont een enkele piek van 60-65 mL die overeenkomt met onze ervaring met de dimeer (Figuur 1D). De dimeer spiraalvormige spiraal afraas altijd eerder dan verwacht op SEC vanwege de verlengde vorm van de opgerolde spoel en de daardoor grote hydrodynamische straal10. NEMO-EEAA in fracties van SEC Peak verschijnt nog steeds als een monomeer en een dimeer op SDS-page gel (Lanes 14-15). Het gebruik van een stirred-Cell-concentrator is belangrijk om te voorkomen dat monster mogelijk aggregatie en precipitatie bij concentratie.

Kristallisatie van Nemo-EEAA
Eerste kristallen werden verkregen uit een commercieel scherm met behulp van PGA (Zie tabel van materialen), gebruikmakend van 1,65 μg/ml Nemo-eeaa in 2 mm Tris, 100 mm NaCl, 2 mm DTT, pH 8,0. Fijne screening produceerde kristallen in 0,1 M Tris pH 8,9, 5% PGA-LM, 3,6% PEG 20k (Figuur 2A), die werden gebruikt om een zaad voorraad te produceren. Uiteindelijke kristallen werden verkregen met zaaien in 0,1 M Tris pH 8,0, 5,8% PGA-LM, 5,45% PEG 20k (Figuur 2B).

Bepaling van gegevensverzameling en-structuur
NEMO-EEAA kristallen lijden aan mosaiciteit en anisotropie. Kristallen gevormd in de P 1 21 1 ruimtegroep, met data resolutie variërend in de a *, b * en c * as (1,88 å, 2,10 å en 2,55 å). Voorbeelden van diffractie-profielen zijn in Figuur 3. De gegevens werden verkregen bij de AMX (17-ID-1) beamline van NSLS II, met een bundel grootte van 7 x 5 μm2. De kleine bundel grootte was essentieel om zich te concentreren op het gewenste deel van het kristal (Figuur 2B) en de kwaliteit van de gegevens te waarborgen.

Het succesvolle protocol voor de bepaling van de structuur vereist anisotrope afkapping van de gegevens met behulp van de staraniso27 server (http://staraniso.globalphasing.org/cgi-bin/staraniso.cgi), gevolgd door een geleidelijke door moleculaire vervanging met behulp van mrage21 binnen Phenix22 en de structuur van dimeer GCN4 (PDB: 4dmd)15 als een zoek model. In de oplossing van deze structuur fasering werd aanvankelijk geprobeerd door het labelen van de inheemse methionine met SeMet. Het afwijkende signaal was te zwak, waarschijnlijk te wijten aan de oplosmiddel blootgestelde aard van Met95 in de ongebonden vorm van NEMO (SeMet95 werd met succes gebruikt voor de geleidelijke fasering van de NEMO/IKKβ-structuur9).

Initiële gegevensanalyse werd geprobeerd met sferische afkapping van de gegevens naar 2,3 Å. Deze gegevensset kan niet met succes worden gefaseerd door moleculaire vervanging, maar een oplossing werd verkregen met behulp van de heer-ROSETTA25 en de structuur van Nemo (44-111) in complex met IKKβ (701-745) als Zoek model (VOB: 3BRV)9. Dit eerste model kan niet met succes worden verfijnd. We gebruikten de Diffraction anisotropie-server op de UCLA26 om de gegevens elliptisch af te kappen en om anisotropie te verwijderen door anisotrope schaling. De nieuw verwerkte gegevensset kan worden gefaseerd door moleculaire vervanging. Om de gegevens verder te verbeteren, hebben we de staraniso27 -server gebruikt voor anisotrope afkapping van de gegevens en amplituden werden gecorrigeerd met een anisotrope correctiefactor met Bayesiaanse schatting28. Deze gegevens, resulterend in een toename van het aantal unieke reflecties tot 19.560, werd gebruikt voor structuur verfijning. Samengestelde weglaten kaarten waar berekend met PHENIX, met uitzondering van 10% van de atomen per keer, en vergeleken met het uiteindelijke structuur model, om te bevestigen dat de structuur niet bevooroordeeld is door het atoommodel. Het kristallografische model is compleet, met uitzondering van de eerste en laatste residuen in keten A van NEMO-EEAA, waarvoor geen elektronen dichtheid werd waargenomen.

NEMO-EEAA is een homo-dimeric, onregelmatige, parallelle spiraalvormige spoel van ~ 175 Å in lengte. De reguliere spiraalvormige spoel regio omvat de ideale sequentie van de spiraalvormige spoel adapter bij het N-eindpunt (residuen 20-50) en de eerste twee heptads van de juiste sequentie van NEMO (residuen 51-65). Een reguliere spiraal spoel is ook aanwezig bij het C-Terminus, beginnend bij NEMO residu 97 en omvat de C-Terminal ideal Coil-Coil adapter (Figuur 4A). Het centrale gedeelte, dat bestaat uit NEMO-residuen 66-98, toont grotere interhelische afstanden (interhelische afstand gaat van een gemiddelde waarde van 7,6 Å in de reguliere spiraalvormige spoel structuur tot een maximum van 11,5 Å in de onregelmatige regio) en discontinue hydrofobische interface in vergelijking met een ideale spiraal spiraal. Deze regio van NEMO vertegenwoordigt ook de interface voor binding IKKβ en ondergaat een conformationele verandering op ligand binding. De IKKβ-gebonden structuur toont een meer open spiraalvormige convector voor de ligand met een grotere interhelische afstand van 1,0 tot 2,2 Å in deze regio (Figuur 4B)12. In de APO-structuur worden Leu93, Met94, Lys96, Phe97 en Arg101 verschoven naar het midden van de spiraalvormige spoel om de ligand binding Pocket binnen te dringen (de Cα-Cα-afstand voor Phe97 is strakker door 2,9 Å), met als totaaleffect het sluiten van de grote hydrofobe spleet die de ligand in de IKKβ-gebonden structuur herbergt.

Figure 1
Figuur 1: zuivering van Nemo-EEAA. (A) sequentie uitlijning van Nemo van homo sapiens, Mus musculus en bos BOVIS en de engineered Nemo-eeaa. De opeenvolging van spiraalvormige adapters wordt onderstreept en de mutaties worden oranje gemarkeerd. (B) SDS-page gel van fracties verzameld tijdens de expressie en zuivering (als gelabeld en verwezen in stroomdiagram 1c). 10% acrylamide, MES-buffer. C) een stroomschema voor de zuivering van Nemo-eeaa. D) formaat-uitsluitings profiel dat het dimeer van Nemo-eeaa (blauw) aangeeft. In het groen worden de moleculair gewichts markeringen (kDa) aangegeven. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: morfologie en grootte van Nemo-EEAA-kristallen. A ) een kristal van Nemo-eeaa van het initiële Sparse matrix-scherm, niet-geseede. Dit type kristal werd gebruikt voor het zaaien voor daaropvolgende kristallisatie pogingen (0,1 M Tris pH 8,0, 5% PGA-LM, 3,6% PEG 20k; met een eiwit oplossing in 2 mM Tris, 100 mM NaCl 2 mM DTT, pH 8,0). B) kristal dat wordt gebruikt voor het verzamelen van gegevens (0,1 M Tris pH 8,0, 5,8% PGA-LM, 5,45% Peg 20k, met een eiwit oplossing in 2 mm tris, 100 mm NaCl 2 mm DTT, pH 8,0). Het geschatte gebied dat wordt gebruikt voor het verzamelen van gegevens wordt rood omcirkeld. De schaalbalk voor 100 μm lengte wordt gedefinieerd in de figuur. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: kristallografische gegevens verkregen uit Nemo-kristallen. A) röntgendiffractie Profiel van vroege Nemo Crystal: langwerpige strepen geven mosaiciteit in het kristal aan. B) Röntgen diffractieprofiel van een geoptimaliseerd Nemo-eeaa-kristal. De resolutie ring wordt getekend bij een ruimtelijke resolutie van 2,5 Å. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: structuur van ongebonden Nemo. A) de Nemo-eeaa-dimeer wordt weergegeven als een lint, licht blauw = spiraalvormige spoel adapters, blauw = Nemo (51-112). B) superpositie van APO Nemo-eeaa-structuur (blauw, VOB: 6MI3) en Nemo (44-111) uit de ikkβ-gebonden structuur (grijs, VOB: 3BRV, ikkβ wordt niet weergegeven), weergegeven als linten; de structuren zijn uitgelijnd op chain A, regio 44-111 alleen. Dit cijfer is gewijzigd van vorige publicatie12. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kristallisatie pogingen van Nemo in de ongebonden vorm waren mislukt, inclusief pogingen met behulp van het volledige eiwit en verschillende afkapping constructies die het IKK-bindende domein omvatten. Onze biofysische karakterisering van het IKK-bindende domein van Nemo (residuen 44-111) door Circulair dichroisme, NMR-spectroscopie en fluorescentie anisotropie gaf aan dat de constructie, zij het in staat om ikkβ te binden, bestond in een toestand van conformationele Exchange, niet geschikt voor kristallisatie9,10. Onze aanpak betrof de engineering van een constructie van het IKK-bindende domein van NEMO dat een stabielere, gevouwen en inheemse-achtige conformatie heeft aangenomen, waardoor de flexibiliteit die kristallisatie voorkwam, werd geëlimineerd. Ideaal opgerold-Coil domein adapters versmolten met de N-en C-Termini van de Nemo (44-111) sequentie bieden het voordeel van het stabiliseren van de dimeer spiraal spiraal-Coil vouw van de native Nemo en het faciliteren van kristallisatie14. Het gedrag van een reeks eiwit constructies werd bij elke stap gemonitord via SDS-page, grootte exclusie chromatografie, circulair dichroïsme, fluorescentie anisotropie en NMR-spectroscopie, zoals eerder10,12beschreven. Ondanks de progressieve verbetering in alle gewenste parameters leverde geen construct diffractie kwaliteits kristallen tot de mutaties E56A, E57A werden geïntroduceerd. De mutaties waren de hoogste impact mutaties voorgesteld door de oppervlakte entropie reductie server SERp29 , waarbij geen residuen betrokken waren bij hotspots van binding voor ikkβ, zoals in de Nemo/IKKβ complexe structuur. Hoewel andere constructies het stabiliseren van de geordende structuur van het IKK-bindende domein van Nemo via cysteïne bisulfide koppeling en binding ikkβ met hoge affiniteit zijn beschreven30, het protocol hier beschreven vertegenwoordigt de eerste succesvolle benadering van de structuurbepaling van het IKK-bindende domein van Nemo in de niet-afhankelijke vorm.

De productie en zuivering van eiwitten volgde standaardprocedures in ons laboratorium. Bij cellyse is een aanzienlijk deel van het eiwit aanwezig in de onoplosbare Fractie, zelfs bij het kweken van de cellen na inductie bij 18 °C, daarom werd het eiwit gesolubiliseerd in 8 M ureum na cellyse en voorafgaand aan zuivering, en opnieuw gevouwen terwijl het gebonden was aan de IMAC-kolom. Uitgebreide wassen van de kolom gebonden eiwitten zowel onder denaturerende voorwaarden en na het opnieuw vouwen zijn van cruciaal belang voor een zuiver product na de eerste zuivering stap. De zuivere NEMO-EEAA heeft een hogere neiging om neer te slaan dan de vorige constructies, maar is nog steeds voldoende oplosbaar onder kristallisatie omstandigheden.

Een belangrijke stap in de bepaling van de structuur was het gebruik van seeding. In een benadering die vergelijkbaar is met microseed matrix screening31, werden zaden van kristal verkregen tijdens Sparse matrix screening gebruikt in een aanvullende screening van condities, gevolgd door een fijne screening ronde, om de uiteindelijke kristallisatie omstandigheden te bepalen. De meeste kristallen die in de laatste omstandigheden geteeld worden, vertonen een hoge mosaiteit en zijn niet geschikt voor het verzamelen van gegevens. Kristallen werden gescreend op verschillende bezoeken aan de beamline en de beste datakwaliteit werd bereikt door het verzamelen van datasets aan de rand van het kristal, waar de nieuwste groei plaatsvond. Omdat de regio, die de uniformiteit van de rooster in kruislings gepolariseerde beelden vertoonde, klein was, was het instrumentaal om toegang te hebben tot de AMX beamline bij NSLS II, vanwege de kleine bundel grootte.

We hebben met succes de structuur van Nemo-eeaa bepaald door moleculaire vervanging met behulp van als een zoek model de structuur van de dimeer spiraalvormige-spoel van GCN415, die is toegewezen aan de ideale spiraalvormige-Coil adapters gesmolten op de N-en C-Termini van de Nemo sequentie. De moleculaire vervanger was succesvol omdat de GCN4-adapters hun eigen structuur behouden wanneer ze werden samengesmolten tot NEMO. Tegelijkertijd konden we nagaan of NEMO zijn inheemse structuur behoudt door de porties te vergelijken die niet betrokken zijn bij IKK-binding met de corresponderende structuur regio in de NEMO/IKKβ-complexe structuur. Als alternatief zou het mogelijk zijn om de structuur van NEMO te gebruiken in het NEMO/IKKβ-complex (VOB: 3BRV)9 als een moleculair vervangings zoekmodel, gericht op monomeer B, dat overeenkomt met de keten die de kleinste conformationele verandering ondergaat op ligand binding. Deze strategie toonde een eerste succes met behulp van de MR-ROSETTA module van PHENIX.

Ten slotte was het essentieel voor een succesvolle structuurbepaling om alle beschikbare gegevens in de gegevensset te gebruiken, door toevlucht te nemen tot een anisotrope cut-off van samengevoegde intensiteitsgegevens, zoals verstrekt door de STARANISO27 -server of de Diffraction Anisotropy-server op UCLA26.

De essentiële rol die het NEMO/IKK-complex in het NF-kB-traject speelt, maakt het een wenselijk doelwit voor de modulatie van het traject voor therapeutische interventie. Eiwit-eiwit interacties, vooral bij het betrekken van een grote binding interface, zijn uitdagend om te remmen met kleine peptiden of kleine moleculen, en structuur gebaseerde remmer ontwerp kan een aanzienlijk voordeel bieden. De constructies van het IKK-bindende domein van NEMO die we ontwikkelden, hebben de grenzen van de flexibele NEMO (44-111) overwonnen om kristallisatie en structuurbepaling te vergemakkelijken. Omdat de constructie gemakkelijk kristalliseert in de ongebonden vorm, stellen we voor dat hetzelfde protocol met succes kan worden toegepast in de kristallisatie van het complex van NEMO met kleine molecuul remmers, om een structuur te bepalen die details zou geven over bindende modi en verdere ligand verbeteringen mogelijk te maken.

Een analyse van kristallen pakking in de kristallisatie omstandigheden die in dit werk worden bereikt, geeft aan dat ligand co-kristallisatie de voorkeur kan krijgen om te ligen in APO-eiwitkristallen te weken. Terwijl Crystal Packing ruimte biedt rond ketting B van de dimeer (6 tot 10 Å naar de dichtstbijzijnde keten) en op één zijde van de ligand bindingsplaats (ongeveer 13 Å in de hot-spot regio tussen Phe82-Phe87), wordt de symmetrische BIND Pocket volledig afgesloten door nabijgelegen ketens, waardoor ligand binding wordt voorkomen.

Spiraalvormige spoelen zijn aanwezig in een significant deel in het proteoom en zijn essentieel in hun functie als moleculaire spacers, steigers en in communicerende conformationele veranderingen16. Ondanks hun overvloed en relevante rollen, er zijn relatief weinig structuren van de volledige lengte spiraalvormige-Coil eiwitten. Het gebruik van spiraalvormige spoel adapters kan helpen bij de stabilisatie van structurele domeinen van spiraalvormige-spoel eiwitten met behoud van hun inheemse structuur en steun in de structurele bepaling en verheldering van hun functie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Acknowledgments

We danken Prof. D. Madden voor veel nuttige discussies tijdens dit project. We danken Prof. D. Bolon voor de gave van het plasmide met de geoptimaliseerde GCN4 spiraalvormige spoel. We danken Dr. B. Guo voor NEMO plasmids. We danken Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili en Amy E. Kennedy voor het aantonen van de procedure. We danken de kern faciliteit voor BioMT kristallografie en de afdelingen chemie en Biochemie & celbiologie bij Dartmouth voor het gebruik van de kristallografie apparatuur en het BioMT-personeel voor hun ondersteuning. Dit onderzoek gebruikte de AMX beamline van de National Synchrotron Light Source II, een Amerikaanse afdeling van energie (DOE) Office of Science User Facility voor het DOE Office of Science door Brookhaven National Laboratory onder contract nr. DE-SC0012704. We danken het personeel van NSLS II voor hun steun. Dit werk werd gefinancierd door NIH grants R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 en P20GM113132, en een Munck-Pfefferkorn roman en interactieve subsidie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) Molecular Dimensions MD2-100-150 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane Spectra/Por 132724 For dialysis removal of imidazole
Amicon Stirred Cell Millipose Sigma UFSC 05001 For protein concentration
Ammonium Chloride Millipore Sigma G8270 For minimal media labeling
Benzonase Nuclease Millipore Sigma 9025-65-4 For digestion of nucleic acid
BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells Agilent Technologies Model: 230245 TEV expression
CryoPro Hampton Research HR2-073 Cryo-protectants kit
D-Glucose (Dextrose) Millipore Sigma A9434 For minimal media labeling
Difco Terrific Broth ThermoFisher DF043817 For culture growth
Dithiothreitol > 99% Goldbio DTT25 For reduction of disulfides
E. coli: Rosetta 2 (DE3) Novagen 71400-3 Expression of unlabeled NEMO-EEAA
FORMULATOR Formulatrix Liquid handler/ screen builder
HCl – 1.0 M Solution Hampton Research HR2-581 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg GE Healthcare 28989333 For size exclusion purification
HisTrap HP 5 mL column GE Healthcare 17524802 For purification of His-tagged NEMO-EEAA
HT 96 MIDAS Molecular Dimensions MD1-59 For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
HT 96 Morpheous Molecular Dimensions MD1-46 For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
Imidazole ThermoFisher 288-32-4 For elution from His-trap column
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside Goldbio I2481C5 For induction of cultures
MRC2 crystallization plate Hampton Research HR3-083 Crystallization plate
NT8 - Drop Setter Formulatrix Crystallization
pET-16b Millipore Sigma 69662 For cloning of NEMO-EEAA
pET-45b Millipore Sigma 71327 For cloning of NEMO-EEAA
Phenylmethylsulfonyl fluoride ThermoFisher 36978 For inhibition of proteases
Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti Beckmann Coulter 339160 Ultracentrifuge bottle
Polyethylene Glycol 20,000 Hampton Research HR2-609 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
pRK793 (TEV) Addgene Plasmid 8827 For TEV production
QuikChange XL II Agilent Technologies 200522 Site directed mutagenesis
Required Cap Assembly: Beckmann Coulter 355623 Ultracenttrifuge bottle cap
ROCK IMAGER Formulatrix Crystallization Imager
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320 Seed generation
Sodium Chloride ≥ 99% Millipore Sigma S9888 For buffering of purification solutions
TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) Goldbio TCEP1 Reducing agent
The Berkeley Screen Rigaku MD15-Berekely For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
The PGA Screen Molecular Dimensions MD1-50 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Tris – 1.0 M Solution Hampton Research HR2-589 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Ultrapure Tris Buffer (powder format) Thermofisher 15504020 For buffering of purification solutions
Urea ThermoFisher 29700 For denaturation of NEMO-EEAA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gilmore, T. D. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives. Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).
  2. Bassères, D. S., Baldwin, A. S. Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression. Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).
  3. Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. NF-kappaB and the immune response. Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).
  4. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional regulation and its misregulation in disease. Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).
  5. Courtois, G., Gilmore, T. D. Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease. Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).
  6. Zhao, J., et al. Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-κB activation. PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).
  7. Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. 30 Years of NF-κB: a blossoming of relevance to human pathobiology. Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).
  8. Jin, D. Y., Jeang, K. T. Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28. Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).
  9. Rushe, M., et al. Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site. Structure. 16 (5), 798-808 (2008).
  10. Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKKβ binding. Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).
  11. Havranek, J. J., Harbury, P. B. Automated design of specificity in molecular recognition. Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).
  12. Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface. Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).
  13. Arimori, T., et al. Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability. Structure. 25 (10), London, England. 1611-1622 (2017).
  14. Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).
  15. Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state. Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).
  16. Truebestein, L., Leonard, T. A. Coiled-coils: The long and short of it. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).
  17. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  18. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).
  19. Miladi, B., et al. A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity. Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).
  20. Miller, M. S., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. (2019).
  21. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40, Pt 4 658-674 (2007).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 2 213-221 (2010).
  23. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, Pt 1 61-69 (2008).
  24. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, Pt 12 Pt 1 2126-2132 (2004).
  25. Terwilliger, T. C., et al. phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta. Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).
  26. Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).
  27. Tickle, I. J., et al. STARANISO. , (2018).
  28. French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).
  29. Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).
  30. Zhou, L., et al. Disulfide-mediated stabilization of the IκB kinase binding domain of NF-κB essential modulator (NEMO). Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).
  31. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, Pt 9 1117-1126 (2014).

Tags

Biochemie uitgave 154 NF-κB NEMO IκB kinase (IKK) NEMO binding Domain (NBD) spiraalsnoer Röntgen kristallografie proteïne-engineering structuurbepaling structuur gebaseerde drug ontwerp
Productie, kristallisatie en structuurbepaling van het IKK-bindende domein van NEMO
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barczewski, A. H., Ragusa, M. J.,… More

Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO. J. Vis. Exp. (154), e60339, doi:10.3791/60339 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter