Summary
Мы описываем протоколы для определения структуры IKK-обязательной области NEMO с помощью рентгеновской кристаллографии. Методы включают экспрессию белка, очищение и характеристику, а также стратегии успешной оптимизации кристалла и определения структуры белка в его несвязанной форме.
Abstract
NEMO – это белок, который играет важную роль на пути NF-ЗБ, собирая IKK-комплекс с киназами IKK и IKK. После активации комплекс IKK фосфорилатирует молекулы I'B, ведущие к ядерной транслокации NF-'B и активации генов-мишеней. Ингибирование взаимодействия NEMO/IKK является привлекательной терапевтической парадигмой для модуляции активности пути NF-ЗВ, что делает NEMO мишенью для проектирования и открытия ингибиторов. Чтобы облегчить процесс обнаружения и оптимизации ингибиторов NEMO, мы разработали улучшенную конструкцию связывающей области NEMO, которая позволила бы определить структуру белка в форме апо и при этом привязанных к небольшим молекулярным ингибитогам веса. Здесь мы представляем стратегию, используемую для проектирования, выражения и структурной характеристики мкноэ, имеющей обязательную область NEMO. Белок выражается в клетках кишечной палочки, растворяется в условиях денатурирования и очищается через три хроматографических шага. Мы обсуждаем протоколы получения кристаллов для определения структуры и описываем стратегии сбора и анализа данных. Протоколы найдут широкое применимость к структурному определению комплексов ИНГибиторов NEMO и малых молекул.
Introduction
Путь НФ-ЗБ активируется в ответ на различные стимулы, включая цитокины, микробные продукты и стресс, для регулирования экспрессии генов-мишеней, ответственных за воспалительный и иммунный ответ, гибель клеток или выживание и пролиферацию1. Патологии, включая воспалительные и аутоиммунные заболевания и рак2,3,4,5 были коррелированы с гиперактивацией пути, что сделало модуляцию деятельности NF-QB основной мишенью для разработки новых методов лечения6,7.
Канонический путь NF-QB, в частности, отличается от неканонического пути, ответственного за лимфорганогенез и активацию В-клеток, зависимостью первого от леса белка NEMO (NF-QB основной модулятор8) для сборки IKK-комплекса с кининами IKK и IKK. Комплекс IKK отвечает за фосфорилирование ИЗБЗ (ингибитор ЗВ), который нацелен на деградацию, освобождая димеры NF-qB для перемещения в ядро для транскрипциигенов 1 ЗЗ и, следовательно, является привлекательной мишенью для развития ингибиторов для модулирования активности NF-B.
Наше исследование фокусируется на характеристике белково-белкового взаимодействия между NEMO и IKK, ориентированной на NEMO для разработки малых молекул ингибиторов формирования комплекса IKK. Минимальная связывающая область NEMO, необходимая для связывания ИККЗ, включает в себя остатки 44-111, и его структура была определена в комплексе с пептидом, соответствующим последовательности IKK 701-7459. NEMO и IKK' образуют четырехсепарок, где NEMO dimer вмещает два сипов IKK (701-745) в удлиненный открытый паз с расширенным интерфейсом взаимодействия. IkK (734-742), также известный как NEMO-обязательный домен (NBD), определяет наиболее важную горячую точку для связывания, где два основных триптофанов (739 741) хоронят глубоко в кармане NEMO. Детали сложной структуры могут помочь в структуре на основе проектирования и оптимизации малых ингибиторов молекулы ориентации NEMO. В то же время, трудно, что связывание небольшой молекулы или пептида воссоздало бы в NEMO полное конформивное изменение (т.е. обширное открытие dimer с коритой сутышки NEMO), вызванное связыванием длинной IKK (701-745), как наблюдается в кристалле, и структура несвязанной NEMO или NEMO, связанной с небольшим ингибитором молекулы, может представлять собой лучшую структуру ингибирования.
Полноформатные NEMO и более мелкие конструкции усечения, охватывающие область IKK-связывания, оказались неразрешимыми для определения структуры в несвязанной форме с помощью рентгеновской кристаллографии и методов ядерного магнитного резонанса (ЯМР)10, что побудило нас разработать улучшенную версию обязательной области NEMO. Действительно, NEMO (44-111) в несвязанной форме лишь частично сложен и претерпевает конформационный обмен, и поэтому мы намерены стабилизировать его димерную структуру, складку свернутой катушки и стабильность, сохраняя при этом связывающее сродство к IkK. Путем связывать 3 heptads идеально dimeric coiled-coil последовательностей11 на N-и C-termini протеина, и серии 4 перегласовок пункта, мы произвели NEMO-EEAA, конструкцию полно dimeric и сложенную в свернутой катушке, которая спасла IKK-связывающе сродство к наномолярному диапазону как наблюдаемое для полной длины NEMO12. В качестве дополнительного преимущества мы надеялись, что адаптеры с кудрявых катушек (на основе последовательности GCN4) облегчат кристаллизацию и в конечном итоге помогут в определении структуры рентгеновского излучения с помощью молекулярной замены. Сонючие катушка адаптеры были аналогичным образом использованы как для повышения стабильности, улучшить поведение решения и облегчить кристаллизацию для тримерных скудных катушек и фрагментов антител13,14. NEMO-EEAA легко выражается и очищается от клеток Escherichia. coli с размытым тегом гистидина, растворяется, сложен в стабильную тусклую свернутую катушки и легко кристаллизуется, с дифракцией до 1,9 евро. Наличие упорядоченных спиральных катушек регионов GCN4 может дополнительно помочь в постепенном использовании данных из кристаллов NEMO-EEAA путем молекулярной замены с использованием известной структуры GCN415.
Учитывая результаты, полученные с apo-NEMO-EEAA, мы считаем, что описанные здесь протоколы также могут быть применены к кристаллизации NEMO-EEAA в присутствии небольших пептидов (например, пептида NBD) или малых ингибиторов молекулы, с целью понимания требований к ингибированию NEMO и структурной оптимизации первоначальных ингибиторов свинца к высокой сродости. Учитывая пластичность и динамичный характер многих доменов скудной катушки16,использование смоченной катушки адаптеры могли бы найти более общую применимость в оказании помощи структурного определения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Конструкция конструкции для кристаллографии
- Клон последовательность NEMO-EEAA, как и в предыдущей публикации12 в векторе для выражения в кишечной палочке с помощью промоутера T7, в том числе N-терминал hexa-гистидин теги и протеазы расщепления сайта.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе мы использовали вектор, измененный, чтобы включить тег гекса-гекса-гистидина N исайтрасщепления табачного etch (TEV). Этот вектор облегчает расщепление его тега для кристаллизации белка и оставляет только короткое расширение остатков GSW до начала желаемой последовательности белка. Вектор, из которого это было получено, и альтернативные векторы перечислены в таблице материалов. В этом протоколе, последующие изменения в оригинальной последовательности NEMO (44-111) были введены поэтапно, как описано ранее10, с использованием стороны направлены мутагенеза. Сначала мы попытались стабилизировать NEMO смозавка катушки димер, подостройяя идеальные скручиваемые адаптеры (длиной не менее трех гептов) к N-терминалу или C-терминалу или к обоим. Двойная скручиваемая катушка была наиболее перспективной из предыдущих испытаний кристаллизации, и впоследствии она была изменена введения мутаций для улучшения кристаллизации, как описано ранее12.
2. Крупномасштабное выражение его6 помеченных NEMO-EEAA
- Преобразование конструкции в компетентные ячейки BL21 (DE3). Хранить при -80 градусов по Цельсию в виде клеточного глицерола.
- День 1 - Подготовка клеток стартера культуры. В колбу Erlenmeyer 125 мл добавьте 20 мл раствора Terrific Broth и 20 л 100 мг/мл бульона ампициллина. Добавьте несколько микролитров клеточного глицерола (от -80 градусов по Цельсию хранения BL21 (DE3) компетентных клеток, преобразованных с переносчиком).
- Встряхните 10 мл стартовой культуры на ночь при 37 градусах по Цельсию, 220 об/мин (примерно 15 л).
- День 2 - От стартера, разбавить до OD600 и 0,1 в 250 мл Потрясающий бульон. Добавьте ампициллин к конечной концентрации 100 мкг/мл. Вырастидо доOD 600 и 0,8-1,0.
- Добавьте изопропил-Д-1-тиогалактопиранозид (IPTG) до 500 мкм и вырастем на 4 ч при 37 градусах Цельсия.
- Измерьте OD600 индуцированной культуры после 4 h. Культура должна достигнуть OD600 и 6-10.
3. Очистка его6 помечены NEMO-EEAA
- Культура спиновых клеток снизилась на 3800 х г в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия.
- Сохранить клетку гранулы и отбросить среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пеллеты клетки могут быть сохранены и сохранены при -20 градусов по Цельсию в этой точке, для очистки на более позднем времени. - Resuspend клетки в 40 мл лисис буфера, содержащего 20 мм Трис, 150 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, 2 мМ MgCl2, 0,5 мм фенилметилфолфонил фторид, 2 мМ Дитиотрейтол (DTT), и 3 QL бензоназа Нуклизе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Никель обездвиженной металлической ионной сродства хроматографии (IMAC) колонка используется совместима с 2 мМ DTT. Кроме того, можно использовать 0,2 мМ три (2-карбоксетил) фосфин (TCEP). - Разделите повторно еле-клетки на две аликоты 20-25 мл.
- Лысы клетки с помощью французского пресса (приблизительное давление 25000 пси), повторяя 2-3 раза для каждого aliquot (в холодной комнате).
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, клетки могут быть лиизированы с помощью звуковой (не проверены в этом протоколе). - Добавить мочевину в клеточный лизат до конечной концентрации 8 М, дайте инкубировать на качалке платформы как минимум 2 ч или до ночи. Это и все последующие шаги очистки, за исключением диализа, могут быть выполнены при комнатной температуре.
- День 3 - Передача лизата в ультрацентрифуговых труби и баланс веса, обеспечивая лисат заполняет трубки, по крайней мере 3 / 4 полной. Спин лизат на 125000 х г в течение 45 мин при 25 градусах Цельсия. Декант супернатант в стакан 100 мл для погрузки на колонну.
ПРИМЕЧАНИЕ: Центрифугия при 4 градусах Цельсия приведет к вылету мочевины. - В быстрожидкой системе хроматографии удалите этанол из колонки IMAC 5 мл с 25 мл ультрачистого H2O при 5 мл/мин, затем 25 мл элюционного буфера, содержащего 20 мм Трис, 150 мм NaCl, 500 мМ имидазол, 2 мМ DTT, pH 8.0, затем 25 мл связывающего буфера, содержащего 20 мм Tris, 150 мМ NaCl, 10 мм имидазола, 2 мМ DTT, 8 М.
- Нагрузка мочевины инкубируется супернатант на 3 мл / мин на iMAC колонки, собирая поток через. Вымойте столбец для 10 объемов столбцов с связывающим буфером на 3 мл/мин.
- Сворачивайте конструкцию NEMO-EEAA на колонне, промыв колонной с складывающимся буфером на 20 столбцов на 3 мл/мин, содержащий 20 мм, 150 мм NaCl, 10 мм имидазола, 2 мМ DTT, pH 8.0.
- Выполните градиентный выращение NEMO-EEAA, от 10 до 500 мМ Имидазол атакжем 12-колонного объема градиента, собирая все eluate в пластине сбора фракций (1 мл фракций).
- Продолжить elution на 500 мМ имидазола для двух объемов колонны, продолжая собирать.
- Запуск натрия додецил сульфат (SDS) - полиакриламид гель электрофорес (PAGE) фракций для определения NEMO- EEAA присутствие в elution фракций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали 10% акриламид, буфер МЧС. - Фракции пула, содержащие чистый целевой белок.
- Измерение концентрации белка Брэдфорд анализ17.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это необходимо для оценки количества протеазы для расщепления тегов.
4. Его6 тегов декольте и очищение
- Добавить TEV в 1:10 соотношение веса tEV: NEMO-EEAA белка расщеплять его6 тега. Протеаза TEV была очищена в доме.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте количество TEV, время и температуру, необходимые для полного расщепления отдельно.- Экспресс TEV протеазы, S219V мутант18 в BL21 (DE3)-RIL клеток и очистить, как описано ранее19. Кратко вырастите клетки, как описано в шаге 2, lyse французской прессой и очистите с помощью колонки IMAC. Храните окончательный белок в буфере фосфата натрия 25 мМ, рН 7,8, 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 2 мМ DTT, 20% v/v глицерол.
- Диализ образца на ночь (примерно 15 ч) в 4 L из 20 мм Tris, 150 мМ NaCl, 2 мМ DTT, pH 8.0, чтобы обеспечить расщепление и удалить избыток имидазола из образца для последующего очищения.
- День 4 - Удалите образец из диализа. Запустите гель SDS-PAGE образца из расщепления TEV, чтобы обеспечить завершение расщепления.
- В быстрожидкой системе хроматографии удалите этанол из колонки IMAC 5 мл с 25 мл ультрачистого H2O при 5 мл/мин, затем 25 мл элюционного буфера, содержащего 20 мм Трис, 150 мм NaCl, 500 мМ имидазол, 2 мМ DTT, pH 8.0, затем связывающий буфер, содержащий 20 мм Tris, 150 мм NaCl, 10 мм имидазол, 2 мМ DTT, pH 8.0.
- Загрузите колонну на 1 мл/мин с TEV-расщепляется NEMO-EEAA. Расщепляется NEMO-EEAA будет щелкать в потоке через: собирать в 96 хорошо фракции сбора пластины (1 мл фракций). Вымойте колонну на пять колонн объемов 20 мм Tris, 150 мМ NaCl, 10 мМ имидазола на 1 мл/мин, продолжая собирать в фракционную пластину сбора.
- Elute TEV и дядя его6-NEMO-EEAA с тремя объемами колонны 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 500 мМ имидазол, 2 мМ DTT, рН 8.0, собирая elution в колбе 50 мл.
- Выполнить SDS-PAGE гель потока через фракции, чтобы определить наличие расщепляется NEMO-EEAA.
- Пул поток через фракции, содержащие расщепляется NEMO-EEAA построить, и сосредоточиться с помощью перемешивают ячейки концентратор до 5 мл. Мембрана молекулярного отсечения веса (MWCO) 3 kDa.
- Используя мембрану 3 kDa MWCO, диализ концентрированный образец в 2 L из 20 мМ Tris, 100 мМ NaCl, 2 мМ DTT, pH 8.0 для 2 ч. Изменение буфера диализа до 2 л свежего диализа буфера для ночного диализа (примерно 15 л), при 4 градусах По с.
- День 5 - Нагрузка 5 мл диализированного образца на размер исключения хроматографии (SEC) 16 мм х 60 см колонки (34 мкм средний размер частицы) на 1 мл/мин в 2 мм ММ Трис, 100 мм NaCl, 2 мМ DTT, pH 8.0. Повторите с дополнительными столбцов в зависимости от объема образца.
- Объедините фракции, соответствующие димерической NEMO-EEAA.
ПРИМЕЧАНИЕ: NEMO-EEAA elutes между 60-65 мл, что соответствует больше молекулярного белка веса, из-за удлиненного характера димерической скудной катушки. - Концентрируйтесь с помощью концентратора с перемешивания и мембраны MWCO 3 kDa до конечной концентрации 113 мкм (1,65 мг/мл).
- Aliquot белка и хранить при 4 градусах Цельсия (стабильный в течение 1 месяца).
5. Скрининг матрицы Sparse
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол выполняет испытания кристаллизации с использованием коммерчески доступных экранов и настройки сидящих экспериментов капли с помощью робота кристаллизации. Кристаллические изображения собираются автоматически изображением.
- Используя коммерчески доступные редкие матричные экраны (см. Таблицу Материалов),пипетку 60 л разреженной матричного раствора в каждую из 96 скважин 2 капли камеры кристаллизации пластины для диффузии сижу капли пара (решение резервуара).
- Используя роботизированный сеттер капли, распределите 100 нл белкового раствора при 1,65 мг/мл в соотношении 1:1 с раствором резервуара в падении 1 для конечного объема 200 нл; затем 66 нл белкового раствора с 134 нл раствора резервуара для окончательного объема 200 нл в падении 2 (1:2 соотношение).
- Печать пластины с помощью 3-дюймовый шириной уплотнения ленты сразу после дозирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Капли высохнут, если их оставят под воздействием атмосферы дольше 2-3 мин. - Храните лотки в хранилище кристаллизации изображений, при 20 градусах Цельсия, проверяя изображения, собранные автоматически на наличие кристалла, начиная через два дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверка кристаллизации проходила параллельно с оптимизацией конструкции. Первоначальные кристаллы образуются в следующих условиях (коммерческие экраны, перечисленные в таблице материалов): а) 0,1 M Tris, pH 8.0, 30% v/v полиэтиленгликоль (PEG) MME 550, 5% поли-з-глутаминовая кислота, 200-400 kDa низкомолекулярного веса полимера (PGA-LM); б) 0,1 м Трис, рН 7,8, 20% ж/ч/ v PEG MME 2k, 5% PGA-LM; в) 0.1 M Tris, рН 7.8, 20% w/v PEG 3350, 5% PGA-LM. Кристаллы спарчатого матричного экрана будут иметь плохую однородность решетчатой; поэтому они будут выглядеть плохо, используя кросс-поляризованные изображения. Используйте УФ-изображения, чтобы убедиться, что кристаллы содержат белок. Следующий шаг генерации семенного запаса необходим для получения окончательных кристаллов качества дифракции.
6. Генерация семенного запаса
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы воспроизводимые получить кристаллы для генерации семян в 0,1 М Трис рН 8,0, 5% PGA-LM, 3,6% ж / V PEG 20k. Тем не менее, кристаллы будут показывать высокую мозаичность и непригодны для сбора данных на данном этапе.
- Используя комплект для генерации семян, подготовить семенной запас путем pipetting из всей капли с хрустальным настоящим, и место в 50 злиц раствор ажениса кристаллизации в предусмотренных флакон.
- Vortex семенной запас в течение 3 мин, пульсируя 20 с и 10 с.
- Серийно разбавлять семенной запас в 1:10 приращений до 1:10,000. Храните все разбавления при 4 градусах Цельсия, для дальнейшего использования.
7. Тонкие экраны
- Дизайн тонких экранов, изменяющих условия для Tris, PGA-LM и PEG. Вариная длина PEG для отдельных лотков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тонкий экран, который произвел кристалл, используемый для определения структуры NEMO-EEAA использовали следующие условия: 0.1 M Tris pH 8; PGA-LM варьировался от 8 до 0% в столбцах 1-12. Строки A-H отсеивают различные ПЭГ, при этом концентрации варьируются в столбцах 1-12 следующим образом. О: PEG 200 (0-40% v/v); B: PEG 400 (0-40% v/v); C: PEG MME 500 (0-40% v/v); D: PEG 1000 (0-30% w/v); E: PEG 3350 (0-30% w/v); F: PEG 6k (0-30% w/v); G: PEG 10k (0-20% w/v); H: PEG 20k (0-20% w/v). Кристалл появился в колодце H4 (5,45% ж/v PEG 20k, 5,8% w/v PGA-LM). В этом протоколе, протеиновый кристаллографии экрана строитель жидкости обработчик был использован для создания экранов. - Семжа белковый бульон в соотношении объема 1:25 1:1,000 разбавления семян.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация NEMO-EEAA немного снизится, но кристаллы все равно сформируются. - Повторите шаг 2 с использованием 1:10,000 разбавления семян, то же соотношение 1:25 объема.
- Используя капельный сеттер, раздавать 100 нл белкового раствора на 1,65 мг/мл, с 1:1,000 разбавления семенного фонда в соотношении 1:1 с резервуарным раствором в падении 1 для окончательного объема 200 нл. Повторите для падения 2, но с 1:10,000 разбавления семян запасов настоящее время.
- Печать пластины с помощью 3-дюймовый шириной уплотнения ленты сразу после дозирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Капли высохнут, если их оставят под воздействием атмосферы дольше 2-3 мин. - Храните лотки в хранилище изображений, при 20 градусах Цельсия, проверяя изображения, собранные через два дня, на наличие кристалла.
- Проверьте кристаллы с кросс-поляризатора imager для решетки однородности, чтобы выбрать для отдельных условий, чтобы создать следующие лотки.
8. Генерация кристаллов для сбора данных
- Дизайн одного состояния экранов вокруг Tris, PGA-LM, и PEG состояние, которое производится однородные кристаллы, как анализируется кросс-поляризованных изображений, и крупнейших кристаллов возможно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кристаллы из этих условий нерегулярные по форме, в основном прямоугольные тонкие листы. Это ключ, чтобы выбрать условие, где края кристалла четко определены и имеют наибольшую толщину возможно. - Сделайте 20 мл состояния кристаллизации вручную.
- Используя многоканальный пипетктор, распределять 60 Л л на хорошо в 2 капли камеры, 96 хорошо кристаллизации пластины для сидения падение диффузии пара.
- Подготовка семенного фонда, как описано в шаге 6.2.
- Распределите белок, как описано в шаге 6.3.
- Печать пластины с помощью 3-дюймовый шириной уплотнения ленты сразу после дозирования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Капли высохнут, если их оставят под воздействием атмосферы дольше 2-3 мин. - Храните лотки в изображении на 20 градусов по Цельсию и проверить изображения на наличие кристалла каждый день.
- Проверьте кросс-поляризованные изображения кристаллов на наличие единообразия решетки, чтобы выбрать кристаллы для сбора данных.
9. Определение криозащиты
- Чтобы протестировать крио-протекторы, создайте биржевые растворы, соответствующие условиям кристаллизации, но содержащие 30%, 20%, 10% и 5% более высокую концентрацию каждого компонента. Добавление криозащитного тома приведет к окончательной концентрации компонентов, что такое же, как условия кристаллизации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для тестирования крио-защиты при концентрации 30% по объему для 0,1 М Tris кристаллизации состояние, начните с фондового раствора 0,143 M Tris, прежде чем добавить крио-защиты. - Из комплекта крио-реагентов создайте 10 зл и пробы для крио-защитного теста, смешивая 30% по объему крио-условия в 70% раствора запасов состояния кристаллизации, для конечной концентрации 30% крио-защиты в исходных условиях кристаллизации. Тщательно перемешайте.
- Используя пипетку с 10 л, возьмите 5 кЛ тестовых криозащищенных растворов и погрузите кончик трубы в жидкий азот. Если лед наблюдается, отбросьте.
- Проверьте все крио-защиты на 30%. Для успешных решений повторите процесс на уровне 20%, затем 10% и 5% криозащиты.
- Используя успешный крио-протекционтный раствор с наименьшим процентом криозащиты, добавьте 0,5 л раствора в тестируемую каплю с кристаллами. Наблюдайте под микроскопом, время, сколько времени кристалл длится в состоянии, если не неопределенный.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти кристаллы для тестирования только и будут отброшены. Для NEMO-EEAA оптимальным криозащитным раствором является 12% 1,2-пропанедиол. 12% приходится на разбавление крио-защиты раствор будет испытывать при добавлении к кристаллической капли около 100 нл, для приблизительной конечной концентрации 1,2-пропанедиола 10%.
10. Хрустальная петля
- Кристаллы петли за 1-2 дня до отгрузки в синхротрон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кристаллы будут примерно 60-100 мкм в диаметре: 0,05 - 0,10 мм петли идеально подходят для циклов. - Вырезать ленту из верхней части колодца.
- Добавьте 0,5 л раствора кристаллизации, содержащего 12% 1,2-пропанедиол крио-защиты непосредственно в скважину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательная концентрация 1,2-пропанедиола в настоящее время составляет около 10%, из-за разбавления на 100 нл раствора падения (приблизительное уменьшение объема падения с первоначальных 200 nL, из-за диффузии пара). - Петля кристалла из колодца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кристаллы часто растут на дне колодца, но вытеснят нежным подталкивание от петли. После того, как выбили, петля. - Храните кристалл, содержащий крио-петли в шайбах, погруженных в жидкость N2.
- Храните эти шайбы в жидкой N2 в колбе Dewar, пока они не будут готовы к отправке для рентгеновской дифракции на синхротрон.
11. Сбор данных
- Соберите данные рентгеновской дифракции. В этом протоколе используйте AMX beamline (ID: 17-ID-1), Национальный синхротронный источник света II.
ПРИМЕЧАНИЕ: Данные были собраны на месте, но могут быть собраны удаленно. Сбор данных в области кристалла, которые показали однородность решетки в кросс-поляризованных изображений. Расположите кристаллы в петле так, чтобы сбор данных не предусматривал «плохих» областей кристалла, в то время как кристалл вращается в гониометре. Данные, которые обеспечили наилучшее разрешение пришли из сбора на краю расширения кристалла около 5 х 5 мкм в размерах. Используйте rastering, чтобы определить лучшие области на кристалле, чтобы собрать20.
12. Обработка рентгеновских данных
- Обработка набора данных с максимальным разрешением собранного (1,8 евро) с помощью программы XDS IDXREF для определения космической группы, ячейки и содержания растворителя.
- Интегрируйте данные с помощью программы XDS INTEGRATE.
- Процесс масштабировал интенсивность программы XDS XSCALE с использованием сервера STARANISO, используя среднее отсечение I/I 1,2 для поверхности ограничения дифракции для данных.
ПРИМЕЧАНИЕ: Данные не будут вырезаны в истинном эллипсоиде. Сохраняйте все данные выше I/I отсечения 1.2. Статистика по данным, рассчитанным на сферическую полноту, будет неудовлетворительной из-за несферической усечения. Эллиптической полноты составила 88% с самымвысоким разрешением: 1,88, 2,10 и 2,55 евро вдоль оси а, би и с, соответственно.
13. Структурное решение
- Используйте рентгеновскую структуру GCN4 (PDB: 4DMD)15 в качестве модели поиска для молекулярной замены с использованием MRage21 в PHENIX22. Структура 4DMD была определена в MRage как «ансамбль», и решение MRage успешно построило структурную часть, соответствующую адаптеру N-терминала сонливки NEMO-EEAA, гомологичной модели поиска, для обеих цепей в димере.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выключите коррекцию анизотропии в PHASER, или данные будут дополнительно сокращены. - Используйте последовательные раунды Autobuild23 в PHENIX и ручного строительства (с использованием 2Fo-Fc и Fo-Fc карт, в Coot24) для создания оставшейся части структуры.
- Ручно построить остатки по-прежнему отсутствует в модели на основе 2Fo-Fc и Fo-Fc карты, используя Coot24.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последний этап включал в себя строительство 4 N-терминала остатков и 4 C-терминала остатков для каждого мономера. Размещение Sidechain также вручную корректировалось по мере необходимости. - Рассчитайте композитную карту опускания с помощью PHENIX и 10% упущения структуры.
14. Доработка структуры
- Уточните конструкции с помощью PHENIX Refine. Запустите первоначальные уточнения против объемных растворителей и стереохимии весов, расслабляющий RMSbond и RMSangle ограничения 0,01 и 1,0, соответственно. Продолжить уточнение по индивидуальным B-факторам, параметрам TLS и заполняемости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Клонирование, выражение и очищение связывающей области NEMO, имеющей обязательную iKK.
Протокол, последовавший в этом исследовании, чтобы получить окончательную последовательность NEMO-EEAA(Рисунок 1A), который произвел дифракционные кристаллы качества, участие выражения и характеристики всех промежуточных конструкций, в том числе добавление скручиваемой катушки адаптеры на N- и или C-терминус, мутации C76A, C95S и мутации E56A, E57A. На рисунке 1B отображается гель SDS-PAGE образцов, собранных на протяжении всей процедуры очистки, как описано в Схеме на рисунке 1C. Белок переэкспрессирован в кишечной палочке и появляется как полоса примерно на 14 kDa Mw вес маркера на SDS-PAGE гель (полоса 3, клетки, собранные на урожай и lysed в laemmli образец буфера дополнены 8 M мочевины). Белок появляется чистым после первой колонки IMAC и отображает мономер и димер-диапазон на уровне маркеров 14 и 28 kDa MW на геле SDS-PAGE (полоса 9). TEV расщепление практически завершена после протокола и белка elutes с потоком через во время второй колонки IMAC почти полностью, как димер, на ожидаемом МВт (полоса ниже 28 kDa). Размер исключения хроматографии отображает один пик eluting между 60-65 мл и соответствующие в нашем опыте димер(Рисунок 1D). Димерическая скручиваемой катушки всегда elutes раньше, чем ожидалось на SEC из-за удлиненной формы скручиваемой катушки и, следовательно, большой гидродинамический радиус10. NEMO-EEAA в фракциях от пика SEC по-прежнему выглядит как мономер и димер на геле SDS-Page (полосы 14-15). Использование концентратора перемешивания ячейки важно для предотвращения возможной агрегации выборки и осадков при концентрации.
Кристаллизация NEMO-EEAA
Первоначальные кристаллы были получены с коммерческого экрана с использованием PGA (см. Таблица материалов),используя 1,65 мкг/мл NEMO-EEAA в 2 мМ Трис, 100 мМ NaCl, 2 мМ DTT, pH 8.0. Прекрасный скрининг производства кристаллов в 0,1 М Tris рН 8,9, 5% PGA-LM, 3,6% PEG 20k (Рисунок 2A), которые были использованы для производства семян фонда. Окончательные кристаллы были получены с посевом в 0,1 M Tris рН 8,0, 5,8% PGA-LM, 5,45% PEG 20k(рисунок 2B).
Сбор данных и определение структуры
Кристаллы NEMO-EEAA страдают от мозаичности и анизотропии. Кристаллы, образующиеся в космической группе P 1 21 1, с разрешением данных, изменяемыми в оси аз, бз и се (1,88, 2,10 и 2,55 и 2,55 евро). Примеры профилей дифракции приведены на рисунке 3. Данные были получены на AMX (17-ID-1) луча NSLS II, с размером луча 7 х 5 мкм2. Небольшой размер луча был необходим, чтобы сосредоточиться на желаемой части кристалла(рисунок 2B) и обеспечить качество данных.
Успешный протокол определения структуры требует анизотропного усечения данных с помощью сервера STARANISO27 (http://staraniso.globalphasing.org/cgi-bin/staraniso.cgi),а затем по пути податливой молекулярной замены с использованием MRage21 в рамках PHENIX22 и структуры dimeric GCN4 (PDB: 4DMD)15 в качестве поисковой модели. В решении этой структуры поэтапный поэтапный был первоначально попытан путем обозначения родного метионина с SeMet. Аномальный сигнал был слишком слабым, вероятно, из-за растворителя подвергается характер Met95 в несвязанной форме NEMO (SeMet95 успешно использовался для погрузки NEMO / IKK ' структура9).
Первоначальный анализ данных был предпринят с сферической усечением данных до 2,3- Этот набор данных не может быть успешно поэтапно ймолекулярной замены, но решение было получено с помощью MR-ROSETTA25 и структура NEMO (44-111) в комплексе с IKK (701-745) в качестве модели поиска (PDB: 3BRV)9. Эта первоначальная модель не может быть успешно усовершенствована. Мы использовали сервер дифракции anisotropy в UCLA26, чтобы эллиптически уседать данные и удалить анизотропию путем анизотропного масштабирования. Недавно обработанный набор данных может быть поэтапно поэтапным засчетом молекулярной. Для дальнейшего улучшения данных, мы использовали сервер STARANISO27 для анизотропной усечения данных и амплитуды были исправлены с анисотропной коррекции фактор с байесовской оценки28. Эти данные, в результате чего число уникальных отражений увеличилось до 19 560, были использованы для уточнения структуры. Композитные карты опускают, где рассчитывается с PHENIX, за исключением 10% атомов за один раз, и по сравнению с конечной моделью структуры, чтобы подтвердить, что структура не была предвзятой по атомной модели. Кристаллографическая модель завершена, за исключением первого и последнего остатков в цепочке А NEMO-EEAA, для которой не наблюдалось плотности электронов.
NEMO-EEAA представляет собой гомо-димерическую, нерегулярную, параллельную скручиваемую катушки длиной 175 евро. Регулярный регион скручиваемой катушки включает в себя идеальную последовательность адаптера с универсала на N-терминах (остатки 20-50) и первые две гепты правильной последовательности NEMO (остатки 51-65). Регулярные скручивания катушки также присутствует на C-конечный, начиная с NEMO остатков 97 и охватывающих C-терминал идеальный адаптер катушки(Рисунок 4A). Центральная часть, охватывающая остатки NEMO 66-98, отображает большие межгелетические расстояния (межгелельное расстояние идет от среднего значения 7,6 евро в обычной структуре скручиваемой катушки до максимум11,5 евро в нерегулярной области) и прерывистой гидрофобной связи по сравнению с идеальной супряжённой катушки. Этот регион NEMO также представляет собой интерфейс для связывания IKK и претерпевает конформационные изменения при связывании лиганда. Структура, связанная с IkK, отображает более открытую конформацию сонкорации стыковых катушек для размещения лиганда с большим межгелевным интервалом на 1,0-2,2 евро в этом регионе (Рисунок 4B)12. В апо структуры остатков Leu93, Met94, Lys96, Phe97 и Arg101 смещаются в центр скручиваемых катушки, чтобы вторгнуться в лиганд связывающий карман (C-C' расстояние для Phe97 является более жестким на 2,9 "
Рисунок 1: Очистка NEMO-EEAA. (A) Последовательность выравнивания NEMO от Homo Sapiens, Мус мускус и Бос Бовис и инженерии NEMO-EEAA. Подчеркивается последовательность адаптеров скудной катушки, а мутации подсвечиваются оранжевым цветом. (B) Гель SDS-PAGE фракций, собранных во время выражения и очистки (как помечено и ссылается на диаграмму потока 1C). 10% Акриламид, буфер МЧС. (C) Диаграмма потока для очистки NEMO-EEAA. (D) Профиль исключения размера, указывающий на димер NEMO-EEAA (синий). В зеленом цвете указываются молекулярные маркеры веса (kDa). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Морфология и размер кристаллов NEMO-EEAA. (A) Кристалл NEMO-EEAA с первоначального разреженной матрицы экрана, несеянный. Этот тип кристалла использовался для посева для последующих попыток кристаллизации (0,1 млн tris pH 8.0, 5% PGA-LM, 3,6% PEG 20k; с белковым раствором в 2 мм Трис, 100 мм NaCl 2 мМ DTT, pH 8.0). (B) Кристалл, используемый для сбора данных (0,1 м Tris pH 8.0, 5.8% PGA-LM, 5.45% PEG 20k, с белковым раствором в 2 мм Трис, 100 мм NaCl 2 мМ DTT, pH 8.0). Приблизительная область, используемая для сбора данных, обведена красным цветом. На рисунке определена шкала длины 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Кристаллографические данные, полученные из кристаллов NEMO. (A) Профиль рентгеновской дифракции раннего кристалла NEMO: удлиненные полосы указывают на мозаичность в кристалле. (B) Профиль рентгеновской дифракции оптимизированного кристалла NEMO-EEAA. Кольцо разрешения нарисовано с пространственным разрешением 2.5 З. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Структура несвязанного NEMO. (A) Димер NEMO-EEAA показан как лента, светло-голубой адаптер ы с скручиваемой катушкой, синий NEMO (51-112). (B) Суперпозиция структуры апо NEMO-EEAA (синий, PDB: 6MI3) и NEMO (44-111) из структуры, привязанной к IkK (серый, PDB: 3BRV, IKK, не отображается), показанная в виде лент; структуры выровнены только по цепочке А, регион 44-111. Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущей публикацией12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Попытки кристаллизации NEMO в несвязанной форме оказались безуспешными, включая попытки использования полноформатного белка и несколько конструкций усечения, охватывающих область, связывающую IKK. Наша биофизическая характеристика МКК-связывающей области NEMO (остатки 44-111) круговой дихрозом, спектроскопией ЯМР и анисотропной флуоресценцией показала, что конструкция, хотя и способна связывать ИККЗ, существовала в состоянии конформации, не пригодной для кристаллизации9,10. Наш подход включал в себя проектирование конструкции IKK-обязательной области NEMO, которая приняла более стабильную, сложенную и родную конформацию, устраняя гибкость, которая препятствовала кристаллизации. Идеальные свернутые катушки доменные адаптеры сливаются с N- и C-термини NEMO (44-111) последовательность предлагают преимущество стабилизации димерической свернутой катушки раза родной NEMO и облегчения кристаллизации14. Поведение ряда белковых конструкций отслеживалось на каждом шагу через SDS-PAGE, хроматографию исключения размера, круговой дихрозизм, флуоресценцию анизотропии и спектроскопию ЯМР, как описано ранее10,12. Несмотря на постепенное улучшение всех желаемых параметров, ни какая конструкция не давала кристаллов качества дифракции до тех пор, пока не были введены мутации E56A, E57A. Мутации были наивысшим воздействием мутаций, предложенных Surface Entropy Reduction Server SERp29, которые не связаны с остатками, замешанными в горячих точках связывания для IkK, как в сложной структуре NEMO / IKK. Хотя другие конструкции, стабилизирующие упорядоченную структуру модно-обязательной области NEMO через цистеин дисульфидную связь и связывающую IkK звания с высоким сродством, были описаны30,описанный здесь протокол представляет собой первый успешный подход к структурированию определения мультяшного домена NEMO в несвязанной форме.
Производство и очистка белка следовали стандартным процедурам в нашей лаборатории. При лизисе клетки значительная часть белка присутствует в нерастворимых фракциях, даже при выращивании клеток после индукции при 18 градусах Цельсия, поэтому белок растворялся в 8 M мочевины после клеточного лизиса и до очищения, и перестраивался при присоединении к Колонка IMAC. Обширная промывка колонки связана белка как в условиях денатурации и после складывания имеют решающее значение для чистого продукта после первого шага очистки. Чистый NEMO-EEAA имеет более высокую тенденцию к осадкам, чем предыдущие конструкции, но все еще достаточно растворим в условиях кристаллизации.
Важным шагом в определении структуры является использование посева. В подходе, аналогичном микросеменной матрицескрининга 31, семена из кристалла, полученные во время разреженной матричной скрининга были использованы в дополнительном скрининге условий, а затем прекрасный раунд скрининга, с тем чтобы определить окончательные условия кристаллизации. Большинство кристаллов, выращенных в конечных условиях, имеют высокую мозаичность и не подходят для сбора данных. Кристаллы были проверены в течение нескольких посещений луча и лучшее качество данных было достигнуто путем сбора наборов данных на краю кристалла, где произошел новейший рост. Поскольку область, продемонстрировавшая единообразие решетки на кросс-поляризованных изображениях, была небольшой, она сыграла важную роль в доступе к лучу AMX на NSLS II, из-за небольшого размера луча.
Мы успешно определили структуру NEMO-EEAA путем молекулярной замены, используя в качестве поисковой модели структуру димерической сможенной катушки GCN415, которая отображала на идеальный скручиваемый катушки адаптеры сливаются в N- и C-терминини последовательности NEMO. Молекулярная замена была успешной, так как адаптеры GCN4 поддерживают свою родную структуру при слитом с NEMO. В то же время, мы могли бы проверить, что NEMO поддерживает свою родную структуру, сравнивая части, не участвующие в IKK-связывания с соответствующей структурой региона в структуре NEMO / IKK. В качестве альтернативы можно было бы использовать структуру NEMO в комплексе NEMO / IKK (PDB: 3BRV)9 в качестве модели молекулярной замены поиска, ориентируясь на мономер B, который соответствует цепочке, которая претерпевает наименьшее конформационное изменение при связке лиганда. Эта стратегия показала некоторый первоначальный успех с помощью модуля MR-ROSETTA PHENIX.
Наконец, было важно для успешной структуры определения использовать все имеющиеся данные в наборе данных, прибегая к анизотропной отсечки объединенных данных интенсивности, как это предусмотрено сервером STARANISO27 или Diffraction Anisotropy Server в Калифорнийском университете26.
Существенная роль комплекса NEMO/IKK на пути NF-kB делает его желательной мишенью для модуляции пути для терапевтического вмешательства. Белково-белковые взаимодействия, особенно при взаимодействии с большим связывающим интерфейсом, сложно ингибировать с помощью небольших пептидов или малых молекул, а конструкционная конструкция ингибитора может предложить значительное преимущество. Конструкции МКК-обязательной области NEMO, что мы разработали преодолеть пределы гибкой NEMO (44-111) для облегчения кристаллизации и определения структуры. Поскольку конструкция легко кристаллизуется в несвязанной форме, мы предусматриваем, что тот же протокол может быть успешно применен в кристаллизации комплекса NEMO с небольшими ингибиторами молекулы, чтобы определить структуру, которая обеспечит подробную информацию о режимах связывания и позволит дальнейшие улучшения лиганда.
Анализ кристаллической упаковки в условиях кристаллизации, достигнутый в этой работе, показывает, что лиганд совместнокристаллизации может быть предпочтительнее лиганд замачивания в апо-белковых кристаллов. В то время как кристаллическая упаковка обеспечивает некоторое пространство вокруг цепи B димера (от 6 до 10 евро до ближайшей цепи) и на одной стороне участка связывания лиганда (приблизительно 13 евро в зоне горячей точки между Phe82-Phe87), симметричный связывающий карман полностью окклюзионный близлежащих цепей, предотвращающих связывание лиганда.
Свернутые катушки присутствуют в значительной пропорции в протеоме и имеют важное значение в их функции, как молекулярные прокладки, леса и в общении конформанформических изменений16. Несмотря на их изобилие и соответствующие роли, существует относительно мало структур полноразмерных скудриты-катушки белков. Использование адаптеров с упряжкой может помочь в стабилизации структурных областей белков скудной катушки, сохраняя при этом их родную структуру и помощь в структурном определении и развязывании их функции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не заявляют о каких-либо конкурирующих интересах.
Acknowledgments
Мы благодарим профессора Д. Мэддена за многочисленные полезные дискуссии на протяжении всего проекта. Мы благодарим профессора Д. Болона за дар плазмиды, содержащей оптимизированную катушки GCN4. Мы благодарим доктора Б. Го за плазмиды NEMO. Мы благодарим Кристину Р. Арнольди, Тамар Басиашвили и Эми Кеннеди за демонстрацию процедуры. Мы благодарим БиоМТ Кристаллография Основной фонд и кафедры химии и биохимии и клеточной биологии в Дартмуте за использование кристаллографического оборудования и персонала BioMT за их поддержку. В этом исследовании использовалась линия луча AMX Национального синхротронного источника света II, Управления министерства энергетики США (DOE) Управления научных пользователей, работаемого для Управления науки Министерства энергетики США По линии Брукхейвенской национальной лаборатории по контракту No. ДЕ-SC0012704. Мы благодарим сотрудников NSLS II за их поддержку. Эта работа была профинансирована грантами NIH R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 и P20GM1131332, а также грантом Munck-Pfefferkorn Novel and Interactive.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) | Molecular Dimensions | MD2-100-150 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| 3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane | Spectra/Por | 132724 | For dialysis removal of imidazole |
| Amicon Stirred Cell | Millipose Sigma | UFSC 05001 | For protein concentration |
| Ammonium Chloride | Millipore Sigma | G8270 | For minimal media labeling |
| Benzonase Nuclease | Millipore Sigma | 9025-65-4 | For digestion of nucleic acid |
| BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells | Agilent Technologies | Model: 230245 | TEV expression |
| CryoPro | Hampton Research | HR2-073 | Cryo-protectants kit |
| D-Glucose (Dextrose) | Millipore Sigma | A9434 | For minimal media labeling |
| Difco Terrific Broth | ThermoFisher | DF043817 | For culture growth |
| Dithiothreitol > 99% | Goldbio | DTT25 | For reduction of disulfides |
| E. coli: Rosetta 2 (DE3) | Novagen | 71400-3 | Expression of unlabeled NEMO-EEAA |
| FORMULATOR | Formulatrix | Liquid handler/ screen builder | |
| HCl – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-581 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| HiLoad 16/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare | 28989333 | For size exclusion purification |
| HisTrap HP 5 mL column | GE Healthcare | 17524802 | For purification of His-tagged NEMO-EEAA |
| HT 96 MIDAS | Molecular Dimensions | MD1-59 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| HT 96 Morpheous | Molecular Dimensions | MD1-46 | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| Imidazole | ThermoFisher | 288-32-4 | For elution from His-trap column |
| Isopropyl-beta-D-thiogalactoside | Goldbio | I2481C5 | For induction of cultures |
| MRC2 crystallization plate | Hampton Research | HR3-083 | Crystallization plate |
| NT8 - Drop Setter | Formulatrix | Crystallization | |
| pET-16b | Millipore Sigma | 69662 | For cloning of NEMO-EEAA |
| pET-45b | Millipore Sigma | 71327 | For cloning of NEMO-EEAA |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | ThermoFisher | 36978 | For inhibition of proteases |
| Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti | Beckmann Coulter | 339160 | Ultracentrifuge bottle |
| Polyethylene Glycol 20,000 | Hampton Research | HR2-609 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| pRK793 (TEV) | Addgene | Plasmid 8827 | For TEV production |
| QuikChange XL II | Agilent Technologies | 200522 | Site directed mutagenesis |
| Required Cap Assembly: | Beckmann Coulter | 355623 | Ultracenttrifuge bottle cap |
| ROCK IMAGER | Formulatrix | Crystallization Imager | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | Seed generation |
| Sodium Chloride ≥ 99% | Millipore Sigma | S9888 | For buffering of purification solutions |
| TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) | Goldbio | TCEP1 | Reducing agent |
| The Berkeley Screen | Rigaku | MD15-Berekely | For sparse matrix screening of NEMO-EEAA |
| The PGA Screen | Molecular Dimensions | MD1-50 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Tris – 1.0 M Solution | Hampton Research | HR2-589 | For fine screen crystallization of NEMO-EEAA |
| Ultrapure Tris Buffer (powder format) | Thermofisher | 15504020 | For buffering of purification solutions |
| Urea | ThermoFisher | 29700 | For denaturation of NEMO-EEAA |
References
- Gilmore, T. D. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives. Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).
- Bassères, D. S., Baldwin, A. S. Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression. Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).
- Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. NF-kappaB and the immune response. Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).
- Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional regulation and its misregulation in disease. Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).
- Courtois, G., Gilmore, T. D. Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease. Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).
- Zhao, J., et al. Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-κB activation. PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).
- Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. 30 Years of NF-κB: a blossoming of relevance to human pathobiology. Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).
- Jin, D. Y., Jeang, K. T. Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28. Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).
- Rushe, M., et al. Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site. Structure. 16 (5), 798-808 (2008).
- Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKKβ binding. Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).
- Havranek, J. J., Harbury, P. B. Automated design of specificity in molecular recognition. Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).
- Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface. Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).
- Arimori, T., et al. Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability. Structure. 25 (10), London, England. 1611-1622 (2017).
- Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).
- Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state. Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).
- Truebestein, L., Leonard, T. A. Coiled-coils: The long and short of it. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).
- Miladi, B., et al. A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity. Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).
- Miller, M. S., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. (2019).
- McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40, Pt 4 658-674 (2007).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 2 213-221 (2010).
- Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, Pt 1 61-69 (2008).
- Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, Pt 12 Pt 1 2126-2132 (2004).
- Terwilliger, T. C., et al. phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta. Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).
- Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).
- Tickle, I. J., et al. STARANISO. , (2018).
- French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).
- Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).
- Zhou, L., et al. Disulfide-mediated stabilization of the IκB kinase binding domain of NF-κB essential modulator (NEMO). Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).
- D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, Pt 9 1117-1126 (2014).
