Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Produksjon, krystallisering og struktur bestemmelse av det IKK-bindende domenet til NEMO

Published: December 28, 2019 doi: 10.3791/60339
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Dartmouth College

Summary

Vi beskriver protokoller for strukturen bestemmelse av IKK-bindende domene av NEMO av X-ray crystallography. Metodene omfatter protein uttrykk, rensing og karakterisering, samt strategier for vellykket krystall optimalisering og struktur bestemmelse av proteinet i sin ubundet form.

Abstract

NEMO er et stillas protein som spiller en viktig rolle i NF-KB veien ved å montere IKK-komplekset med kinaser IKKα og IKKβ. Ved aktivering IKK komplekse fosforylerer IκB molekyler som fører til NF-KB kjernefysiske translokasjon og aktivering av mål gener. Hemming av NEMO/IKK interaksjon er et attraktivt terapeutisk paradigme for modulering av NF-KB Pathway aktivitet, noe som gjør NEMO et mål for hemmere design og oppdagelse. For å lette prosessen med oppdagelse og optimalisering av NEMO-hemmere, utviklet vi en forbedret konstruksjon av det IKK-bindende domenet til NEMO som ville muliggjøre struktur bestemmelse av proteinet i Apo form og mens bundet til små molekylvekt hemmere. Her presenterer vi strategien benyttet for design, uttrykk og strukturelle karakterisering av IKK-bindende domenet til NEMO. Proteinet uttrykkes i E. coli celler, solubilized under denaturering forhold og renset gjennom tre kromatografiske trinn. Vi diskuterer protokollene for å skaffe krystaller for struktur besluttsomhet og beskriver datainnsamling og analyse strategier. Protokollene vil finne bred anvendelse til strukturen bestemmelse av komplekser av NEMO og små molekyl hemmere.

Introduction

NF-KB-veien aktiveres som svar på en rekke stimuli, inkludert cytokiner, mikrobielle produkter og stress, for å regulere uttrykk for mål gener som er ansvarlige for inflammatorisk og immunrespons, celle død eller overlevelse og spredning1. Patologi inkludert inflammatoriske og autoimmune sykdommer og kreft2,3,4,5 har vært korrelert til hyperactivation av veien, som har gjort modulering av NF-KB aktivitet en førsteklasses mål for utvikling av nye terapier6,7.

Den kanoniske NF-KB veien spesielt skilles fra ikke-kanoniske veien, ansvarlig for lymphorganogenesis og B-celle aktivering, av den tidligere avhengighet av stillas proteinet NEMO (NF-KB essensielle modulator8) for montering av ikk-komplekset med kinaser IKKα og IKKβ. Den IKK komplekset er ansvarlig for fosforylering av IκBα (inhibitor av KB) som mål den for degradering, frigjør NF-KB dimers til translocate til kjernen for genet transkripsjon1 og er derfor et attraktivt mål for utvikling av hemmere å modulere NF-KB aktivitet.

Vår forskning fokuserer på karakterisering av protein-protein interaksjon mellom NEMO og IKKβ, målretting NEMO for utvikling av små molekyler hemmere av IKK kompleks formasjon. Den minimale bindende domene av NEMO, som kreves for å binde IKKβ, omfatter rester 44-111, og dens struktur har blitt bestemt i komplekse med et peptid tilsvarende IKKβ sekvens 701-7459. NEMO og IKKβ danner en fire-Helix bunt der NEMO dimer rommer de to helikser av IKKβ (701-745) i en langstrakt åpen Groove med en utvidet interaksjon grensesnitt. IKKβ (734-742), også kjent som NEMO-bindende domene (neste arbeidsdag), definerer det viktigste hot-spot for binding, hvor de to essensielle tryptophans (739 741) begraver dypt inne i NEMO-lommen. Detaljene i den komplekse strukturen kan hjelpe til med struktur BAS ert design og optimalisering av små molekyl hemmere som er rettet mot NEMO. På samme tid, er det vanskelig at bindingen av et lite molekyl eller peptid ville gjenskape i NEMO hele conformational endring (dvs. omfattende åpning av NEMO spiral-coil dimer) forårsaket av binding av den lange IKKβ (701-745), som observert i krystall, og strukturen av ubundet NEMO eller NEMO bundet til en liten molekyl inhibitor kan representere et bedre mål for struktur-basert narkotika design og hemmer optimalisering.

Full lengde NEMO og mindre avkorting konstruksjoner som omfatter IKK-binding domenet har bevist intractable for struktur bestemmelse i ubundet form via røntgen crystallography og kjernefysisk magnetisk resonans (NMR) metoder10, som fikk oss til å designe en forbedret versjon av ikk-binding domene av Nemo. Faktisk er NEMO (44-111) i ubundet form bare delvis foldet og gjennomgår conformational utveksling og vi derfor satt til å stabilisere sin dimeric struktur, spiral-coil fold og stabilitet, og samtidig bevare bindende affinitet for IKKβ. Ved å føye tre heptads av ideelle dimeric spiral-coil sekvenser11 på N-og C-Termini av proteinet, og en serie på fire punkt mutasjoner, genererte vi Nemo-aeee, en konstruere fullt dimeric og foldet i en spiral spiral, som reddet ikk-binding affinitet til nanomolar området som observert for full lengde Nemo12. Som en ekstra fordel, håpet vi at spiral-coil adaptere (basert på GCN4 sekvensen) ville lette krystallisering og til slutt bistand i X-ray struktur besluttsomhet via molekylær erstatning. Spiral-spole adaptere har blitt brukt på samme måte både for å øke stabiliteten, forbedre løsnings atferden og tilrettelegge for krystallisering for trimeric spiral spoler og antistoff fragmenter13,14. NEMO-AEEE er lett uttrykt og renset fra Escherichia. coli celler med en spaltbare histidin tag, er løselig, foldet i en stabil dimeric spiral coil og er lett krystallisert, med diffraksjon til 1,9 å. Tilstedeværelsen av de bestilte spiral-coil regionene i GCN4 kan i tillegg bistand i å fase dataene fra krystaller av NEMO-AEEE av molekylær erstatning ved hjelp av den kjente strukturen i GCN415.

Gitt resultatene oppnådd med Apo-NEMO-AEEE, tror vi protokollene beskrevet her kan også brukes til krystallisering av NEMO-AEEE i nærvær av små peptider (som neste arbeidsdag peptid) eller små molekyl hemmere, med mål om å forstå kravene til NEMO hemming og struktur-basert optimalisering av innledende føre hemmere til høy affinitet. Gitt plastisitet og dynamiske natur mange spiral-coil domener16, kan bruken av spiral adaptere finne mer generell anvendelse i å hjelpe strukturelle besluttsomhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. design av konstruksjon for crystallography

  1. Klon sekvensen av NEMO-AEEE som i forrige publikasjon12 i en vektor for uttrykk i E. coli ved hjelp av T7 promoter, inkludert en N-Terminal Hexa-histidin Tag og en protease kløft området.
    Merk: i denne protokollen, brukte vi en vektor modifisert til å omfatte en N-Terminal Hexa-histidin Tag og en tobakk etch virus (TEV) kløft området10. Denne vektoren Letter kløft av hans tag for protein krystallisering og etterlater bare den korte forlengelsen av GSW rester før starten av ønsket protein sekvensen. Vektoren som dette var avledet, og alternative vektorer er oppført i tabellen av materialer. I denne protokollen ble senere endringer i den opprinnelige NEMO (44-111) sekvensen innført trinnvis, som beskrevet tidligere10, ved hjelp av side rettet mutagenese. Vi først forsøkte å stabilisere NEMO spiral-coil dimer tilføyer den ideelle spiral-coil adaptere (i en lengde på minst tre heptads) til N-Terminal eller C-terminal ende eller til begge. Den doble spiral coil var den mest lovende fra tidligere krystallisering prøvelser og det ble senere modifisert innføre mutasjoner for å forbedre krystallisering som beskrevet tidligere12.

2. stor skala uttrykk for hans6 Tagged Nemo-aeee

  1. Transform konstruere i BL21 (DE3) kompetente celler. Oppbevar at-80 ° c som en celle glyserol lager.
  2. Dag 1-Forbered en celle startkultur. I en 125 mL Erlenmeyer kolbe, tilsett 20 mL fantastisk buljong løsning og 20 μL av en 100 mg/mL lager av Ampicillin. Tilsett noen mikroliter av celle glyserol (fra-80 ° c lagring av BL21 (DE3) kompetente celler forvandlet med vektor).
  3. Rist 10 mL Start kulturen over natten ved 37 ° c, 220 RPM (ca. 15 timer).
  4. Dag 2 – fra starteren, fortynne til en OD600 = 0,1 i 250 ml fantastisk buljong. Legg Ampicillin til en endelig konsentrasjon på 100 μg/mL. Vokse til en OD600 = 0.8-1.0.
    1. Legg til isopropylalkohol β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTH) til 500 μM, og vokse for 4 h ved 37 ° c.
    2. Mål OD600 av indusert kultur etter 4 h. kultur bør nå en OD600 = 6-10.

3. rensing av hans6 Tagged Nemo-aeee

  1. Spin cellekultur ned ved 3 800 x g i 20 min ved 4 ° c.
  2. Lagre cellen pellet og forkaste mediet.
    Merk: celle pellet kan lagres og oppbevares ved-20 ° c på dette punktet, for rensing på et senere tidspunkt.
  3. Resuspend cellene i 40 mL av lyseringsbuffer inneholdende 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 mM MgCl2, 0,5 mm phenylmethylsulfonyl fluor, 2 mm DITHIOTREITOL (DTT), og 3 ΜL av Benzonase nuklease.
    Merk: den nikkel immobilisert metall ion affinitet kromatografi (IMAC) kolonnen benyttes er kompatibel med 2 mM DTT. Alternativt kan 0,2 mM Tris (2-carboxyethyl) fosfin (TCEP) utnyttes.
  4. Split resuspendert celler i to 20-25 mL alikvoter.
  5. Lyse cellene ved hjelp av fransk trykk (omtrentlig trykk 25 000 psi), Gjenta 2-3 ganger for hver alikvot (i kaldt rom).
    Merk: Alternativt kan celler bli lysert av sonikering (ikke testet i denne protokollen).
  6. Legg urea til cellen lysat til en endelig konsentrasjon på 8 M, la det ruge på en rocking plattform for minimum 2 t eller opp til over natten. Dette og alle følgende rensing trinn, med unntak av dialyse, kan utføres ved romtemperatur.
  7. Dag 3 – Overfør lysat til ultracentrifuge rør og balansevekt, noe som sikrer lysat fyller rør til minst 3/4 fullt. Snurr lysat ved 125 000 x g for 45 min ved 25 ° c. Dekanter supernatanten i et 100 mL beger for lasting til søylen.
    Merk: sentrifugering ved 4 ° c vil føre til at urea krasjer.
  8. På et raskt flytende kromatografi system, Fjern etanol fra IMAC 5 mL kolonne med 25 mL ultrarent H2O ved 5 ml/min, etterfulgt av 25 ml eluering buffer inneholdende 20 mm Tris, 150 mm NaCl, 500 mm imidazole, 2 mm DTT, pH 8,0, deretter 25 ml bindings buffer som inneholder 20 mm Tris, 150 mm NaCl, 10 mm imidazole, 2 mm DTT, 8 M urea, pH 8,0.
  9. Load urea inkubert supernatanten på 3 mL/min til IMAC kolonne, samle strømmen gjennom. Vask kolonnen for 10 kolonne volumer med binding buffer på 3 mL/min.
  10. Refold NEMO-AEEE konstruere på kolonne ved å vaske kolonne med refolding buffer for 20 kolonne volumer på 3 mL/min, inneholdende 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 mM DTT, pH 8,0.
  11. Utfør gradient eluering av NEMO-AEEE, fra 10 til 500 mM Imidazole over en 12-kolonne volum gradient, samle alle eluatet i brøkdel samling plate (1 mL fraksjoner).
  12. Fortsett eluering på 500 mM imidazole for to kolonne volumer, fortsetter å samle.
  13. Kjør natrium natriumdodecylsulfat sulfat (SDS)-polyakrylamid gel elektroforese (side) av fraksjoner å avgjøre NEMO-AEEE tilstedeværelse i eluering fraksjoner.
    Merk: vi brukte 10% akrylamid, MES-buffer.
  14. Pool fraksjoner inneholder ren mål protein.
  15. Mål proteinkonsentrasjon av Bradford analysen17.
    Merk: Dette er nødvendig for å anslå mengden av protease for merke kløften.

4. hans6 -tag kløft og rensing

  1. Legg TEV i en 1:10 vekt ratio på TEV: NEMO-AEEE protein å holde fast på hans6 tag. TEV protease ble renset i huset.
    Merk: Optimaliser mengden av TEV, tid og temperatur som kreves for fullstendig kløft separat.
    1. Express TEV protease, S219V mutant18 in BL21 (DE3)-RIL celler og renser som beskrevet tidligere19. Få en kort vekst i cellene som beskrevet i trinn 2, lyse med fransk Trykk og rens ved hjelp av en IMAC-kolonne. Oppbevar endelig protein i 25 mM natrium fosfat buffer, pH 7,8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 20% v/v glyserol.
  2. Dialyze prøven over natten (ca 15 h) i 4 L 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0, for å muliggjøre kløft og for å fjerne overflødig imidazole fra prøven for den påfølgende rensing.
  3. Dag 4 – Fjern prøven fra dialyse. Kjør en SDS-side gel av prøven fra TEV-kløften for å sikre at kløften er ferdig.
  4. På en rask væske kromatografi system, Fjern etanol fra en IMAC 5 mL kolonne med 25 mL ultrarent H2O ved 5 ml/min, etterfulgt av 25 ml eluering buffer som inneholder 20 mm Tris, 150 mm NaCl, 500 mm imidazole, 2 mm DTT, pH 8,0, deretter innbindings buffer som inneholder 20 mm Tris, 150 mm NaCl, 10 mm imidazole, 2 mm DTT, pH 8,0.
  5. Legg kolonnen til 1 mL/min med TEV-kløyvde NEMO-AEEE. Kløyvde NEMO-AEEE vil eluere i gjennomstrømning: samle inn en 96 brønn fraksjon samling plate (1 mL fraksjoner). Vask kolonnen med fem Kol onne volumer på 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole ved 1 mL/min, fortsetter å samle inn i brøkdels oppsamlings plate.
  6. Eluere TEV og uncleaved hans6-Nemo-aeee med tre kolonne volumer på 20 mm Tris, 150 mm NaCl, 500 mm imidazole, 2 mm DTT, pH 8,0, samle eluering i en 50 ml kolbe.
  7. Kjør SDS-side gel av gjennomstrømning fraksjoner å bestemme tilstedeværelsen av kløyvde NEMO-AEEE.
  8. Pool Flow-gjennom fraksjoner som inneholder kløyvde NEMO-AEEE konstruere, og konsentrere seg ved hjelp av en rørt celle konsentratoren til 5 mL. Membran molekylvekt cut-off (MWCO) = 3 kDa.
  9. Ved hjelp av en 3 kDa MWCO membran, dialyze konsentrert prøve i 2 L 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0 for 2 t. endre buffer for dialyse til 2 liter fersk dialyse buffer for over natten dialyse (ca. 15 timer), ved 4 ° c.
  10. Dag 5 – Load 5 mL av dialyzed prøven på en størrelses eksklusjon kromatografi (SEC) 16 mm x 60 cm kolonne (34 μm gjennomsnittlig partikkelstørrelse) ved 1 mL/min i 2 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8,0. Gjenta med flere kolonner avhengig av prøvevolum.
  11. Pool fraksjoner tilsvarende dimeric NEMO-AEEE.
    Merk: NEMO-AEEE elutes mellom 60-65 mL, tilsvarende en større molekylvekt protein, på grunn av langstrakt natur dimeric spiral spiral.
  12. Konsentrer deg om å bruke en rørt celle konsentrat og en MWCO = 3 kDa membran til en endelig konsentrasjon på 113 μM (1,65 mg/mL).
  13. Alikvot proteinet og oppbevar ved 4 ° c (stabilt i over 1 måned).

5. spredte matrise screening

Merk: protokollen utfører krystallisering forsøk ved hjelp av kommersielt tilgjengelige skjermer og sette opp sittende drop eksperimenter ved hjelp av en krystallisering robot. Crystal bilder samles automatisk av et Imager.

  1. Ved hjelp av kommersielt tilgjengelige spredte matrise skjermer (se tabell av materialer), Pipetter 60 μL av sparsom matrise løsning i hver av de 96 brønner av en 2 drop-kammer krystallisering plate for sittende drop damp diffusjon (reservoar løsning).
  2. Ved hjelp av en robot dråpe setter, dispensere 100 nL av protein løsning på 1,65 mg/mL i en 1:1 ratio med reservoar løsning i drop 1 for et endelig volum på 200 nL; deretter 66 nL av protein løsning med 134 nL av reservoar løsning for et endelig volum på 200 nL i dråpe 2 (1:2 ratio).
  3. Forsegle platen ved hjelp av 3-tommers tetnings tape umiddelbart etter dosering.
    Merk: dråpene vil tørke ut hvis de utsettes for mer atmosfære enn 2-3 min.
  4. Oppbevar skuffene i lagringsplassen på krystallisering imager, ved 20 ° c, sjekk bildene som samles inn automatisk for krystall tilstedeværelse, fra og med to dager.
    Merk: krystallisering screening fortsatte parallelt med konstruere optimalisering. Initial krystaller dannet i følgende forhold (kommersielle skjermer oppført i tabellen av materialer): a) 0,1 M Tris, pH 8,0, 30% v/v polyetylen GLYKOL (PEG) mme 550, 5% Poly-γ-Glutaminsyre acid, 200-400 KDA lav molekylvekt POLYMER (pga-lm); b) 0,1 M Tris, pH 7,8, 20% w/v PEG MME 2k, 5% PGA-LM; c) 0,1 M Tris, pH 7,8, 20% w/v PEG 3350, 5% PGA-LM. Sparsom matrise skjerm krystaller vil ha dårlig gitter ensartethet; Derfor vil de se dårlig ved hjelp av kryss-polarisert Imaging. Bruk UV-avbildning for å sikre at krystallene inneholder proteiner. Følgende frø lager generasjon trinn er nødvendig for å oppnå den endelige Diffraksjon kvalitet krystaller.

6. Seed lager generasjon

Merk: vi reproduserbar få krystaller for frø generasjon i 0,1 M Tris pH 8,0, 5% PGA-LM, 3,6% w/v PEG 20k. Krystaller vil imidlertid vise høy mosaicity og er uegnet for datainnsamling på dette stadiet.

  1. Ved hjelp av et kit for frø generasjon, forberede frø lager ved pipettering ut hele dråpe med krystall stede, og plass i 50 μL av krystallisering tilstand løsning i den med følgende hetteglasset.
  2. Vortex frøet lager i 3 min, pulserende 20 s på og 10 s av.
  3. Serielt fortynne frø lager i 1:10 trinn ned til 1:10000. Oppbevar alle fortynninger ved 4 ° c, for videre bruk.

7. fine skjermer

  1. Design fine skjermer som varierer forholdene for Tris, PGA-LM, og PEG. Varier PEG lengde for individuelle skuffer.
    Merk: den fine skjermen som produserte krystallen benyttet for struktur bestemmelse av NEMO-AEEE ansatt følgende betingelser: 0,1 M Tris pH 8; PGA-LM varierte fra 8 til 0% i kolonner 1-12. Rader A-H skjermet forskjellige PEGs, med konsentrasjoner varierende i kolonnene 1-12 som følger. A: PEG 200 (0-40% v/v); B: PEG 400 (0-40% v/v); C: PEG MME 500 (0-40% v/v); D: PEG 1000 (0-30% w/v); E: PEG 3350 (0-30% w/v); F: PEG 6k (0-30% w/v); G: PEG 10k (0-20% w/v); H: PEG 20k (0-20% w/v). Krystallen dukket opp i brønnen H4 (5,45% w/v PEG 20k, 5,8% w/v PGA-LM). I denne protokollen, et protein crystallography Screen Builder flytende handler ble brukt til å bygge skjermene.
  2. Seed et protein lager i en 1:25 volum ratio på 1:1000 frø fortynning.
    Merk: konsentrasjon av NEMO-AEEE vil falle litt, men krystaller vil fortsatt danne.
  3. Gjenta trinn 2 med 1:10000 frø fortynning, samme 1:25 volumforhold.
  4. Ved bruk av dråpe setter, dispensere 100 nL av protein løsning på 1,65 mg/mL, med 1:1000 fortynning av frø lager i et 1:1-forhold med reservoar løsning i drop 1 for et endelig volum på 200 nL. Gjenta for drop 2, men med 1:10000 fortynning av frø lager til stede.
  5. Forsegle platen ved hjelp av 3-tommers tetnings tape umiddelbart etter dosering.
    Merk: dråpene vil tørke ut hvis de utsettes for mer atmosfære enn 2-3 min.
  6. Oppbevar skuffene i imager lagring, ved 20 ° c, sjekke bilder som er samlet inn etter to dager for krystall tilstedeværelse.
  7. Sjekk krystaller med tverr polarisator imager for gitter ensartethet, for å velge for enkelt forhold å sette opp følgende skuffer.

8. generering av krystaller for datainnsamling

  1. Design single condition skjermer rundt Tris, PGA-LM, og PEG tilstand som produserte uniform krystaller som analyseres av kryss-polarisert bilder, og den største krystaller mulig.
    Merk: krystaller fra disse forholdene er uregelmessig i form, for det meste rektangulære tynne ark. Det er nøkkelen til å velge en tilstand der kantene av krystallen er godt definert og har størst tykkelse mulig.
  2. Lag 20 mL av krystallisering tilstand for hånd.
  3. Ved hjelp av en multi-kanals pipettehjelper, dispensere 60 μL per brønn i en 2 drop-kammer, 96 brønn krystallisering plate for sittende drop damp diffusjon.
  4. Forbered frø lager som beskrevet i trinn 6,2.
  5. Dispensere proteinet som beskrevet i trinn 6,3.
  6. Forsegle platen ved hjelp av 3-tommers tetnings tape umiddelbart etter dosering.
    Merk: dråpene vil tørke ut hvis de utsettes for mer atmosfære enn 2-3 min.
  7. Oppbevar skuffene i imager ved 20 ° c og sjekk bildene for krystall tilstedeværelse hver dag.
  8. Sjekk kryss-polarisert bilder av krystaller for gitter ensartethet, for å velge krystaller for datainnsamling.

9. fastsettelse av fryse-protectant

  1. For å teste protectants, opprette lager løsninger som tilsvarer krystallisering forhold, men som inneholder 30%, 20%, 10%, og 5% høyere konsentrasjon av hver komponent. Tilsetning av protectant volum vil resultere i en endelig konsentrasjon av komponenter som er den samme som krystallisering forhold.
    Merk: for å teste en protectant på 30% konsentrasjon etter volum for en 0,1 M Tris krystallisering tilstand, Start med en lagerløsning på 0,143 M Tris, før du legger til fryse-protectant.
  2. Fra et fryse sett, Opprett 10 μL prøve for protectant test ved å blande 30% av volum av fryse tilstand i 70% av krystallisering tilstand lagerløsning, for en endelig konsentrasjon på 30% protectant i opprinnelige krystallisering forhold. Bland godt.
    1. Ved hjelp av en 10 μL pipette, ta 5 μL av test fryse-beskyttet løsning og stupe den Pipet spissen i flytende nitrogen. Hvis isen er observert, kast.
    2. Test alle protectants ved 30%. For de vellykkede løsningene, gjentar du prosessen med 20%, deretter 10% og 5% av protectant.
    3. Ved hjelp av den vellykkede protectant løsningen med den minste prosenten av protectant, tilsett 0,5 μL oppløsning i en test dråpe med krystaller til stede. Observer under mikroskop, timing hvor lenge krystall varer i tilstanden, om ikke ubestemt.
      Merk: disse krystallene er bare for test og vil bli forkastet. For NEMO-AEEE, 12% 1, 2-propandiol er den optimale protectant løsningen. 12% står for fortynning den protectant løsningen vil oppleve når den legges til krystall dråpe på ca 100 nL, for en omtrentlig sluttkonsentrasjon på 1, 2-propandiol på 10%.

10. krystall looping

  1. Loop krystaller 1-2 dager før forsendelse til Synchrotron.
    Merk: krystaller vil være omtrent 60-100 μm i diameter: 0,05-0,10 mm løkker er ideelle for looping.
  2. Skjær tapen fra toppen av brønnen.
  3. Tilsett 0,5 μL av krystallisering løsning som inneholder 12% 1, 2-propandiol fryse-protectant direkte til brønnen.
    Merk: endelig konsentrasjon av 1, 2-propandiol er nå på ca 10%, på grunn av fortynning av 100 nL av drop-løsning (omtrentlig drop volumreduksjon fra første 200 nL, på grunn av damp diffusjon).
  4. Loop krystallen fra brønnen.
    Merk: krystaller vokser ofte på bunnen av brønnen, men vil løsne med en mild dytte fra loopen. Når forskyves, loop.
  5. Oppbevar krystallen som inneholder fryse løkker i pucker nedsenket i flytende N2.
  6. Oppbevar disse pucker i flytende N2 i Dewar kolbe til de er klare for forsendelse for X-ray Diffraksjon på Synchrotron.

11. data innsamling

  1. Samle inn X-ray-Diffraksjon data. I denne protokollen, bruk AMX beamline (ID: 17-ID-1), National Synchrotron Light kilde II.
    Merk: data ble samlet på stedet, men kan samles inn eksternt. Samle data i den regionen av krystallen som viste gitter ensartethet i kryss-polarisert bilder. Plasser krystallene i loopen slik at datainnsamlingen ikke involverer "fattige" regioner av krystallen mens krystallen roterer i goniometer. Data som ga den beste oppløsningen kom fra samlingen på kanten av en forlengelse av en krystall ca 5 x 5 μm i størrelse. Bruk Rastering å identifisere de beste områdene på krystallen å samle20.

12. røntgen databehandling

  1. Behandle datasett til den høyeste oppløsningen som er samlet inn (1,8 å) med XDS IDXREF program for å bestemme plass gruppe, enhet celle, og løsemiddel innhold.
  2. Integrer data ved hjelp av XDS INTEGRER-programmet.
  3. Prosess skalert intensitet fra XDS XSCALE program ved hjelp STARANISO server, med I/σI cut gjennomsnittet av 1,2 for Diffraksjon-grense overflate for dataene.
    Merk: data vil ikke bli kuttet i ekte ellipsoiden. Behold alle data over i/σI av 1,2-grensen. Statistikken på data beregnet for sfærisk fullstendighet vil være dårlig, på grunn av den ikke-sfæriske avkorting. Den elliptiske fullstendigheten var 88% med høyeste oppløsning på: 1,88 å, 2,10 å og 2,55 å langs a *, b * og c aksen, henholdsvis.

13. struktur løsning

  1. Bruk X-ray-strukturen i GCN4 (PDB: 4DMD)15 som en søke modell for molekylær erstatning ved hjelp av MRage21 i PHENIX22. Den 4DMD strukturen ble definert i MRage som et "ensemble", og MRage løsningen vellykket bygget strukturen delen tilsvarende N-Terminal spiral-coil adapter av NEMO-AEEE, homologe til søke modellen, for begge kjedene i dimer.
    Merk: slå av anisotropien korreksjon i PHASER, eller data vil bli ytterligere skalert tilbake.
  2. Bruk påfølgende runder med Autobuild23 i PHENIX og manuell bygging (med 2Fo-Fc og fo-fc kart, i Sothøne24) for å bygge resten av strukturen.
  3. Manuelt bygge rester fortsatt mangler i modellen basert på 2Fo-fc og fo-fc kart, med Sothøne24.
    Merk: det siste stadiet involverte bygging av 4 N-Terminal rester og 4 C-terminal rester for hver monomer. Sidechain plassering ble også manuelt justert etter behov.
  4. Beregn en sammensatt utelate kart ved hjelp av PHENIX og en 10% unnlatelse av strukturen.

14. struktur raffinement

  1. Avgrens strukturene med PHENIX Avgrens. Kjør den første avgrensninger mot bulk-løsemiddel og stereochemistry vekter, avslappende RMSbond og RMSangle begrensninger til 0,01 og 1,0, henholdsvis. Fortsett raffinement på individuelle B-faktorer, TLS-parametere og anvendelsesområder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kloning, uttrykk og rensing av IKK-binding domenet til NEMO.
Protokollen fulgte i denne studien for å få den endelige sekvensen av NEMO-AEEE (figur 1A), som produserte Diffraksjon kvalitet krystaller, involverte uttrykk og karakterisering av alle mellomliggende konstruksjoner, inkludert tillegg av spiral-coil adaptere på N-og eller C-Terminus, mutasjoner C76A, C95S og mutasjoner E56A, E57A. Figur 1B viser en SDS-side gel av prøver som er samlet inn gjennom rensing prosedyren som beskrevet i ordningen i figur 1C. Proteinet er overexpressed i E. coli og fremstår som et band omtrent på 14 KDA MW vekt markør på SDS-side gel (kjørefelt 3, celler samlet ved høsting og Lysert i Laemmli prøve buffer supplert med 8 M urea). Proteinet virker ren etter den første IMAC-kolonnen og viser et monomer og et dimer bånd på nivå med 14 og 28 kDa MW-markører på SDS-side-gelen (kjørefelt 9). TEV-kløften er praktisk talt komplett etter protokollen og proteinet som elutes med flyten gjennom den andre IMAC-kolonnen nesten helt som en dimer, ved det forventede MW (båndet under 28 kDa). Størrelses ekskludering kromatografi viser en enkelt topp tent mellom 60-65 mL og tilsvarende i vår erfaring til dimer (figur 1D). Den dimeric spiral coil alltid elutes tidligere enn forventet på SEC grunn av langstrakt form av spiral coil og følgelig store hydrodynamisk radius10. NEMO-AEEE i fraksjoner fra SEC peak vises fortsatt som en monomer og en dimer på SDS-side gel (baner 14-15). Bruk av en rørt celle konsentratoren er viktig for å forhindre prøvetaking mulig aggregering og utfelling ved konsentrasjon.

Krystallisering av Nemo-EEAA
Initial krystaller ble innhentet fra en kommersiell skjerm ved hjelp av PGA (se tabell over materialer), utnytte 1,65 μg/ml av Nemo-aeee i 2 mm Tris, 100 mm NaCl, 2 mm DTT, pH 8,0. Fine screening produserte krystaller i 0,1 M Tris pH 8,9, 5% PGA-LM, 3,6% PEG 20k (figur 2A), som ble benyttet for å produsere et frø lager. Final krystaller ble oppnådd med seeding i 0,1 M Tris pH 8,0, 5,8% PGA-LM, 5,45% PEG 20k (figur 2B).

Fastsettelse av data innsamling og struktur
NEMO-AEEE krystaller lider av mosaicity og anisotropien. Krystaller dannet i P 1 21 1 plass gruppe, med data oppløsning varierende i a *, b * og c * akse (1,88 å, 2,10 å og 2,55 å). Eksempler på Diffraksjon profiler er i Figur 3. Data ble kjøpt på AMX (17-ID-1) beamline av NSL II, med en bjelke størrelse på 7 x 5 μm2. Den lille strålen størrelse var avgjørende for å fokusere på den ønskede delen av krystall (figur 2B) og sikre datakvalitet.

Vellykket protokoll for struktur bestemmelse krever Anisotrop avkorting av dataene ved hjelp av STARANISO27 server (http://staraniso.globalphasing.org/cgi-bin/staraniso.cgi), etterfulgt av fase ved molekylær erstatning ved hjelp av MRage21 innen PHENIX22 og strukturen i dimeric GCN4 (pdb: 4DMD)15 som en søke modell. I løsningen av denne strukturen fase ble først forsøkt ved å merke den innfødte metionin med SeMet. Uregelrett signalet var for svakt, sannsynligvis på grunn av løsemiddel eksponert natur Met95 i ubundet form av NEMO (SeMet95 ble vellykket brukt til å fase av NEMO/IKKβ struktur9).

Innledende dataanalyse ble forsøkt med sfæriske avkorting av dataene til 2,3 å. Dette datasettet kan ikke med hell bli faset av molekylær erstatning, men en løsning ble innhentet ved hjelp av MR-ROSETTA25 og STRUKTUREN i Nemo (44-111) i komplekse med IKKβ (701-745) som en søke modell (pdb: 3BRV)9. Denne første modellen kunne ikke forbedres. Vi benyttet Diffraksjon Anisotropien server ved UCLA26 til elliptically avkorte data og å fjerne anisotropien ved Anisotrop skalering. Det nylig behandlede datasettet kan bli faset av molekylær erstatning. For å forbedre dataene ytterligere, brukte vi STARANISO27 -serveren til Anisotrop avkorting av dataene og amplituder ble korrigert med en Anisotrop korrigerings faktor med Bayesisk anslag28. Disse dataene, som resulterer i en økning i antall unike refleksjoner til 19 560, ble brukt for struktur raffinement. Sammensatt utelate kart der beregnet med PHENIX, unntatt 10% av atomer om gangen, og sammenlignet med den endelige strukturen modellen, for å bekrefte at strukturen ikke var partisk av Atom-modellen. Den krystallografisk modellen er komplett med unntak av første og siste rester i kjede A av NEMO-AEEE, som det ikke ble observert elektron tetthet for.

NEMO-AEEE er en homo-dimeric, uregelmessig, parallell spiral spiral av ~ 175 å ha i lengde. Den vanlige spiral-coil regionen omfatter den ideelle spiral-coil adapter sekvens på N-Terminus (rester 20-50) og de to første heptads av NEMO riktig rekkefølge (rester 51-65). En vanlig spiral coil er også til stede ved C-Terminus, som starter ved NEMO rester 97 og omfatter C-terminal ideelle coil-coil adapter (Figur 4A). Den sentrale delen, omfatter NEMO rester 66-98 viser større interhelical avstander (interhelical avstand går fra en gjennomsnittlig verdi på 7,6 å i den vanlige spiral-spiral struktur til maksimalt 11,5 å i den uregelmessige regionen) og usammenhengende hydrofobe grensesnitt sammenlignet med en ideell spiral coil. Denne regionen av NEMO representerer også grensesnittet for binding av IKKβ og gjennomgår en conformational endring ved ligand binding. Den IKKβ-bundne strukturen viser en mer åpen spiral konformasjon for å imøtekomme ligand med større interhelical avstand på 1,0 til 2,2 å i denne regionen (Figur 4B)12. I Apo struktur rester Leu93, Met94, Lys96, Phe97 og Arg101 er forskjøvet mot midten av spiral spolen å invadere ligand bindende lommen (den Cα-Cα avstand for Phe97 er strammere ved 2,9 å), med den samlede effekten av å lukke den store hydrofobe kløft som er vert for ligand i IKKβ-Bound struktur.

Figure 1
Figur 1: rensing av Nemo-aeee. (A) sekvens justering av Nemo fra homo sapiens, mus laboratoriemusmusculus og Bos bovis og utviklet Nemo-aeee. Den spiral-coil adaptere sekvensen er understreket, og mutasjoner er uthevet i oransje. (B) SDS-side gel av fraksjoner som samles inn underuttrykk og rensing (som merket og referert i Flow Chart 1C). 10% akrylamid, MES buffer. (C) en flytskjema for rensing av Nemo-aeee. (D) størrelse-utelukkelse profil indikerer DIMER av Nemo-aeee (blå). I grønt er molekylvekt markører (kDa) indikert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: morfologi og størrelse av Nemo-aeee krystaller. (A) en krystall av Nemo-aeee fra den første spredte matrise skjermen, unseeded. Denne typen krystall ble brukt til såing for påfølgende krystallisering forsøk (0,1 M Tris pH 8,0, 5% PGA-LM, 3,6% PEG 20k, med en protein løsning i 2 mM Tris, 100 mM NaCl 2 mM DTT, pH 8,0). (B) krystall som brukes til datainnsamling (0,1 M Tris pH 8,0, 5,8% pga-LM, 5,45% Peg 20k, med en protein løsning i 2 mm Tris, 100 mm NaCl 2 mm DTT, pH 8,0). Det omtrentlige området som brukes til datainnsamling, er markert med rødt. Skalaen bar for 100 μm lengde er definert i figuren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: krystallografisk data innhentet fra Nemo krystaller. (A) X-ray Diffraksjon profilen til tidlig Nemo krystall: langstrakte striper indikerer mosaicity i krystallen. (B) X-ray Diffraksjon profilen til en optimalisert Nemo-aeee krystall. Oppløsnings ringen trekkes i en romlig oppløsning på 2,5 å. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: oppbygging av UBUNDET Nemo. (A) Nemo-aeee dimer vises som et bånd, lys blå = spiral-coil adaptere, blå = Nemo (51-112). (B) superposisjon av Apo Nemo-aeee struktur (blå, pdb: 6MI3) og Nemo (44-111) fra IKKβ-Bound struktur (grå, pdb: 3BRV, IKKβ vises ikke), vist som bånd; strukturene er justert på kjede A, region 44-111 bare. Dette tallet er endret fra forrige publikasjon12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Krystallisering forsøk på NEMO i den ubundne formen var mislykket, inkludert forsøk med full lengde protein og flere avkorting konstruksjoner som omfattet det IKK-bindende domenet. Våre Biofysiske karakterisering av ikk-binding domenet til Nemo (rester 44-111) av sirkulære dichroism, NMR spektroskopi og fluorescens anisotropien indikerte at konstruksjonen, om enn i stand til å binde IKKβ, eksisterte i en tilstand av conformational Exchange, ikke egnet for krystallisering9,10. Vår tilnærming involverte engineering en konstruksjon av IKK-bindende domenet til NEMO som vedtok en mer stabil, foldet og innfødt-lignende konformasjon, eliminerer fleksibiliteten som forhindret krystallisering. Ideell spiral-coil domene adaptere smeltet til N-og C-Termini i NEMO (44-111) sekvens tilbyr fordelen av å stabilisere dimeric spiral-coil fold av innfødte NEMO og tilrettelegging krystallisering14. Oppførselen til en rekke protein konstruksjoner ble overvåket på hvert trinn gjennom SDS-side, størrelse utelukkelse kromatografi, sirkulær dichroism, fluorescens anisotropien og NMR spektroskopi, som beskrevet tidligere10,12. Til tross for progressiv forbedring i alle ønskede parametre ingen konstruere gitt Diffraksjon kvalitet krystaller til mutasjoner E56A, E57A ble innført. Mutasjoner var den høyeste virkningen mutasjoner foreslått av Surface entropi Reduction server SERp29 som ikke involverer rester innblandet i hot-spots for binding for IKKβ, som i Nemo/IKKβ kompleks struktur. Selv om andre konstruksjoner som stabiliserer den bestilte strukturen i det IKK-bindende domenet til NEMO gjennom cystein disulfide kobling og binding IKKβ med høy affinitet, har blitt beskrevet30, er protokollen her beskrevet den første vellykkede tilnærmingen til å strukturere bestemmelse av det ikk-bindende DOMENET til Nemo i den ubundne formen.

Protein produksjon og rensing fulgte standard prosedyrer i laboratoriet vårt. Ved cellelyse er en betydelig del av proteinet tilstede i den uløselig fraksjonen, selv når cellene vokser etter induksjon ved 18 ° c, derfor ble proteinet solubilized i 8 M urea etter cellelyse og før rensing, og ombrettes mens bundet til IMAC-kolonnen. Omfattende vask av kolonnen bundet protein både under denaturering forhold og etter refolding er avgjørende for et rent produkt etter den første rensing trinn. Den rene NEMO-AEEE har en høyere tendens til å fremskynde enn den forrige konstruksjoner, men er fortsatt tilstrekkelig løselig under krystallisering forhold.

Et kritisk skritt i strukturen besluttsomhet var bruken av seeding. I en tilnærming som ligner på microseed matrise screening31, frø fra krystall innhentet under sparsom matrise screening ble brukt i en ekstra screening av forholdene, etterfulgt av en fin screening runde, for å fastslå endelige krystallisering forhold. De fleste av krystallene vokst i de endelige forholdene viser høy mosaicity og er ikke egnet for datainnsamling. Krystaller ble vist over flere besøk til beamline og best datakvaliteten ble oppnådd ved å samle datasett på kanten av krystallen, der den nyeste veksten hadde skjedd. Som regionen som viste gitter ensartethet i kryss-polarisert bilder var liten, var det medvirkende til å ha tilgang til AMX beamline på NSL II, på grunn av liten stråle størrelse.

Vi klarte å fastslå strukturen i NEMO-AEEE av molekylær erstatning bruke som et søk modellstrukturen av dimeric spiral-coil på GCN415, som er kartlagt til den ideelle spiral-coil adaptere smeltet på N-og C-TERMINI av Nemo sekvensen. Den molekylære utskifting var vellykket som GCN4 adaptere opprettholde sin opprinnelige struktur når smeltet til NEMO. Samtidig kan vi bekrefte at NEMO opprettholder sin opprinnelige struktur ved å sammenligne de delene som ikke er involvert i IKK-binding med tilsvarende struktur region i NEMO/IKKβ kompleks struktur. Som et alternativ kan det være mulig å bruke strukturen til NEMO i NEMO/IKKβ-komplekset (PDB: 3BRV)9 som en molekylær søke modell, med fokus på monomer B, som tilsvarer den minste conformational endringen ved ligand binding. Denne strategien viste noen innledende suksess ved hjelp av MR-ROSETTA modul av PHENIX.

Til slutt var det avgjørende for en vellykket struktur vilje til å utnytte alle tilgjengelige data i datasettet, ved å ty til en Anisotrop cut-off av sammenslåtte intensitet data, som leveres av STARANISO27 server eller Diffraksjon anisotropien server ved UCLA26.

Den essensielle rollen av NEMO/IKK-komplekset i NF-kB-banen gjør det til et ønskelig mål for modulering av veien for terapeutisk intervensjon. Proteiner-protein interaksjoner, spesielt når det involverer et stort bindings grensesnitt, er utfordrende å hemme med små peptider eller små molekyler, og struktur-basert inhibitor design kan tilby en betydelig fordel. Konstruksjoner av IKK-bindende domene av NEMO at vi utviklet overvinne grensene for fleksible NEMO (44-111) for å lette krystallisering og struktur besluttsomhet. Som konstruerer lett krystalliseres i ubundet form, ser vi for oss at den samme protokollen kan med hell brukes i krystallisering av komplekset av NEMO med små molekyl hemmere, for å bestemme en struktur som ville gi detaljer om bindende moduser og tillate ytterligere ligand forbedringer.

En analyse av krystall pakking i krystallisering forholdene oppnådd i dette arbeidet indikerer at ligand co-krystallisering kan foretrekkes å ligand soaking i Apo-protein krystaller. Mens krystall pakking gir litt plass rundt kjede B i dimer (6 til 10 å til nærmeste kjede) og på den ene siden av ligand bindings sted (ca. 13 å i hot-spot-regionen mellom Phe82-Phe87), er den symmetriske innbindings lommen fullstendig okkludert av nærliggende kjeder, forebygge ligand binding.

Spiral spoler er til stede i en betydelig andel i proteom og er avgjørende i deres funksjon som molekylære avstandsstykker, stillaser og i å kommunisere conformational endringer16. Til tross for deres overflod og relevante roller, er det relativt få strukturer av full lengde spiral-coil proteiner. Bruk av spiral-coil adaptere kan hjelpe i stabilisering av strukturelle domener av spiral-coil proteiner og samtidig bevare sin opprinnelige struktur og bistand i den strukturelle besluttsomhet og elucidation av deres funksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker Prof. D. Madden, for mange nyttige diskusjoner gjennom dette prosjektet. Vi takker Prof D. Bolon for gaven av plasmider inneholder optimalisert GCN4 spiral coil. Vi takker Dr. B. Guo for NEMO plasmider. Vi takker Christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili og Amy E. Kennedy for å demonstrere prosedyren. Vi takker BioMT Crystallography Core Facility og avdelingene for kjemi og biokjemi & Cell Biology på Dartmouth for bruk av Crystallography utstyr og BioMT personell for deres støtte. Denne forskningen anvendt det AMX beamline av det nasjonal Synchrotron lyset kilde II, en U.S. avdeling av energi (DOE) kontor av vitenskap bruker Letter operert for DOE kontor av vitenskap av Brookhaven nasjonal laboratorium under kontrakt nei. DE-SC0012704. Vi takker de ansatte på NSL II for deres støtte. Dette arbeidet ble finansiert av NIH tilskudd R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 og P20GM113132, og en Munck-Pfefferkorn Novel og Interactive stipend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) Molecular Dimensions MD2-100-150 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane Spectra/Por 132724 For dialysis removal of imidazole
Amicon Stirred Cell Millipose Sigma UFSC 05001 For protein concentration
Ammonium Chloride Millipore Sigma G8270 For minimal media labeling
Benzonase Nuclease Millipore Sigma 9025-65-4 For digestion of nucleic acid
BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells Agilent Technologies Model: 230245 TEV expression
CryoPro Hampton Research HR2-073 Cryo-protectants kit
D-Glucose (Dextrose) Millipore Sigma A9434 For minimal media labeling
Difco Terrific Broth ThermoFisher DF043817 For culture growth
Dithiothreitol > 99% Goldbio DTT25 For reduction of disulfides
E. coli: Rosetta 2 (DE3) Novagen 71400-3 Expression of unlabeled NEMO-EEAA
FORMULATOR Formulatrix Liquid handler/ screen builder
HCl – 1.0 M Solution Hampton Research HR2-581 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg GE Healthcare 28989333 For size exclusion purification
HisTrap HP 5 mL column GE Healthcare 17524802 For purification of His-tagged NEMO-EEAA
HT 96 MIDAS Molecular Dimensions MD1-59 For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
HT 96 Morpheous Molecular Dimensions MD1-46 For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
Imidazole ThermoFisher 288-32-4 For elution from His-trap column
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside Goldbio I2481C5 For induction of cultures
MRC2 crystallization plate Hampton Research HR3-083 Crystallization plate
NT8 - Drop Setter Formulatrix Crystallization
pET-16b Millipore Sigma 69662 For cloning of NEMO-EEAA
pET-45b Millipore Sigma 71327 For cloning of NEMO-EEAA
Phenylmethylsulfonyl fluoride ThermoFisher 36978 For inhibition of proteases
Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti Beckmann Coulter 339160 Ultracentrifuge bottle
Polyethylene Glycol 20,000 Hampton Research HR2-609 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
pRK793 (TEV) Addgene Plasmid 8827 For TEV production
QuikChange XL II Agilent Technologies 200522 Site directed mutagenesis
Required Cap Assembly: Beckmann Coulter 355623 Ultracenttrifuge bottle cap
ROCK IMAGER Formulatrix Crystallization Imager
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320 Seed generation
Sodium Chloride ≥ 99% Millipore Sigma S9888 For buffering of purification solutions
TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) Goldbio TCEP1 Reducing agent
The Berkeley Screen Rigaku MD15-Berekely For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
The PGA Screen Molecular Dimensions MD1-50 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Tris – 1.0 M Solution Hampton Research HR2-589 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Ultrapure Tris Buffer (powder format) Thermofisher 15504020 For buffering of purification solutions
Urea ThermoFisher 29700 For denaturation of NEMO-EEAA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gilmore, T. D. Introduction to NF-kappaB: players, pathways, perspectives. Oncogene. 25 (51), 6680-6684 (2006).
  2. Bassères, D. S., Baldwin, A. S. Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation and progression. Oncogene. 25 (51), 6817-6830 (2006).
  3. Hayden, M. S., West, A. P., Ghosh, S. NF-kappaB and the immune response. Oncogene. 25 (51), 6758-6780 (2006).
  4. Lee, T. I., Young, R. A. Transcriptional regulation and its misregulation in disease. Cell. 152 (6), 1237-1251 (2013).
  5. Courtois, G., Gilmore, T. D. Mutations in the NF-kappaB signaling pathway: implications for human disease. Oncogene. 25 (51), 6831-6843 (2006).
  6. Zhao, J., et al. Development of novel NEMO-binding domain mimetics for inhibiting IKK/NF-κB activation. PLoS biology. 16 (6), 2004663 (2018).
  7. Zhang, Q., Lenardo, M. J., Baltimore, D. 30 Years of NF-κB: a blossoming of relevance to human pathobiology. Cell. 168 (1-2), 37-57 (2017).
  8. Jin, D. Y., Jeang, K. T. Isolation of full-length cDNA and chromosomal localization of human NF-kappaB modulator NEMO to Xq28. Journal of Biomedical Science. 6 (2), 115-120 (1999).
  9. Rushe, M., et al. Structure of a NEMO/IKK-associating domain reveals architecture of the interaction site. Structure. 16 (5), 798-808 (2008).
  10. Guo, B., Audu, C. O., Cochran, J. C., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Protein engineering of the N-terminus of NEMO: structure stabilization and rescue of IKKβ binding. Biochemistry. 53 (43), 6776-6785 (2014).
  11. Havranek, J. J., Harbury, P. B. Automated design of specificity in molecular recognition. Nature Structural Biology. 10 (1), 45-52 (2003).
  12. Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. The IKK-binding domain of NEMO is an irregular coiled coil with a dynamic binding interface. Scientific Reports. 9 (1), 2950 (2019).
  13. Arimori, T., et al. Fv-clasp: an artificially designed small antibody fragment with improved production compatibility, stability, and crystallizability. Structure. 25 (10), London, England. 1611-1622 (2017).
  14. Hernandez Alvarez, B., Hartmann, M. D., Albrecht, R., Lupas, A. N., Zeth, K., Linke, D. A new expression system for protein crystallization using trimeric coiled-coil adaptors. Protein Engineering, Design and Selection. 21 (1), 11-18 (2008).
  15. Oshaben, K. M., Salari, R., McCaslin, D. R., Chong, L. T., Horne, W. S. The native GCN4 leucine-zipper domain does not uniquely specify a dimeric oligomerization state. Biochemistry. 51 (47), 9581-9591 (2012).
  16. Truebestein, L., Leonard, T. A. Coiled-coils: The long and short of it. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 38 (9), 903-916 (2016).
  17. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  18. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Engineering. 14 (12), 993-1000 (2001).
  19. Miladi, B., et al. A new tagged-TEV protease: construction, optimisation of production, purification and test activity. Protein Expression and Purification. 75 (1), 75-82 (2011).
  20. Miller, M. S., et al. Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II. Molecules. 24 (3), Basel, Switzerland. (2019).
  21. McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D., Winn, M. D., Storoni, L. C., Read, R. J. Phaser crystallographic software. Journal of Applied Crystallography. 40, Pt 4 658-674 (2007).
  22. Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 2 213-221 (2010).
  23. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 64, Pt 1 61-69 (2008).
  24. Emsley, P., Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 60, Pt 12 Pt 1 2126-2132 (2004).
  25. Terwilliger, T. C., et al. phenix.mr_rosetta: molecular replacement and model rebuilding with Phenix and Rosetta. Journal of Structural and Functional Genomics. 13 (2), 81-90 (2012).
  26. Strong, M., Sawaya, M. R., Wang, S., Phillips, M., Cascio, D., Eisenberg, D. Toward the structural genomics of complexes: crystal structure of a PE/PPE protein complex from Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (21), 8060-8065 (2006).
  27. Tickle, I. J., et al. STARANISO. , (2018).
  28. French, S., Wilson, K. On the treatment of negative intensity observations. Acta Crystallographica Section A: Crystal Physics, Diffraction, Theoretical and General Crystallography. 34 (4), 517-525 (1978).
  29. Goldschmidt, L., Cooper, D. R., Derewenda, Z. S., Eisenberg, D. Toward rational protein crystallization: A Web server for the design of crystallizable protein variants. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 16 (8), 1569-1576 (2007).
  30. Zhou, L., et al. Disulfide-mediated stabilization of the IκB kinase binding domain of NF-κB essential modulator (NEMO). Biochemistry. 53 (50), 7929-7944 (2014).
  31. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: what have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, Pt 9 1117-1126 (2014).

Tags

Biokjemi NF-KB NEMO IκB kinase (IKK) NEMO bindende domene (neste arbeidsdag) spiral coil røntgen crystallography protein engineering struktur bestemmelse struktur-basert legemiddel design
Produksjon, krystallisering og struktur bestemmelse av det IKK-bindende domenet til NEMO
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barczewski, A. H., Ragusa, M. J.,… More

Barczewski, A. H., Ragusa, M. J., Mierke, D. F., Pellegrini, M. Production, Crystallization, and Structure Determination of the IKK-binding Domain of NEMO. J. Vis. Exp. (154), e60339, doi:10.3791/60339 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter