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JoVE Journal Biochemistry
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Biochemistry

Produção, cristalização e determinação da estrutura do domínio ikk-obrigatório da NEMO

Published: December 28, 2019 doi: 10.3791/60339
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Dartmouth College

Summary

Descrevemos protocolos para a determinação da estrutura do domínio ikk-obrigatório da NEMO por cristalografia de raios-X. Os métodos incluem expressão de proteína, purificação e caracterização, bem como estratégias para otimização de cristal bem-sucedida e determinação da estrutura da proteína em sua forma desvinculada.

Abstract

Nemo é uma proteína de andaimes que desempenha um papel essencial na via NF-κB através da montagem do complexo IKK com as kinases IKKα e IKKβ. Após a ativação, o complexo ikk fosforiatos as moléculas IκB levando a NF-κB translocação nuclear e ativação de genes-alvo. A inibição da interação NEMO/IKK é um paradigma terapêutico atraente para a modulação da atividade da via NF-κB, tornando a NEMO um alvo para o design e descoberta de inibidores. Para facilitar o processo de descoberta e otimização de inibidores nemo, projetamos uma construção melhorada do domínio ikk-binding da NEMO que permitiria a determinação da estrutura da proteína na forma de apo e, embora vinculado a pequenos inibidores de peso molecular. Aqui, apresentamos a estratégia utilizada para a concepção, expressão e caracterização estrutural do domínio ikk-binding da NEMO. A proteína é expressa em células De. coli, solubilizada em condições de desnajantes e purificada através de três etapas cromatográficas. Discutimos os protocolos de obtenção de cristais para determinação da estrutura e descrevemos estratégias de aquisição e análise de dados. Os protocolos encontrarão ampla aplicabilidade à determinação da estrutura de complexos de NEMO e inibidores de pequenas moléculas.

Introduction

A via NF-κB é ativada em resposta a uma variedade de estímulos, incluindo citocinas, produtos microbianos e estresse, para regular a expressão de genes-alvo responsáveis pela resposta inflamatória e imune, morte celular ou sobrevivência e proliferação1. Patologias, incluindo doenças inflamatórias e autoimunes e câncer2,3,4,5 foramcorrelacionadas à hiperativação da via, o que tornou a modulação da atividade NF-κB um alvo principal para o desenvolvimento de novas terapias6,7.

A via canônica NF-κB, em particular, distingue-se da via não canônica, responsável pela linfogenênese e ativação de células B, pela dependência do primeiro da proteína de andaimes NEMO (modulador essencial NF-κB8)para a montagem do complexo IKK com as quinases IKKα e IKKβ. O complexo do IKK é responsável pela fosforilação de IκBα (inibidor da κB) que o visa para degradação, liberando os dimers NF-κB para translocar para o núcleo para transcrição gênica1 e, portanto, é um alvo atraente para o desenvolvimento de inibidores para modular a atividade NF-κB.

Nossa pesquisa se concentra na caracterização da interação proteína-proteína entre NEMO e IKKβ, visando NEMO para o desenvolvimento de inibidores de pequenas moléculas da formação complexa do IKK. O domínio de ligação mínimo do NEMO, necessário para ligar IKKβ, abrange resíduos 44-111, e sua estrutura foi determinada em complexo com um peptídeo correspondente à seqüência IKKβ 701-7459. NEMO e IKKβ formam um pacote de quatro hélices onde o dimer NEMO acomoda os dois helices de IKKβ (701-745) em um sulco aberto alongado com uma interface de interação estendida. IKKβ (734-742), também conhecido como domínio nemo-obrigatório (NBD), define o ponto quente mais importante para a ligação, onde os dois triptofanos essenciais (739.741) enterrar profundamente dentro do bolso NEMO. Os detalhes da estrutura complexa podem auxiliar no projeto e otimização baseados na estrutura de inibidores de pequenas moléculas visando nemo. Ao mesmo tempo, é difícil que a ligação de uma pequena molécula ou peptídeo recriaria em NEMO a mudança conformal completa (ou seja, a abertura extensiva do dimer de bobina enrolada nemo) causada pela ligação do longo IKKβ (701-745), como observado no cristal, e a estrutura de NEMO ou NEMO desvinculado saqueada pode representar um alvo melhor para o projeto e inibição de drogas baseados em estrutura.

Nemo de comprimento total e construções de truncação menores que abrangem o domínio ikk-binding provaram intratável para a determinação da estrutura na forma desvinculada através de cristalografia de raios-X e ressonância magnética nuclear (RMN) métodos10, o que nos levou a projetar uma versão melhorada do domínio ikk-binding de NEMO. De fato, nemo (44-111) na forma desvinculada é apenas parcialmente dobrado e sofre troca conformaçãol e, portanto, definido para estabilizar a sua estrutura dimérica, bobina enrolada e estabilidade, preservando a afinidade vinculativa para IKKβ. Ao anexar três heptads de sequências de bobina enroladas dimeric e11 ideais no N-and C-termini da proteína, e uma série de mutações de quatro pontos, geramos NEMO-EEAA, uma construção totalmente fraca e dobrada em uma bobina enrolada, que resgatou aafinidade de ligação iKK à faixa de namolanor, como observado para nemo12de comprimento completo . Como vantagem adicional, esperávamos que os adaptadores de bobina enroladas (com base na sequência GCN4) facilitassem a cristalização e, eventualmente, ajudassem na determinação da estrutura de raios-X através da substituição molecular. Adaptadores de bobina enrolada têm sido utilizados da mesma forma para aumentar a estabilidade, melhorar o comportamento da solução e facilitar a cristalização de bobinas enroladas e fragmentos de anticorpos13,14. Nemo-EEAA é facilmente expresso e purificado a partir de células Escherichia. coli com uma tag Histidine cleavable, é solúvel, dobrado em uma bobina enrolada dimérica e estável e é facilmente cristalizada, com difração de 1,9 Å. A presença das regiões ordenadas de bobina enrolada de GCN4 poderia, adicionalmente, ajudar na eliminação dos dados dos cristais da NEMO-EEAA por substituição molecular usando a estrutura conhecida do GCN415.

Dado os resultados obtidos com apo-NEMO-EEAA, acreditamos que os protocolos aqui descritos também podem ser aplicados à cristalização da NEMO-EEAA na presença de pequenos peptídeos (como o peptídeo NBD) ou inibidores de pequenas moléculas, com o objetivo de compreender os requisitos para a inibição nemo e otimização baseada em estrutura de inibidores de chumbo iniciais para alta afinidade. Dada a plasticidade e a natureza dinâmica de muitos domínios de bobina enrolada16,o uso dos adaptadores de bobina enrolada poderia encontrar aplicabilidade mais geral para ajudar a determinação estrutural.

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Protocol

1. Projeto de construção para cristalografia

  1. Clonar a seqüência de NEMO-EEAA como na publicação anterior12 em um vetor de expressão em E. coli usando o promotor T7, incluindo uma tag hexa-histidina n-terminal e um local de clivagem protease.
    NOTA: Neste protocolo, usamos um vetor modificado para incluir uma etiqueta de hexa-histidina terminal N e um site de clivagem tobacco Etch Virus (TEV)10. Este vetor facilita a clivagem da sua marca para cristalização de proteínas e deixa apenas a curta extensão dos resíduos de GSW antes do início da sequência de proteína desejada. O vetor do qual este foi derivado, e vetores alternativos estão listados na Tabela de Materiais. Neste protocolo, as modificações subseqüentes à seqüência original de NEMO (44-111) foram introduzidas stepwise, como descrito mais cedo10,usando o mutagenesis dirigido lateral. Inicialmente, tentamos estabilizar o dimer nemo bobinado-bobina anexando os adaptadores ideais bobina enrolada (em um comprimento de pelo menos três heptads) para o terminal N ou c-terminal final ou para ambos. A bobina enrolada dupla foi a mais promissora em ensaios de cristalização anteriores e foi posteriormente modificada introduzindo mutações para melhorar a cristalização, conforme descrito anteriormente12.

2. Expressão em grande escala de Seus6 marcados NEMO-EEAA

  1. Transforme a construção em células competentes BL21 (DE3). Armazenar a -80 °C como um estoque de glicerol de células.
  2. Dia 1 - Prepare uma cultura inicial de células. Em um frasco erlenmeyer de 125 mL, adicione 20 mL de solução de caldo fantástico e 20 μL de um estoque de 100 mg/mL de Ampicillin. Adicione alguns microlitros de caldo de glicerol celular (de -80 °C de células competentes BL21 (DE3) transformadas com vetor).
  3. Agite a cultura inicial de 10 mL durante a noite a 37 °C, 220 rpm (aproximadamente 15 h).
  4. Dia 2 - A partir do arranque, diluir a um OD600 = 0,1 em 250 mL de Caldo Fantástico. Adicione a ampicilina a uma concentração final de 100 μg/mL. Crescer para um OD600 = 0,8-1,0.
    1. Adicione o nisôpropico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) a 500 μM, e cresça por 4 h a 37 °C.
    2. Medida OD600 de cultura induzida após 4 h. Cultura deve chegar a um OD600 = 6-10.

3. Purificação de seus6 marcados NEMO-EEAA

  1. Cultura de células de spin para baixo em 3.800 x g para 20 min em 4 °C.
  2. Salve a pelota celular e descarte o meio.
    NOTA: A pelota celular pode ser salva e armazenada a -20 °C neste momento, para purificação em um momento posterior.
  3. Resuspenda as células em 40 mL de lúbio tampão contendo 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 mM MgCl2,0,5 mm fenilmetillsulfonyl fluoreto, 2 mM Dithiothreitol (DTT), e 3 μL de Benzona Nuclesease.
    NOTA: A coluna de afinidade de iões metálicos imobilizados de níquel (IMAC) utilizada é compatível com 2 mM DTT. Alternativamente, 0,2 mM tris (2-carboxyethyl) fosfina (TCEP) pode ser utilizado.
  4. Células resuspensas divididas em dois alíquos de 20-25 mL.
  5. Lyse as células usando a imprensa francesa (pressão aproximada 25.000 psi), repetindo 2-3 vezes para cada alibato (na sala fria).
    NOTA: Alternativamente, as células poderiam ser lysed por sonication (não testado neste protocolo).
  6. Adicione a urea ao lysate da pilha a uma concentração final de 8 M, deixe incubar em uma plataforma de balanço para um mínimo de 2 h ou até durante a noite. Esta e todas as etapas seguintes da purificação, à excecpção da diálise, podem ser executadas na temperatura ambiente.
  7. Dia 3 - Transfira o lysate para tubos de ultracentrífuga e balance o peso, garantindo que o lysate preencha os tubos para pelo menos 3/4 cheios. Gire o lysate a 125.000 x g por 45 min a 25 °C. Decantar o supernatant em um copo de 100 mL para carregar na coluna.
    NOTA: Centrífuga em 4 °C fará com que a ureia caia para fora.
  8. Em um sistema de cromatografia líquido rápido, retire o etanol da coluna IMAC 5 mL com 25 mL de ultrapuro H2O a 5 mL/min, seguido por 25 mL de tampão de elução contendo 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM imidazole, 2 mM DTT, pH 8.0, então 25 mL de buffer de ligação contendo 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 mM DTT, 8 M urea, pH 8.0.
  9. Carregue o supernatant incubado ureia em 3 mL/min na coluna de IMAC, coletando o fluxo completamente. Lave a coluna para 10 volumes de coluna com buffer de ligação em 3 mL/min.
  10. Refold NEMO-EEAA construir na coluna por coluna de lavagem com buffer redobramento para 20 volumes de coluna em 3 mL/min, contendo 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 mM DTT, pH 8.0.
  11. Realize a elução de gradiente da NEMO-EEAA, de 10 a 500 mM Imidazole sobre um gradiente de volume de 12 colunas, coletando todos os eluate em placa de coleta de frações (1 mL frações).
  12. Continue a elução a 500 mM imidazol e para dois volumes de coluna, continuando a coletar.
  13. Executar sulfato dodócia de sódio (SDS) - eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) de frações para determinar a presença nemo-eeaa em frações de elução.
    NOTA: Usamos 10% de acrilamida, buffer MES.
  14. Frações de piscina contendo proteína alvo puro.
  15. Medir a concentração de proteína por Bradford ensaio17.
    NOTA: Isso é necessário para estimar a quantidade de protease para clivagem tag.

4. Sua clivagem e purificaçãode 6 etiquetas

  1. Adicione TEV em uma relação de peso 1:10 de TEV:NEMO-EEAA proteína para apegar a sua tag6. A protease TEV foi purificada em casa.
    NOTA: Otimizar a quantidade de TEV, tempo e temperatura necessária para clivagem completa separadamente.
    1. Express tev protease, s219v mutante18 em BL21 (DE3) -RIL células e purificar como descrito anteriormente19. Brevemente crescer as células, como descrito no passo 2, lyse pela imprensa francesa e purificar usando uma coluna IMAC. Armazenar a proteína final em 25 mM tampão de fosfato de sódio, pH 7.8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 20% v/v glicerol.
  2. Diálise a amostra durante a noite (aproximadamente 15 h) em 4 L de 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8.0, para permitir clivagem e remover o excesso de imidazol da amostra para a purificação subsequente.
  3. Dia 4 - Retire a amostra da diálise. Executar um gel SDS-PAGE da amostra de clivagem TEV para garantir clivagem é concluída.
  4. Em um sistema de cromatografia líquido rápido, retire o etanol de uma coluna IMAC 5 mL com 25 mL de ultrapuro H2O a 5 mL/min, seguido por 25 mL de buffer de elução contendo 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM imidazole, 2 mM DTT, pH 8.0, então buffer de ligação contendo 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole, 2 mM DTT, pH 8.0.
  5. Carregue a coluna a 1 mL/min com TEV-cleaved NEMO-EEAA. Cleaved NEMO-EEAA vai elute no fluxo: coletar em uma placa de coleta de 96 poços (1 frações mL). Lave a coluna para cinco volumes de coluna de 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM imidazole em 1 mL/min, continuando a coletar em placa de coleta de frações.
  6. Elute TEV e desabar seu6-NEMO-EEAA com três volumes de coluna de 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 500 mM imidazole, 2 mM DTT, pH 8.0, coletando elution em um flask de 50 mL.
  7. Executar gel SDS-PAGE de frações de fluxo para determinar a presença de nemo-eeaa clleaved.
  8. As frações de fluxo de pool contendo a construção nemo-eeaa clitada e concentram-se usando um concentrador de células agitadas para 5 mL. Corte de peso molecular da membrana (MWCO) = 3 kDa.
  9. Usando uma membrana de 3 kDa MWCO, amostra concentrada em diálise em 2 L de 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8.0 para 2 h. Alterar o buffer de diálise para 2 L de tampão de diálise fresco para diálise durante a noite (aproximadamente 15 h), em 4 °C.
  10. Dia 5 - Carga 5 mL da amostra dilífica em uma cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) 16 mm x 60 cm coluna (34 μm tamanho médio de partículas) em 1 mL/min em 2 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8.0. Repita com colunas adicionais, dependendo do volume da amostra.
  11. Reunir as frações correspondentes a dimeric NEMO-EEAA.
    NOTA: Nemo-EEAA elutes entre 60-65 mL, correspondendo a uma proteína de peso molecular maior, devido à natureza alongada da bobina enrolada dimeric.
  12. Concentre-se usando um concentrador de células agitadas e um MWCO = 3 kDa membrana para uma concentração final de 113 μM (1,65 mg/mL).
  13. Aliquot a proteína e armazenar a 4 °C (estável por mais de 1 mês).

5. Triagem de matriz esparsa

NOTA: O protocolo realiza ensaios de cristalização usando telas comercialmente disponíveis e configuração de experimentos de queda sentado usando um robô de cristalização. As imagens de cristal são coletadas automaticamente por um imager.

  1. Usando telas de matriz esparsa comercialmente disponíveis (ver Tabela de Materiais),pipeta 60 μL de solução de matriz esparsa em cada um dos 96 poços de uma placa de cristalização de 2 câmaras de gota para difusão de vapor de queda sentada (solução do reservatório).
  2. Usando um setter robótico da gota, dispense 100 nL da solução da proteína em 1.65 mg/mL em uma relação 1:1 com a solução do reservatório na gota 1 para um volume final de 200 nL; em seguida, 66 nL de solução de proteína com 134 nL de solução reservatório para um volume final de 200 nL na queda 2 (1:2 ratio).
  3. Selar a placa usando fita de vedação de 3 polegadas de largura imediatamente após a dispensação.
    NOTA: Gotas vai secar se deixado exposto à atmosfera por mais de 2-3 min.
  4. Guarde as bandejas no armazenamento do imager da cristalização, em 20 °C, verificando as imagens coletadas automaticamente para a presença de cristal, começando após dois dias.
    NOTA: A triagem de cristalização prosseguiu em paralelo com a otimização da construção. Cristais iniciais formados nas seguintes condições (telas comerciais listadas na Tabela de Materiais):a) 0,1 M Tris, pH 8.0, 30% v/v polietileno glicol (PEG) MME 550, 5% de ácido poli-γ-glutamômico, 200-400 kDa baixo polímero de peso molecular (PGA -LM); b) 0,1 M Tris, pH 7,8, 20% w/v PEG MME 2k, 5% PGA-LM; c) 0,1 M Tris, pH 7,8, 20% w/v PEG 3350, 5% PGA-LM. Os cristais escassos da tela da matriz terão a uniformidade pobre da estrutura; portanto, eles vão olhar pobre usando imagens polarizadas. Use imagens UV para garantir que os cristais contenham proteína. A seguinte etapa da geração de estoque da semente é necessária para obter os cristais finais da qualidade da difração.

6. Geração de ações de sementes

NOTA: Nós reproduzivelmente obter cristais para geração de sementes em 0,1 M Tris pH 8,0, 5% PGA-LM, 3,6% w / v PEG 20k. No entanto, os cristais mostrarão alta mosaicidade e não são adequados para coleta de dados nesta fase.

  1. Usando um kit para geração de sementes, prepare o estoque de sementes canalizando toda a queda com crystal present e coloque em 50 μL de solução de condição de cristalização no frasco fornecido.
  2. Vortex o estoque de sementes para 3 min, pulsando 20 s e 10 s off.
  3. Ações de sementes em série diluídas em incrementos de 1:10 até 1:10.000. Guarde todas as diluições a 4 °C, para uso adicional.

7. Telas finas

  1. Projetar telas finas variando as condições para Tris, PGA-LM, e PEG. Varie o comprimento do PEG para bandejas individuais.
    NOTA: A tela fina que produziu o cristal utilizado para a determinação da estrutura da NEMO-EEAA empregou as seguintes condições: 0,1 M Tris pH 8; Pga-LM variou de 8 a 0% nas colunas 1-12. As linhas A-H selecionaram PEGs diferentes, com concentrações variando nas colunas 1-12 da seguinte forma. R: PEG 200 (0-40% v/v); B: PEG 400 (0-40% v/v); C: PEG MME 500 (0-40% v/v); D: PEG 1000 (0-30% w/v); E: PEG 3350 (0-30% w/v); F: PEG 6k (0-30% w/v); G: PEG 10k (0-20% w/v); H: PEG 20k (0-20% w/v). O cristal apareceu em H4 bem (5,45% w / v PEG 20k, 5,8% w / v PGA-LM). Neste protocolo, um manipulador líquido do construtor da cristalografia da proteína foi usado para construir as telas.
  2. Semente um estoque de proteína em uma relação de volume de 1:25 de 1:1,000 diluição de sementes.
    NOTA: Concentração de NEMO-EEAA vai cair um pouco, mas os cristais ainda se formarão.
  3. Repita o passo 2 usando 1:10,000 diluição de sementes, mesma relação de volume de 1:25.
  4. Usando o setter de queda, dispensar 100 nL de solução de proteína em 1,65 mg /mL, com 1:1,000 diluição de estoque de sementes em uma proporção de 1:1 com solução reservatório na queda 1 para um volume final de 200 nL. Repita para a queda 2, mas com 1:10,000 diluição do estoque de sementes presente.
  5. Selar a placa usando fita de vedação de 3 polegadas de largura imediatamente após a dispensação.
    NOTA: Gotas vai secar se deixado exposto à atmosfera por mais de 2-3 min.
  6. Guarde as bandejas no armazenamento do imager, a 20 °C, verificando imagens coletadas após dois dias para presença de cristal.
  7. Verifique os cristais com o imager cross-polarizador para a uniformidade de treliça, para selecionar para condições individuais para configurar seguindo bandejas.

8. Geração de cristais para coleta de dados

  1. Projete telas de condição única em torno de Tris, PGA-LM e peg condição que produziu cristais uniformes, como analisado por imagens polarizadas, e os maiores cristais possíveis.
    NOTA: Cristais dessas condições são irregulares em forma, principalmente folhas finas retangulares. É fundamental selecionar uma condição onde as bordas do cristal são bem definidas e têm a maior espessura possível.
  2. Faça 20 mL de condição de cristalização à mão.
  3. Usando um pipettor multicanal, dispense 60 μL por poço em uma câmara de 2 gotas, 96 placas de cristalização de poços para difusão de vapor sentado.
  4. Prepare o estoque de sementes, conforme descrito no passo 6.2.
  5. Dispense a proteína como descrito na etapa 6.3.
  6. Selar a placa usando fita de vedação de 3 polegadas de largura imediatamente após a dispensação.
    NOTA: Gotas vai secar se deixado exposto à atmosfera por mais de 2-3 min.
  7. Guarde as bandejas no imager a 20 °C e verifique se as imagens se há presença de cristal todos os dias.
  8. Verifique imagens polarizadas cruzadas dos cristais para uniformidade de treliça, para selecionar cristais para coleta de dados.

9. Determinação do crioprotetor

  1. Para testar os crioprotetores, crie soluções de ações correspondentes às condições de cristalização, mas contendo 30%, 20%, 10% e 5% maior concentração de cada componente. A adição do volume crioprotetor a crioprotetor resultará em uma concentração final de componentes que é o mesmo que as condições de cristalização.
    NOTA: Para testar um protetor criocrisa a uma concentração de 30% em volume para uma condição de cristalização de 0,1 M Tris, comece com uma solução de estoque de 0,143 M Tris, antes de adicionar o protetor crio-protetor.
  2. A partir de um kit de crio-reagentes, crie 10 μL de amostra para teste de crioprotetor apartir da mistura de 30% pelo volume de condição criocrino em 70% da solução de estoque de condição de cristalização, para uma concentração final de 30% protetor a criocriem em condições originais de cristalização. Homogeneizar.
    1. Usando uma pipeta de 10 μL, faça 5 μL de solução protegida por criocrisde de teste e mergulhe a ponta do tubo em nitrogênio líquido. Se o gelo é observado, descarte.
    2. Teste todos os protetores de criocriem em 30%. Para as soluções bem-sucedidas, repita o processo em 20%, depois 10% e 5% do protetor criocriso.
    3. Utilizando a solução crioprotetora bem-sucedida com a menor porcentagem de crioprotetor, adicione 0,5 μL de solução em uma queda de teste com cristais presentes. Observe microscópio, cronometrando quanto tempo o cristal dura na circunstância, se não indefinida.
      NOTA: Estes cristais são apenas para teste e serão descartados. Para nemo-eeaa, 12% 1,2-propanediol é a ideal crio-protetora de solução. 12% explica a diluição que a solução protetora de criocriso experimentará quando adicionada à queda de cristal de aproximadamente 100 nL, para uma concentração final aproximada de 1,2 propanediol de 10%.

10. Looping de cristal

  1. Cristais de loop 1-2 dias antes do embarque para síncrotron.
    NOTA: Cristais serão de aproximadamente 60-100 μm de diâmetro: 0,05 - 0,10 mm loops são ideais para looping.
  2. Corte a fita do topo do poço.
  3. Adicione 0,5 μL de solução de cristalização contendo 12% 1,2 propanediol crio-protetor diretamente para o poço.
    NOTA: A concentração final de 1,2 propanediol está agora em aproximadamente 10%, devido à diluição por 100 nL da solução da gota (redução aproximada do volume da gota de 200 nL inicial, devido à difusão do vapor).
  4. Loop o cristal do poço.
    NOTA: Cristais muitas vezes crescem na parte inferior do poço, mas vai desalojar com uma cutucada suave do laço. Uma vez desalojado, loop.
  5. Armazenar o cristal contendo crio-loops em discos imersos em n líquido2.
  6. Guarde esses discos em n2 líquido em frasco de deguerra até que eles estejam prontos para envio de difração de raios-X no síncrotron.

11. Coleta de dados

  1. Coletar dados de difração de raios-X. Neste protocolo, use a linha de luz AMX (ID: 17-ID-1), Fonte Nacional de Luz Síncrotron II.
    NOTA: Os dados foram coletados no local, mas podem ser coletados remotamente. Coletar dados na região do cristal que mostrou uniformidade de treliça em imagens polarizadas. Posicione os cristais no laço de modo que a coleta de dados não envolva regiões "pobres" do cristal quando o cristal girar no goniometer. Os dados que forneceram a melhor resolução vieram da coleta na borda de uma extensão de um cristal de cerca de 5 x 5 μm de tamanho. Use rastering para identificar as melhores áreas no cristal para coletar20.

12. Processamento de dados de raios-X

  1. Conjunto de dados de processo para a mais alta resolução coletado (1,8 Å) com o programa XDS IDXREF para determinar o grupo espacial, células unitárias e conteúdo solvente.
  2. Integrar dados usando o programa XDS INTEGRATE.
  3. Intensidades dimensionadas de processo do programa XDS XSCALE usando o servidor STARANISO, usando a média de corte de I/σI de 1,2 para superfície de limite de difração para os dados.
    NOTA: Os dados não serão cortados no verdadeiro elipsóide. Reter todos os dados acima do i/σI de 1.2 ponto de corte. As estatísticas sobre os dados calculados para a completude esférica serão fracas, devido à truncição não esférica. A completude elíptica foi de 88%, com maiores resoluções de: 1,88 Å, 2,10 Å e 2,55 Å ao longo do eixo a*, b* e c, respectivamente.

13. Solução de estrutura

  1. Utilize a estrutura de raios-X do GCN4 (PDB: 4DMD)15 como modelo de pesquisa para substituição molecular usando MRage21 em PHENIX22. A estrutura 4DMD foi definida no MRage como um "conjunto", e a solução MRage construiu com sucesso a porção de estrutura correspondente ao adaptador de bobina enrolada n-terminal da NEMO-EEAA, homologous ao modelo de pesquisa, para ambas as cadeias no dimer.
    NOTA: Desligue a correção de anisotropia no PHASER, ou os dados serão mais reduzidos.
  2. Utilize rodadas sucessivas de Autobuild23 em PHENIX e edifício manual (usando mapas 2Fo-Fc e Fo-Fc, em Coot24)para construir o restante da estrutura.
  3. Construir manualmente os resíduos ainda ausentes no modelo com base em 2Fo-Fc e Fo-Fc c mapas, usando Coot24.
    NOTA: A última etapa envolveu a construção dos 4 resíduos do terminal N e 4 resíduos de terminal C para cada monomer. A colocação do sidechain foi ajustada igualmente manualmente como necessário.
  4. Calcule um mapa composto do omitído usando PHENIX e uma omissão de 10% da estrutura.

14. Refinamento estrutura

  1. Refinar as estruturas com FENIX Refinar. Executar os refinamentos iniciais contra os pesos solventes em massa e estéreo, relaxando rmsbond e rmsangle restrições para 0,01 e 1,0, respectivamente. Continue o refinamento em fatores B individuais, parâmetros TLS e ocupações.

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Representative Results

Clonagem, expressão e purificação do domínio ikk-obrigatório da NEMO.
O protocolo seguiu neste estudo para obter a seqüência final de NEMO-EEAA (Figura 1A), que produziu cristais de qualidade de difração, envolveu a expressão e caracterização de todas as construções intermediárias, incluindo a adição dos adaptadores de bobina enrolada em N- e ou C-terminus, as mutações C76A, C95S e as mutações E56A, E57A. A Figura 1B exibe um gel sds-page de amostras coletadas durante todo o procedimento de purificação, conforme descrito no Esquema na Figura 1C. A proteína é superexpressa em E. coli e aparece como uma faixa aproximadamente no marcador de peso de 14 kDa MW no gel SDS-PAGE (pista 3, células coletadas na colheita e liscadas no amortecedor de amostra laemmli complementada por 8 M urea). A proteína parece pura após a primeira coluna IMAC e exibe um monomer e uma banda de dimer ao nível dos marcadores de 14 e 28 kDa MW no gel SDS-PAGE (pista 9). A clivagem tev está praticamente completa seguindo o protocolo e as proteínas elutes com o fluxo durante a segunda coluna IMAC quase inteiramente como um dimer, no MW esperado (banda abaixo de 28 kDa). Cromatografia de exclusão de tamanho exibe um único pico de tensão entre 60-65 mL e correspondente em nossa experiência ao dimer (Figura 1D). A bobina enrolada dimeric sempre elutes mais cedo do que o esperado na SEC devido à forma alongada da bobina enrolada e, consequentemente, grande raio hidrodinâmico10. NEMO-EEAA em frações do pico da SEC ainda aparece como um monomer e um dimer no gel SDS-Page (pistas 14-15). A utilização de um concentrador de células agitadas é importante para evitar uma possível agregação e precipitação da amostra e precipitação após a concentração.

Cristalização de NEMO-EEAA
Os cristais iniciais foram obtidos a partir de uma tela comercial usando pga (ver tabela de materiais),utilizando 1,65 μg/mL de NEMO-EEAA em 2 mM Tris, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 8.0. A triagem fina produziu cristais em 0,1 M Tris pH 8,9, 5% PGA-LM, 3,6% PEG 20k (Figura 2A),que foram utilizados para produzir um estoque de sementes. Cristais finais foram obtidos com semeadura em 0,1 M Tris pH 8.0, 5,8% PGA-LM, 5,45% PEG 20k (Figura 2B).

Coleta de dados e determinação da estrutura
Cristais NEMO-EEAA sofrem de mosaicidade e anisotropia. Cristais formados no grupo espacial P 1 21 1, com resolução de dados variando no eixo a*, b* e c* (1,88 Å, 2,10 Å e 2,55 Å). Exemplos de perfis de difração estão na Figura 3. Os dados foram adquiridos na linha de luz AMX (17-ID-1) do NSLS II, com um tamanho de feixe de 7 x 5 μm2. O tamanho do pequeno feixe foi essencial para se concentrar na parte desejada do cristal(Figura 2B)e garantir a qualidade dos dados.

O protocolo bem-sucedido para determinação da estrutura requer truncação anisotrópica dos dados usando o servidor STARANISO27 (http://staraniso.globalphasing.org/cgi-bin/staraniso.cgi),seguido pela eliminação da pudez por substituição molecular usando o MRage21 dentro do PHENIX22 e a estrutura do dimeric GCN4 (PDB: 4DMD)15 como modelo de pesquisa. Na solução desta estrutura, a eliminação foi inicialmente tentada rotulando a metionina nativa com o SeMet. O sinal anômalo era muito fraco, provavelmente devido à natureza exposta solvente do Met95 na forma desvinculada de NEMO (SeMet95 foi usado com sucesso para a eliminação da estrutura NEMO / IKKβ9).

A análise inicial dos dados foi tentada com truncation esférica dos dados a 2.3 Å. Esse conjunto de dados não pôde ser faseado com sucesso pela substituição molecular, mas uma solução foi obtida usando MR-ROSETTA25 e a estrutura da NEMO (44-111) em complexo com IKKβ (701-745) como modelo de pesquisa (PDB: 3BRV)9. Este modelo inicial não poderia ser refinado com sucesso. Utilizamos o Servidor de Anisotropia de Difração na UCLA26 para truncar elíptica mente os dados e remover a anisotropia por escala anisotrópica. O conjunto de dados recém-processado pode ser faseado por substituição molecular. Para melhorar ainda mais os dados, empregamos o servidor STARANISO27 para trunciação anisotrópica dos dados e as amplitudes foram corrigidas com um fator de correção anisotrópico com estimativa bayesiana28. Esses dados, resultando em um aumento no número de reflexões únicas para 19.560, foram utilizados para refinamento estrutura. Mapas compostos omitem onde calculados com PHENIX, excluindo 10% dos átomos de cada vez, e comparados com o modelo de estrutura final, para confirmar que a estrutura não era tendenciosa pelo modelo atômico. O modelo cristalográfico está completo, exceto para o primeiro e último resíduos na cadeia A de NEMO-EEAA, para o qual nenhuma densidade de elétrons foi observada.

NEMO-EEAA é uma bobina enrolada homo-dimeric, irregular, paralela de ~175 Å de comprimento. A região regular da bobina enrolada abrange a sequência ideal de adaptação de bobina enrolada no N-terminus (resíduos 20-50) e as duas primeiras heptads da seqüência adequada nemo (resíduos 51-65). Uma bobina enrolada regular também está presente no C-terminus, a partir do resíduo NEMO 97 e abrangendo o adaptador c-terminal ideal de bobinas (Figura 4A). A parte central, abrangendo resíduos NEMO 66-98 exibe distâncias interhelical maiores (espaçamento interhelérico vai de um valor médio de 7,6 Å na estrutura regular bobina enrolada para um máximo de 11,5 Å na região irregular) e interface hidrofóbica descontínua em comparação com uma bobina enrolada ideal. Esta região de NEMO também representa a interface para a ligação IKKβ e sofre uma mudança conformal sobre ligação e ligação. A estrutura ikkβ-bound exibe uma conformação de bobina enrolada mais aberta para acomodar o ligante com maior espaçamento interhelical por 1,0 a 2,2 Å nesta região (Figura 4B)12. Nos resíduos da estrutura do apo Leu93, Met94, Lys96, Phe97 e Arg101 são deslocados para o centro da bobina enrolada para invadir o bolso obrigatório do ligand (a distância de Cα-Cα para Phe97 é mais apertada por 2.9 Å), com o efeito total de fechar a fenda hidrofóbica grande que hospeda o ligand na estrutura IKKβ-limitada.

Figure 1
Figura 1: Purificação de NEMO-EEAA. (A) Alinhamento sequenciado de NEMO do Homo Sapiens, Mus Musculus e Bos Bovis e o engenheiro NEMO-EEAA. A seqüência de adaptadores de bobina enrolada é sublinhada, e as mutações são destacadas em laranja. (B) Gel SDS-PAGE de frações coletadas durante a expressão e purificação (conforme rotulado e referenciado no fluxograma 1C). 10% acrilamida, mes buffer. (C) Um fluxograma para a purificação da NEMO-EEAA. (D) Perfil de exclusão de tamanho indicando o dimer de NEMO-EEAA (azul). Em verde, os marcadores de peso molecular (kDa) são indicados. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2: Morfologia e tamanho dos cristais NEMO-EEAA. (A) Um cristal de NEMO-EEAA da tela matriz esparsa inicial, sem sementes. Este tipo de cristal foi utilizado para semeadura para tentativas de cristalização subsequentes (0,1 M Tris pH 8.0, 5% PGA-LM, 3,6% PEG 20k; com uma solução proteica em 2 mM Tris, 100 mM NaCl 2 mM DTT, pH 8.0). (B) Cristal utilizado para coleta de dados (0,1 M Tris pH 8.0, 5,8% PGA-LM, 5,45% PEG 20k, com uma solução proteica em 2 mM Tris, 100 mM NaCl 2 mM DTT, pH 8.0). A área aproximada usada para coleta de dados é circulada em vermelho. A barra de escala para 100 μm de comprimento é definida na figura. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 3
Figura 3: Dados cristalográficos obtidos a partir de cristais NEMO. (A) Perfil de difração de raios-X do cristal NEMO inicial: estrias alongadas indicam mosaicidade no cristal. (B) Perfil de difração de raios-X de um cristal NEMO-EEAA otimizado. O anel de resolução é desenhado em uma resolução espacial de 2,5 Å. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Estrutura de NEMO desvinculado. (A) O dimer NEMO-EEAA é mostrado como uma fita, azul claro = adaptadores de bobina enrolada, azul = NEMO (51-112). (B) Superposição da estrutura apo NEMO-EEAA (azul, PDB: 6MI3) e NEMO (44-111) da estrutura ligada ao IKKβ (cinza, PDB: 3BRV, IKKβ não é exibida), mostrada como fitas; as estruturas estão alinhadas na cadeia A, região 44-111 apenas. Este número foi modificado a partir da publicação anterior12. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

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Discussion

As tentativas de cristalização do NEMO na forma desvinculada não tiveram sucesso, incluindo tentativas de utilização da proteína de corpo inteiro e várias construções de truncation que abrangem o domínio de ligação ao IKK. Nossa caracterização biofísica do domínio ikk-obrigatório de NEMO (resíduos 44-111) por dicroismo circular, espectroscopia NMR e anisotropia de fluorescência indicou que a construção, embora capaz de ligar IKKβ, existia em um estado de troca conformaçãoal, não é adequado para cristalização9,10. Nossa abordagem envolveu a engenharia de uma construção do domínio ikk-binding da NEMO que adotou uma conformação mais estável, dobrada e nativa, eliminando a flexibilidade que impediu a cristalização. Adaptadores ideais de domínio de bobina enrolada fundidos à sequência N- e C-termini do NEMO (44-111) oferecem a vantagem de estabilizar a dobra de bobina enrolada dimérica do NEMO nativo e facilitar a cristalização14. O comportamento de uma série de construções de proteínas foi monitorado a cada etapa através da SDS-PAGE, cromatografia de exclusão de tamanho, dicroismo circular, anisotropia de fluorescência e espectroscopia nmr, como descrito anteriormente10,12. Apesar da melhoria progressiva em todos os parâmetros desejados nenhuma construção rendeu cristais da qualidade da difração até que as mutações E56A, E57A foram introduzidas. As mutações foram as mutações de maior impacto sugeridas pelo Surface Entropy Reduction Server SERp29 que não envolveu resíduos implicados em pontos quentes de ligação para IKKβ, como na estrutura complexa NEMO /IKKβ. Embora outras construções que estabilizam a estrutura ordenada do domínio ikk-obrigatório da NEMO através da ligação de disulfeto cisteína e ikkβ ligação obrigatória com alta afinidade foram descritos30, o protocolo aqui descrito representa a primeira abordagem bem sucedida para estruturar a determinação do domínio ikk-binding da NEMO na forma desvinculada.

A produção e purificação de proteínas seguiram os procedimentos padrão em nosso laboratório. Após a lyse celular, uma porção considerável da proteína está presente na fração insolúvel, mesmo quando o crescimento das células após a indução a 18 °C, portanto, a proteína foi solubilizada em urea de 8 M após a lyse celular e antes da purificação, e redobrada enquanto ligada ao Coluna IMAC. A lavagem extensiva da proteína ligada coluna, tanto em condições de desestruturação e após redobrar são fundamentais para um produto puro após a primeira etapa de purificação. O puro NEMO-EEAA tem uma tendência maior para precipitar do que as construções anteriores, mas ainda é suficientemente solúvel em condições de cristalização.

Um passo crítico na determinação da estrutura foi o uso da semeade. Em uma abordagem semelhante ao rastreamento da matriz de microsenados 31,sementes de cristal obtidas durante o rastreamento de matriz esparsa foram usadas em uma triagem adicional de condições, seguidas por uma rodada de triagem fina, a fim de determinar as condições finais de cristalização. A maioria dos cristais cultivados nas condições finais exibem alta mosaicidade e não são adequados para coleta de dados. Cristais foram rastreados ao longo de várias visitas à linha de luz e melhor qualidade de dados foi alcançado através da coleta de conjuntos de dados na borda do cristal, onde o mais novo crescimento tinha ocorrido. Como a região que mostrava uniformidade de treliça em imagens polarizadas cruzadas era pequena, foi fundamental ter acesso à linha de luz AMX no NSLS II, devido ao pequeno tamanho do feixe.

Determinamos com sucesso a estrutura da NEMO-EEAA por substituição molecular usando como modelo de pesquisa a estrutura da bobina enrolada dimérica do GCN415,que mapeou os adaptadores ideais de bobina enrolada fundidos no N- e C-termini da seqüência NEMO. A substituição molecular foi bem sucedida, pois os adaptadores GCN4 mantêm sua estrutura nativa quando fundidos à NEMO. Ao mesmo tempo, pudemos verificar se a NEMO mantém sua estrutura nativa como, comparando as porções não envolvidas na ligação do IKK com a região de estrutura correspondente na estrutura complexa NEMO /IKKβ. Como alternativa, poderia ser possível utilizar a estrutura da NEMO no complexo NEMO/IKKβ (PDB: 3BRV)9 como modelo de busca de substituição molecular, com foco no monomer B, que corresponde à cadeia que sofre a menor mudança conformal sobre a ligação da ligand. Esta estratégia mostrou algum sucesso inicial usando o módulo MR-ROSETTA de PHENIX.

Finalmente, foi essencial para uma determinação de estrutura bem-sucedida utilizar todos os dados disponíveis no conjunto de dados, recorrendo a um corte anisotrópico de dados de intensidade fundida, conforme fornecido pelo servidor STARANISO27 ou pelo Servidor de Anisotropia difração na UCLA26.

O papel essencial desempenhado pelo complexo NEMO/IKK na via NF-kB torna-o um alvo desejável para a modulação do caminho para a intervenção terapêutica. Interações proteína-proteína, especialmente quando envolvem uma grande interface de ligação, são desafiadoras para inibir com pequenos peptídeos ou pequenas moléculas, e design inibidor baseado em estrutura pode oferecer uma vantagem significativa. As construções do domínio ikk-binding de NEMO que desenvolvemos superaram os limites do NEMO flexível (44-111) para facilitar a cristalização e a determinação da estrutura. À medida que a construção se cristaliza facilmente na forma desvinculada, vislumbramos que o mesmo protocolo pode ser aplicado com sucesso na cristalização do complexo de NEMO com inibidores de pequenas moléculas, para determinar uma estrutura que forneceria detalhes sobre modos de ligação e permitiria mais melhorias de ligand.

Uma análise da embalagem de cristal nas condições de cristalização alcançadas neste trabalho indica que a cocristalização da ligand pode ser preferida para ligand imersão em cristais de proteína apo. Enquanto a embalagem de cristal fornece algum espaço em torno da cadeia B do dimer (6 a 10 Å para a cadeia mais próxima) e em uma face do site de ligação (aproximadamente 13 Å na região hot-spot entre Phe82-Phe87), o bolso de ligação simétrica é completamente ocluído por cadeias próximas, impedindo a ligação.

Bobinas enroladas estão presentes em uma proporção significativa no proteoma e são essenciais em sua função como espaçadores moleculares, andaimes e na comunicação de mudanças conformacionais16. Apesar de sua abundância e papéis relevantes, existem relativamente poucas estruturas de proteínas de bobina enrolada de corpo inteiro. O uso de adaptadores de bobina enrolada pode auxiliar na estabilização de domínios estruturais de proteínas de bobina enrolada, preservando sua estrutura nativa e ajuda na determinação estrutural e elucidação de sua função.

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Disclosures

Os autores não declaram interesses concorrentes.

Acknowledgments

Agradecemos ao Prof. D. Madden por muitas discussões úteis ao longo deste projeto. Agradecemos ao Prof. D. Bolon pelo dom do plasmídeo contendo a bobina enrolada GCN4 otimizada. Agradecemos ao Dr. B. Guo por plasmids NEMO. Agradecemos christina R. Arnoldy, Tamar Basiashvili e Amy E. Kennedy para demonstrar o procedimento. Agradecemos ao BioMT Crystallography Core Facility e aos departamentos de Química e Biologia Celular em Dartmouth pelo uso do equipamento de cristalografia e do pessoal da BioMT por seu apoio. Esta pesquisa usou a linha de luz AMX do National Synchrotron Light Source II, um Departamento de Energia dos EUA (DOE) Office of Science User Facility operado para o Escritório de Ciência do DOE pelo Laboratório Nacional de Brookhaven o Contrato Nº. DE-SC0012704. Agradecemos ao pessoal da NSLS II pelo seu apoio. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R03AR066130, R01GM133844, R35GM128663 e P20GM113132, e uma subvenção Munck-Pfefferkorn Novel and Interactive.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20% w/v γ-PGA (Na+ form, LM) Molecular Dimensions MD2-100-150 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
3.5 kDa MWCO Dialysis Membrane Spectra/Por 132724 For dialysis removal of imidazole
Amicon Stirred Cell Millipose Sigma UFSC 05001 For protein concentration
Ammonium Chloride Millipore Sigma G8270 For minimal media labeling
Benzonase Nuclease Millipore Sigma 9025-65-4 For digestion of nucleic acid
BL21-CodonPlus (DE3)-RIL Competent Cells Agilent Technologies Model: 230245 TEV expression
CryoPro Hampton Research HR2-073 Cryo-protectants kit
D-Glucose (Dextrose) Millipore Sigma A9434 For minimal media labeling
Difco Terrific Broth ThermoFisher DF043817 For culture growth
Dithiothreitol > 99% Goldbio DTT25 For reduction of disulfides
E. coli: Rosetta 2 (DE3) Novagen 71400-3 Expression of unlabeled NEMO-EEAA
FORMULATOR Formulatrix Liquid handler/ screen builder
HCl – 1.0 M Solution Hampton Research HR2-581 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
HiLoad 16/600 Superdex 75 pg GE Healthcare 28989333 For size exclusion purification
HisTrap HP 5 mL column GE Healthcare 17524802 For purification of His-tagged NEMO-EEAA
HT 96 MIDAS Molecular Dimensions MD1-59 For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
HT 96 Morpheous Molecular Dimensions MD1-46 For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
Imidazole ThermoFisher 288-32-4 For elution from His-trap column
Isopropyl-beta-D-thiogalactoside Goldbio I2481C5 For induction of cultures
MRC2 crystallization plate Hampton Research HR3-083 Crystallization plate
NT8 - Drop Setter Formulatrix Crystallization
pET-16b Millipore Sigma 69662 For cloning of NEMO-EEAA
pET-45b Millipore Sigma 71327 For cloning of NEMO-EEAA
Phenylmethylsulfonyl fluoride ThermoFisher 36978 For inhibition of proteases
Polycarbonate Bottle for use in Ultracentrifuge Rotor Type 45 Ti Beckmann Coulter 339160 Ultracentrifuge bottle
Polyethylene Glycol 20,000 Hampton Research HR2-609 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
pRK793 (TEV) Addgene Plasmid 8827 For TEV production
QuikChange XL II Agilent Technologies 200522 Site directed mutagenesis
Required Cap Assembly: Beckmann Coulter 355623 Ultracenttrifuge bottle cap
ROCK IMAGER Formulatrix Crystallization Imager
Seed Bead Kit Hampton Research HR2-320 Seed generation
Sodium Chloride ≥ 99% Millipore Sigma S9888 For buffering of purification solutions
TCEP (Tris (2-Carboxyethyl) phosphine Hydrochloride) Goldbio TCEP1 Reducing agent
The Berkeley Screen Rigaku MD15-Berekely For sparse matrix screening of NEMO-EEAA
The PGA Screen Molecular Dimensions MD1-50 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Tris – 1.0 M Solution Hampton Research HR2-589 For fine screen crystallization of NEMO-EEAA
Ultrapure Tris Buffer (powder format) Thermofisher 15504020 For buffering of purification solutions
Urea ThermoFisher 29700 For denaturation of NEMO-EEAA

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