Summary
Presenteras här är ett protokoll för tillverkning av ett implanterbart system för in vivo kronologisk registrering av framkallat och spontana elektromyografiska potentialer. Systemet tillämpas på undersökningen av reinnervation av laryngeal muskler efter nervskada.
Abstract
Elektromyografi (EMG) mäter muskelresponsen på elektrisk stimulering eller spontan aktivitet hos motorenheter och spelar en viktig roll vid bedömningen av neuromuskulär funktion. Kronisk inspelning av EMG aktivitet återspeglar en muskel reinnervation status efter nervskada har begränsats, på grund av den invasiva karaktären av traditionella EMG inspelningstekniker. I detta avseende är ett implanterbart system utformat för långsiktig, in vivo EMG-registrering och nervstimulering. Det har tillämpats och testats i en studie om reinnervation av laryngeal muskler. Detta system består av 1) två bipolära elektrodnervmanschetter och leder för att stimulera var och en av två nerver: den återkommande laryngeal nerv (RLN) och inre gren av den överlägsna laryngeal nerv (SLN); 2) två EMG inspelning elektroder och leder för var och en av de två laryngeal muskler: bakre cricoarytenoid (PCA) muskel och thyroarytenoid-laterala cricoarytenoid (TA-LCA) muskelkomplex; och 3) ett huduttag som samverkar alla implanterade blyterminaler till en extern förförstärkare och stimulator med hjälp av en anslutningskabel. Trådledningarna är Teflon-belagda, multi-filament, typ 316 rostfritt stål. De lindas och kan sträcka under kroppens rörelse av det vakna djuret för att förhindra blybrytning och elektrodmigration. Detta system implanteras under en aseptisk operation. Därefter utförs EMG-inspelningar vid baslinjen innan RLN transekteras vid den andra operationen för att studera muskelåternervation. Under hela studien utförs flera fysiologiska sessioner i det sövda djuret för att erhålla framkallad och spontan EMG-aktivitet som återspeglar reinnervation status laryngeal muskler. Systemet är kompakt, utan infektion under studiens gång och mycket hållbart. Detta implanterbara system kan ge en tillförlitlig plattform för forskning där långsiktig registrering eller nervstimulering krävs i ett sövt eller fritt rörligt djur.
Introduction
EMG-inspelning är en användbar teknik för att mäta elektrisk aktivitet som produceras av en skelettmuskulatur när den aktiveras genom elektrisk stimulering av dess nerv eller spontan bränning av dess motorenheter. Övervakning av EMG-signaler kan användas för bedömning av neuromuskulär transmission och muskelbiomekanik1. EMG-inspelning spelar också en viktig roll i karakteriseringen av kvaliteten och omfattningen av muskelåterventering efter nervskada2,,3,,4,5. Flera EMG-inspelningar under hela perioden av återinsättning kan dock inte uppnås genom en invasiv metod. Därför har implanterbara enheter utformats och utvecklats för upprepad, kronisk stimulering och registrering i neuromuskulära system6,,7,,8,9,10,11,12,13. Syftet med detta dokument är att beskriva ett protokoll för tillverkning och implantation av ett stabilt system för att erhålla tillförlitliga kronologiska EMG-data från struphuvudet.
Detta system tillämpas här på studiet av laryngeal muskel reinnervation. En kort översikt över struphuvudet ges för orientering (figur 1). En exakt samordning mellan sensoriska och motoriska komponenter är avgörande för korrekt muskelrörelse under andning, fakturering och luftvägsskydd. PCA muskeln, som ligger i den bakre struphuvudet, är den enda kidnappare av stämbanden. Denna muskel aktiveras spontant under inspiration för att öka glottal område för inandning. TA-LCA-komplexet är den stora adductor av vocal fold. Aktivering av denna muskel komplex tillsammans med en annan adductor (dvs. interarytenoid muskeln) medialize luckan för vibrationer och ljudproduktion och stänga luckan för luftvägarna skydd under sväljning.
Dessutom, motor neuron fibrer innervate både kidnappare och adductor muskler i RLN. Kidnappar- och adductormusklerna kan urskiljas baserat på motorenhetens sammansättning14,15. PCA muskeln uppvisar ökad bränning under hypercapnic och/eller hypoxic villkor16 på grund av förekomsten av inandningsledning motorenheter. Däremot reflex glottic stängning (RGC) motorenheter, som stänger glottis reflexively genom aktivering av sensoriska receptorer inom laryngeal slemhinnan, finns i TA-LCA muskelkomplex. Den inre grenen av den överlägsna struphuvudet nerv (SLN) bär afferent fibrer av sensoriska receptorer i struphuvudet17. Även om fakturering är främst en adductor funktion, både kidnappare och adductor motorenheter är inblandade i denna högt utvecklade laryngeal beteende.
Figur 1: Struphuvudets anatomi. Komponenterna i detta implanterbara system visas också. SLN = överlägsen laryngeal nerv; RLN = återkommande laryngeal nerv; PCA = bakre cricoarytenoid muskel; TA-LCA = thyroarytenoid-laterala cricoarytenoid muskelkomplex; DBS = djup hjärnstimulering. Denna siffra har reproducerats med tillstånd från Wiley27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Skada på RLN kan resultera i vocal fold förlamning (VFP), vilket äventyrar både bortförande och adducting funktioner på grund av laryngeal muskel denervation14,18,19. Därefter uppstår regenerering av RLN nervfibrer och reinnervation av muskler ofta. Dock är reinnervation en slumpmässig process och resulterar i missriktad, olämplig muskel återanslutning i de flesta fall. Detta kallas synkinesis, där spontan aktivering av kidnappare och adductor antagonister är felaktig och producerar ineffektiva eller till och med paradoxala rörelse av vokala veck14,19,20,21. Med synkinesis är den kritiska funktionen som går förlorad vocal fold abduction, vilket resulterar i otillräcklig ventilation. Även om det pågår försök att behandla laryngeal synkinesi genom att antingen 1) blockera glottic stängning med Botox22,23 eller 2) elektriskt stimulera den glottiska öppningen med en implanterbar pacemaker24,25, det finns ingen klinisk intervention som tillförlitligt förhindrar synkinesis26. Det finns dock bevis för att elektrisk konditionering av PCA muskeln under reinnervation vid en låg frekvens främjar lämpliga neuromuskulära återanslutning och minimerar synkinesi från att hända. Studier pågår för närvarande för att klargöra de underliggande mekanismerna2.
Fokus för detta dokument är att beskriva ett enkelt och billigt implanterbart system för kronisk nervstimulering och EMG-inspelning. Detta system kan användas för att undersöka effekterna av lågfrekvent elektrisk konditionering av PCA muskeln på specificiteten i dess efterföljande reinnervation. EMG-signaler som erhålls genom detta system kan återspegla kvaliteten och kvantiteten av laryngeal muskel reinnervation över tiden.
Protocol
Denna studie har godkänts av institutionella djurvård och användning kommittén (IACUC) av Vanderbilt University och genomfördes i enlighet med Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Detta system innehåller fem implanterbara komponenter och en extern kabel.
1. Två bipolära RLN Stimulus Elektrod manschetter, var och en med par lindade blytrådar och terminalstift
- Använd Teflon-belagda, multi-filament, typ 316 rostfritt stål tråd (med isolerad diameter på 0,0078 " eller 0,198 mm) för varje manschetten blytråd. Skär en 70 cm lång tråd och linda den i en 12 cm lång fjäder med hjälp av en spoleing enhet eller skaffa prefabricerade lindade ledningar. Om det behövs, sträck fjädern för att öka dess längd för varje implantatställe. Lämna ändarna på de lindade ledningarna rakt på 3 mm och 10 mm längder och deinsulate dem.
- Löda en guldpläterad koppar hona stift på 3 mm änden av den lindade ledningen.
- För att förbereda nervmanschetten, skär ett 5 mm segment av silikonröret (OD = 0,156", ID = 0,094"; eller OD = 3,96 mm, ID = 2,39 mm) från en rulle av slangen.
- För att sätta in en ledning i röret, använd en 25 G hypodermisk nål för att tränga igenom slangväggen 1,5 mm från änden och från-mitten nära innerväggen. Fyll på 10 mm änden av ledningen i nålens spets. Dra ut nålen för att deponera den avinsulated delen i röret. Böj tillbaka den nakna trådänden utanför röret och vrid på ledningen vid dess ingångspunkt i röret.
OBS: Använd ett fungerande mikroskop för att utföra dessa steg. En sond kan placeras i röret för att böja tråden mot innerväggen. Målet är att placera den nakna delen av tråden så att stimuli kan levereras till nerven utan att riskera mekaniska skador på nerven. - För in den andra ledningen 1,5 mm från rörets motsatta ände med samma procedur. Justera ingångspunkten till den första leadet. Pierce väggen med nålen så att den nakna delen av tråden deponeras nära den inre väggen mittemot den första ledningen.
OBS: Tittar ner i röret, bör de två stimulus elektroderna bilda en 45 ° "V" form, som kommer att grensla nerven en gång på plats och säkerställa nuvarande leverans genom nerven från anod till katod. - Gör en S-formad slits i rörväggen mittemot elektrodpunkterna med hjälp av ett par böjda saxar.
OBS: Manschettens spiralläppar kan sedan öppnas för att placera nerven inuti mellan elektroderna under operationen. - Sätt in en längd av 6-0 monofilament, nonabsorbable sutur i manschetten väggen i varje ände med hjälp av en böjd mikrokirurgisk nål för eventuella securement av manschetten runt nerven.
- Applicera medicinsk kvalitet typ-A silikon gel för att tömma alla exponerade bar tråd utanför manschetten.
2. Två bipolära SLN Stimulus Elektrod manschetter, var och en med par lindade blytrådar och terminalstift
- Montera SLN stimulus elektrod manschetten på samma sätt som RLN stimulus elektrod manschetten. Använd dock det mindre diameterröret (OD = 0,125", ID = 0,062"; eller OD = 3,18 mm, ID = 1,57 mm) rör, eftersom nerven är mindre i diameter.
3. Två PCA muskel EMG inspelning elektroder, var och en med Lindad blytråd och terminal stift
- Montera en lindad ledning för PCA muskelelektroden som görs i steg 1.1.
- Löda en hona stift på ledningen som görs i steg 1.2.
- För in 10 mm änden av PCA-muskelledningen i spetsen på en djup hjärnstimuleringselektrod (DBS) med samma strategi för nålledsinföring i en manschett (steg 1.4). Böj änden av ledningen för att bilda en krok och klipp den för att ge totalt 5 mm inspelningslängd.
OBS: I denna ansökan är PCA muskeln och dess reinnervating nerv terminaler utsätts för elektrisk konditionering. Stimuli genereras av en implanterbar pulsgenerator (IPG) och levereras till laryngealmuskeln genom en DBS-elektrod (figur 1, infälld). Detta system är anpassat från terapeutisk hjärnstimulering (t.ex. Parkinsons sjukdom). DBS-elektroden kommer att sättas in i en submuskulär ficka och förankras på plats. Om teknik för elektrisk konditionering av muskeln inte krävs, pca EMG elektrod kan införas direkt i muskeln och förankras med sin krok.
4. Två TA-LCA Muscle Complex EMG Inspelning elektroder, var och en med lindad blytråd och terminal stift
- Montera en lindad ledning för TA-LCA muskelelektroden som görs i steg 1.1.
- Löda en hona stift på ledningen som görs i steg 1.2.
- Punktskatt en 5 mm x 10 mm rektangulär bit av stickad polyester transplantat. Gör ett hål i mitten av nätet med en 20 G hypodermisk nål. Sätt in 10 mm änden av sladden i hålet med ytterligare 3 mm spole som sticker ut utanför hålet. Fäst ledningen på nätet med 6-0 monofilament, ickeabsorberbar sutur.
OBS: Denna bit av mesh kommer att användas för att förankra elektroden leda till sköldkörteln brosk överliggande muskelkomplex. - Böj änden av ledningen för att bilda en krok och klipp den för att ge totalt 5 mm inspelningslängd.
5. Hudbehållare för gränssnitt mellan elektroder och extern utrustning
- Använd en enda rad kvinnlig stift rand kontakt för att göra kärlet. Skär två delar (vardera 17,5 mm långa) från remsan, var och en innehållande åtta stiftshål. Först rugpa de yttre ytorna på varje bit med sandpapper, limma dem sedan tillsammans med fenol i en rökhuva för att göra en dubbelradskontakt. Placera kontakten i 60–80 °C vatten i en rökhuva i 30 min för att möjliggöra limhärdning.
OBS: Detta dubbelradiga monteringsformat ger bekvämlighet i tilldelningen av hål för vänster- kontra högerlektroder. - Skär en 25,6 mm längd bit från remsan för att göra kontaktens frontplåt (den del som kommer att sticka ut utanför implantatet plats för hud förankring). Skär ett rektangulärt hål på 5,4 × 17,4 mm i mitten av frontplattan med en skalpell.
- Placera dubbelradskontakten inuti den rektangulära hålet på frontplattan tills den är spolad med ytan utan utsprång. Om kontakten inte passar in i den rektangulära hålet på frontplattan kan hålet förstoras något med en fil. Eftersom kontakthålen inte är symmetriska sätter du in kopplingskanten med hålen med större diameter i frontplattan.
OBS: Som ett resultat, en kvinnlig stift införas i den motsatta kanten av kontakten med mindre diameter hålet kommer att knäppa och låsa på plats. - Använd fenol för att limma ihop kontakten och frontplattan. Placera enheten i 60–80 °C vatten i en rökhuva i 30 min för att möjliggöra limhärdning.
- Borra ett 1,3 mm hål i varje hörn av frontplattan och på varje sida av frontplattan halvvägs från ändarna för totalt sex hål.
OBS: Dessa hål kommer att användas för att suturera det slutliga hudbehållaren vid implantatstället. - Skär ett 15 mm långt rör av stickat polyestertransplantat för att omge enheten under frontplattan, vilket gör monteringen biokompatibel. För att fästa röret på monteringen, använd en hypodermisk nål för att gänga rostfria trådar genom väggen i tre lika placerade lägen (vardera 3,8 mm från varandra) längs dess längd.
- Placera lika fördelade skåror i varje hörn av kontakten för att förankra kablarna mot monteringsytan. Vrid ändarna på varje tråd med ett par tång för att cinch röret till församlingen för att bilda en kjol.
- Gör ett permanent märke på polyesterplåstret i ena änden av kärlet.
OBS: Använd detta märke för orientering för att identifiera den rostrala änden av kärlet under implantatkirurgi. I rostral till caudal riktning bör följande stiftelektrodtilldelning för var och en av de två raderna (vänster sida och höger sida) vara följande: PCA EMG, TA-LCA EMG, tomt hål, tomt hål, RLN-anod, RLN katod, SLN-anod och SLN-katod.
6. Extern anslutningskabel till inspelning förförstärkare och stimulator
OBS: En kabel används för att göra anslutningar mellan det implanterade hudbehållaren och extern utrustning under nervstimulering-EMG-inspelningssessioner (avsnitten 8 och 10). Den består av 12 isolerade trådar som avslutas med manliga stift för att sätta in i kvinnliga stift i hudbehållaren. Denna kabel består av två delar: en EMG inspelning plugg och nerv stimulering trådar. En inspelningsplugg är nödvändig för att isolera emg-signaler med låg spänning från högre spänningsstimulansartefakter som strålar ut från stimulansstift. Av samma anledning lämnas två hål i varje rad i hudbehållaren obebodda för att separera inspelningsstift från stimuleringsstift.
- För att göra EMG-inspelningspluggen, använd en hankbandskontakt (samma längd och bredd, men hälften av höjden på en honkontakt). Skär den i två bitar, var och en innehåller endast två hål. Fäst de två delarna med fenollim med samma metod för att göra dubbelradskontakten i hudbehållaren (steg 5.1). Ta de fyra EMG-inspelningstrådarna i kabeln och sätt in deras terminalhannestift i vart och ett av de fyra hålen tills de låser sig på plats med spetsarna utskjutande utanför remsans kant.
- Använd bencement för att täta toppen av kontakten för att isolera trådstiftskorsningar.
- Använd de återstående åtta trådarna i kabeln som slutar i manliga stift för att göra individuella anslutningar till nervstimuleringsmanschetterna via sina kvinnliga stift.
7. Första implantatkirurgi
- Skaffa en 1–2-åring, 20–25 kg hund av båda könen från en licensierad gård. Acklimatisera djuret innan aseptisk implantatkirurgi. Autoklav all utrustning före operationen. Undanhålla mat i 10–12 timmar före operationen.
- Förbered djuret för operation.
- Raka djurets huvud och hals och rengör huden med alkohol- och betadinskrubblösning. Söva djuret genom intravenös injektion av 2-4 mg/kg tiletamine och zolazepam kombination, följt av 3% isofluran i syre genom intubation.
- Placera djuret på ett operationsbord med en värmedyna i ryggläge och kirurgiskt drapera djuret. Övervaka djurets hjärtfrekvens, andningsfrekvens, kroppstemperatur och syremättnad minst var 15:e minut under hela operationen för att säkerställa fysiologisk stabilitet vid ett måttligt plan av anestesi.
- Gör ett mittlinje hals snitt från sköldkörteln hack till manubrium. Dissekera luftstrupen fri från matstrupen och exponera sämre gränsen av cricoid brosk.
- Placera stimulusmanschetten på var och en av de bilaterala SLV:erna och RLNs. Stäng läpparna på varje manschett med hjälp av de medföljande suturer.
- Gör ett broskfönster med en biopsi punch (4 mm i diameter) på den främre ytan av sköldkörtelbrosket på varje sida. Exponera de laterala aspekterna av både TA-LCA muskelkomplex. För in EMG-inspelningseltroderna i TA-LCA-muskelkomplexen med hjälp av en 23 G-nål genom att föra in taggen i nålens spets. Sutur elektrod polyester plåstret på brosk.
- Placera DBS-elektroden tillsammans med dess följeslagare hook-wire EMG inspelning elektrod under PCA muskeln på varje sida. Använd ett endoskop för att bekräfta att stimulering ger vocal fold bortförande för varje kanal. Förankra DBS-elektroderna till cricoidbrosket med 4-0 icke-oabsorberbara suturer.
- Sätt in alla trådledningar på nervstimulering-EMG-inspelningselektroder i kärlet via sina kvinnliga stift. Tryck stiften i hål med ett insättningsverktyg som är format från en hemostat. Täta behållarens underlägsna yta för att isolera blystiftskorsningar med bencement.
- Efter cementhärdar, placera kärlet i rostral änden av mittlinjen snittet genom huden och sutur det till subkutan vävnader via sin polyester kjol. Fäst hudkanten på kärlet genom suturer som passerar genom hålen i frontplattan.
OBS: En käke av hemostat har en slutslits som leder till en counter-sink hål. Kabeln kan placeras genom slitsen i hålet och förbänken placeras mot stiftets huvud. Den andra käken placeras på den motsatta sidan av kärlet. Klämma hemostat pressar stiftet i sina respektive kärl hål.
- Efter cementhärdar, placera kärlet i rostral änden av mittlinjen snittet genom huden och sutur det till subkutan vävnader via sin polyester kjol. Fäst hudkanten på kärlet genom suturer som passerar genom hålen i frontplattan.
- Gör ett snitt på vänster hals för att exponera trapezius muskeln. Utför dissekering för att göra en submuskulär ficka för placering av den implanterbara pulsgeneratorn. Tunnel varje DBS bly subkutant till halsen snittet för införande i IPG.
- Stäng alla kirurgiska sår med suturer. Övervaka djuret noga tills full återhämtning från operationen.
- Ge postoperativa analgetika (t.ex. buprenorfin: 0,01–0,02 mg/kg) rutinmässigt i upp till 48 timmar. Hus djuret sjungande därefter för hela studien, och begränsa motion under en period av 10 dagar för att möjliggöra normal sårläkning och stabilisering av den implanterade enheten.
OBS: Hudbehållaren ska rengöras dagligen med vävnadskompatibel antiseptisk lösning. Dessutom bör dummy manliga stift införas i de kvinnliga stiften i hudbehållaren rutinmässigt utom under EMG-inspelningssessionerna. Denna manöver kommer att undvika ansamling av skräp i kärlet, tillåta effektiva anslutningar som ska göras med den externa kabeln, och förhindra infektion.
8. Nervstimulering-EMG Inspelning Sessioner vid baslinjen
OBS: Utför dessa sessioner 2x–3x efter implantatkirurgi (avsnitt 7) och före nervtranssektionskirurgi (avsnitt 9) för att erhålla EMG-signaler vid baslinjen när de bilaterala RLNs är intakta. Tillämpa följande protokoll under en standard nervstimulering-EMG inspelningssession (avsnitten 8 och 10).
- Håll inne mat före ingreppet för 10–12 h. Bedöva djuret med tiletamine och zolazepamkombination (initial laddningsdos 2–4 mg/kg genom intravenös injektion och behåll sedan med 0,4 mg/kg per timme via en i.v. linje). Placera djuret på en värmedyna i ryggläge och underhåll djuret i ett måttligt plan av anestesi. Övervaka djurets vitalitet under förfarandet enligt beskrivningen i steg 7.2.
- Sätt in ett nollgradigt styvt endoskop med en ansluten CCD-videokamera genom ett laryngoskop för att visualisera vokalveckrörelse i glottis-nivån.
- Koppla ihop den externa kabeln som ansluts till labbstimulatorn och EMG-förförstärkaren till hudbehållaren via pluggen och stiften. Anslut utgångarna från förförstärkare till en datainsamlingsenhet och/eller ett oscilloskop för att visa, registrera och mäta EMG-signaler.
- Leverera stimuli (enda kvadratiska våg pulser, 0,1-0,5 ms varaktighet, 0,5-2,0 mA amplitud) till vänster och höger RLNs, respektive, att spela in framkallat EMG svar från bilaterala TA-LCA komplex och PCA muskler under varje villkor.
- Leverera stimuli (en kvadratiska våg pulser, 0,1-0,5 ms varaktighet, 0,5-2,0 mA amplitud) till vänster och höger SLN, respektive, att spela in framkallat EMG svar från bilaterala TA-LCA komplex och PCA muskler under varje villkor.
- Leverera CO2 blandas med rumsluft genom munnen på djuret för att inducera hyperkapni och öka djurets andningsansträngning. Begränsa exponeringen till 1 min, under vilken den maximala inandningsmotorenheten rekrytering kommer att ske. Registrera spontana EMG verksamhet TA-LCA komplex och PCA muskler under denna hyperkapnic villkor.
- Övervaka djuret tills den återhämtar sig helt från anestesi och återlämna djuret till anläggningen.
9. Andra kirurgi för nervtranssektion och annastomos
- Utför den andra operationen 10–14 dagar efter den första operationen. Undanhålla mat i 10–12 timmar före operation.
- Söva djuret, drapera och övervaka vitala intraoperatively med hjälp av den teknik som beskrivs i steg 7.2.
- Ta bort suturer och öppna mittlinjen snittet genom trubbig dissekering när det är möjligt. Undvik skador på den tidigare implantationen under dissekeringen. Exponera de bilaterala RLNs genom dissekering. Isolera, transect och annastomose varje nerv med 7-0 monofilament, nonabsorbable suturer att inducera bilaterala laryngeal förlamning.
- Skölj halsen snittet med steril saltlösning och gentamycin antibiotikum. Stäng muskel- och subkutanvävnader med 3-0 absorberbara suturer. Stäng huden med 3-0 nonabsorbable monofilament suturer.
- Noga övervaka djuret tills full återhämtning från kirurgi.
- Ge smärtstillande medel (t.ex. buprenorfin: 0,01–0,02 mg/kg) rutinmässigt i upp till 48 timmar postoperativt. Ge antibiotika (t.ex. cefpodoxime: 10 mg/kg) oralt till djuret i minst 3 dagar. Begränsa djuret från motion under en period av 10 dagar för att möjliggöra normal sårläkning.
10. Nerv stimulering-EMG Inspelning Sessioner efter bilaterala RLN skador
- Utför dessa sessioner 1x per vecka under de första 3 månaderna, sedan varannan vecka därefter. Följ protokollet som beskrivs i avsnitt 8 för dessa sessioner.
Representative Results
Exempel på komponenter visas i figur 2. Från vänster till höger i figur 2A är nervstimulansmanschetten, TA-LCA-inspelningselektroden, PCA-inspelningselektroden och hudgränssnittsbehållaren. Den relativa storleken på dessa komponenter kan uppskattas. Hudbehållaren (figur 2B) har två rader med hål i vilka honstiften i slutet av varje lindad tråd (figur 2D) sätts in. De sätts in mittemot frontplattan (pilen) under implantationsoperationen. Kärlet har en polyesterkjol (figur 2C) fäst vid kontakt sidoväggarna. Denna kjol är utformad för att förankra kärlet på plats genom bindväv infiltration. Varje Teflon-belagda EMG-bly i rostfritt stål (figur 2E) avaktiveras (5 mm) på spetsen för att bilda en krokformad elektrod för muskelregistrering. Stimuleringsmanschetten har två elektroder gängade mot innermanschettväggen. De är åtskilda med ett avstånd av 2 mm (figur 2F) och bildar en "V" form (figur 2G) för att säkerställa strömtillförsel över nerven.
Figur 2: Komponenter i implantatsystemet. (A) Från vänster till höger är nervstimulans manschetten, TA-LCA inspelning elektrod, PCA inspelning elektrod, och hud gränssnitt kärl, respektive. (B)Hudbehållaren som visar två rader med hål. (C)Kärlet som visar en polyesterkjol fäst vid kontaktkanterna. D)Lindadtråd som innehåller honstift som skall föras in i B.(E)Teflonbelagd EMG-bly av rostfritt stål avtar (5 mm) på spetsen för att bilda en krokformad elektrod för muskelregistrering. F)Stimuleringsmanschetten har två elektroder gängade mot innermanschettväggen, som är åtskilda av 2 mm. (G)"V" formbildning av elektroder för att säkerställa strömtillförsel över nerven. Denna siffra har ändrats med tillstånd27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 visar det implanterade hudbehållaren och hur kabeln från extern utrustning är gränssnitt till kärlen. Det bör noteras att dummy manliga stift (visas inte) sätts in i de kvinnliga stiften i kärlet för att hålla dem fria från skräp mellan inspelning sessioner.
Bild 3: Hudbehållare och gränssnittskabel. (A)Det implanterade hudkärlet på den främre halsen utan dummy manliga stift visas. (B) Bilden visar hur stimulansstift och EMG-inspelningsplugg (pil) på kabeln från extern utrustning är gränssnitt till kärlet under en nervstimulering-EMG-inspelningssession. Denna siffra har ändrats med tillstånd27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 visar en EMG-inspelning från en av baslinjesessionerna med RLNs intakta.
Figur 4: EMG-inspelningar från laryngealmuskler med normal innervation. (A)Exempel inspelning från PCA muskeln där RLN stimulering ger en stimulans artefakt (pil) följt av en stor framkallad EMG potential. (B)Exempel inspelning av TA-LCA muskelkomplex, där SLN stimulering ger en stimulans artefakt (pil). Representeras här är (a) en kort latens monosynaptiska muskel svar och (b) en längre latens polysynaptic RGC svar. (C)Skurar (pilar) av spontan EMG-aktivitet som registrerats från PCA-muskeln under normala inspirationskällor. D)Ökning av inandnings-EMG-aktivitet under co2-leveransen. Denna siffra har ändrats med tillstånd27. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
I en inspelning från PCA muskeln (Figur 4A), RLN stimulering ger en stimulans artefakt (pil) följt av en stor framkallat EMG potential. De maximala RLN-framkallade svaren ger ett bra index över den totala storleken på normal innervation samt nivån av reinnervation efter efterföljande neurorrhaphy, oavsett motorenhet typ. Detta beror på att RLN innehåller nervfibrer av både inandnings- och reflexglädje (RGC) motorenheter. RLN stimulation rekryterar båda typerna av enheter. Framkallad EMG motorenhet aktivitet rättas och integreras under en 20 ms tidsperiod för att få ett kvantitativt mått på muskel innervation.
I en inspelning från TA-LCA muskelkomplex (Figur 4B), SLN stimulering ger en stimulans artefakt (pil). Denna artefakt följs av en kort latens monosynaptisk muskel svar (a) och längre latens polysynaptic RGC svar (b). Potentialen (a) är ett direkt svar från cricothyroid muskeln, eftersom denna muskel är innervated av den närliggande yttre grenen av SLN. Herrelösa aktivering av denna gren sker ofta under nerv manschetten stimulering av den inre grenen för att aktivera RGC svar. Cricothyroid potential registreras av TA-LCA elektroden, eftersom denna muskel ligger nära komplexet. Tidigare studier har visat att den cricothyroid potential framkallas av inre gren stimulering kan selektivt avskaffas genom att dela upp den yttre grenen av SLN (Zealear, opublicerade observationer). De maximala SLN-framkallade EMG-svaren återspeglar omfattningen av den naturliga innervationen av TA-LCA-komplexet genom dess RGC-sensoriska motoriska väg. Före RLN neurorrhaphy, det finns ingen RGC innervation av PCA muskeln, så ingen SLN potential bör detekteras från denna muskel. Efter nerv transection och reparation, SLN-framkallat potentialer återspeglar mängden korrekt RGC reinnervation av TA-LCA komplexa och felaktiga RGC reinnervation av PCA muskeln. RGC-aktivitet kvantifieras genom rättelse och integration under en 20 ms tidsperiod för att fånga hela RGC-vågformen.
I (Figur 4C), skurar (pilar) av spontan EMG-aktivitet registreras från PCA muskeln under normala inspirationskällor. Denna inandnings-EMG-aktivitet ökar under CO2-leverans, vilket visas i (figur 4D) med en långsammare svephastighet. Spontana PCA EMG verksamhet ger en bra uppskattning av omfattningen av normala innervation av denna muskel genom sin ursprungliga inandning motoneurons. Det finns ingen inandning av TA-LCA-komplexet, så inga inandningspotentialer bör detekteras från dessa muskler. Detta beror på att endast inandningsmotorenheter är inblandade i att föra bort stämvikten vid maximal inandningsinsats i det sövda djuret. Efter nerv transection och reparation, spontana inandningspotentialer återspeglar omfattningen av korrekt reinnervation av PCA muskeln och omfattningen av felaktiga reinnervation av TA-LCA komplexa. Inspelningar av inandnings-EMG-aktivitet förstärks, rättas och integreras under en 8-längre tidsperiod.
Discussion
Detta dokument beskriver de steg som krävs vid tillverkning av en ny, ekonomisk och implanterbara system för stimulering av laryngeal nerver och registrering av EMG svar från laryngeal muskler på lång sikt. Protokollet är okomplicerat och kan producera ett implantat som är kompakt nog att användas i ett djur så litet som en råtta. Det finns flera kritiska steg som bör betonas. Först bör blyledningar lindas noggrant och jämnt för att förhindra bly avisolering, kinking eller brott. Om det inte finns någon spolemaskin kan prefabricerade lindade ledningar erhållas kommersiellt. För det andra är strategin att sätta in blytrådar i ett silikonrör för att bilda ett "V" som sträcker sig över nerven avgörande för att främja nuvarande leverans genom nerven inuti manschetten. Om båda ledningarna placeras på samma sida av röret, kan växling av ström mellan elektroderna uppstå. Det är också viktigt att ledningarna är placerade mot rörets innervägg för att undvika risken för skiva skada på nerven.
För det tredje, under implantation kirurgi, laryngeal nerver bör dissekeras noggrant för att förhindra skador. I det senare skedet av implantationen, när du sätter in stiften i kärlet, bör kraft appliceras på stiftet i linje med hålet för att förhindra plötslig böjning av stiftets huvud. Därefter bör bencement fördelas noggrant på kärlets botten för fullständig isolering och förebyggande av överhörning mellan kanaler. Slutligen är förebyggande av infektion avgörande för att säkerställa implantatsystemets integritet över tiden. Det kan uppnås genom en kombination av flera manövrar: tillägg av en kjol till kärlet, administrering av antibiotika, daglig rengöring av såret och kärlet med vävnadskompatibla antiseptisk lösning, och placering av dummy manliga stift i kärlets kvinnliga stift för att hålla dem rena från skräp mellan sessionerna.
Protokollet har visat sig vara framgångsrikt i denna hund laryngeal modell. Vissa ändringar eller alternativa strategier kan dock övervägas för andra tillämpningar. Till exempel är de avinsulerade avkänningstipsen på PCA- och TA-LCA EMG-elektroderna förankrade i musklerna med ett externt medel, antingen polyestertransplantatet eller DBS-elektroden. I ett program där extern förankring inte behövs eller utförs, kan taggningen av elektroden ensam fungera som ankare. I ett sådant fall kan Teflon-belagda, rostfritt stål, monofilamenttråd vara att föredra framför multifilamenttråd med tanke på dess större draghållfasthet, vilket ger en hulling som är mer stabil i vävnad. Det bör dock noteras att multifilament trådar kan vara mindre benägna att bryta. En alternativ strategi för tillverkning och montering av hudbehållaren är att 3D-printa med hjälp av biokompatibla polymerer (t.ex. Detta kan förenkla tillverkningsprocessen.
Efter implantationskirurgi och återhämtning av djuret utförs fysiologiska sessioner med RLNs fortfarande intakt för att erhålla baslinjedata. Under en session kan frånvaro av EMG-signaler från en laryngealmuskel uppstå efter RLN-stimulering. För att felsöka orsaken (tabell 1) bör det först avgöras om det finns en sångviksrörelse. Om det är närvarande, innebär detta att nerven effektivt aktiveras av manschetten, men det finns ett problem med EMG-ledningen. I denna situation bör användarna titta vidare på EMG stimulans artefakt. Om EMG-artefakten saknas, finns det sannolikt en diskontinuitet i EMG-indata till förförstärkaren. Sextio-cykel buller kommer också att vara närvarande och stor i amplitud. Om artefakten är stor, kan växling från en stimulans stift till inspelningen stift vara ansvarig för mätta kanalen förförstärkare och utplåna EMG svar. Om artefakten är normal, då EMG-ledningen har sannolikt ur led från muskeln och kan inte upptäcka dess aktivitet. Å andra sidan, om den vokala vikningsrörelsen är frånvarande, aktiveras inte nerven. Om artefakten är frånvarande, kan det finnas en diskontinuitet i stimulering kretsen, förhindra nervaktivering. Om artefakten verkar normal, kan nerven ha skadats under implantatkirurgi eller manschetten kan ha migrerat från nerven. En liknande strategi kan användas för att felsöka orsaken till frånvarande EMG-signaler under SLN-stimulering.
| Stimulerad nerv | Målmuskler | Ipsilateral vocal fold rörelse | Stimulus artefakt | Orsakar |
| Rln | Partnerskaps- och samarbets- och/eller samarbets- | Ja | Frånvarande (60-cykel buller närvarande) | Avbrott i EMG-ingången till förförstärkare (t.ex. bly, stift, kabel); |
| Stora | Korssamtal mellan stim och inspelningsstift vid kärlet | |||
| Normal | Förskjutning av ELEKTROD för EMG | |||
| Nej | Frånvarande | Avbrott i stimuleringskretsen | ||
| Normal | 1. RLN skada; 2. Manschett förskjutning | |||
| Sln | TA-LCA | Ja | Frånvarande (60-cykel buller närvarande) | Avbrott i EMG-ingången till förförstärkare (t.ex. bly, stift, kabel); |
| Stora | Korssamtal mellan stim och inspelningsstift vid kärlet | |||
| Normal | Förskjutning av ELEKTROD för EMG | |||
| Nej | Frånvarande | Avbrott i stimuleringskretsen | ||
| Normal | 1. SLN- eller RLN-skada. 2. Manschett förskjutning |
Tabell 1: Felsökningsguide.
Det bör nämnas att det finns två mindre begränsningar i den nuvarande tillämpningen av denna teknik. Först har plötslig böjning av den kvinnliga stiftet under insättning i kärlet inträffat i flera fall. Lyckligtvis kan stiften rätas ut och införas i sina hål framgångsrikt. Om stiftskador är irreparabla måste sladden och hela dess komponent bytas ut. Därför bör backup komponenter vara lätt tillgängliga före operationen. För det andra är den tid som krävs för att slutföra den kirurgiska implantationen lång (~ 10 h). Den långa varaktigheten återspeglar delvis det stora antalet stimulering och omkodning komponenter som krävs för denna studie: fyra nerver, fyra muskler, ett kärl, och en IPG. Om färre komponenter krävs med hjälp av denna teknik bör implantationstiden minskas avsevärt (t.ex. råtttungan modell28).
Denna tekniska metod introducerar flera funktioner som har fördel jämfört med befintliga metoder. Spolningen av blytrådar är det mest nya och viktiga inslaget i detta system. Coiled leder är inte allmänt tillgängliga för icke-kommersiella djurförsök trots de många fördelar de ger. En lindad ledning kan utökas till önskad längd under implantation. Vidare kommer det att sträcka sig i vaken, flytta djuret för att förhindra förskjutning av elektrodspetsen eller trådbrott efter implantation. Denna funktion säkerställer livslängd implantatet och stabil nervstimulering och muskelinspelning på lång sikt. Dessutom, lägga till en vävnad kompatibel kjol runt kärlet förhindrar exponering av såret till denna främmande kropp och främjar normal fibros och sårläkning i avsaknad av infektion. Tidigare studier utan denna kjol resulterade i tidig infektion och för tidig uppsägning av experimentet. Slutligen är detta implantatsystem kompakt och flerkanaligt, vilket möjliggör effektiv datainsamling från många neuromuskulära strukturer i djurmodeller av olika storlek.
Denna tekniska metod har anpassats och framgångsrikt översatts till en råtta modell. Denna studie har utformats för att undersöka effekten av elektrisk konditionering för att förhindra tungan muskelatrofi och dysfunktion i den åldrande råtta. Hypoglossal nerverna var implanteras med manschetten elektroder för konditionering och tungan implanteras med EMG inspelning elektroder28. Denna teknik kan också användas i andra forskningsapplikationer. Som en förlängning av det nuvarande protokollet i hund struphuvudet, effekterna av elektrisk konditionering på att främja selektiv reinnervation studeras för närvarande i kanin ansiktsmusklerna. Denna studie kan ge en grund för förebyggande av ansiktssynkinesi hos patienter med Bells pares, ett vanligt och försvagande medicinskt tillstånd. En slutlig potentiell användning av denna teknik är att stimulera och spela in från vaken, fritt rörliga djur. För närvarande har sådana data erhållits via extern kabel från vaken, ohämmad råttor28. I framtiden kan detta ekonomiska system också kombineras med fjärrinspelningsstimuleringsteknik (t.ex. telemetri) för att aktivera eller sondera neuromuskulära system trådlöst.
Disclosures
Dr David Zealear marknadsför denna implanterbara, nerv stimulering-EMG-teknik för en mängd olika neuromuskulära system och djurmodeller.
Acknowledgments
Författarna tackar Dr Hongmei Wu för hennes bidrag till djurvård och datainsamling under hela studien. Vi tackar Amy Nunnally, Jamie Adcock och Phil Williams för deras hjälp med sterila operationer. Expertisen och engagemanget hos personalen vid Vanderbilt University Animal Care Facility var ovärderlig. Denna forskning stöddes av NIH-stipendiet U01DC016033.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305175 | |
| 23 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305145 | |
| 25 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305125 | |
| 3-0 absorbable sutures, COATED VICRYL | Ethicon | J219H | |
| 3-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | 8684G | |
| 4-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | 8871H | |
| 6-0 monofilament, nonabsorbable taper needle suture, Prolene | Ethicon | 8805 | |
| 7-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | M8735 | |
| Adhesive silicone solvent-Hexamethydisiloxane 98% | ACROS | code 194790100 | for dilution of modical adhesive silicone |
| Bone cement | Zimmer | 1102-16 | 20g powder 10 mL liquid |
| Buprenorphine (Buprenex, ampules of 1 mLl) | Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd | 12496-0757-1 | |
| CCD video camera attached to the endoscope | Sony | MCC500MD | |
| Cefpodoxime (Simplicef 100 mg tablets) | Zoetis | 5228 | |
| Data acquisition device , PowerLab 16/35 | ADInstruments, Inc | 5761-E | |
| Deep-brain stimulation (DBS) electrodes | Abbott | 6172ANS | |
| Digital oscilloscope | Tektronix | DPO71304SX | |
| Implantable pulse generator (IPG), Infinity | Abbott | 6660ANS | |
| Knitted polyester graft | Meadox Medical Inc | 92220 | 20 mm in diameter |
| Medical Grade Polyethylene Micro Tubing | Amazon.com | BB31695-PE/13-10 | OD 0.156", ID 0.094" |
| Metal female pin | Allied Electronics & Automation | 220-S02-100 | |
| Metal male pin | CDM electronics | 220-p02-1 | |
| Prefabricated coiled leads | Medical innovations Inc. | ||
| Silastic Laboratory Tubing | Cole-Parmer | 2415569 | OD 0.125", ID 0.062" |
| Silastic Medical Adhesive Silicone | Dow corning | Type A, 2 oz | |
| Stainless steel monofilament wire | The Harris Products Group | type 316 | 0.008" (coated), 0.005" (bare) |
| Sterile Disposable Biopsy Punch (4 mm) | Sklar Instruments | 96-1146 | |
| Strip connector | CDM electronics | 2.6 x 11.6 x 101.5 mm | single row, round, through hole |
| Teflon-coated multi-filament stainless steel wire | Medwire | Part 316, ss7/44T | |
| Tiletamine and Zolazepam combination, Telazol - 5 mL | Zoetis | 004866 | |
| Tissue-compatible antiseptic solution, Nolvasan - 1 Gallon | Zoetis | 540561 | |
| Zero-degree rigid endoscope | Karl Storz | 8712AA |
References
- Wikipedia contributors. Electromyography. Wikipedia, The Free Encyclopedia. , Available from: https://en.wikipedia.org/wiki/Electromyography (2019).
- Zealear, D. L., et al. Stimulation of denervated muscle promotes selective reinnervation, prevents synkinesis, and restores function. The Laryngoscope. 124 (5), 180-187 (2014).
- Gaweł, M. Electrodiagnostics: MUNE and MUNIX as methods of estimating the number of motor units - biomarkers in lower motor neurone disease. Neurologia i neurochirurgia polska. 53 (4), 251-257 (2019).
- Foerster, G., Mueller, A. H. Laryngeal EMG: Preferential damage of the posterior cricoarytenoid muscle branches especially in iatrogenic recurrent laryngeal nerve lesions. Laryngoscope. 128 (5), 1152-1156 (2018).
- Lin, R. J., Smith, L. J., Munin, M. C., Sridharan, S., Rosen, C. A. Innervation status in chronic vocal fold paralysis and implications for laryngeal reinnervation. Laryngoscope. 128 (7), 1628-1633 (2018).
- Koh, T. J., Leonard, T. R. An implantable electrical interface for in vivo studies of the neuromuscular system. Journal of Neuroscience Methods. 70 (1), 27-32 (1996).
- Grimonprez, A., et al. A Preclinical Study of Laryngeal Motor-Evoked Potentials as a Marker Vagus Nerve Activation. International Journal of Neural Systems. 25 (8), 1550034 (2015).
- Haidar, Y. M., et al. Selective recurrent laryngeal nerve stimulation using a penetrating electrode array in the feline model. The Laryngoscope. 128 (7), 1606-1614 (2018).
- Kneisz, L., Unger, E., Lanmüller, H., Mayr, W. In Vitro Testing of an Implantable Wireless Telemetry System for Long-Term Electromyography Recordings in Large Animals. Artificial Organs. 39 (10), 897-902 (2015).
- Inzelberg, L., Rand, D., Steinberg, S., David-Pur, M., Hanein, Y. A Wearable High-Resolution Facial Electromyography for Long Term Recordings in Freely Behaving Humans. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
- Horn, K. M., Pong, M., Batni, S. R., Levy, S. M., Gibson, A. R. Functional specialization within the cat red nucleus. Journal of Neurophysiology. 87 (1), 469-477 (2002).
- Larson, C. R., Kistler, M. K. The relationship of periaqueductal gray neurons to vocalization and laryngeal EMG in the behaving monkey. Experimental Brain Research. 63 (3), 596-606 (1986).
- Zealear, D., Larson, C. A Microelectrode Study of Laryngeal Motoneurons in the Nucleus Ambiguus of the Awake Vocalizing Monkey. Vocal Fold Physiology Volume. 2, 229-238 (1988).
- Zealear, D. L., Billante, C. R. Neurophysiology of vocal fold paralysis. Otolaryngologic Clinics of North America. 37 (1), 1-23 (2004).
- Zealear, D. L., et al. Electrical Stimulation of a Denervated Muscle Promotes Selective Reinnervation by Native Over Foreign Motoneurons. Journal of Neurophysiology. 87 (4), 2195-2199 (2002).
- Insalaco, G., Kuna, S. T., Cibella, F., Villeponteaux, R. D. Thyroarytenoid muscle activity during hypoxia, hypercapnia, and voluntary hyperventilation in humans. Journal of Applied Physiology. 69 (1), 268-273 (1990).
- Ludlow, C. L., Van Pelt, F., Koda, J. Characteristics of Late Responses to Superior Laryngeal Nerve Stimulation in Humans. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 101 (2), 127-134 (1992).
- Li, Y., et al. Comparison of Ventilation and Voice Outcomes between Unilateral Laryngeal Pacing and Unilateral Cordotomy for the Treatment of Bilateral Vocal Fold Paralysis. ORL. 75 (2), 68-73 (2013).
- Mueller, A. H. Laryngeal pacing for bilateral vocal fold immobility. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (6), 439-443 (2011).
- Crumley, R. L. Laryngeal Synkinesis Revisited. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 109 (4), 365-371 (2000).
- Hydman, J., Mattsson, P. Collateral reinnervation by the superior laryngeal nerve after recurrent laryngeal nerve injury. Muscle & Nerve. 38 (4), 1280-1289 (2008).
- Marie, J. P., Navarre, I., Lerosey, Y., Magnier, P., Dehesdin, D., Andrieu Guitrancourt, J. Bilateral laryngeal movement disorder and synkinesia: value of botulism toxin. Apropos of a case. Rev Laryngol Otol Rhinol (Bord). 119 (4), 261-264 (1998).
- Zealear, D. L., Billante, C. R., Sant’anna, G. D., Courey, M. S., Netterville, J. L. Electrically stimulated glottal opening combined with adductor muscle botox blockade restores both ventilation and voice in a patient with bilateral laryngeal paralysis. Annals of Otology, Rhinology and Laryngology. 111 (6), 500-506 (2002).
- Zealear, D. L., et al. Reanimation of the paralyzed human larynx with an implantable electrical stimulation device. Laryngoscope. 113 (7), 1149-1156 (2003).
- Mueller, A. H., et al. Laryngeal pacing via an implantable stimulator for the rehabilitation of subjects suffering from bilateral vocal fold paralysis: A prospective first-in-human study. Laryngoscope. 126 (8), 1810-1816 (2016).
- Li, Y., Garrett, G., Zealear, D. Current Treatment Options for Bilateral Vocal Fold Paralysis: A State-of-the-Art Review. Clinical and Experimental Otorhinolaryngology. 10 (3), 203-212 (2017).
- Li, Y., Huang, S., Zealear, D. An implantable system for In Vivo chronic electromyographic study in the larynx. Muscle & Nerve. 55 (5), 706-714 (2017).
- Connor, N. P., et al. Tongue muscle plasticity following hypoglossal nerve stimulation in aged rats. Muscle & Nerve. 47 (2), 230-240 (2013).
