Summary
여기서 제시된 것은 유발되고 자발적인 근전도 전위내의 생체 내 연대순 기록을 위한 이식형 시스템의 제조를 위한 프로토콜이다. 이 시스템은 신경 손상 다음 후두 근육의 회안의 조사에 적용됩니다.
Abstract
근전도(EMG)는 운동 단위의 전기 자극 또는 자발적인 활동에 대한 근육 반응을 측정하고 신경 근육 기능을 평가하는 데 중요한 역할을 합니다. 신경 손상 후 근육의 reinnervation 상태를 반영 하는 EMG 활동의 만성 기록 제한 되었습니다., 전통적인 EMG 기록 기술의 침략적 특성으로 인해. 이와 관련하여, 이식형 시스템은 장기간, 생체 내 EMG 기록 및 신경 자극을 위해 설계된다. 그것은 적용 하 고 후 두 근육의 reinnereation에 대 한 연구에서 테스트 되었습니다. 이 시스템은 1) 2개의 양극성 전극 신경 커프스로 구성되고 두 개의 신경각각을 자극하기 위한 리드: 재발성 후두 신경 (RLN) 및 우수한 후두 신경의 내부 분기 (SLN); 2) 두 개의 EMG 기록 전극 및 두 후두 근육각각에 대한 리드: 후방 크리코리티노이드 (PCA) 근육 및 티로리티노이드-측면 크리코테리노이드(TA-LCA) 근육 복합체; 및 3) 이식된 모든 리드 단말과 연결 케이블을 이용하여 외부 기록 프리앰프 및 자극기로 인터페이싱하는 피부 리셉터클. 와이어 리드는 테프론 코팅, 멀티 필라멘트, 유형 316 스테인레스 스틸입니다. 그(것)들은 코일이고 납 파손 및 전극 이동을 방지하기 위하여 깨어있는 동물의 바디 운동 도중 기지개할 수 있습니다. 이 시스템은 무균 수술 중에 이식됩니다. 그 후, 기준선 EMG 기록은 RLN이 근육 재심을 연구하기 위해 두 번째 수술에서 전이되기 전에 수행됩니다. 연구 전반에 걸쳐, 여러 생리 세션은 후두 근육의 reinnervation 상태를 반영하는 자극과 자발적인 EMG 활동을 얻기 위해 마취 동물에서 실시된다. 이 시스템은 컴팩트하고 연구 과정 동안 감염이 없으며 내구성이 뛰어납니다. 이 이식형 시스템은 마취또는 자유롭게 움직이는 동물에서 장기 기록 또는 신경 자극이 필요한 연구를 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼을 제공할 수 있습니다.
Introduction
EMG 기록은 신경의 전기 자극 또는 모터 단위의 자발적인 발사에 의해 활성화될 때 골격 근에 의해 생성된 전기 활동을 측정하는 유용한 기술입니다. EMG 신호 모니터링은 신경 근육 전달 및 근육 생체 역학의 평가에 사용할 수 있습니다1. EMG 기록은 또한 신경 상해2,3,3,4,,5에따른 근육 회복의 질 과 크기를 특성화하는 데 중요한 역할을 한다. 그러나, reinnervation의 전체 기간 동안 다중 EMG 기록은 침략적인 접근에 의해 달성될 수 없습니다. 따라서 이식형 장치는 신경 근육 시스템에서 반복, 만성 자극 및 기록을 위해 설계 및 개발되었으며6,7,7,8,9,,10,,911,,12,13.12 이 백서의 목적은 후두로부터 신뢰할 수있는 연대순 EMG 데이터를 얻기위한 안정적인 시스템의 제조 및 이식프로토콜을 설명하는 것입니다.
이 시스템은 후두 근육 교정 연구에 여기에 적용됩니다. 후두에 대한 간략한 개요가 오리엔테이션에 대해제공됩니다(그림 1). 호흡, 보이싱 및 기도 보호 중 적절한 근육 이동에 감각 및 운동 성분 간의 정확한 조정이 필수적입니다. 후두 후두에 위치한 PCA 근육은 보컬 폴드의 유일한 납치자입니다. 이 근육은 흡입을 위한 glottal 지역을 증가시키기 위하여 영감 도중 자발적으로 활성화됩니다. TA-LCA 컴플렉스는 보컬 폴드의 주요 배더입니다. 다른 adductor와 함께이 근육 복합체의 활성화 (즉, interarytenoid 근육) 진동 및 사운드 생산을 위한 접힌을 하리화 하 고 삼 키는 동안 기도 보호를 위한 접을 닫습니다.
추가적으로, 모터 신경 섬유는 RLN에 있는 납치자 및 adductor 근육 둘 다 invate. 납치자 및 유도체 근육은 모터 유닛조성물(14,,15)에기초하여 구별될 수 있다. PCA 근육 전시 하이퍼 카프 닉 및/또는 저산소 조건 동안 발사 증가16 흡인 모터 단위의 존재로 인해. 대조적으로, 후두 점막 내의 감각 수용체의 활성화를 통해 반사적으로 글로티스를 닫는 반사 성 glottic 폐쇄 (RGC) 모터 단위는 TA-LCA 근육 복합체에 존재합니다. 우수한 후두 신경 (SLN)의 내부 분기는 후두(17)에서감각 수용체의 구심성 섬유를 운반합니다. 보이싱은 주로 도우미 기능이지만, 납치자와 인덕터 모터 유닛모두 이 고도로 진화된 후두 행동에 관여합니다.
그림 1 : 후두의 해부학. 이 이식형 시스템의 구성 요소도 표시됩니다. SLN = 우수한 후두 신경; RLN = 재발성 후두 신경; PCA = 후방 코리코리티노이드 근육; TA-LCA = 티로어리티노이드-측면 크리코리티노이드 근육 복합체; DBS = 깊은 뇌 자극. 이 그림은 와일리27의허가를 받아 재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
RLN에 상해는 후두 근육 탈문14,,18,,19때문에 납치 및 유도 기능을 모두 손상하는 음성 배 마비 (VFP)를 초래할 수 있습니다. 그 후, RLN 신경 섬유의 재생 및 근육의 reinnervation 일반적으로 발생. 그러나, reinnervation 임의의 과정 및 잘못 된 결과, 대부분의 경우에 부적절 한 근육 재연결. 이는 납치범과 길항제의 자발적인 활성화가 결함이 있고 보컬 폴드14,,19,,20,,21의비효율적 또는 역설적 인 움직임을 생성하는 synkinesis라고합니다. synkinesis를 사용하면 손실되는 중요한 기능은 보컬 폴드 납치로 인해 환기가 부적당합니다. 후두 합성증을 치료하려는 시도가 1) 보톡스22,,23 또는 2) 이식형 맥박 조정기로 글로틱 개구부를 전기적으로 자극하여 폐색성 폐쇄를 차단하여 후두합성을 치료하려는 시도가 계속되고있지만,2526.26 그러나, 낮은 주파수에서 reinnervation 동안 PCA 근육의 전기 컨디셔닝 적절 한 신경 근육 재연결을 촉진 하 고 발생에서 synkinesis를 최소화 하는 증거가 있다. 연구는 현재 기본 메커니즘을 해명 하기 위해 실시 되 고2.
이 논문의 초점은 만성 신경 자극 및 EMG 기록을 위한 간단하고 저렴한 이식 가능한 시스템을 설명하는 것입니다. 이 시스템은 PCA 근육의 저주파 전기 적 컨디셔닝이 후속 재심의 특이성에 미치는 영향을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 시스템에 의해 얻어진 EMG 신호는 시간이 지남에 따라 후두 근육 재의 질 그리고 양을 반영할 수 있습니다.
Protocol
이 연구는 밴더빌트 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었으며 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라 수행되었습니다 (건강의 국립 연구소, 베데스다, 메릴랜드). 이 시스템에는 5개의 이식형 부품과 1개의 외부 케이블이 포함되어 있습니다.
1. 양극성 RLN 자극 전극 커프스 2개, 코일 리드 와이어 및 터미널 핀 쌍이 각각
- 각 커프 스리드 와이어에 테프론 코팅, 멀티 필라멘트, 유형 316 스테인레스 스틸 와이어 (0.0078 "또는 0.198 mm의 절연 직경)를 사용합니다. 70cm 길이의 와이어를 자르고 코일 장치를 사용하여 12cm 길이의 스프링으로 코일하거나 조립식 코일 리드를 조달하십시오. 필요한 경우 스프링을 늘려 각 임플란트 부위의 길이를 늘립니다. 코일 리드의 끝을 3mm 및 10mm 길이로 똑바로 두고 절연해제합니다.
- 코일 리드의 3mm 끝에 금도금 구리 암 핀을 납땜합니다.
- 신경 커프를 준비하려면, 튜빙의 롤에서 실리콘 튜브 (OD = 0.156", ID = 0.094"; 또는 OD = 3.96 mm, ID = 2.39 mm)의 5mm 세그먼트를 잘라.
- 튜브에 납을 삽입하려면 25G 피하 바늘을 사용하여 튜브 벽을 1.5mm 끝에서 관통하고 내부 벽에 가까운 오프 센터를 관통하십시오. 리드의 10mm 끝을 바늘 끝으로 채웁니다. 탈절연 부분을 튜브에 증착하기 위해 바늘을 인출합니다. 튜브 외부의 베어 와이어 끝을 뒤로 구부리고 튜브로 들어가는 지점에서 리드에 비틀립니다.
참고: 작동 현미경을 사용하여 이러한 단계를 수행합니다. 프로브를 튜브에 배치하여 와이어를 내부 벽에 곡선으로 만들 수 있습니다. 목표는 신경에 기계적 손상을 입히지 않고 자극이 신경에 전달될 수 있도록 와이어의 베어 부분을 배치하는 것입니다. - 동일한 절차를 사용하여 튜브의 반대쪽 끝에서 두 번째 리드 1.5 mm를 삽입합니다. 진입점을 첫 번째 잠재 고객의 진입점에 정렬합니다. 와이어의 베어 부분이 첫 번째 리드 반대의 내벽 근처에 증착되도록 바늘로 벽을 관통합니다.
참고: 튜브를 내려다 보면, 두 자극 전극은 45 ° "V"모양을 형성해야하며, 이는 한 번 신경을 제자리에 걸치고 양극에서 음극까지 신경을 통해 전류 전달을 보장합니다. - 곡선 가위를 사용하여 입력 전극 점 맞은편 튜브 벽에 S자 형 슬릿을 만듭니다.
참고: 커프의 나선형 입술은 수술 중 전극 사이의 내부 신경을 배치하기 위해 열 수 있습니다. - 6-0 monofilament의 길이를 삽입, 신경 주위 커프의 궁극적 인 고정을 위해 곡선 미세 수술 바늘을 사용하여 각 끝의 커프 벽에 비 흡수 성 봉합사.
- 의료용 A형 실리콘 젤을 적용하여 커프 외부의 노출된 모든 베어 와이어를 재절연시역합니다.
2. 양극성 SLN 자극 전극 커프스 2개, 코일 리드 와이어 및 터미널 핀 쌍이 각각
- RLN 자극 전극 커프와 동일한 방식으로 SLN 자극 전극 커프를 조립합니다. 그러나, 신경이 직경이 작기 때문에 더 작은 직경(OD = 0.125", ID = 0.062"; 또는 OD = 3.18 mm, ID = 1.57 mm) 튜브를 사용한다.
3. 코일 리드 와이어 및 터미널 핀이있는 두 개의 PCA 근육 EMG 기록 전극
- 1.1단계에서 수행된 것처럼 PCA 근육 전극에 대한 코일 리드를 조립합니다.
- 1.2단계에서 와 같이 리드에 암컷 핀을 납땜합니다.
- PCA 근육리드의 10 mm 말단을 깊은 뇌 자극(DBS) 전극의 끝에 삽입하여 동일한 전략을 사용하여 커프스내로 바늘 납 삽입을 위한 전략을 사용한다(1.4단계). 리드의 끝을 구부려 후크를 형성하고 클립하여 총 5mm의 기록 길이를 제공합니다.
참고: 이 응용 프로그램에서, PCA 근육과 그 재인두 신경 말단은 전기 컨디셔닝에 노출된다. 자극은 이식형 펄스 발생기(IPG)에 의해 생성되고 DBS 전극을 통해 후두 근육으로 전달된다(도1,인세트). 이 시스템은 치료 뇌 자극 (예를 들어, 파킨슨 병)에서 적응된다. DBS 전극은 근육 속 주머니에 삽입되고 제자리에 고정됩니다. 근육의 전기 적 컨디셔닝 기술이 필요하지 않은 경우 PCA EMG 전극을 근육에 직접 삽입하고 후크에 의해 고정 할 수 있습니다.
4. 두 개의 TA-LCA 근육 복합 EMG 기록 전극, 코일 리드 와이어 및 터미널 핀각
- 1.1단계에서 수행된 것처럼 TA-LCA 근육 전극에 대한 코일 리드를 조립합니다.
- 1.2단계에서 와 같이 리드에 암컷 핀을 납땜합니다.
- 니트 폴리 에스테르 접목의 5mm x 10mm 직사각형 조각을 절제하십시오. 20G 피하 바늘로 메쉬 중앙에 구멍을 만듭니다. 리드의 10mm 끝을 구멍 너머로 3mm의 코일이 추가로 돌출하여 구멍에 넣습니다. 6-0 모노필라멘트, 흡수되지 않는 봉합사를 사용하여 메쉬에 리드를 부착합니다.
참고: 이 메쉬 조각은 전극이 근육 복합체를 덮어쓰는 갑상선 연골로 이어지는 고정하는 데 사용될 것이다. - 리드의 끝을 구부려 후크를 형성하고 클립하여 총 5mm의 기록 길이를 제공합니다.
5. 전극과 외부 장비 사이의 인터페이싱 연결을 위한 스킨 리셉터클
- 단일 행 암 핀 스트라이프 커넥터를 사용하여 리셉터클을 만듭니다. 스트립에서 두 조각 (각각 17.5 mm 길이)을 자르고 각각 8 개의 핀 구멍이 있습니다. 첫째, 사포로 각 조각의 외부 표면을 거칠게 한 다음 연기 후드에 페놀과 함께 접착제를 사용하여 이중 열 커넥터를 만듭니다. 접착제 경화를 허용하기 위해 30 분 동안 연기 후드에 60-80 °C의 물에 커넥터를 놓습니다.
참고: 이 이중 행 어셈블리 형식은 왼쪽 및 오른쪽 전극에 대한 핀홀 할당에 편리함을 제공합니다. - 스트립에서 25.6mm 길이의 조각을 잘라 커넥터의 페이스 플레이트(피부 고정을 위해 임플란트 부위 외부로 돌출되는 부분)를 만듭니다. 메스로 페이스 플레이트 중앙에 5.4mm x 17.4mm 직사각형 구멍을 자른다.
- 2열 커넥터가 돌출되지 않고 페이스플레이트 표면으로 플러시될 때까지 페이스플레이트의 직사각형 구멍 내부에 놓습니다. 커넥터가 페이스플레이트의 직사각형 구멍에 맞지 않으면 파일로 구멍을 약간 확대할 수 있습니다. 커넥터 구멍이 대칭이 아니므로 지름이 큰 커넥터 모서리를 면판에 삽입합니다.
참고: 결과적으로 지름이 작은 구멍이 있는 커넥터의 반대쪽 모서리에 삽입된 암 핀이 스냅되어 제자리에 고정됩니다. - 페놀을 사용하여 커넥터와 페이스플레이트를 함께 붙입니다. 접착제 경화를 허용하기 위해 30 분 동안 연기 후드에 60-80 °C 의 물에 조립을 놓습니다.
- 페이스플레이트의 각 모서리와 페이스플레이트의 양쪽에서 1.3mm의 구멍을 드릴링하여 총 6개의 구멍을 끝부분에서 중간에 뚫습니다.
참고: 이 구멍은 임플란트 부위의 최종 피부 소켓을 봉합하는 데 사용됩니다. - 니트 폴리 에스테르 접목의 15mm 길이 튜브를 잘라 면판 아래어 조립을 둘러싸면 어셈블리가 생체 적합성이 됩니다. 튜브를 어셈블리에 고정하려면 피하 주사바늘을 사용하여 길이를 따라 3개의 동등한 간격의 위치(각 3.8mm 간격)에서 벽을 통해 스테인리스 스틸 와이어를 스레드합니다.
- 커넥터의 각 모서리에 균등한 간격의 노치를 배치하여 와이어를 어셈블리 표면에 고정합니다. 펜치 한 쌍으로 각 와이어의 끝을 비틀어 튜브를 어셈블리에 끼우고 치마를 형성합니다.
- 리셉터클의 한쪽 끝에 있는 폴리에스테르 패치에 영구 표시를 합니다.
참고: 이 마크를 오리엔테이션에 사용하여 임플란트 수술 중 리셉터클의 장밋빛을 식별합니다. 로스트랄에서 꼬임 방향으로, 두 행각각에 대한 다음 핀 전극 할당(왼쪽 및 오른쪽)은 다음과 같이 해야 한다: PCA EMG, TA-LCA EMG, 빈 구멍, 빈 구멍, RLN 양극, RLN 양극, SLN 양극 및 SLN 음극.
6. 녹화 사전 증폭기 및 자극기에 외부 연결 케이블
참고: 케이블은 신경 자극-EMG 기록 세션(섹션 8 및 10) 동안 이식된 피부 리셉터클과 외부 장비 간의 연결을 만드는 데 사용됩니다. 그것은 피부 리셉터클에 여성 핀에 삽입하는 남성 핀으로 종료 12 절연 와이어로 구성되어 있습니다. 이 케이블은 EMG 기록 플러그와 신경 자극 와이어의 두 부분으로 구성됩니다. 기록 플러그는 자극 핀에서 방사되는 고전압 자극 아티팩트에서 저전압 EMG 신호를 격리하는 데 필요합니다. 같은 이유로, 피부 리셉터클의 각 행에 있는 두 개의 구멍은 자극 핀에서 기록 핀을 분리하기 위해 비어 있습니다.
- EMG 레코딩 플러그를 만들려면 수커넥터(길이와 너비는 같지만 암 커넥터 높이의 절반)를 사용합니다. 두 조각으로 잘라, 각각 두 개의 구멍을 포함. 동일한 접근법을 사용하여 페놀 접착제를 사용하여 두 조각을 부착하여 피부 리셉터클에 이중 열 커넥터를 만듭니다(단계 5.1). 케이블에 있는 4개의 EMG 레코딩 와이어를 가지고 단자 수컷 핀을 4개의 구멍 각각에 삽입하여 스트립 가장자리 너머로 돌출된 팁으로 제자리에 고정할 때까지.
- 뼈 시멘트를 사용하여 플러그 상단을 밀봉하여 와이어 핀 접합을 절연합니다.
- 수컷 핀에서 케이블 종단에 나머지 8개의 와이어를 사용하여 여성 핀을 통해 신경 자극 커프에 개별적인 연결을 만듭니다.
7. 첫 번째 임플란트 수술
- 허가 된 농장에서 1-2 세, 20-25kg 의 개 중 하나를 얻습니다. 무균 임플란트 수술 전에 동물을 적응시킴. 수술 전에 모든 장비를 오토클레이브하십시오. 수술 전에 10-12 시간 동안 음식을 보류하십시오.
- 수술을 위해 동물을 준비하십시오.
- 동물의 머리와 목을 면도하고 알코올과 베타딘 스크럽 용액으로 피부를 청소하십시오. 2-4 mg/kg 타일타민과 졸라제팜 조합의 정맥 주사로 동물을 마취시키고, 삽관을 통해 산소에서 3% 이소플루란을 채취합니다.
- 가열 패드가 있는 수술대에 동물을 놓고 수술로 동물을 드레이프합니다. 수술 내내 적어도 15분마다 동물의 심박수, 호흡속도, 체온 및 산소 포화도를 모니터링하여 적당한 마취 평면에서 생리학적 안정성을 보장합니다.
- 갑상선 노치에서 마네움으로 중간 선 목을 절개하십시오. 식도에서 무료로 기관을 해부하고 cricoid 연골의 열등한 경계를 노출.
- 자극 커프를 양측 SLN 및 LN 각각에 놓습니다.
- 각 면에 갑상선 연골의 앞쪽 표면에 생검 펀치 (직경 4mm)로 연골 창을 만드십시오. 두 TA-LCA 근육 복합체의 측면 측면을 노출. 바늘 의 끝에 바브를 삽입하여 23G 바늘을 사용하여 TA-LCA 근육 복합체에 EMG 기록 전극을 삽입합니다. 연골에 전극 폴리 에스테르 패치를 봉합.
- DBS 전극을 양쪽 PCA 근육 아래에 동반자 후크 와이어 EMG 기록 전극과 함께 놓습니다. 내시경을 사용하여 자극이 각 채널에 대한 음성 접힌 납치를 생성하는지 확인합니다. DBS 전극을 4-0 비흡수성 봉합사에 의해 크리케이드 연골에 고정시.
- 신경 자극-EMG 기록 전극의 모든 와이어 리드를 여성 핀을 통해 리셉터클에 삽입합니다. 핀을 구멍에 밀어 넣은 삽입 도구가 지혈구에서 유행합니다. 리셉터클의 열등한 표면을 밀봉하여 뼈 시멘트를 사용하여 납 핀 접합을 절연합니다.
- 시멘트가 굳은 후, 피부를 통해 중간선 절개의 로스트랄 끝에 리셉터클을 놓고 폴리 에스테르 스커트를 통해 피하 조직에 봉합하십시오. 면판의 구멍을 통과하는 봉합사에 의해 피부 가장자리를 리셉터클에 부착합니다.
참고: 지혈대 의 한 턱에는 카운터 싱크 홀로 이어지는 끝 슬릿이 있습니다. 리드 와이어는 슬릿을 통해 구멍에 배치될 수 있으며 카운터싱크는 핀의 헤드에 배치할 수 있습니다. 두 번째 턱은 리셉터클의 반대쪽에 배치됩니다. 지혈을 압박하는 것은 각각의 리셉터클 구멍에 핀을 누릅니다.
- 시멘트가 굳은 후, 피부를 통해 중간선 절개의 로스트랄 끝에 리셉터클을 놓고 폴리 에스테르 스커트를 통해 피하 조직에 봉합하십시오. 면판의 구멍을 통과하는 봉합사에 의해 피부 가장자리를 리셉터클에 부착합니다.
- 왼쪽 목에 절개를하여 사다리꼴 근육을 노출시십시오. 이식형 펄스 발생기를 배치하기 위한 근육 주머니를 만들기 위해 해부를 수행합니다. 터널 각 DBS는 IPG에 삽입하기 위한 목 절개로 피하적으로 리드합니다.
- 봉합사로 모든 외과 적 상처를 닫습니다. 수술후 완전히 회복될 때까지 동물을 면밀히 모니터링하십시오.
- 수술 후 진통제(예: 부프레노르핀: 0.01-0.02 mg/kg)를 최대 48시간 동안 정기적으로 항생제(예: 세포독증: 10 mg/kg)를 동물에게 3일 이상 경구 투여하십시오. 연구 전반에 걸쳐 동물을 개별적으로 보관하고, 이식된 장치의 정상적인 상처 치유 및 안정화를 허용하도록 10일 동안 운동을 제한한다.
참고: 피부 리셉터클은 조직 과 호환 방부제로 매일 청소해야합니다. 또한, 더미 남성 핀은 EMG 기록 세션 동안을 제외하고 일상적으로 피부 리셉터클의 여성 핀에 삽입되어야 한다. 이 기동은 리셉터클에 이물질이 쌓이는 것을 피하고, 외부 케이블로 효과적인 연결을 허용하고, 감염을 방지할 것입니다.
8. 기준선에서 신경 자극-EMG 기록 세션
참고: 임플란트 수술 후 2x-3x 이러한 세션을 수행하고 신경 성분절 수술 전에 (섹션 9) 양측 RLN이 손상되지 않은 경우 기준선 EMG 신호를 얻기 위해. 표준 신경 자극-EMG 기록 세션(섹션 8 및 10) 동안 다음 프로토콜을 적용한다.
- 10-12 시간 동안 음식을 보류하십시오. 타일타민과 졸라제팜 조합으로 동물을 마취하십시오 (초기 로딩 용량 2-4 mg / kg은 정맥 주사로, i.v. 라인을 통해 시간당 0.4 mg / kg으로 유지하십시오). 동물을 가열 패드에 놓고 적당한 마취 면에 동물을 유지하십시오. 7.2단계에서 설명한 바와 같이 시술 중에 동물의 활력을 모니터링한다.
- 후두경을 통해 연결된 CCD 비디오 카메라로 0도 강성 내시경을 삽입하여 글로티스 수준에서 보컬 폴드 모션을 시각화합니다.
- 플러그와 핀을 통해 실험실 자극기 및 EMG 프리앰프에 연결되는 외부 케이블을 피부 리셉터클에 인터페이스합니다. Preamplifiers의 출력을 데이터 수집 장치 및/또는 오실로스코프에 연결하여 EMG 신호를 표시, 기록 및 측정합니다.
- 각 조건하에서 양측 TA-LCA 복합체 및 PCA 근육으로부터 유발된 EMG 반응을 기록하기 위해 각각 좌우 RLAN에 자극(단일 사각파 펄스, 0.1-0.5 ms 지속 시간, 0.5-2.0 mA 진폭)을 전달합니다.
- 각 조건하에서 양측 TA-LCA 복합체 및 PCA 근육에서 유발된 EMG 반응을 기록하기 위해 각각 좌우 SLN에 자극(단일 사각파 펄스, 0.1-0.5 ms 지속 시간, 0.5-2.0 mA 진폭)을 전달합니다.
- 동물의 입을 통해 실내 공기와 혼합된CO2를 전달하여 과다 한견을 유발하고 동물의 호흡을 증가시다. 최대 흡기 모터 유닛 모집이 발생하는 동안 1 분으로 노출을 제한하십시오. 이 hypercapnic 조건하에 TA-LCA 복합체 및 PCA 근육의 자발적인 EMG 활동을 기록하십시오.
- 마취에서 완전히 회복 될 때까지 동물을 모니터링하고 시설로 동물을 반환합니다.
9. 신경 절제술 과 해부학에 대한 두 번째 수술
- 첫 번째 수술 후 10-14 일 두 번째 수술을 수행합니다. 수술 전에 10-12 시간 동안 음식을 보류하십시오.
- 7.2단계에서 기술된 기술을 사용하여 동물을 마취시키고, 드레이프하고, 작동 중 바이탈을 모니터링한다.
- 봉합사를 제거하고 가능하면 무딘 해부에 의해 중간선 절개를 다시 엽니 다. 해부 중에 이전 이식에 손상을 피하십시오. 해부를 통해 양측 RlN을 노출합니다. 분리, 트랜스페및 아나스토모스 각 신경을 7-0 monofilament, 비흡수성 봉합사로 양두 후두 마비를 유도합니다.
- 멸균 식염수와 젠타마이신 항생제로 목 절개를 관개하십시오. 3-0 흡수성 봉합사를 사용하여 근육 및 피하 조직을 닫습니다. 3-0 무흡수성 모노필라멘트 봉합사로 피부를 닫습니다.
- 수술후 완전히 회복될 때까지 동물을 면밀히 모니터링하십시오.
- 수술 후 최대 48시간 동안 진통제(예: 부프레노르핀: 0.01-0.02 mg/kg)를 정기적으로 제공합니다. 항생제 (예를 들어, cefpodoxime: 10 mg/kg)를 적어도 3 일 동안 동물에게 경구로 주십시오. 정상적인 상처 치유를 허용하기 위해 10 일 동안 동물의 운동을 제한하십시오.
10. 양측 RLN 부상 다음 신경 자극-EMG 기록 세션
- 처음 3개월 동안 일주일에 1회 씩 세션을 수행한 다음 격주로 수행합니다. 이러한 세션에 대한 섹션 8에 설명된 프로토콜을 따릅니다.
Representative Results
구성 요소의 예는 그림 2에나와 있습니다. 도 2A에서 왼쪽에서 오른쪽으로신경 자극 커프, TA-LCA 기록 전극, PCA 기록 전극 및 피부 인터페이스 리셉터클이 각각 있다. 이러한 구성 요소의 상대적 크기를 평가할 수 있습니다. 피부 리셉터클(그림2B)에는각 코일 와이어의 끝에 있는 암핀이 삽입되는 두 개의 구멍이있습니다(그림 2D). 그들은 이식 수술 중 얼굴 판 (화살표) 맞은 편에 삽입됩니다. 리셉터클에는 커넥터 측벽에 연결된 폴리에스테르스커트(그림 2C)가있습니다. 이 스커트는 결합 조직 침투에 의해 위치에 리셉터클을 고정하도록 설계되었습니다. 각 테프론 코팅 스테인리스 스틸 EMG리드(도 2E)는팁에서 단절연(5 mm)되어 근육 기록을 위한 후크 형 전극을 형성한다. 자극 커프는 내부 커프 벽에 나사로 두 개의 전극이 있습니다. 이들은 2 mm의 거리로 분리되어(도 2F)및 "V" 형상(도2G)을형성하여 신경을 가로지르는 전류 전달을 보장한다.
그림 2: 임플란트 시스템의 구성 요소. (A)왼쪽에서 오른쪽으로 신경 자극 커프, TA-LCA 기록 전극, PCA 기록 전극 및 피부 인터페이스 리셉터클이 각각 있습니다. (B)두 줄의 구멍을 보여주는 피부 소켓. (C)커넥터 측벽에 부착된 폴리에스테르 스커트를 보여주는 리셉터클. (D)B.(E) 테플론 코팅스테인리스 스틸EEMG 리드에 삽입되는 암컷 핀을 함유하는 코일 와이어는 근육 기록을 위한 후크형 전극을 형성하기 위해 팁에 단열(5 mm)된다. (F)자극 커프는 2mm로 분리된 내부 커프벽에 두 개의 전극이 나사로 박혀 있습니다. (G)"V" 형성은 신경을 가로질러 전류 전달을 보장하기 위해 전극의 형성이다. 이 그림은 사용 권한27로수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3은 이식된 피부 리셉터클과 외부 장비의 케이블이 리셉터클에 어떻게 인터페이스되는지를 보여줍니다. 더미 남성 핀 (도시되지 않음)은 레셉터클의 암석 핀에 삽입되어 녹음 세션 사이에 이물질이 없도록합니다.
그림 3: 피부 리셉터클 및 인터페이스 케이블. (A)더미 남성 핀없이 전방 목에 이식 된 피부 리셉터클이 표시됩니다. (B)이미지는 외부 장비로부터 케이블의 자극 핀 및 EMG 기록 플러그(화살표)가 신경 자극-EMG 기록 세션 동안 리셉터클에 인터페이스되는 방법을 묘사한다. 이 그림은 사용 권한27로수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4는 RlN이 그대로 있는 기준 세션 중 하나에서 EMG 레코딩을 보여 줍니다.
그림 4: 정상적인 내벽을 가진 후두 근육에서 EMG 기록. (a)RLN 자극이 자극 아티팩트(arrow)를 생성하는 PCA 근육으로부터의 기록 예는 큰 EMG 전위가 뒤따랐다. (b)SLN 자극이 자극 아티팩트(화살표)를 생성하는 TA-LCA 근육 복합체의 예기록. 여기서 나타낸 것은(a)짧은 대기시간 단시냅스 근육 반응 및(b)더 긴 대기 시간 다시냅스 RGC 반응이다. (C)정상적인 영감 동안 PCA 근육에서 기록 된 자발적EMG 활동의 버스트 (화살표). (D)CO2 전달 과정에서 인스내시EMG 활성의 증가. 이 그림은 사용 권한27로수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
PCA 근육으로부터의기록(도 4A)에서,RLN 자극은 자극 아티팩트(arrow)를 생성하고 큰 EMG 전위를 일으킨다. 최대 RLN 유발 응답은 모터 단위 유형에 관계없이 후속 신경 성 후의 반응에 따라 정상 내화의 전체 크기뿐만 아니라 reinnervation의 수준에 대한 좋은 인덱스를 제공합니다. 이것은 RLN 흡입 및 반사 glottic 폐쇄 (RGC) 모터 단위의 신경 섬유를 포함 하기 때문에 사실이다. RLN 자극은 두 가지 유형의 유닛을 모집합니다. EMG 모터 유닛 활성을 불러일으킨 것은 20 ms 기간 동안 정류되고 통합되어 근육 내심의 정량적 측정을 구한다.
TA-LCA 근육 복합체로부터의기록에서(도 4B),SLN 자극은 자극 아티팩트(화살표)를 생성한다. 이러한 아티팩트는 짧은 대기 시간 단시냅스 근육 반응(a) 및 더 긴 대기 시간 다시냅스 RGC 반응(b)에 의해 뒤따른다. 전위 (a) cricothyroid 근육에서 직접 응답, 이 근육은 SLN의 근처 외부 지점에 의해 내면화 하기 때문에. 이 가지의 길 잃은 활성화는 일반적으로 RGC 반응을 활성화하기 위해 내부 가지의 신경 커프 자극 중에 발생합니다. 이 근육은 복합체 근처에 위치하기 때문에 Cricothyroid 전위는 TA-LCA 전극에 의해 기록됩니다. 이전 연구는 내부 가지 자극에 의해 유발 된 cricothyroid 잠재력은 SLN의 외부 분기를 분할하여 선택적으로 폐지 될 수 있음을 보여 주었다 (열성, 게시되지 않은 관찰). 최대 SLN-불러온 EMG 응답은 RGC 감각 모터 경로를 통해 TA-LCA 복합체의 자연스러운 내심의 크기를 반영합니다. RLN neurorrhaphy 전에, PCA 근육의 RGC 내심이 없다, 그래서 더 SLN 잠재력이 이 근육에서 검출되어야한다. 신경 절제술 및 수리 에 이어, SLN-유발 잠재력은 TA-LCA 복합체의 올바른 RGC 재원화의 양을 반영하고 PCA 근육의 잘못된 RGC 재원. RGC 활성은 전체 RGC 파형을 포착하기 위해 20 ms 기간 동안 정류 및 통합에 의해 정량화됩니다.
(도 4C)에서,자발적인 EMG 활동의 파열(화살표)은 정상적인 영감 동안 PCA 근육으로부터 기록된다. 이러한 EMG 활성은 느린 스윕 속도로(그림 4D)에도시된 바와 같이CO2 전달의 과정에 걸쳐 증가한다. 자발적인 PCA EMG 활동은 원래의 흡인 운동 신경 세포에 의해이 근육의 정상적인 내심 의 크기의 좋은 추정을 제공합니다. TA-LCA 복합체의 흡인 내심은 없으므로 이러한 근육에서 흡인 잠재력을 감지해서는 안됩니다. 이것은 단지 흡인 모터 단위가 마취된 동물에 있는 최대 흡인 노력에 있는 보컬 폴드를 납치에 관여하기 때문입니다. 신경 transection 및 복구 다음, 자발적인 흡기 잠재력 PCA 근육의 올바른 reinnervation의 크기와 TA-LCA 복합체의 잘못 된 reinneration의 크기를 반영. 인서열 EMG 활동의 기록은 8 s 기간 동안 증폭, 정류 및 통합됩니다.
Discussion
이 논문은 후두 신경의 자극과 장기적으로 후두 근육에서 EMG 응답의 기록을 위한 새로운, 경제적, 이식 가능한 시스템의 제조에 필요한 단계를 설명합니다. 프로토콜은 복잡하지 않으며 쥐처럼 작은 동물에서 활용될 수 있을 만큼 컴팩트한 임플란트를 생성할 수 있습니다. 강조해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 리드 와이어는 단열재, 꼬임 또는 파손을 방지하기 위해 신중하고 균일하게 코일되어야 합니다. 코일 기계를 사용할 수 없는 경우 조립식 코일 리드를 상업적으로 얻을 수 있습니다. 둘째, 실리콘 튜브에 납 와이어를 삽입하여 신경을 가로지르는 "V"를 형성하는 전략은 커프 내부의 신경을 통해 현재 전달을 촉진하는 데 중요합니다. 두 리드가 튜브의 동일한 쪽에 놓이면 전극 사이의 전류가 절제될 수 있습니다. 또한 신경에 슬라이스 손상의 가능성을 피하기 위해 리드가 튜브 내벽에 대해 위치하는 것이 중요합니다.
셋째, 이식 수술 중에 후두 신경은 손상을 방지하기 위해 신중하게 해부해야합니다. 이식의 나중 단계에서, 리셉터클에 핀을 삽입 할 때, 힘은 핀의 머리의 갑작스런 굴곡을 방지하기 위해 구멍에 정렬핀에 적용되어야한다. 그 후, 뼈 시멘트는 완전한 절연 및 채널 사이의 누화의 예방을 위해 리셉터클 바닥에 철저하게 배포되어야한다. 마지막으로, 감염 예방은 시간이 지남에 따라 임플란트 시스템의 무결성을 보장하는 데 중요합니다. 그것은 여러 기동의 조합에 의해 달성 될 수있다 : 리셉터클에 스커트의 추가, 항생제 의 관리, 조직 호환 방부제 용액상처와 리셉터클의 매일 청소, 세션 사이의 파편을 깨끗하게 유지하기 위해 리셉터클의 여성 핀에 더미 남성 핀의 배치.
이 프로토콜은 이 개 후두 모델에서 성공한 것으로 입증되었습니다. 그러나 일부 수정 또는 대체 전략은 다른 응용 프로그램에 대해 고려될 수 있습니다. 예를 들어, PCA 및 TA-LCA EMG 전극의 절연 감지 팁은 폴리에스테르 이식편 또는 DBS 전극 중 하나-외부 수단에 의해 근육에 고정된다. 외부 앵커링이 필요하지 않거나 수행되지 않는 응용 분야에서는 전극의 바브만으로도 앵커 역할을 할 수 있습니다. 이러한 경우, 테프론 코팅, 스테인리스, 모노필라멘트 와이어는 더 큰 인장 강도를 고려하여 멀티필라멘트 와이어에 바람직할 수 있으며, 조직에서 보다 안정한 바브를 제공한다. 그러나 다중 필라멘트 와이어가 파손되기 쉽기 때문에 주의해야 합니다. 피부 리셉터클의 제조 및 조립에 대한 대체 전략은 생체 적합성 폴리머(예: Stratasys에 의한 MED610)를 사용하여 3D 인쇄하는 것입니다. 이는 제조 공정을 단순화할 수 있다.
이식 수술 및 동물의 회복 후, 생리세션은 기준선 데이터를 얻기 위해 여전히 손상되지 않은 RlN으로 진행됩니다. 세션 도중, 후두 근육에서 EMG 신호의 부재는 RLN 자극 다음 생길 수 있습니다. 원인(표 1)을트러블슈팅하기 위해 먼저 보컬 폴드 움직임이 존재하는지 여부를 결정해야 한다. 그것이 존재하는 경우에, 이것은 신경이 효과적으로 커프에 의해 활성화된다는 것을 의미합니다, 그러나 EMG 지도에 문제가 있습니다. 이 경우 사용자는 EMG 자극 아티팩트를 더 자세히 살펴봐야 합니다. EMG 아티팩트가 없는 경우, Preamplifier에 대한 EMG 입력에 불연속이 있을 수 있습니다. 60사이클 노이즈도 진폭으로 존재합니다. 아티팩트가 큰 경우, 자극 핀에서 레코딩 핀으로 의기질은 채널 프리앰프를 포화시키고 EMG 반응을 말살하는 책임이 있을 수 있다. 아티팩트가 정상인 경우, EMG 리드는 근육에서 탈구될 가능성이 있으며 그 활동을 감지할 수 없습니다. 다른 한편으로는, 보컬 접기 운동이 결석하는 경우에, 신경은 활성화되지 않습니다. 아티팩트가 없는 경우, 자극 회로에 불연속이 있을 수 있으며, 신경 활성화를 방지할 수 있다. 유물이 정상으로 나타나면 임플란트 수술 중에 신경이 부상을 입었거나 커프가 신경에서 멀어질 수 있습니다. 유사한 전략은 SLN 자극 도중 결석 한 EMG 신호의 원인을 트러블슈팅하기 위해 적용될 수 있습니다.
| 자극 된 신경 | 대상 근육(들) | 입측 보컬 폴드 무브먼트 | 자극 아티팩트 | 원인 |
| RLN (동음이의) | PCA 및/또는 TA-LCA | 예 | 부재(60사이클 노이즈 존재) | 프리앰프에 대한 EMG 입력의 불연속(예: 리드, 핀, 케이블); |
| 큰 | 리셉터클에서 스팀과 레코딩 핀 간의 크로스토크 | |||
| 정상적인 | EMG 전극의 전위 | |||
| 아니요 | 결 석 | 자극 회로의 불연속성 | ||
| 정상적인 | 1. RLN 부상; 2. 커프 전위 | |||
| .sln | 타-LCA | 예 | 부재(60사이클 노이즈 존재) | 프리앰프에 대한 EMG 입력의 불연속(예: 리드, 핀, 케이블); |
| 큰 | 리셉터클에서 스팀과 레코딩 핀 간의 크로스토크 | |||
| 정상적인 | EMG 전극의 전위 | |||
| 아니요 | 결 석 | 자극 회로의 불연속성 | ||
| 정상적인 | 1. SLN 또는 RLN 부상; 2. 커프 전위 |
표 1: 문제 해결 가이드.
이 기술의 현재 응용 프로그램에는 두 가지 사소한 제한이 있음을 언급해야합니다. 첫째, 리셉터클에 삽입하는 동안 암핀의 갑작스런 굽힘이 여러 경우에 일어났다. 다행히핀을 스트레이트하여 구멍에 성공적으로 삽입할 수 있습니다. 핀 손상을 복구할 수 없는 경우 리드와 전체 구성 요소를 교체해야 합니다. 따라서 수술 전에 백업 구성 요소를 쉽게 사용할 수 있어야 합니다. 둘째, 외과 이식을 완료하는 데 필요한 시간은 길다 (~10 시간). 긴 기간은 부분적으로 이 연구에 필요한 많은 수의 자극 및 재코딩 구성 요소를 반영합니다: 네 개의 신경, 4개의 근육, 리셉터클 및 IPG. 이 기술을 사용하여 더 적은 수의 성분이 요구되는 경우, 이식 시간이 현저히 감소되어야 한다(예를 들어, 래트 혀 모델28).
이 기술 적 접근 방식은 기존 방법에 비해 장점이 있는 몇 가지 기능을 소개합니다. 리드 와이어의 코일링은 이 시스템의 가장 참신하고 중요한 기능입니다. 코일 리드는 그들이 제공하는 많은 혜택에도 불구하고 비상업적 동물 실험에 일반적으로 사용할 수 없습니다. 코일 리드는 이식 중에 원하는 길이로 확장될 수 있다. 또한, 이식 후 전극 팁 또는 와이어 파손의 탈구를 방지하기 위해 동물을 이동, 깨어에서 스트레칭한다. 이 기능은 임플란트의 수명을 보장하고 장기적으로 안정적인 신경 자극및 근육 기록을 보장합니다. 또한, 리셉터클 주위에 조직 호환 스커트를 추가하면이 이물질에 상처가 노출되는 것을 방지하고 감염이없는 경우 정상적인 섬유증 및 상처 치유를 촉진합니다. 이 치마없이 이전 연구는 실험의 조기 감염과 조기 종료결과. 마지막으로, 이 임플란트 시스템은 컴팩트하고 다채널화되어 다양한 크기의 동물 모델에서 수많은 신경 근육 구조에서 효과적인 데이터 수집을 가능하게 합니다.
이러한 기술적 접근법은 적응되어 쥐 모델로 성공적으로 번역되었습니다. 이 연구는 노화 쥐에 혀 근육 위축 및 기능 장애를 방지에 전기 컨디셔닝의 효과 조사 하도록 설계 되었습니다. 저자극성 신경은 컨디셔닝을 위한 커프전극과 EMG 기록전극(28)으로이식된 혀를 이식하였다. 이 기술은 다른 연구 응용 분야에서도 활용될 수 있습니다. 개 후두에서 현재 프로토콜의 확장으로, 선택적 reinnervation을 촉진에 전기 컨디셔닝의 효과 현재 토끼 얼굴 근육에서 공부 되고있다. 이 연구는 벨 마비 환자에서 안면 synkinesis의 예방에 대 한 기초를 제공할 수 있습니다., 일반적이 고 쇠 약 의료 조건. 이 기술의 최종 잠재적 인 사용은 자극하고 깨어에서 기록하는 것입니다, 자유롭게 움직이는 동물. 현재, 이러한 데이터는 깨어있는, 억제되지 않은 쥐28로부터외부 케이블을 통해 얻어졌다. 미래에, 이러한 경제적인 시스템은 또한 원격 기록-자극 기술(예를 들어, 원격 측정)과 결합되어 신경근육 시스템을 무선으로 활성화 또는 프로브할 수 있다.
Disclosures
데이비드 Zealear 박사는 다양한 신경 근육 시스템 및 동물 모델에 이식형 신경 자극-EMG 기술을 마케팅하고 있습니다.
Acknowledgments
저자는 연구 전반에 걸쳐 동물 관리 및 데이터 수집에 대한 그녀의 기여에 대한 홍메이 우 박사에게 감사드립니다. 에이미 수녀, 제이미 애드콕, 필 윌리엄스가 멸균 수술을 도와준 것에 대해 감사드립니다. 밴더빌트 대학 동물 보호 시설의 직원의 전문 지식과 헌신은 매우 귀중했습니다. 이 연구는 NIH 교부금 U01DC016033에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305175 | |
| 23 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305145 | |
| 25 G x 1" Gauge hypodermic needle | BD | 305125 | |
| 3-0 absorbable sutures, COATED VICRYL | Ethicon | J219H | |
| 3-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | 8684G | |
| 4-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | 8871H | |
| 6-0 monofilament, nonabsorbable taper needle suture, Prolene | Ethicon | 8805 | |
| 7-0 monofilament, nonabsorbable sutures, Prolene | Ethicon | M8735 | |
| Adhesive silicone solvent-Hexamethydisiloxane 98% | ACROS | code 194790100 | for dilution of modical adhesive silicone |
| Bone cement | Zimmer | 1102-16 | 20g powder 10 mL liquid |
| Buprenorphine (Buprenex, ampules of 1 mLl) | Reckitt Benckiser Healthcare (UK) Ltd | 12496-0757-1 | |
| CCD video camera attached to the endoscope | Sony | MCC500MD | |
| Cefpodoxime (Simplicef 100 mg tablets) | Zoetis | 5228 | |
| Data acquisition device , PowerLab 16/35 | ADInstruments, Inc | 5761-E | |
| Deep-brain stimulation (DBS) electrodes | Abbott | 6172ANS | |
| Digital oscilloscope | Tektronix | DPO71304SX | |
| Implantable pulse generator (IPG), Infinity | Abbott | 6660ANS | |
| Knitted polyester graft | Meadox Medical Inc | 92220 | 20 mm in diameter |
| Medical Grade Polyethylene Micro Tubing | Amazon.com | BB31695-PE/13-10 | OD 0.156", ID 0.094" |
| Metal female pin | Allied Electronics & Automation | 220-S02-100 | |
| Metal male pin | CDM electronics | 220-p02-1 | |
| Prefabricated coiled leads | Medical innovations Inc. | ||
| Silastic Laboratory Tubing | Cole-Parmer | 2415569 | OD 0.125", ID 0.062" |
| Silastic Medical Adhesive Silicone | Dow corning | Type A, 2 oz | |
| Stainless steel monofilament wire | The Harris Products Group | type 316 | 0.008" (coated), 0.005" (bare) |
| Sterile Disposable Biopsy Punch (4 mm) | Sklar Instruments | 96-1146 | |
| Strip connector | CDM electronics | 2.6 x 11.6 x 101.5 mm | single row, round, through hole |
| Teflon-coated multi-filament stainless steel wire | Medwire | Part 316, ss7/44T | |
| Tiletamine and Zolazepam combination, Telazol - 5 mL | Zoetis | 004866 | |
| Tissue-compatible antiseptic solution, Nolvasan - 1 Gallon | Zoetis | 540561 | |
| Zero-degree rigid endoscope | Karl Storz | 8712AA |
References
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