Summary
यहाँ प्रस्तुत प्रोस्टेट उपकला organoids में औषधीय प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल है. ऑर्गेनोइड्स विवो जीव विज्ञान के समान होते हैं और रोगी आनुवंशिकी को पुनरूपित करते हैं, जिससे उन्हें आकर्षक मॉडल सिस्टम मिलते हैं। प्रोस्टेट organoids wildtype प्रोस्टेट से स्थापित किया जा सकता है, आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल, सौम्य मानव ऊतक, और उन्नत प्रोस्टेट कैंसर.
Abstract
यहाँ प्रस्तुत फार्माकोडायनामिक्स, स्टेम सेल क्षमता, और प्रोस्टेट उपकला organoids में कैंसर भेदभाव का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। प्रोस्टेट organoids एण्ड्रोजन उत्तरदायी हैं, तीन आयामी (3 डी) एक परिभाषित माध्यम है कि प्रोस्टेटिक उपकला जैसा दिखता है में विकसित संस्कृतियों. प्रोस्टेट organoids जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल, सौम्य मानव ऊतक, और उन्नत प्रोस्टेट कैंसर से स्थापित किया जा सकता है. महत्वपूर्ण बात, रोगी व्युत्पन्न organoids बारीकी से आनुवंशिकी में ट्यूमर और विवो ट्यूमर जीव विज्ञान के समान है। इसके अलावा, ORGANoids आनुवंशिक रूप से CRISPR/Cas9 और shRNA प्रणालियों का उपयोग कर हेरफेर किया जा सकता है. ये नियंत्रित आनुवंशिकी organoid संस्कृति तेजी से औषधीय प्रतिक्रियाओं पर जीनोटाइप और उत्परिवर्तन प्रोफाइल के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए एक मंच के रूप में आकर्षक बनाते हैं. हालांकि, प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल विशेष रूप से organoid संस्कृतियों के 3 डी प्रकृति के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए reproduible परिणाम प्राप्त करने के लिए. यहाँ वर्णित organoid गठन क्षमता निर्धारित करने के लिए assays बोने प्रदर्शन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल हैं. बाद में, इस रिपोर्ट से पता चलता है कि कैसे दवा उपचार प्रदर्शन और व्यवहार्यता माप, प्रोटीन अलगाव, और आरएनए अलगाव के माध्यम से औषधीय प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने के लिए. अंत में, प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि कैसे xenografting के लिए organoids तैयार करने के लिए और बाद में vivo विकास परख में subcutaneous grafting का उपयोग कर. इन प्रोटोकॉल अत्यधिक reproduible डेटा उपज और व्यापक रूप से 3 डी संस्कृति प्रणालियों के लिए लागू होते हैं.
Introduction
दवा प्रतिरोध कैंसर के इलाज में प्रमुख नैदानिक समस्याओं में से एक है। Metastatic प्रोस्टेट कैंसर (PCa) उपचार मुख्य रूप से एण्ड्रोजन संकेत अक्ष पर निर्देशित है. अगली पीढ़ी के विरोधी एण्ड्रोजन चिकित्सा (जैसे, enzalutamide और abiraterone) महान नैदानिक सफलता दिखाई है, लेकिन लगभग सभी पीसीए अंततः एक एण्ड्रोजन स्वतंत्र राज्य की ओर प्रगति, या castration प्रतिरोधी प्रोस्टेट कैंसर (CRPC).
सीआरपीसी के हाल ही में जीनोमिक और ट्रांसक्रिमिक प्रोफाइलिंग से पता चला कि प्रोस्टेट कैंसर में प्रतिरोध के तीन सामान्य तंत्र हैं: 1) उत्परिवर्तनों को सक्रिय करना जिसके परिणामस्वरूप एण्ड्रोजन रिसेप्टर (एआर) की बहाली1का संकेत है; 2) बाईपास संकेतन के सक्रियण, के रूप में अगली पीढ़ी के विरोधी एण्ड्रोजन चिकित्सा प्रतिरोध के लिए एक पूर्व नैदानिक मॉडल में उदाहरण के रूप में glucocorticoid रिसेप्टर (जीआर) के सक्रियण एआर संकेतन2के नुकसान के लिए क्षतिपूर्ति कर सकते हैं; और 3) वंश plasticity की हाल ही में पहचान की प्रक्रिया है, जिसमें ट्यूमर कोशिकाओं एक सेल प्रकार से एक और सेल प्रकार है कि इस पर निर्भर नहीं है के लिए दवा लक्ष्य पर निर्भर वंश स्विचन द्वारा प्रतिरोध प्राप्त (जो, पीसीए में, एआर-नकारात्मक के रूप में प्रतिनिधित्व किया है और /या neuroendocrine रोग [NEPC])3,4. हालांकि, दवा प्रतिरोध का कारण है कि आणविक तंत्र समझ में नहीं आ रहे हैं. इसके अलावा, अधिग्रहण विरोधी एण्ड्रोजन प्रतिरोध चिकित्सीय कमजोरियों है कि शोषण किया जा सकता करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इसलिए, यह मॉडल प्रणाली है कि रोगी phenotypes और जीनोटाइप की नकल में दवा प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक है.
प्रोस्टेट organoids एक परिभाषित माध्यम के साथ एक 3 डी प्रोटीन मैट्रिक्स में बड़े organotypic संस्कृतियों रहे हैं. महत्वपूर्ण बात यह है कि प्रोस्टेट organoids murine या मानव मूल के सौम्य और कैंसर ऊतक से स्थापित किया जा सकता है, और वे phenotypic और जीनोटाइपिक सुविधाओं को बनाए रखनेvivo5,6में पाया . महत्वपूर्ण बात, दोनों विरोधी एंड्रोजन संवेदनशील पीसीए और CRPC कोशिकाओं organoids के वर्तमान संग्रह में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. इसके अलावा, प्रोस्टेट organoids आसानी से आनुवंशिक रूप से CRISPR/Cas9 और shRNA5का उपयोग कर हेरफेर कर रहे हैं. इस प्रकार, प्रोस्टेट organoids दवा प्रतिक्रियाओं के परीक्षण और स्पष्ट प्रतिरोध तंत्र के लिए एक उपयुक्त मॉडल प्रणाली हैं. यहाँ, एक विस्तृत प्रोटोकॉल दवा परीक्षण प्रदर्शन और प्रोस्टेट organoids का उपयोग कर औषधीय प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए वर्णित है.
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Protocol
इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी काम पहले से स्थापित murine organoids और रोगी व्युत्पन्न organoids के साथ किया गया है. सभी पशु काम मेमोरियल स्लोन केटरिंग कैंसर सेंटर के अनुसंधान पशु संसाधन केंद्र के दिशा निर्देशों के अनुपालन में किया गया था (IACUC: 06-07-012). सभी रोगी व्युत्पन्न ऊतकों के नियमों और स्मारक स्लोआन केटरिंग कैंसर सेंटर (IRB: 12001) के नियमों के अनुपालन में एकत्र किए गए थे।
1. मध्यम और बफर तैयारी
- प्रयोग शुरू करने से पहले रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर थाव तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (उदाहरण के लिए, Matrigel) 4 डिग्री सेल्सियस पर। उपयोग के दौरान इसे बर्फ पर रखें।
- प्रयोगों से पहले 24 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति प्लेटें रखें। यह तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स गुंबद में मदद मिलेगी (बाद में मैट्रिक्स गुंबद के रूप में भेजा) बहुलक बनाने के लिए. चढ़ाना organoids चरण 2.1.2 में वर्णित है.
- स्थापित प्रोटोकॉल5के अनुसार अंगाभ माध्यम तैयार करें।
- अधिचर्म वृद्धि कारक के अतिरिक्त बिना अंगाभ माध्यम तैयार करें (EGF; घटकों के लिए सामग्री की तालिका देखें)। EGF एआर ट्रांसक्रिप्शनल आउटपुट को दबा देता है और एंटी-एंड्रोजन प्रतिरोध5प्रदान करता है।
- 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) तैयार करें.
नोट: यह मीडिया वर्गों में trypsin प्रतिस्थापन के साथ एंजाइमी पाचन को बाधित करने के लिए प्रयोग किया जाता है 2-4. - निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार दवा समाधान तैयार करें। enzalutamide/mdv3100 के लिए (इसके बाद दूसरी पीढ़ी के विरोधी एण्ड्रोजन के रूप में संदर्भित), dimethyl sulfoxide (DMSO) में 100 $M का एक स्टॉक समाधान तैयार करते हैं। स्टॉक को 6 महीने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और इसे ताजा नहीं बनाया जा सकता है।
2. अलगाव, एंजाइमी पाचन, और organoids की स्थापना
- पहले से स्थापित प्रोटोकॉल5,7के अनुसार माउस या मानव ऊतक से प्रोस्टेट organoids अलग . एक संक्षिप्त विवरण नीचे प्रदान की गई है.
- एक एकल सेल निलंबन का उत्पादन करने के लिए मिन्स और एंजाइमी रूप से प्रोस्टेट ऊतक को पचाते हैं। इस प्रयोग में, ADMEM/F12 में 5 मिलीग्राम/एमएल कोलैजाइन प्रकार II का 1 एमएल प्रोस्टेट ऊतक के 50 मिलीग्राम के पाचन के लिए उपयोग किया गया था।
- 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं को ले लीजिए, कोशिकाओं की गिनती, उन्हें तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स में resuspend, और उचित घनत्व पर प्लेट5,7 पूर्व-वार्मorganoid संस्कृति प्लेटों पर मैट्रिक्स गुंबदों में (प्लेटिंग विधि चित्र 1कमें दर्शायागया है।
- गुंबदों को ठोस करने और गुंबदों के शीर्ष पर मीडिया को जोड़ने की अनुमति दें ताकि वे पूरी तरह से कवर कर सकें।
- डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए वांछित मात्रा में organoids हो जाना. कक्ष संख्या मानक गिनती तरीकों से निर्धारित किया जा सकता है. घनत्व पर अतिरिक्त विवरण के लिए प्रोटोकॉल के अनुप्रयोग-विशिष्ट अनुभाग देखें।
- एक P1000 पिपेट का उपयोग करना, मध्यम और पिपेट ऊपर और नीचे को बाधित करने के लिए आकर्षित. जब तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पूरी तरह से बाधित है, एक 15 एमएल शंकु ट्यूब के लिए निलंबन हस्तांतरण. प्रति एकल 15 एमएल शंकु ट्यूब पर 10 से अधिक गुंबदों को न रखें। 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
- सुपरनेंट को ड्रा करें और पीबीएस के 5 एमएल के साथ सेल गोली धो एंड्रा करें। 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
- सुपरनेंट को ड्रा करें और ट्रिप्सिन प्रतिस्थापन के 4 एमएल में गोली को फिर से शुरू करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए के साथ 5-10 मिनट के लिए डाइजेस्ट। trypsin प्रतिस्थापन को बाधित करने के लिए organoid मध्यम + 10% FBS के एक बराबर मात्रा जोड़ें. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
- सुपरनेंट को ड्रा करें और पीबीएस के 1 एमएल में फिर से निलंबित करें।
- एक एकल सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए एक 40 डिग्री मीटर फिल्टर के साथ निलंबन फ़िल्टर करें। एक हेमोसाइटोमीटर या समकक्ष गणना डिवाइस का उपयोग करसेल नंबर को परिमाणित करें।
नोट: व्यवहार्य एकल कक्ष प्राप्त करना मुश्किल है, तो किसी एकल कक्ष समाधान प्राप्त करने के लिए प्रवाह छँटाई का उपयोग करें।
3. organoid गठन क्षमता का आकलन
नोट: कोशिकाओं है कि एक organoid उत्पन्न कर सकते हैं का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए, एक बोने परख स्टेम के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में किया जा सकता / organoid गठन क्षमता भी व्यवहार्यता परख के लिए एक सेल बोने की संख्या को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है.
- चरण 2.7 से 100 कोशिकाओं में प्राप्त सेल निलंबन को पतला करें, जिसमें ऑर्गनॉइड माध्यम का उपयोग करके 10 डिग्री सेल्सियस का उपयोग किया गया है जिसमें 10 डिग्री रो काइनेज अवरोधक Y-27632 शामिल है।
- एक नई शंकु ट्यूब के लिए 1,100 कोशिकाओं (110 $ एल निलंबन के) स्थानांतरण।
- तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के 285 $L जोड़ें और कोशिकाओं को फिर से निलंबित. यह एक $ 70% मैट्रिक्स एकाग्रता में परिणाम होगा.
नोट: बोने के दौरान तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के फैलाव बहुत गुंबद आकार में भिन्नता कम कर देता है, प्रोटीन मैट्रिक्स की चिपचिपापन की वजह से. - एक पूर्व गर्म 24 अच्छी तरह से थाली में मैट्रिक्स गुंबदों के 35 डिग्री एल में बीज कोशिकाओं, 200 कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप / प्रति नमूना प्लेट 3-5 प्रतिकृति (चित्र 1A और चरण 2.1.2) में प्लेटिंग विधि भी देखें।
- यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाएं मैट्रिक्स गुंबद के भीतर रहती हैं, प्लेट को फ्लिप करें और इसे तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को ठोस करने के लिए एक सेल इनक्यूबेटर में रखें।
- 10 मिनट के बाद, इनक्यूबेटर से प्लेट को हटा दें और रो काइनेज अवरोधक वाले माध्यम जोड़ें।
- माध्यम को हर 2 दिन ताज़ा करें। 7 दिनों के बाद, organoids की संख्या की मात्रा निर्धारित. प्रयोग के दौरान मीडिया में Rho kinase अवरोध करनेवाला रखें.
- गुंबद प्रति स्थापित organoids की संख्या की गणना और चढ़ाया कोशिकाओं की कुल संख्या से बाहर गठित organoids के प्रतिशत की गणना (200 कोशिकाओं).
नोट: Organoid स्थापना अनुपात सेल प्रकार और जीनोटाइप के आधार पर 3%-60% से भिन्न होते हैं।
4. organoids के औषधीय प्रतिक्रियाओं का निर्धारण
- चरण 2.7 से जारी, एक मैट्रिक्स गुंबद में 1,000-10,000 कोशिकाओं बीज. अंतिम सेल संख्या का निर्धारण करने के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में organoid गठन दक्षता और विकास की गति का प्रयोग करें.
नोट: अनुशंसित कक्ष संख्याएँ तालिका 1में प्रदान की गई हैं। विश्लेषण प्रति शर्त तीन से पांच प्रतिकृति का उपयोग करें. चिपचिपापन द्वारा प्रेरित पाइपटिंग त्रुटियों को कम करने के लिए 70% तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के एक अंतिम एकाग्रता का उपयोग करें। - एक 24 अच्छी तरह से थाली में मैट्रिक्स गुंबदों के बीज 35 डिग्री सेल्सियस और गुंबदों खंड 3 में किया के रूप में जम (यह भी चित्र 1ए में चढ़ाना विधि और चरण 2.1.2) देखें. रो काइनेज अवरोधक और पसंद की दवा युक्त मध्यम जोड़ें। इस विधि सभी दवाओं के लिए लागू किया जा सकता है, लेकिन इस प्रोटोकॉल में, एक दूसरी पीढ़ी के विरोधी एण्ड्रोजन एक उदाहरण के लिए 10 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोग किया जाता है. आधा अधिकतम निरोधात्मक एकाग्रता निर्धारित करने के लिए (IC50), एक log10 वृद्धिशील प्रदर्शन, और एक नियंत्रण के रूप में, वाहन जिसमें दवा भंग कर दिया गया था का उपयोग करें.
- हर दो या तीन दिनों में माध्यम को ताज़ा करें और दवा की औषधीय प्रतिक्रिया निर्धारित करने के लिए 7 दिन पर organoids का विश्लेषण करें। timepoints प्रयोग और दवा के चुनाव के बीच भिन्न हो सकते हैं.
नोट: Organoids इन परख प्रदर्शन करने के लिए trypsinized किया जा करने के लिए नहीं है। - organoids बरकरार रखने के लिए, एक P1000 पिपेट का उपयोग कर, ऊपर और नीचे मध्यम और पिपेट आकर्षित तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को बाधित करने के लिए.
- जब तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स पूरी तरह से बाधित है, एक 15 एमएल शंकु ट्यूब के लिए निलंबन हस्तांतरण. प्रति 10 मैट्रिक्स गुंबदों से अधिक स्थानांतरित न करें 15 एमएल शंकु ट्यूब।
- 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, सुपरनेटसेक से ड्रा करें और पीबीएस के 5 एमएल से धोएं।
- पीबीएस के 1 एमएल में organoids को पुन: निलंबित करें और trituration और एक गिलास पाश्चर पिपेट का उपयोग कर organoids को बाधित।
- ऑर्गेनिड खंडों की संख्या को परिमाणित करें. बीज 5 प्रतिकृति 100 organoid टुकड़े के रूप में चरण 2.1.2 में वर्णित युक्त.
- अनुभाग 7 में नीचे वर्णित के रूप में सेल व्यवहार्यता परख प्रदर्शन.
5. organoids से आरएनए अलगाव
नोट: वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध स्तंभ-आधारित तरीके अच्छी मात्रा और आरएनए की गुणवत्ता प्राप्त करते हैं। अच्छी मात्रा आरएनए सुनिश्चित करने के लिए, प्रति नमूना एक गुंबद की एक न्यूनतम का उपयोग करें; हालांकि, तीन गुंबदों का उपयोग करने की सिफारिश की है, जो एक 12 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में बीज किया जा सकता है.
- जेड-मेरकैप्टोथेनोल जोड़ें (1%) RNA अलगाव किट में glutathione lysis बफर करने के लिए.
- organoids युक्त तहखाने झिल्ली गुंबदों से माध्यम से ड्रा और इस बफर के 750 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. एक P1000 पिपेट का उपयोग कर ऊपर और नीचे पिपेट. जाँच करें कि सभी तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स भंग कर दिया गया है.
- 70% इथेनॉल के 750 $L जोड़ें और pipeting द्वारा मिश्रण. इसके बाद मिश्रण के 700 डिग्री सेल्सियस को कॉलम में स्थानांतरित करें, 1 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम पर अपकेंद्रण, और lysate के शेष के साथ दोहराएँ।
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार washes और पर कॉलम DNase उपचार प्रदर्शन करते हैं। आरएनए-मुक्त जल के 30-50 डिग्री सेल्सियस में एल्यूट आरएनए।
- OD में एक fluorometer का उपयोग कर सांद्रता को मापने - 260 एनएम और 280 एनएम और -80 डिग्री सेल्सियस पर दुकान या बहाव अनुप्रयोगों के साथ जारी है.
6. organoids से प्रोटीन अलगाव
नोट: प्रोटीन अलगाव के लिए, फास्फेटेज और प्रोटीज़ इनहिबिटर(सामग्री की तालिका)युक्त मानक RIPA बफर तैयार करें। कम से कम तीन गुंबदों का उपयोग करने की सिफारिश की है, जो एक एकल 12 अच्छी तरह से बीज किया जा सकता है.
- एक P1000 पिपेट का उपयोग करना, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को बाधित करने के लिए organoids और पिपेट युक्त तहखाने झिल्ली गुंबदों के साथ सेल से माध्यम को आकर्षित.
- जब पूरी तरह से बाधित, एक 15 एमएल शंकु ट्यूब के लिए निलंबन हस्तांतरण. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
- सुपरनेंट को ड्रा करें और 5 एमएल बर्फ-ठंडा पीबीएस से धोएं। 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
- सुपरनेंट को ड्रा करें और ट्रिप्सिन प्रतिस्थापन के 4 एमएल में गोली को फिर से शुरू करें। 5-10 मिनट के लिए डाइजेस्ट जबकि 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए।
- trypsin प्रतिस्थापन को बाधित करने के लिए organoid मध्यम + 10% FCS के एक बराबर मात्रा जोड़ें. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
नोट: बाद centrifugation, कोई तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स गोली में दिखाई देना चाहिए. - सुपरनेंट को ड्रा करें और 5 एमएल बर्फ-ठंडा पीबीएस से धोएं। सुपरनेंट को ड्रा करें और एक P1000 पाइप्ट का उपयोग करके 300 डिग्री सेल्सियस lysis बफर में सेल गोली को फिर से चालू करें, फिर 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
- 10 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट और बाद में 4 डिग्री सेल्सियस के तापमान के साथ ठंडा पानी में 30 s प्रत्येक के लिए 2x sonicate। ट्यूब बर्फ पर वापस प्लेस और मानक तरीकों का उपयोग कर प्रोटीन परिमाणीकरण प्रदर्शन करते हैं।
- सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) को जोड़कर प्रोटीन को विकृत करें जिसमें लोडिंग डाई होता है और 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए उबाललें। -80 डिग्री सेल्सियस पर lysates स्टोर या बहाव अनुप्रयोगों के साथ जारी है।
7. organoids के साथ सेल व्यवहार्यता परख
नोट: सेल व्यवहार्यता व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेल व्यवहार्यता परख किट और एक luminometer का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है. निर्माता के निर्देशों के अनुसार बफ़र्स तैयार करें। हालत प्रति पांच प्रतिकृतिकी की सिफारिश की है: एक एक 24 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से एक अच्छी तरह से में एक 35 डिग्री एल तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स गुंबद से मिलकर दोहराने.
- organoid संस्कृति के माध्यम से ड्रा, मैट्रिक्स गुंबदों बरकरार छोड़ने के लिए सावधान किया जा रहा है.
- मैट्रिक्स गुंबद को बाधित करने के लिए पीबीएस और पिपेट के 65 डिग्री एल जोड़ें।
- सेल व्यवहार्यता परख किट बफर के 100 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और pipeting द्वारा resuspend.
- मिलाते हुए के साथ 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर इनक्यूबेट।
- एक गैर-translucent luminometer के लिए उपयुक्त प्लेट के लिए मिश्रण के 100 $L स्थानांतरण और सेल व्यवहार्यता परख किट के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार पढ़ने प्रदर्शन करते हैं।
8. xenografting के लिए organoids की तैयारी
नोट: organoids भी दोनों प्रतिरक्षा समझौता जानवरों में subcutaneous grafting के लिए अनुकूल हैं, साथ ही, isogenic चूहों. इंजेक्शन organoids vivo में भेद कर रहे हैं यह सुनिश्चित करने के लिए, एक गठन fluorophor5व्यक्त करने के साथ लेबल organoids. यह 5 x 105 कोशिकाओं का उपयोग कर के लिए एक पायलट प्रयोग करने के लिए सिफारिश की है 2 x 106 कोशिकाओं प्रति इंजेक्शन, 5 x 106 कोशिकाओं की वृद्धि के साथ, के रूप में grafting दक्षता organoid लाइनों के बीच भिन्न होता है.
- एक P1000 पिपेट का उपयोग करना, ऊपर और नीचे मध्यम और पिपेट आकर्षित तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को बाधित करने के लिए. जब पूरी तरह से बाधित, एक 15 एमएल शंकु ट्यूब के लिए निलंबन हस्तांतरण. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
नोट: प्रति 15 एमएल शंकु ट्यूब प्रति 10 से अधिक मैट्रिक्स गुंबदों को स्थानांतरित न करें। - सुपरनेंट से ड्रा करें और पीबीएस के 5 एमएल के साथ धो लें। 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
- सुपरनेंट को ड्रा करें और ट्रिप्सिन प्रतिस्थापन के 4 एमएल में गोली को फिर से शुरू करें। 5-10 मिनट के लिए डाइजेस्ट जबकि 37 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए।
- trypsin प्रतिस्थापन को बाधित करने के लिए organoid मध्यम + 10% FBS के बराबर मात्रा जोड़ें. 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
- सुपरनेंट को ड्रा करें और पीबीएस के 1 एमएल में फिर से निलंबित करें। एक एकल सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए एक 40 डिग्री मीटर फिल्टर के साथ निलंबन फ़िल्टर करें। मानक विधियों का उपयोग करके कोशिकाओं को मात्रा निर्धारित करें।
- नीचे स्पिन और पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित + Rho अवरोध करनेवाला की एकाग्रता के लिए 2 x 106 कोशिकाओं प्रति 100 $L (सेल सांद्रता और निरपेक्ष कोशिका संख्या अलग सांद्रता के लिए आवश्यक के लिए तालिका 2 देखें). एक 1:1 निलंबन उत्पन्न करने के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स के एक बराबर मात्रा का उपयोग करें. बर्फ पर निलंबन रखें.
- मानक प्रोटोकॉल के अनुसार कोशिकाओं को इंजेक्ट करें और मानक विधियों का उपयोग करके एक्सोग्रैफ्ट वृद्धि की निगरानीकरें 8.
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Representative Results
सीडिंग दक्षता
ऑर्गेनॉइड गठन क्षमता फीनोटाइप और जीनोटाइप द्वारा निर्धारित की जाती है। जंगली प्रकार (WT) प्रोस्टेट बेसल कोशिकाओं बेहतर organoid गठन क्षमता से पता चला (30%-40%) luminal कोशिकाओं की तुलना में (3%) (चित्र 1ए) organoid स्थापना के बाद, गठन क्षमता काफी वृद्धि हुई. आमतौर पर, एक WT organoid से व्युत्पन्न कोशिकाओं के 25%-30% एक नया organoid फार्म कर सकते हैं (चित्र 1बी). CRISPR/Cas9-मध्यस्थ की हानि Pten (Pten[/]या p53 (च53/ च् 53 तथा प्टेन दोनों की हानि ने निर्माण क्षमता में और वृद्धि की (चित्र 1ठ)।
औषधीय प्रतिक्रिया
बोने की क्षमता के आधार पर, एक 24 अच्छी तरह से थाली में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स गुंबद के 35 डिग्री एल में 1,000-10,000 कोशिकाओं का बोने प्रदर्शन किया गया था। ऑर्गनॉइड गठन दक्षता के आधार पर अनुशंसित सेल सीडिंग संख्या तालिका 1में प्रदान की गई है। हालांकि, organoid प्रसार गति बहुत जीनोटाइप के आधार पर अलग कर सकते हैं. कोशिका बोने की संख्या में अतिरिक्त परिवर्तन प्रसार के आधार पर किए जा सकते हैं।
चित्र 2 मेंविकास पर एंटी-एंड्रोजेनिक अणुओं के प्रभाव का विभिन्न जीनोटाइपों के साथ मरिन ऑर्गेनॉइड्स में परीक्षण किया गया। कुल 2,500 कोशिकाओं को एक WT जीनोटाइप, p53 हानि, Pten हानि, या दोहरी p53 और Pten हानि के साथ murine organoids से बीज थे. p53 और Pten हानि एक gRNA के lentiviral परिचय द्वारा शुरू किया गया था p53 और /या Pten locus organoids में contitutively व्यक्त Cas9 एक C57/Bl6 आनुवंशिक पृष्ठभूमि9के साथ Rosa26 प्रमोटर के नियंत्रण में.
च53 की हानि ने एंटी-एंड्रोजेनिक अणुओं का प्रतिरोध नहीं किया। Pten की हानि विरोधी एंड्रोजेनिक यौगिक के लिए प्रतिरोध में वृद्धि हुई, जैसा कि पहले दिखाया गया10. तथापि, च53 तथा प्टेन की दोहरी हानि के परिणामस्वरूप दूसरी पीढ़ी के एंटी-एंड्रोजन का पूर्ण प्रतिरोध हुआ(चित्र 2क)। ए.आर. संदमन ने ऑर्गेनॉयड फीनोटाइप्स को भी बदल दिया। नियंत्रण में Cas9+/+ organoids, साथ ही साथ P53] / -नष्ट कर दिया और Pten [ /organoids, organoid लुमेन आकार में कमी देखा गया था ( चित्र2बी) . च53/प्टेन ]/ इन परिणामों के अनुसार, जब 1 x 106 कोशिकाओं को पार्श्व में नीचे कलम किया गया था, तोकेवल च53/ कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चलता है कि p53 /Pten / / सह विलोपन murine organoids में दूसरी पीढ़ी के विरोधी एंड्रोजन के लिए प्रतिरोध में परिणाम.
रोगी व्युत्पन्न पी.सी.ए. ऑर्गनॉइड फीनोटाइप और जीनोटाइप11,12में विषमांगी होते हैं; इसलिए, दवाओं के लिए प्रतिक्रियाओं मानव पीसीए organoid लाइनों के बीच बहुत अलग कर सकते हैं. चित्र 3 मेंदो अलग-अलग मानव पी.सी.ए.ऑर्गेनॉइड्स, MSKPCA2 और MSKPCA3 की एंटी-एंड्रोजेनिक अणु प्रतिक्रिया दिखाई गई है। एमएसकेपीसीए2 ऑर्गेनॉइड्स का प्रसार एंटी-एंड्रोजेनिक अणुओं द्वारा दृढ़ता से बाधित किया गया था, जबकि एमएसकेपीसीए3 ऑर्गेनॉइड्स अप्रभावित रहे (चित्र 3ए, बी)। MSKCPCA2 organoids एआर और एआर लक्ष्य FKBP5 के उच्च स्तर व्यक्त की है, और वे ऐसे CK8 और CK18 के रूप में हॉलमार्क luminal प्रोटीन व्यक्त की. इसके विपरीत, MSKPCA3 organoids भी बेसल (CK5) और mesenchymal (Vimentin) मार्करों व्यक्त की और FKBP5 की कोई अभिव्यक्ति नहीं दिखाया. इन परिणामों से पता चलता है कि ये organoids एक गैर-लुमिनल एण्ड्रोजन स्वतंत्र phenotype मॉडल.
चित्र 1: मानव और माउस प्रोस्टेट कोशिकाओं के organoid गठन दरों को मापने. (क)बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स (बाएं) में कोशिका पुनर्निलंबन का योजनाबद्ध अवलोकन और मैट्रिक्स गुंबदों (दाएं) में ऑर्गनॉइड सीडिंग। (ठ)मानव के सापेक्ष organoid गठन (CD49f +)-व्युत्पन्न आधार और (CD26+)-व्युत्पन्न luminal कोशिकाओं (%, y-अक्ष; मतलब ] एसडी ) की उपस्थिति में 1 एनएम DHT. कुल 200 कोशिकाओं को बीज दिया गया था और organoids की संख्या 7 दिनों के बाद बीज (एन $ 3, * * पी और lt; 0.01, टी परीक्षण) मात्रा निर्धारित किया गया था। (ग ) मौरीन डब्ल्यूटी, प्टेन, च्53, तथा च्53 के सापेक्ष अंग-अंग 1 दM DHT की उपस्थिति में , और च्53/ कुल 200 कोशिकाओं को बीज दिया गया था और organoids की संख्या 7 दिनों के बाद बीज (द ] 3) मात्रा निर्धारित किया गया था. p53 और Pten हानि एक Rosa26 प्रमोटर के तहत Cas9 गठन व्यक्त organoids में p53 और /या Pten लोकों के gRNA के लक्ष्य द्वारा मध्यस्थता की गई थी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों से व्युत्पन्न organoids के औषधीय प्रतिक्रिया का आकलन. (ए ) मौरीन डब्ल्यूटी के सापेक्ष सेल प्रसार,पीटेन, च53,तथा च53 ]/ organoids; (द ] 3, *च और 0ण्05, त-परीक्षण) 1 एन एम DHT या दूसरी पीढ़ी के एंटीएंड्रोजेन के 10 डिग्री उ के साथ जैसा कि दर्शाया गया है। (ख) डट के प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियों, पस्टेन , च्53़ ,तथा च53] / (ग ) डब्लूटी के प्रतिनिधि विकास वक्र,प्टेन, च्53़़़ , तथा च53 ]/ केवल च्53र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र्ं र् कुल 1 x 106 कोशिकाओं को इंजेक्ट किया गया था। च्53 के तीन स्वतंत्र वक्रों को वृद्धि की गति में विषमता दर्शाने के लिए दर्शाया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: organoids व्युत्पन्न मानव प्रोस्टेट कैंसर बायोप्सी के औषधीय प्रतिक्रिया का आकलन. (क)रोगी व्युत्पन्न MSKPCA2 और MSKPCA2 organoids के सापेक्ष सेल प्रसार (y-अक्ष,मतलब ] एसडी, सेल व्यवहार्यता परख किट द्वारा मापा) 5,000 कोशिकाओं के 7 दिनों के बाद organoids की स्थापना (एन $ 4, * पी और 0.05, टी परीक्षण) 1 एनएम DHT या 10 डिग्री के साथ दूसरी पीढ़ी के विरोधी एण्ड्रोजन के रूप में संकेत दिया. (ख) MSKPCA2 और MSKPCA3 organoids संस्कृतियों के प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियों 1 एनएम DHT या 10 डिग्री एम दूसरी पीढ़ी के विरोधी एंड्रोजन के साथ इलाज के रूप में संकेत दिया. (सी) एमएसकेपीसीए2 और एमएसकेपीसीए3 में एआर, एफकेबीपी5 (एआर-लक्ष्य जीन), सीके 8 और सीके18 (ल्यूमिनल मार्कर), सीके 5 (बेसल मार्कर) और विमेन्टिन (मेसेन्काइमल मार्कर) का पश्चिमी दाग विश्लेषण। GAPDH एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
ऑर्गेनॉयड सीडिंग दक्षता (%) | सेल-सीडिंग संख्या (प्रति गुंबद) |
1-10% | 100000 |
10-20% | 5000 |
20-60% | 2500 |
60-100% | 1000 |
तालिका 1: कोशिका बीजसंख्या organoid गठन क्षमता के आधार पर औषधीय प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया। कॉलम द्वारा तालिका (बाएं से दाएं) में organoid गठन क्षमता पर्वतमाला और मैट्रिक्स गुंबद प्रति बीज के लिए कोशिकाओं की इसी संख्या शामिल है।
कुल कक्ष संख्या | पीबीएस0+ वाई-27632 | मैट्रिजेल मात्रा | सेल एकाग्रता / |
5 x 106 | 500 डिग्री सेल्सियस | 500 डिग्री सेल्सियस | 5 x 105 |
10 x 106 | 500 डिग्री सेल्सियस | 500 डिग्री सेल्सियस | 1 x 106 |
15 x 106 | 500 डिग्री सेल्सियस | 500 डिग्री सेल्सियस | 1.5 x 106 |
20 x 106 | 500 डिग्री सेल्सियस | 500 डिग्री सेल्सियस | 2 x 106 |
तालिका 2: organoid xenografting प्रयोगों के लिए अनुशंसित सेल संख्या. बाएँ से दाएँ कॉलम में 10 इंजेक्शन के लिए पूर्ण कुल सेल संख्या, पीबीएस की कुल मात्रा + Y-27632 10 इंजेक्शन के लिए, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स मात्रा, और इंजेक्शन प्रति सेल संख्या शामिल हैं।
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Discussion
आणविक तंत्र अंतर्निहित विरोधी एण्ड्रोजन प्रतिरोध को समझना और संभावित चिकित्सीय कमजोरियों की खोज प्रोस्टेट कैंसर की नकल मॉडल प्रणालियों में औषधीय प्रतिक्रियाओं के परीक्षण की आवश्यकता है. यहाँ वर्णित रोगी व्युत्पन्न और आनुवंशिक रूप से इंजीनियर प्रोस्टेट organoids और बहाव अनुप्रयोगों के लिए इन organoid नमूनों की तैयारी में औषधीय प्रतिक्रियाओं के विश्वसनीय विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल है.
इस प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण चरण हैं। पहले organoids के बीजिंग दक्षता और विकास दर का निर्धारण है. ऑर्गेनॉयड वृद्धि की गति बहुत भिन्न होती है। यह प्रजातियों पर निर्भर है, के रूप में murine व्युत्पन्न organoids के बारे में दो गुना तेजी से बढ़ने मानव व्युत्पन्न organoids. प्रजातियों के अलावा, विकास की गति जीनोटाइप और फीनोटाइप पर निर्भर है। हालांकि, जब बोने दक्षता और विकास की गति निर्धारित कर रहे हैं, इस प्रोटोकॉल सभी प्रोस्टेट organoid प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
दूसरा महत्वपूर्ण कदम प्रोटीन-मैट्रिक्स आधारित 3 डी संस्कृति के साथ काम कर रहा है बाद में बहाव अनुप्रयोगों के लिए तैयार करते हैं. चढ़ाना के दौरान तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स की चिपचिपापन द्वारा बोने भिन्नता की शुरूआत पतला (70%) का उपयोग करके बचा जा सकता है तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स, के रूप में वर्णित है. organoids परेशान बिना ठीक से बहुलक मैट्रिक्स को तोड़ने भी विस्तार से वर्णित है. इस प्रोटोकॉल organoid readout में भिन्नता शुरू करने के बिना मैट्रिक्स के विघटन में सक्षम बनाता है, जो पीसीए में विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के लिए दवा पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इसके अलावा, CRISPR/Cas9- या SHRNA-आधारित अभिव्यक्ति हस्तक्षेप करके, दवा प्रतिरोध प्रदान करने वाले जीनों से पूछताछ की जा सकती है।
विचार का एक बिंदु यह है कि प्रोस्टेट organoid संस्कृति के मध्यम संरचना औषधीय प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, EGF, दोनों murine और मानव प्रोस्टेट organoid संस्कृति का एक घटक, बहुत विरोधी एण्ड्रोजन के लिए संवेदनशीलता कम कर देता है. इसलिए, EGF इस प्रोटोकॉल में मध्यम से छोड़ा जाता है, और विरोधी एण्ड्रोजन के लिए संवेदनशीलता बहाल है. यह निर्धारित करने के लिए सलाह दी जाती है अगर किसी भी organoid सामग्री दवा परीक्षण किया जा रहा है के लिए संवेदनशीलता को प्रभावित. यह जटिल मानव प्रोस्टेट organoid संस्कृति माध्यम के लिए विशेष रूप से सच रखती है, जो (EGF के अलावा, नोगिन, आर-spondin1, DHT, और A83-001 [मरिन organoid माध्यम की संरचना]) फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक शामिल 10 (FGF2), prostaglandin E2, निकोटिनामिदे, और p38i अवरोधक SB202190.
organoid मध्यम संरचना कैंसर के ऊतकों पर सौम्य प्रोस्टेट उपकला के विकास के पक्ष में है, इस प्रकार कोई प्राथमिक हार्मोन संवेदनशील पीसीए organoid लाइनों की स्थापना की गई है. वर्तमान में, सभी मानव पीसीए organoids उन्नत मेटास्टैटिक विरोधी एण्ड्रोजन प्रतिरोधी पीसीए के साथ रोगियों से प्राप्त कर रहे हैं; इसलिए, इन लाइनों के अधिकांश विरोधी एण्ड्रोजन प्रतिरोधी और नए उपचार की पहचान करने के लिए उपयुक्त हैं. सबूत के रूप में अवधारणा, डेल्टा की तरह 3 (DLL3) रोगी व्युत्पन्न NEPC organoids कि rovalpituzumab tesirine13के साथ लक्षित कर रहे हैं का उपयोग कर एक चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में पहचान की गई है. इस विधि प्रयोगों के इन प्रकार के लिए उपयुक्त है और सामान्य सौम्य ऊतक से प्रोस्टेट organoids के लिए भी उपयुक्त है, प्राथमिक प्रोस्टेट कैंसर, और सीटीसी.
प्रोस्टेट organoid संस्कृति की एक कमी एक सेलुलर आला का अभाव है. इस प्रकार, गैर ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा दवा प्रतिरोध के लिए योगदान वर्तमान मंच का उपयोग कर अध्ययन नहीं किया जा सकता है. हालांकि, ऑटोलॉगस टी-कोशिकाओं के साथ कोलोरेक्टल कैंसर और फेफड़ों के कैंसर organoids की सह-संस्कृति हाल ही में स्थापित किया गया है, ट्यूमर और प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच बातचीत के अध्ययन को सक्षमकरने 14. अन्य सह-संस्कृति प्रणालियों को आगे गैर-सेल-स्वायत्त बातचीत का अध्ययन करने के लिए स्थापित किया जा सकता है।
अंत में, यह रिपोर्ट प्रोस्टेट organoids और बाद में बहाव अनुप्रयोगों में औषधीय प्रतिक्रियाओं के reproduible मूल्यांकन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है. महत्वपूर्ण बात यह है कि यह प्रोटोकॉल मोटे तौर पर लागू होता है और इसका उपयोग अन्य अंगों की अंगाद संस्कृतियों के लिए किया जा सकता है, जिनमें कोलन15, छोटी आंत16 , पेट17,18,यकृत19, अग्न्याशय20, गुर्दे21, और स्तन ग्रंथि22.
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Disclosures
सी.एल.एस. नोवार्टिस के निदेशक मंडल में कार्य करता है; ORIC फार्मास्यूटिकल्स के एक सहसंस्थापक और enzalutamide और apalutamide के coinventor है; Agios, Beigene, खाका, स्तंभ समूह, Foghorn, हाउसी फार्मा, नेक्सेच, KSQ, पेट्रा, और PMV के लिए एक विज्ञान सलाहकार है; और Seragon के एक सह संस्थापक है, Genentech द्वारा खरीदा / डब्ल्यू.आर.के. ऑर्गनॉइड प्रौद्योगिकी के एक सहआविष्कारक और पेटेंट धारक हैं।
Acknowledgments
के.पी. NIH 1F32CA236126-01 द्वारा समर्थित है. C.L.S. HHMI द्वारा समर्थित है; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; और स्टार कैंसर कंसोर्टियम. W.R.K. डच कैंसर फाउंडेशन/KWF Buit 2015-7545 और प्रोस्टेट कैंसर फाउंडेशन पीसीएफ 17YOUN10 द्वारा समर्थित है।
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
A83-01 | Tocris | 2939 | Organoid medium component: Final concentration 200 nM |
ADMEM/F12 | Gibco/Life technologies | 12634028 | Organoid medium component |
B27 | Gibco/Life technologies | 17504-044 | Organoid medium component |
Cell culture plates | Fisher | 657185 | |
Cell Titer Glo | Promega | G7571 | |
DHT | Sigma-Aldrich | D-073 | Organoid medium component: Final Concentration 1 nM |
DMSO | Fisher | BP231-100 | |
EGF | Peprotech | 315-09 | Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml |
FGF2 | Peprotech | 100-18B | Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml |
Glutamax | Gibco/Life technologies | 35050079 | Organoid medium component |
HEPES | MADE IN-HOUSE | N/A | Organoid medium component: Final concentration 10 mM |
Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) | Corning | CB-40230C | Organoid medium component |
N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM |
NOGGIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) | 120-10C | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml |
Penicillin/Streptavidin | Gemini Bio-Products | 400-109 | Organoid medium component |
Phospatase inhibitors | Merck Millipore | 524629 | |
Prostaglandin E2 | Tocris | 3632464 | |
Protease Inhibitors | Merck Millipore | 539131 | |
R-SPONDIN | Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) | 120-38 | Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml |
RIPA buffer | Merck | 20-188 | |
RNA-easy minikit | Qiagen | 74104 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | 152121-30-7 | Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM |
TryplE | ThermoFisher | 12605036 | |
Y-27632 | Selleckchem | S1049 | Organoid medium component: Final Concentration 10 μM |
References
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