Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Genotipleri ve Mutasyonel Profilleri Farmakolojik Tepkilere Çeviren Araçlar Olarak Prostat Organoid Kültürleri

Published: October 24, 2019 doi: 10.3791/60346

Summary

Burada sunulan prostat epitel organoidleri farmakolojik yanıtları çalışma için bir protokoldür. Organoidler vivo biyolojiye çok benzer ler ve hasta genetiğini yeniden özetlerler, bu da onları çekici model sistemleri haline getirir. Prostat organoidleri wildtype prostatlar, genetiği değiştirilmiş fare modelleri, iyi huylu insan dokusu ve ileri prostat kanserinden kurulabilir.

Abstract

Burada sunulan bir protokol farmakodinamik çalışma, kök hücre potansiyeli, ve prostat epitel organoidlerde kanser farklılaşması. Prostat organoidleri, prostatik epiteli andıran tanımlanmış bir ortamda yetişen androjen duyarlı, üç boyutlu (3D) kültürlerdir. Prostat organoidleri vahşi tip ve genetiği değiştirilmiş fare modelleri, iyi huylu insan dokusu ve ileri prostat kanserinden kurulabilir. Daha da önemlisi, hasta kaynaklı organoidler genetik ve in vivo tümör biyolojisindeki tümörlere çok benzerler. Ayrıca, organoidler CRISPR/Cas9 ve shRNA sistemleri kullanılarak genetik olarak manipüle edilebilir. Bu kontrollü genetik, genotiplerin ve mutasyonprofillerinin farmakolojik yanıtlar üzerindeki etkilerini hızla test etmek için bir platform olarak organoid kültürü cazip kılmaktadır. Ancak, deneysel protokoller özellikle tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için organoid kültürlerin 3D doğaya adapte edilmelidir. Burada tanımlanan organoid oluşum kapasitesini belirlemek için tohumlama tahlilleri gerçekleştirmek için ayrıntılı protokoller vardır. Daha sonra, bu rapor ilaç tedavilerini nasıl gerçekleştireceklerini ve canlılık ölçümleri, protein izolasyonu ve RNA izolasyonu yoluyla farmakolojik yanıtın nasıl analiz edilebildiğini göstermektedir. Son olarak, protokol, organoidlerin ksenogreftleme için nasıl hazırlanacağını ve subkutan greftleme kullanılarak in vivo büyüme testlerinin nasıl hazırlanacağını açıklamaktadır. Bu protokoller son derece tekrarlanabilir veriler sağlar ve 3B kültür sistemleri için yaygın olarak uygulanabilir.

Introduction

İlaç direnci kanser tedavisinde önemli klinik sorunlardan biridir. Metastatik prostat kanseri (PCa) tedavisi öncelikle androjen sinyal eksenine yöneliktir. Yeni nesil anti-androjen tedavileri (örneğin, enzalutamide ve abiraterone) büyük klinik başarı göstermiştir, ama hemen hemen tüm PCa sonunda bir androjen-bağımsız devlet doğru ilerler, ya da kastrasyona dirençli prostat kanseri (CRPC).

CRPC'nin son genomik ve transkripsiyon profili prostat kanserinde üç genel direnç mekanizması olduğunu ortaya koymuştur: 1) androjen reseptörünün (AR)sinyalizasyonuile sonuçlanan mutasyonları aktive eder 1; 2) bypass sinyalaktivasyonu, yeni nesil anti-androjen tedavi direnci için bir ön klinik modelde örneklendiği gibi hangi glukokortikoid reseptöraktivasyonu (GR) AR sinyal kaybı telafi edebilir2; ve 3) tümör hücrelerinin ilaç hedefine bağımlı bir hücre tipinden buna bağımlı olmayan başka bir hücre tipine geçiş yaparak direnç kazandığı soy plastisite süreci (PCa'da AR-negatif olarak temsil edilir) ve/veya nöroendokrin hastalık [NEPC])3,4. Ancak, ilaç direncine neden olan moleküler mekanizmalar anlaşılamamıştır. Ayrıca, edinsel anti-androjen direnci yararlanılabilir terapötik güvenlik açıklarına yol açabilir. Bu nedenle, hasta fenotiplerini ve genotipleri taklit eden model sistemlerde ilaç yanıtlarını değerlendirmek esastır.

Prostat organoidleri tanımlanmış bir ortama sahip 3Boyutlu protein matrisinde yetişen organotipik kültürlerdir. Daha da önemlisi, prostat organoidler murin veya insan kökenli iyi huylu ve kanserli doku kurulabilir, ve onlar in vivo bulunan henotypic ve genotypik özellikleri korumak5,6. Daha da önemlisi, hem anti-androjen duyarlı PCa ve CRPC hücreleri organoidlerin mevcut özet temsil edilmektedir. Ayrıca, prostat organoidleri kolayca genetik CRISPR /Cas9 ve shRNA5kullanılarak manipüle edilir. Bu nedenle, prostat organoidleri ilaç yanıtlarını test etmek ve direnç mekanizmalarını açıklamak için uygun bir model sistemdir. Burada, prostat organoidleri kullanarak ilaç testi yapmak ve farmakolojik yanıtları analiz etmek için ayrıntılı bir protokol tanımlanmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokolde tanımlanan tüm çalışmalar daha önce kurulmuş olan murine organoidler ve hasta kaynaklı organoidler ile gerçekleştirilmiştir. Tüm hayvan çalışmaları Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi Araştırma Hayvan Kaynak Merkezi yönergelerine uygun olarak yapılmıştır (IACUC: 06-07-012). Tüm hasta kaynaklı dokular Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi 'nin (IRB: 12001) kural ve yönetmeliklerine uygun olarak toplanmıştır.

1. Orta ve tampon hazırlama

  1. Deneye başlamadan önce bir gecede 4 °C'de çözülen bazal membran matrisi (örneğin, Matrigel). Kullanım sırasında buzüzerinde tutun.
  2. Kültür plakalarını deneylerden önce 24 saat boyunca 37 °C'ye yerleştirin. Bu polimerize bodrum membran matris kubbe (bundan böyle matris kubbe olarak anılacaktır) yardımcı olacaktır. Kaplama organoidleri adım 2.1.2 olarak tanımlanır.
  3. Organoid ortamı belirlenen protokol5'egöre hazırlayın.
  4. Epidermal büyüme faktörü eklemeden organoid ortamı hazırlayın (EGF; komponentler için Malzeme Tablosu'na bakın). EGF AR transkripsiyonel çıktı bastırır ve anti-androjen direnciconfers 5.
  5. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ile Dulbecco Modifiye Kartal orta (DMEM) hazırlayın.
    NOT: Bu ortam bölüm 2-4'te tripsin replasmanı ile enzimatik sindirimi inhibe etmek için kullanılır.
  6. Üreticinin protokolüne göre ilaç çözümleri hazırlayın. Enzalutamide/mdv3100 (bundan böyle ikinci nesil anti-androjen olarak anılacaktır) için, dimetil sülfoksit (DMSO) 100 μM'lik bir stok çözeltisi hazırlayın. Stok -20 °C'de 6 aya kadar saklanabilir ve taze olarak yapılmak zorunda değildir.

2. İzolasyon, enzimatik sindirim ve organoidlerin kurulması

  1. Daha önce kurulmuşprotokolleregöre fare veya insan dokusundan prostat organoidleri izole5 ,7. Kısa bir açıklama aşağıda verilmiştir.
    1. Kıyma ve enzimatik tek bir hücre süspansiyon üretmek için prostat dokususindirmek. Bu deneyde ADMEM/F12'de 5mg/mL kollajenaz tip II'nin 1 mL'si prostat dokusunun 50 mg sindirimi için kullanıldı.
    2. 5 dakika için 300 x g santrifüj ile hücreleri toplamak, hücreleri saymak, bazal membran matris onları yeniden askıya almak, ve uygun yoğunlukta plaka5,7 önceden ısıtılmış organoid kültür plakaları üzerinde matris kubbeler (kaplama yöntem Şekil 1A'dagösterilmiştir.
    3. Kubbelerin katılaşmasını ve kubbelerin üstlerine ortam eklemesine izin verin ki tamamen kaplanmış olacak.
  2. Aşağı akım uygulamaları için organoidleri istenilen miktarda büyütün. Hücre numarası standart sayma yöntemleri ile belirlenebilir. Yoğunluk la ilgili ek ayrıntılar için protokolün uygulamaya özel bölümüne bakın.
  3. P1000 pipet kullanarak, orta ve pipet yukarı ve aşağı bozmak için çizin. Bazal membran matrisi tamamen bozulduğunda süspansiyonu 15 mL konik bir tüpe aktarın. Tek 15 mL konik tüp başına 10'dan fazla kubbe yerleştirmeyin. Santrifüj 300 x g 5 dk.
  4. Supernatant çekin ve PBS 5 mL ile hücre pelet yıkayın. Santrifüj 300 x g 5 dk.
  5. Supernatant çekin ve tripsin replasmanın4 mL pelet resuspend. 37 °C'de sallayarak 5-10 dakika sindirin. Tripsin replasmanı inhibe etmek için eşit hacimli organoid ortam + %10 FBS ekleyin. Santrifüj 300 x g 5 dk.
  6. Supernatant kapalı çekin ve PBS 1 mL resuspend.
  7. Tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için süspansiyonu 40 μm filtre ile filtreleyin. Hemositometre veya eşdeğer sayma cihazı kullanarak hücre numarasını ölçün.
    NOT: Tek hücreli tek hücreleri elde etmek zorsa, tek hücreli bir çözüm elde etmek için akış sıralamasını kullanın.

3. Organoid oluşum kapasitesinin değerlendirilmesi

NOT: Organoid oluşturabilen hücrelerin yüzdesini belirlemek için, kök/ata potansiyeli için bir tohumlama tonu yapılabilir. Organoid oluşum kapasitesi de canlılık tahlilleri için bir hücre tohumlama numarası tanımlamak için önemlidir.

  1. 10 μM Rho kinaz inhibitörü Y-27632 içeren organoid ortam kullanarak süspansiyonun 10 μL'si başına 2,7 ila 100 hücre de elde edilen hücre süspansiyonu seyreltin.
  2. 1.100 hücreyi (110 μL süspansiyon) yeni bir konik tüpe aktarın.
  3. 285 μL'lik bazal membran matrisi ekleyin ve hücreleri yeniden askıya alın. Bu ~ 70% matris konsantrasyonu neden olacaktır.
    NOT: Tohumlama sırasında bazal membran matrisinin seyreltilmesi, protein matrisinin viskozitesinin neden olduğu kubbe büyüklüğündeki değişimi büyük ölçüde azaltır.
  4. Önceden ısıtılmış 24 kuyu plakalı matris kubbelerin 35 μL'lik tohum hücreleri 200 hücre/kuyu ile sonuçlanır. Plaka 3-5 örnek başına çoğaltma (ayrıca Şekil 1A ve adım 2.1.2'deki kaplama yöntemine de bakınız).
  5. Hücrelerin matris kubbe içinde kalmasını sağlamak için, plaka yıkın ve bir hücre kuluçka içine yerleştirin bodrum membran matris katılaşmak için.
  6. 10 dakika sonra, kuvözden plakayı çıkarın ve Rho kinez inhibitörü içeren ortam ekleyin.
  7. Ortamı 2 günde bir yenileyin. 7 gün sonra organoid sayısını ölçün. Rho kinazininhibitörlerini deney boyunca medyada tutun.
  8. Kubbe başına kurulan organoid lerin sayısını sayın ve kaplanmış toplam hücre sayısından (200 hücre) oluşan organoidlerin yüzdesini hesaplayın.
    NOT: Organoid kuruluş oranları hücre tipine ve genotiplerine bağlı olarak %3-60 arasında değişmektedir.

4. Organoidlerin farmakolojik yanıtlarının belirlenmesi

  1. Adım 2.7'den itibaren, bir matris kubbede 1.000-10.000 hücre tohum. Son hücre numarasını belirlemek için organoid oluşum verimliliğini ve büyüme hızını bir proxy olarak kullanın.
    NOT: Önerilen hücre numaraları Tablo 1'deverilmiştir. Çözümleme başına koşul başına üç ila beş çoğaltma kullanın. Viskozitenin neden olduğu borulama hatalarını azaltmak için %70'lik son konsantrasyonu kullanın.
  2. 24 kuyu plakalı matris kubbelerin 35°L'lik tohumu ve kubbelerin bölüm 3'te yapıldığı gibi katılamasına izin verin (Şekil 1A ve adım 2.1.2'deki kaplama yöntemine de bakınız). Rho kinaz inhibitörü ve tercih edilen ilaç içeren orta ekleyin. Bu yöntem tüm ilaçlara uygulanabilir, ancak bu protokolde örneğin 10 μM'de ikinci nesil anti-androjen kullanılır. Yarım maksimal inhibitör konsantrasyonu belirlemek için (IC50), bir log10 artımlı gerçekleştirmek, ve bir kontrol olarak, ilacın çözündolduğu araç kullanın.
  3. Her iki veya üç günde bir orta yenileyin ve ilacın farmakolojik yanıtını belirlemek için 7. Zaman dilimleri deney ve ilaç seçimi arasında değişebilir.
    NOT: Organoidlerin bu tahlilleri yapabilmeleri için dengeleniye gerek yoktur.
  4. Bir P1000 pipet kullanarak organoidleri sağlam tutmak için, orta ve pipet yukarı ve aşağı bodrum membran matris bozmak için çizin.
  5. Bazal membran matrisi tamamen bozulduğunda süspansiyonu 15 mL konik bir tüpe aktarın. 15 mL konik tüp başına 10'dan fazla matris kubbe aktarmayın.
  6. Santrifüj 300 x g için 5 dk. Supernatant çekin ve 5 mL PBS ile yıkayın.
  7. 1 mL PBS'deki organoidleri yeniden askıya alın ve triturasyon ve cam Pasteur pipet kullanarak organoidleri bozun.
  8. Organoid parçalarının sayısını ölçün. Tohum 5, adım 2.1.2'de açıklandığı gibi 100 organoid parçasını içeren kopyalar.
  9. Bölüm 7'de aşağıda açıklandığı şekilde hücre canlılığı tayini gerçekleştirin.

5. Organoidlerden RNA izolasyonu

NOT: Ticari olarak kullanılabilen sütun tabanlı yöntemler, RNA'nın iyi miktarda ve kalitesisağlar. İyi miktarda RNA sağlamak için, örnek başına en az bir kubbe kullanın; ancak, üç kubbe kullanarak tavsiye edilir, hangi bir 12 kuyu plaka tek bir kuyuda tohumlanmış olabilir.

  1. ß-mercaptoethanol ekle (%1) RNA izolasyon kitinde glutatyon lisis tampon.
  2. Organoidler içeren bodrum membran kubbelerden orta çekin ve bu tampon 750 ° L ekleyin. P1000 pipetkullanarak pipet yukarı ve aşağı. Tüm temel membran matrisinin çözülmüş olup olmadığını kontrol edin.
  3. %70 etanol 750 μL ekleyin ve pipetleme ile karıştırın. Daha sonra karışımın 700 μL'sini kolona aktarın, 12.000 x g'de 1 dk santrifüj yapın ve kalan kısmı yla tekrarlayın.
  4. Üreticinin talimatlarına göre yıkar ve kolon da DNase tedavisi ni gerçekleştirin. 30-50 μL RNAse içermeyen suda elute RNA.
  5. Konsantrasyonları OD = 260 nm ve 280 nm'de bir florometre kullanarak ölçün ve -80 °C'de saklayın veya akış aşağı uygulamalarına devam edin.

6. Organoidlerden protein izolasyonu

NOT: Protein izolasyonu için fosfataz ve proteaz inhibitörleri içeren standart RIPA tamponu hazırlayın(Malzeme Tablosu). En az üç kubbe kullanılması tavsiye edilir, hangi tek bir 12 kuyuda tohumlanabilir.

  1. Bir P1000 pipet kullanarak, temel membran matris bozmak için yukarı ve aşağı organoidler ve pipet içeren bodrum membran kubbeler ile hücreden orta çizin.
  2. Tamamen bozulduğunda, süspansiyonu 15 mL konik bir tüpe aktarın. Santrifüj 300 x g 5 dk.
  3. Supernatant çekin ve buz gibi PBS 5 mL ile yıkayın. Santrifüj 300 x g 5 dk.
  4. Supernatant çekin ve tripsin replasmanın4 mL pelet resuspend. 37 °C'de sallayarak 5-10 dakika sindirin.
  5. Tripsin replasmanı inhibe etmek için eşit hacimli organoid ortam + %10 FCS ekleyin. Santrifüj 300 x g 5 dk.
    NOT: Santrifüj sonrası pelette hiçbir bazal membran matrisi görünmemelidir.
  6. Supernatant çekin ve buz gibi PBS 5 mL ile yıkayın. Supernatant çekin ve bir P1000 pipet kullanarak lysis tampon 300 μL hücre pelet yeniden askıya, sonra 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
  7. 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka ve daha sonra 4 ° C sıcaklıkta soğutulmuş suda 30 s her için 2x sonicate. Tüpü tekrar buzun üzerine yerleştirin ve standart yöntemlerle protein nicelemesi yapın.
  8. 95 °C'de 5 dakika kaynatın ve yükleme boyası içeren sodyum dodecyl sülfat (SDS) ekleyerek proteinden arındırın. -80 °C'de depolayın veya akış aşağı uygulamalarına devam edin.

7. Organoidler ile hücre canlılığı tsay

NOT: Hücre canlılığı, ticari olarak kullanılabilen hücre canlılığı titrekiti ve luminometre kullanılarak değerlendirilebilir. Üreticinin talimatlarına göre arabellek hazırlayın. Durum başına beş çoğaltma önerilir: bir çoğaltma bir 35 μL bodrum membran matris kubbe bir kuyuda oluşan 24 kuyu plaka.

  1. Matris kubbeleri sağlam bırakmak için dikkatli olmak, organoid kültürün orta çekin.
  2. Matris kubbesini bozmak için 65 μL PBS ve pipet ekleyin.
  3. Hücre canlılık isame kiti arabelleği 100 μL ekleyin ve pipetleme ile yeniden askıya alın.
  4. Sallayarak 10 dakika oda sıcaklığında (RT) kuluçka.
  5. 100 μL karışımı luminometreye uygun olmayan yarı saydam bir plakaya aktarın ve hücre canlılığı ölçüm kiti için üreticinin talimatlarına göre okuma yapın.

8. Ksenogreftleme için organoidlerin hazırlanması

NOT: Organoidler, hem bağışıklık sistemi zayıf olan hayvanlarda hem de İzojenik farelerde deri altı greftleme için de uygundur. Enjekte edilen organoidlerin in vivo olarak ayırt edilebilmesini sağlamak için, florofor5'ioluşturan bir şekilde ifade eden organoidleri etiketletir. Aşılama verimi organoid çizgiler arasında değiştiğinden, enjeksiyon başına 5 x10 6 hücreye 5 x 106 hücre kullanılarak aşılama için pilot deney yapılmasını tavsiye edilir.

  1. Bir P1000 pipet kullanarak, orta ve pipet yukarı ve aşağı bodrum membran matris bozmak için çizin. Tamamen bozulduğunda, süspansiyonu 15 mL konik bir tüpe aktarın. Santrifüj 300 x g 5 dk.
    NOT: 15 mL konik tüp başına 10'dan fazla matris kubbe aktarmayın.
  2. Supernatant çekin ve PBS 5 mL ile yıkayın. Santrifüj 300 x g 5 dk.
  3. Supernatant çekin ve tripsin replasmanın4 mL pelet resuspend. 37 °C'de sallayarak 5-10 dakika sindirin.
  4. Trippsin replasmanı inhibe etmek için eşit hacimli organoid ortam + %10 FBS ekleyin. Santrifüj 300 x g 5 dk.
  5. Supernatant kapalı çekin ve PBS 1 mL resuspend. Tek bir hücre süspansiyonu sağlamak için süspansiyonu 40 μm filtre ile filtreleyin. Hücreleri standart yöntemlerle ölçün.
  6. PBS + Rho inhibitöründeki hücreleri 100 μL'de 2 x 106 hücre konsantrasyonuna geri döndürün (değişen konsantrasyonlar için gerekli hücre konsantrasyonları ve mutlak hücre sayısı için Tablo 2'ye bakın). 1:1 süspansiyon oluşturmak için eşit hacimli bodrum membran matrisi kullanın. Süspansiyonu buza yerleştirin.
  7. Hücreleri standart protokollere göre enjekte edin ve standart yöntemlerle ksenogreft büyümesini izleyin8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tohumlama verimliliği
Organoid oluşum kapasitesi fenotip ve genotip ile belirlenir. Yabani tip (WT) prostat bazal hücreleri üstün organoid oluşum kapasitesi (%30-%40) gösterdi luminal hücrelere göre (%3) (Şekil 1A). Organoid kurulmasından sonra oluşum kapasitesi önemli ölçüde artmıştır. Tipik olarak, WT organoidinden elde edilen hücrelerin %25-30'u yeni bir organoid oluşturabilir(Şekil 1B). CRISPR/Cas9 aracılı Pten (PtenΔ/Δ)veya p53 (p53Δ/Δ)kaybı organoid oluşum kapasitesinde küçük bir artışa neden oldu. Hem p53 hem de Pten'in kaybı oluşum kapasitesini daha da artırmıştır (Şekil 1B).

Farmakolojik yanıt
Tohumlama verimliliğine göre, 24 kuyu plakalı bazal membran matris kubbenin 35 μL'sinde 1.000-10.000 hücrenin tohumlanması yapılmıştır. Organoidoluşum etkinliğine dayalı önerilen hücre tohumlama sayıları Tablo 1'de verilmiştir. Ancak, organoid proliferasyon hızları genotip bağlı olarak büyük ölçüde farklı olabilir. Hücre tohumlama numarasında çoğalmaya dayalı ek değişiklikler yapılabilir.

Şekil 2'deanti-androjenik moleküllerin büyüme üzerindeki etkileri farklı genotiplere sahip murine organoidlerinde test edildi. WT genotip, p53 kaybı, Pten kaybı veya çift p53 ve Pten kaybı ile toplam 2.500 hücre murine organoidlerden tohumlandı. p53 ve Pten kaybı organoidlerde p53 ve/veya Pten çekirgesini hedefleyen bir gRNA'nın lentiviral olarak tanıtılmasıyla başlatıldıveCas9'u C57/Bl6 genetik arka plan 9 ile Rosa26 organizatörünün kontrolü altında ifade etti.

P53 kaybı anti-androjenik moleküllere direnç neden olmadı. Pten kaybı anti-androjenik bileşiğe karşı direnci ni arttırmıştır, daha önce gösterildiği gibi10. Ancak, p53 ve Pten'in çift kaybı, ikinci nesil anti-androjene karşı tam direnç le sonuçlandı (Şekil 2A). AR inhibisyonu da organoid fenotipleri değiştirdi. Kontrolde Cas9+/+ organoidlerin yanı sıra P53Δ/Δ-silinmiş ve PtenΔ/Δ organoidlerinde organoid lümen boyutunda azalma gözlenmiştir (Şekil 2B). p53Δ/Δ PtenΔ/Δ organoidler fenotipik olarak etkilenmemiştir (Şekil 2B). Bu sonuçlar doğrultusunda, 1 x 106 hücre kanadında deri altı aşılandığında, sadece p53Δ/Δ PtenΔ/Δ organoidler büyüdü (Şekil 2C). Genel olarak, bu sonuçlar p53Δ/Δ PtenΔ/Δ co-deletion'ın ikinci nesil anti-androjene karşı direnç le sonuçverdiğini göstermektedir.

Hasta kaynaklı PCa organoidleri fenotip ve genotip11,12; bu nedenle, ilaçlara yanıtlar insan PCa organoid hatları arasında büyük ölçüde farklı olabilir. Şekil 3'teiki farklı insan PCa organoidi MSKPCA2 ve MSKPCA3'ün anti-androjenik moleküller yanıtı gösterilmiştir. MSKPCA2 organoidlerinin çoğalması anti-androjenik moleküller tarafından güçlü bir şekilde inhibe edilirken, MSKPCA3 organoidleri etkilenmemiş olarak kalmıştır(Şekil 3A,B). MSKCPCA2 organoidleri yüksek düzeyde AR ve AR-hedef FKBP5'i ifade ettiler ve CK8 ve CK18 gibi luminal proteinleri ifade ettiler. Buna karşılık, MSKPCA3 organoidler de bazal (CK5) ve mezenkimal (Vimentin) belirteçleri ifade ve FKBP5 hiçbir ifade gösterdi. Bu sonuçlar, bu organoidlerin luminal androjen-bağımsız fenotip modeli olduğunu göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: İnsan ve fare prostat hücrelerinin organoid oluşum oranlarının ölçülmesi. (A) Bazal membran matrisinde (solda) hücre süspansiyonunun şematik bakışı ve matris kubbelerde (sağda) organoid tohumlama. (B) 1 nM DHT varlığında insan (CD49f+)-türetilmiş bazal ve (CD26+)-türetilmiş luminal hücreler (%, y-ekseni; ortalama ± SD) göreceli organoid oluşumu. Toplam 200 hücre tohumlandı ve organoid sayısı tohumlamadan sonra 7 gün olarak ölçüldü (n = 3, ***p < 0.01, t-testi). (C) Bağıl organoid oluşumu murine WT, PtenΔ/Δ, P53Δ/Δ, ve P53Δ/Δ PtenΔ/Δ organoidler (%, y-eksen; ortalama ± SD) varlığında 1 nM DHT. Toplam 200 hücre tohumlandı ve organoid sayısı tohumlamadan 7 gün sonra sayısallaştırılmıştır (n = 3). p53 ve Pten kaybı, gRNA'nın bir Rosa26 organizatörü altında Cas9'u oluşturan organoidlerde p53 ve/veya Pten lokusu hedeflemesi ile aracılık edilebildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Genetik olarak tasarlanmış farelerden elde edilen organoidlerin farmakolojik yanıtının değerlendirilmesi. (A) Murine WT, PtenΔ/Δ,P53Δ/Δve P53Δ/Δ PtenΔ/Δ organoidlerinin(y-eksen, ortalama ± SD, hücre canlılık tahse kiti ile ölçülen) göreli hücre çoğalması 7 gün sonra organoidler; (n = 3, *p < 0.05, t-test) ile 1 nM DHT veya 10 μM ikinci nesil antiandrojen belirtilir. (B) WT, PtenΔ/Δ, P53Δ/Δve P53Δ/Δ PtenΔ/Δ organoid kültürlerin 1 nM DHT veya 10 μM ikinci nesil anti-androjen ile tedavi edilen temsili parlak alan görüntüleri belirtilir. (C) WT, PtenΔ/Δ, P53Δ/Δve P53Δ/Δ PtenΔ/Δ organoidlerinin temsili büyüme eğrisi, İzojenik C57/Bl6 farelerinin kanadında enjekte edilir. Sadece P53Δ/Δ PtenΔ/Δ organoidleri büyüme gösterdi. Toplam 1 x 106 hücre enjekte edildi. P53Δ/Δ PtenΔ/Δ organoidlerinin üç bağımsız eğrisinin büyüme hızında heterojenliği gösterdiği gösterilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Organoidlerin farmakolojik yanıtının değerlendirilmesi insan prostat kanseri biyopsileri türemiştir. (A) Hasta kaynaklı MSKPCA2 ve MSKPCA2 organoidlerinin(y-eksen, ortalama ± SD, hücre canlılık testi kiti ile ölçülen) 5.000 hücrenin organoidlerin kurulmasından 7 gün sonra (n = 4, *p < 0.05, t-testi) 1 nM DHT veya 10 μM ile göreceli hücre çoğalması belirtildiği gibi ikinci nesil anti-androjen. (B) MSKPCA2 ve MSKPCA3 organoidlerinin temsili brightfield görüntüleri belirtildiği gibi 1 nM DHT veya 10 μM ikinci nesil anti-androjen ile tedavi edilir. (C) MSKPCA2 ve MSKPCA3 organoidlerinde AR, FKBP5 (AR-hedef geni), CK8 ve CK18 (luminal belirteçler), CK5 (bazal marker) ve Vimentin (mezenkimal marker) batı leke analizi. GAPDH yükleme kontrolü olarak kullanılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Organoid tohumlama verimi (%) Hücre tohumlama sayısı (kubbe başına)
1-10% 100000
10-20% 5000
20-60% 2500
60-100% 1000

Tablo 1: Farmakolojik yanıtı organoid oluşum kapasitesine göre değerlendirmek için kullanılan hücre tohumlama numaraları. Sütuna tablo (soldan sağa) organoid oluşum kapasite aralıkları ve matris kubbe başına tohum için karşılık gelen hücre sayısını içerir.

Toplam Hücre Numarası PBS0+ Y-27632 Matrigel hacmi hücre konsantrasyonu / Enjeksiyon
5 x 106 500 μl 500 μl 5 x 105
10 x 106 500 μl 500 μl 1 x 106
15 x 106 500 μl 500 μl 1,5 x 106
20 x 106 500 μl 500 μl 2 x 106

Tablo 2: Organoid ksenogreftleme deneyleri için önerilen hücre numaraları. Soldan sağa sütunlar 10 enjeksiyon için mutlak toplam hücre numarası, 10 enjeksiyon için PBS + Y-27632 toplam hacmi, bodrum membran matris hacmi ve enjeksiyon başına hücre numarası içerir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Anti-androjen direncinin altında yatan moleküler mekanizmaların anlaşılması ve potansiyel terapötik zayıflıkların keşfedilmesi, prostat kanserini taklit eden model sistemlerde farmakolojik yanıtların test edilmesini gerektirir. Burada açıklanan hasta kaynaklı ve genetiği değiştirilmiş prostat organoidlerinde farmakolojik yanıtların güvenilir analizi ve bu organoid örneklerinin downstream uygulamaları için hazırlanması için ayrıntılı bir protokoldür.

Bu protokolde iki kritik adım vardır. Bunlardan ilki, organoidlerin tohumlama verimliliğini ve büyüme oranını belirlemektir. Organoid büyüme hızı büyük ölçüde değişir. Bu türe bağlıdır, çünkü minüri türdeki organoidler insan kaynaklı organoidlerden yaklaşık iki kat daha hızlı büyürler. Türlerin dışında büyüme hızı genotip ve fenotip bağlıdır. Ancak tohumlama verimi ve büyüme hızı belirlendiğinde bu protokol tüm prostat organoid tiplerine uyarlanabilir.

İkinci kritik adım, sonraki downstream uygulamalarına hazırlanmak için protein-matris tabanlı 3D kültürü ile çalışmaktır. Kaplama sırasında bodrum membran matrisinin viskozitesi ile tohumlama varyasyonunun tanıtılması seyreltilmiş (%70) kullanılarak önlenebilir olarak, bazal membran matris. Düzgün organoidler rahatsız etmeden polimerize matris kırma da ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Bu protokol, PCa'da farklı genetik arka planlar için ilaç kütüphanelerinin taranması için uyarlanabilen organoid okumada varyasyon getirilmeden matrisin bozulmasına olanak sağlar. Ayrıca CRISPR/Cas9 veya shRNA tabanlı ekspresyon paraziti gerçekleştirerek ilaç direncini gösteren genler sorgulanabilir.

Bir husus prostat organoid kültürünün orta bileşimi farmakolojik yanıtı etkileyebilir. Örneğin, EGF, hem murine ve insan prostat organoid kültürünün bir bileşeni, büyük ölçüde anti-androjen duyarlılığı azaltır. Bu nedenle, EGF ortamdan bu protokolde atlanır ve anti-androjen duyarlılığı geri yüklenir. Herhangi bir organoid maddeler test edilen ilaç için duyarlılığı etkilemek olup olmadığını belirlemek için tavsiye edilir. Bu özellikle karmaşık insan prostat organoid kültür ortamı için geçerlidir, hangi (dışında EGF, Noggin, R-spondin1, DHT, ve A83-001 [murine organoid orta bileşimi]) fibroblast büyüme faktörü 10 (FGF10), FGF2, prostaglandin E2, nikotinamid ve p38i inhibitörü SB202190.

Organoid orta bileşimi kanser dokusu üzerinde benign prostat epitel büyümesini tercih, böylece hiçbir birincil hormon duyarlı PCa organoid hatları kurulmuştur. Şu anda, tüm insan PCa organoidler ileri metastatik anti-androjen dirençli PCa olan hastalardan elde edilir; bu nedenle, bu hatların çoğu anti-androjen dirençli ve yeni tedaviler tanımlamak için uygundur. Kanıt-of-concept olarak, delta gibi 3 (DLL3) rovalpituzumab tesirine13ile hedeflenebilir hasta kaynaklı NEPC organoidler kullanarak terapötik bir hedef olarak tespit edilmiştir. Bu yöntem bu tür deneyler için uygundur ve normal benign doku, primer prostat kanseri ve CtCs prostat organoidleri için de uygundur.

Prostat organoid kültürünün bir eksiklik hücresel niş yokluğudur. Bu nedenle, tümör olmayan hücreler tarafından ilaç direncine katkıları mevcut platform kullanılarak çalışılamaz. Ancak, otolog T-hücreleri ile kolorektal kanser ve akciğer kanseri organoidlerin co-kültürleri son zamanlarda kurulmuş, tümör ve bağışıklık sistemi arasındaki etkileşimlerin çalışmaları sağlayan14. Hücre özerk olmayan etkileşimleri daha fazla incelemek için başka ortak kültür sistemleri kurulabilir.

Sonuç olarak, bu rapor prostat organoidlerinde farmakolojik yanıtların ve daha sonraki downstream uygulamalarının tekrarlanabilir değerlendirilmesi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Daha da önemlisi, bu protokol geniş uygulanabilir ve kolon15dahil olmak üzere diğer organların organoid kültürler için kullanılabilir, ince bağırsak16 , mide17,18, karaciğer19, pankreas20, böbrek21, ve meme bezi22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

C.L.S Novartis yönetim kurulunda görev yapmaktadır; ORIC İlaç kurucularından ve enzalutamide ve apalutamid coinventor olduğunu; Agios, Beigene, Blueprint, Column Group, Foghorn, Housey Pharma, Nextech, KSQ, Petra ve PMV'nin bilim danışmanıdır; 2014 yılında Genentech/Roche tarafından satın alınan Seragon'un kurucularındandır. W.R.K. bir coinventor ve organoid teknoloji patent sahibidir.

Acknowledgments

K.P. NIH 1F32CA236126-01 tarafından desteklenir. C.L.S. HHMI tarafından desteklenir; CA193837; CA092629; CA224079; CA155169; CA008748; ve Starr Kanser Konsorsiyumu. W.R.K. Hollanda Kanser Vakfı/KWF Buit 2015-7545 ve Prostat Kanseri Vakfı PCF 17YOUN10 tarafından destekleniyor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A83-01 Tocris 2939 Organoid medium component: Final concentration 200 nM
ADMEM/F12 Gibco/Life technologies 12634028 Organoid medium component
B27 Gibco/Life technologies 17504-044 Organoid medium component
Cell culture plates Fisher 657185
Cell Titer Glo Promega G7571
DHT Sigma-Aldrich D-073 Organoid medium component: Final Concentration 1 nM
DMSO Fisher BP231-100
EGF Peprotech 315-09 Organoid medium component: Final concentration 50 ng/ml for mouse, 5 ng/nl for Human
FGF10 Peprotech 100-26 Human specific organoid medium component: Final concentration 10 ng/ml
FGF2 Peprotech 100-18B Human specific organoid medium component: Final concentration 5 ng/ml
Glutamax Gibco/Life technologies 35050079 Organoid medium component
HEPES MADE IN-HOUSE N/A Organoid medium component: Final concentration 10 mM
Matrigel (Growthfactor reduced & Phenol Red free) Corning CB-40230C Organoid medium component
N-Acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165 Organoid medium component: Final concentration 1.25 mM
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636 Human specific organoid medium component: Final concentration 10 mM
NOGGIN Peprotech or stable transfected 293t cells with Noggin construct (Karthaus et al. 2014) 120-10C Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 100 ng/ml
Penicillin/Streptavidin Gemini Bio-Products 400-109 Organoid medium component
Phospatase inhibitors Merck Millipore 524629
Prostaglandin E2 Tocris 3632464
Protease Inhibitors Merck Millipore 539131
R-SPONDIN Peprotech or stable transfected 293t cells with R-Spondin1 construct (Karthaus et al. 2014) 120-38 Organoid medium component: Final Concentration 10% conditioned medium or 500 ng/ml
RIPA buffer Merck 20-188
RNA-easy minikit Qiagen 74104
SB202190 Sigma-Aldrich 152121-30-7 Human specific organoid medium component: Final concentration 10 μM
TryplE ThermoFisher 12605036
Y-27632 Selleckchem S1049 Organoid medium component: Final Concentration 10 μM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162 (2), 454 (2015).
  2. Arora, V. K., et al. Glucocorticoid Receptor Confers Resistance to Antiandrogens by Bypassing Androgen Receptor Blockade. Cell. 155 (6), 1309-1322 (2013).
  3. Ku, S. Y., et al. Rb1 and Trp53 cooperate to suppress prostate cancer lineage plasticity, metastasis, and antiandrogen resistance. Science. 355 (6320), 78-83 (2017).
  4. Mu, P., et al. SOX2 promotes lineage plasticity and antiandrogen resistance in TP53- and RB1-deficient prostate cancer. Science. 355 (6320), 84-88 (2017).
  5. Karthaus, W. R., et al. Identification of Multipotent Luminal Progenitor Cells in Human Prostate Organoid Cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  6. Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  7. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nature Protocols. 11 (2), 347-358 (2016).
  8. Bose, R., et al. ERF mutations reveal a balance of ETS factors controlling prostate oncogenesis. Nature. 546 (7660), 671-675 (2017).
  9. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  10. Carver, B. S., et al. Reciprocal feedback regulation of PI3K and androgen receptor signaling in PTEN-deficient prostate cancer. Cancer Cell. 19 (5), 575-586 (2011).
  11. Puca, L., et al. Patient derived organoids to model rare prostate cancer phenotypes. Nature Communications. 9 (1), 2404 (2018).
  12. Gao, D., et al. Organoid Cultures Derived from Patients with Advanced Prostate Cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  13. Puca, L., et al. Delta-like protein 3 expression and therapeutic targeting in neuroendocrine prostate cancer. Science Translational Medicine. 11 (484), eaav0891 (2019).
  14. Dijkstra, K. K., et al. Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids. Cell. 174 (6), 1586-1598 (2018).
  15. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  16. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  17. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell stem cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  18. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  19. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  20. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  21. Schutgens, F., et al. Tubuloids derived from human adult kidney and urine for personalized disease modeling. Nature Biotechnology. 37 (3), 303-313 (2019).
  22. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. , 1-25 (2017).

Tags

Kanser Araştırmaları Sayı 152 prostat organoidleri prostat kanseri ikinci nesil anti-androjenler ilaç direnci primer hücre kültürü prostat model sistemleri
Genotipleri ve Mutasyonel Profilleri Farmakolojik Tepkilere Çeviren Araçlar Olarak Prostat Organoid Kültürleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pappas, K. J., Choi, D., Sawyers, C. More

Pappas, K. J., Choi, D., Sawyers, C. L., Karthaus, W. R. Prostate Organoid Cultures as Tools to Translate Genotypes and Mutational Profiles to Pharmacological Responses. J. Vis. Exp. (152), e60346, doi:10.3791/60346 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter