Summary
Forniamo un protocollo per l'isolamento della microglia da diverse regioni sezionate di un emisfero cerebrale adulto, seguito dalla preparazione della libreria semiautomatica per il sequenziamento profondo dell'RNA unicellulare di trascrittomi a lunghezza intera. Questo metodo aiuterà a chiarire l'eterogeneità funzionale della microglia in salute e malattia.
Abstract
Come macrofagi residenti nel sistema nervoso centrale, microglia controllano attivamente lo sviluppo cerebrale e l'omeostasi, e le loro disfunzioni possono guidare le malattie umane. Sono stati compiuti notevoli progressi per scoprire le firme molecolari della microglia omeostatica e le alterazioni della loro espressione genica in risposta agli stimoli ambientali. Con l'avvento e la maturazione delle metodologie genomiche unicellulari, è sempre più riconosciuto che la microglia eterogina può essere alla base dei diversi ruoli che svolgono in diverse condizioni di sviluppo e patologiche. Un'ulteriore dissezione di tale eterogeneità può essere ottenuta attraverso un isolamento efficiente delle microglia da una determinata regione di interesse, seguito da una profilazione sensibile delle singole cellule. Qui, forniamo un protocollo dettagliato per il rapido isolamento della microglia da diverse regioni del cervello in un singolo emisfero certo adulto. Dimostriamo anche come utilizzare queste microglia ordinate per il sequenziamento profondo dell'RNA a cellule a base di piastre. Discutiamo l'adattabilità di questo metodo ad altri scenari e forniamo linee guida per migliorare il sistema per accogliere studi su larga scala.
Introduction
Le microglia, che rappresentano il 5%-10% di tutte le cellule neurali, sono macrofagi residenti sparsi in tutto il sistema nervoso centrale (SNC)1. Protetto dietro barriera emato-encefalica, microglia tipica in un cervello adulto sano contengono molti processi fini che si estendono rapidamente e si ritraggono per interagire con i neuroni e altre cellule gliali nel parenchyma. La microglia può anche adottare la morfologia ameboide associata ad una maggiore funzione fagocitica durante specifiche fasi di sviluppo o su sfide immunitarie in lesioni e malattie1,2,3,4. Recenti scoperte entusiasmanti hanno chiaramente dimostrato che le microglia non sono affatto astanti passivi a segnali derivati dal cervello o patologici, ma svolgono un ruolo fondamentale nel controllo dello sviluppo cerebrale e dell'omeostasi, ad esempio, sostenendo la sopravvivenza neuronale, potando sinapsi immature, promuovendo la differenziazione delle cellule lignaggio oligodocito e l'asgiogenesi1 . Man mano che le funzioni della microglia sono chiarite, l'eccitazione è ulteriormente alimentata da studi di genetica umana, che hanno dimostrato che molti geni del rischio di malattie neurodegenerative, come TREM2, sono prevalentemente o esclusivamente espressi da microglia5,6,7. Data la loro importanza nello sviluppo e nei plausibili ruoli guidati dalle malattie, recentemente è stato compiuto un enorme sforzo verso la nostra comprensione della regolazione genica microgliale e della funzione nella speranza di trovare nuovi bersagli terapeutici per le malattie neurodegenerative1,8.
Il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) consente una caratterizzazione imparziale dell'espressione genica specifica del tipo di cellula, che a sua volta guida gli scienziati a studiare le funzioni geniche nelle reti cellulari dense7. L'RNA-seq era stato fatto per lo più su campioni sfusi, portando alla scoperta di una firma del gene microgliale omeostatica che li distingue da altre cellule neurali e immunitarie9. Tuttavia, un tale approccio potrebbe trascurare le differenze molecolari e funzionali tra le microglia, in particolare quelle temporanee presenti in fase di sviluppo o associate all'invecchiamento e alla malattia. Infatti, RNA-seq unicellulare (scRNA-seq) offre la sensibilità e la risoluzione che hanno rivoluzionato il campo rivelando l'eterogeneità della microglia precedentemente sottovalutata in una varietà di contesti2,3,10. Inoltre, a causa della presenza di altre cellule immunitarie simili all'interfaccia di circolazione del CNS, scRNA-seq fornisce informazioni che aiutano la progettazione di nuovi strumenti per separare e sezionare funzionalmente queste cellule correlate con poca conoscenza precedente2,11.
È stata inventata una vasta gamma di piattaforme scRNA-seq, ognuna adatta per determinate applicazioni12. In generale, i metodi basati sulle goccioline, come 10x Genomica, sono più elevati in termini di produttività con (decine di) migliaia di cellule sequenziate in ogni esecuzione e sono meno selettivi per l'input che può contenere popolazioni di cellule miste che richiedono un'ampia categorizzazione. I metodi a base di piastre forniscono una maggiore sensibilità e profondità di lettura13,14, di solito mirando a popolazioni specifiche dallo smistamento delle cellule per rivelare sottili differenze o trascrizioni rare. Data la piccola percentuale di cellule microgliali, in particolare quelle sottopopolazioni associate allo sviluppo o alla malattia, tra tutti i tipi di cellule SNC, è spesso auspicabile isolare la microglia da una specifica regione di interesse e ottenere informazioni trascrittomiche profonde e complete per comprenderne l'eterogeneità.
Qui, forniamo dettagli su come isolare microglia da diverse regioni del cervello del topo sezionate da un singolo emisfero, che vengono utilizzate per l'RNA-seq a singola cellula (o alla rinfusa) seguendo una procedura di preparazione della libreria semi-automatica basata su lamiere. L'altro emisfero può quindi essere utilizzato per la convalida istologica. Semplificato da un metodoprecedentementepubblicato 9 , questo protocollo di isolamento mira a massimizzare la resa da piccole quantità di materiali di partenza, e nel frattempo mantenere profili di espressione genica microgliale endogeni. Utilizziamo lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) per arricchire la microglia (o altre cellule immunitarie correlate di interesse) in piastre di 96 pozze e diimentare i volumi di reagenti per la preparazione della biblioteca al fine di aumentare la produttività. Mettiamo in evidenza questa piattaforma scRNA-seq sensibile, anche se possono essere applicate altre strategie basate su piastre. Questo metodo può essere facilmente adattato per isolare microglia da altri tessuti sezionati, come lesioni o foci di malattia, e l'età del topo può variare in quasi tutti gli stadi postnatali. L'isolamento efficiente della microglia regionale per gli studi sulla trascrittomica a una cellula faciliterà una migliore comprensione delle loro funzioni in materia di salute e malattia.
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Protocol
Tutte le procedure che coinvolgono roditori sono conformi alle linee guida della Stanford University, che rispettano le leggi e le politiche nazionali e statali. Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal gruppo amministrativo della Stanford University sulla cura degli animali da laboratorio.
NOT: Tutte le composizioni di soluzioni e buffer sono disponibili nella Tabella dei materiali.
1. Preparazione il giorno dell'isolamento cellulare
- Preparare i seguenti reagenti e raffreddarli sul ghiaccio: medio A (50 mL), buffer di smistamento cellulare ad attivazione magnetica (30 mL), buffer FACS (25 mL), salina con buffer fosfato (PBS; 30 mL), DNase (320 zL) e inibitore di RNase (30 l).
NOT: I volumi qui forniti sono sufficienti per isolare microglia da 4 regioni cerebrali (ad esempio, corteccia, cervelletto, ippocampo e striato) di un singolo emisfero cerebrale del topo. Scalabilità verticale se vengono utilizzati più tessuti. - Mettete quattro omogeneizzatori puliti da 2 mL sul ghiaccio e aggiungete 2 mL di mezzo A con 80 gradi di DNase (12.500 unità/mL) e 5 luna di inibitore di RNase in ogni omogeneizzatore Dounce. Raffreddare i pistoni in tubi da 15 mL.
- Etichettare quattro piatti Petri da 6 cm con regioni cerebrali per la raccolta dei tessuti e aggiungere 200 l di mezzo freddo A in ogni piatto sul ghiaccio. Aggiungere circa 5 mL di mezzo A in un piatto Petri di 6 cm per la dissezione.
NOT: Prima dell'uso, assicurarsi che tutti i reagenti siano sterili e adatti per applicazioni di RNA. Gli utensili da banco e dissezione devono essere puliti e spruzzati con la soluzione di decontaminazione RNase (Tabella dei materiali).
2. Dissezione della Regione del Cervello
NOT: Questo passaggio dovrebbe richiedere 30 min.
- Iniettare nel peritoneo di un topo da giovane a stamiche da giovane a xilometro (>1 mese di vita).
NOT: Un topo maschio è usato qui per illustrazione, ma entrambi i sessi sono adatti. - Attendere 5 min e pizzicare una zampa posteriore per garantire la mancanza di retrazione.
- Utilizzare immediatamente un ago da 26 G x 3/8 per eseguire la perfusione transcardiale con 20-30 mL di PBS ghiacciato fino a quando il buffer non si esaurisce senza sangue visibile.
- Decapitare il topo con un paio di forbici chirurgiche. Utilizzare piccole forbici per tagliare aprire la pelle per esporre il cranio sottostante, e poi tagliare attraverso la sutura sagittale, sutura lambdoidal e sutura coronale. Utilizzare pinze per tirare fuori entrambi i lati dell'osso parietale e dell'osso interparietale senza danneggiare il tessuto, e spostare con attenzione il cervello nella dissezione piatto Petri con mezzo A.
- Utilizzare una lama pre-raffreddata per tagliare il cervello attraverso la linea mediana in due emisferi.
NOT: Le quattro regioni cerebrali qui descritte da un singolo emisfero producono un numero sufficiente di microglia per applicazioni RNA-seq singole o sfuse. L'altro emisfero può essere utilizzato per l'immunostochimica o l'RNA nella convalida in situ. - Separare il cervelletto dal lobo corticale e dal tronco encefalico con #55 pinze e trasferire il tessuto in un piatto Petri di raccolta.
- Utilizzare #55 pinze per sezionare con attenzione l'ippocampo e lo striato dalla corteccia e trasferire ogni tessuto in un piatto Petri di raccolta.
3. Dissociazione dei tessuti meccanici
NOT: Mantenere le cellule e reagenti fresco tutto il tempo tranne durante le fasi di colorazione. Questo passaggio dovrebbe richiedere 30 min.
- Tritare ogni tessuto cerebrale con una lama di rasoio in pezzi <1 mm3 fini.
- Utilizzare 1 mL pipette (con punte tagliate) per trasferire i pezzi di tessuto negli omogeneizzatori Dounce pre-raffreddati, ciascuno contenente 2 mL di media A con inibitore DNase e RNase.
- Omogeneizzare il tessuto ruotando lentamente il pistone dentro e fuori l'omogeneizzatore dounce per 6-10 colpi completi, fino a quando non sono presenti pezzi visibili.
NOT: Douncing uccide i neuroni e la maggior parte delle altre cellule gliali, ma lasciare le cellule microgliali piuttosto intatte. Sia l'insufficiente che l'esagerazione possono portare a un basso rendimento delle cellule. - Trasferire i tessuti dissociati in tubi da 50 mL attraverso ceppi di 70 m.
- Sciacquare ogni omogeneizzatore e pistone Dounce con un totale di 6 mL di mezzo freddo A e filtrare la soluzione di risciacquo attraverso lo stesso colino nel tubo corrispondente.
- Trasferire le sospensioni a singola cella (circa 8 mL ciascuna) in tubi conici da 15 mL e centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi con freno 5.
4. Rimozione della mielina
NOT: Questo passaggio dovrebbe richiedere 60 min.
- Preparare 1 colonna di esaurimento di grandi dimensioni (LD) (per la corteccia) e 3 colonne di selezione ampia (LS) (per le altre 3 regioni) in un separatore magnetico (Tabella dei materiali). Risciacquare ogni colonna con 3 mL di buffer MCS.
- Una volta terminata la centrifuga, pipetta fuori e scartare il supernatale senza disturbare il pellet. Per i tessuti della corteccia e del cervelletto, risospendere le cellule in buffer MCS da 850 litri con 1,8 gradi di inibitore di RNase. Per i tessuti ippocampo e striato, risospendere le cellule in 400 - L di buffer MCS con 0,9 .
NOT: Le colonne (LD vs LS) e il volume utilizzato per la sospensione sono ottimizzati in base alla quantità di mielina presente nel tessuto. Se altre regioni del cervello sono sapientemente, queste condizioni potrebbero essere necessario regolare a seconda delle dimensioni del tessuto e quanto mielina può esistere. L'efficacia della rimozione della mielina può essere stimata al passo 4.9. - Aggiungete 100 l di perline di rimozione della mielina ciascuna nelle cellule della corteccia e del cervelletto e aggiungete 50 -L di rimozione della mielina ciascuna nelle cellule dell'ippocampo e dello striato.
- Mescolare delicatamente le cellule con perline e incubare i tubi sul ghiaccio per 10 min.
- Portare il volume del tubo con cellule corticali a 2 mL con buffer MCS, e tutti gli altri a 1 mL (cioè, aggiungere 1 mL per le cellule corticali; 500 L per le cellule ippocampali e striacali; non c'è bisogno di aggiungere buffer alle cellule cerebellari).
- Una volta che le colonne sono vuote di tampone di risciacquo, posizionare un tubo da 15 mL sotto ogni colonna. Caricare le celle corticali (2 mL) nella colonna LD e tutte le altre (1 mL ciascuna) sulle colonne LS. Utilizzare immediatamente 1 mL di buffer MCS ciascuno per lavare i tubi originali e caricare la soluzione sulle colonne corrispondenti.
- Lavare la colonna LD una volta con 1 mL di buffer MCS e lavare ogni colonna LS due volte con 1 mL di tampone MCS ogni lavaggio. Continuare a raccogliere la soluzione di flusso attraverso durante il lavaggio.
- Filtrare le cellule in tubi FACS rotondi attraverso i tappi del colino da 35 m.
NOT: Ogni tubo dovrebbe raccogliere circa 4 mL di sospensione a cella singola impoverito di mielina. - Facoltativamente, prendere 10 l della sospensione cellulare e mescolare con 10 .L di 0,4% soluzione di trypan blu. Esaminare le cellule al microscopio a campo luminoso 10 volte per stimare la resa, il tasso di sopravvivenza e il livello di mielina residua.
NOT: Una preparazione di successo dovrebbe generare oltre il 90% di cellule vive (di forma rotonda ed escludendo il colorante blu) con poco o nessun detriti di mielina. - Celle di pellet nei tubi FACS a 400 x g per 5 min a 4 gradi centigradi, con freno 5. Versare lentamente supernatali e tamponare il bordo del tubo su carta velina. Risospendere le cellule in ogni tubo con 300 l di tampone FACS.
NOT: Se lo smistamento MCS è preferito, perline CD11b possono essere utilizzate per selezionare microglia e altre cellule mieloidi dopo la rimozione della mielina. Queste cellule possono quindi essere utilizzate per lo scRNA-seq non a base di piastra e per l'RNA-seq sfuso. L'avvertenza di questo approccio alternativo è che le perline CD11b non separano microglia da altre cellule immunitarie correlate che sono anche positive per questo antigene.
5. Colorazione per lo smistamento delle celle attivato dalla fluorescenza
NOT: Questo passaggio dovrebbe richiedere 40 min.
- Aggiungere 5 -L di topo Fc recettori blocco reagente (Tabella dei materiali) in ogni tubo. Incubare per 5 min sul ghiaccio.
- Aggiungete 1 - L di CD45-PE-Cy7 e 1 - L di CD11b-BV421 in ogni tubo.
NOT: Possono essere utilizzati anticorpi con altri fluorofori coniugati. È inoltre possibile includere anticorpi contro TMEM119, un marcatore specifico per la microglia omeostatica9,ma si consiglia di essere utilizzati insieme a CD45 e CD11b, perché alcune sottopopolazioni di microglia possono perdere l'espressione superficiale di TMEM119. - Incubare i tubi su uno shaker per 10 min a temperatura ambiente (RT).
- Aggiungere 2 mL di tampone FACS per lavare.
- Cellule di Pellet a 4 gradi centigradi, 400 x g per 5 min. versare lentamente supernatali e tamponare il bordo del tubo su carta velina. Risospendere le cellule in ogni tubo utilizzando 400 l di TAC tampone con 1 L di inibitore di RNase e 0,5 L di propidio iodide (PI, 1:1,000 diluizione).
6. Ordinamento FACS indice
NOT: Questo passaggio dovrebbe richiedere 1 h.
- Seguendo la procedura FACS standard, disegnare cancelli in base a dispersione (esclusi detriti), singole cellule, cellule vive (PI negativo), microglia e cellule mieloidi (CD45,CD11b).
NOT: Le cellule microgliali tipiche esprimono CD45 a livelli inferiori rispetto ad altri macrofagi associati ai confini, come i macrofagi perivascolari e meningei, e quindi gating su CD45 basso CD11b- dovrebbe essere sufficiente se il focus della ricerca sono profili di espressione genica in queste microglia classiche1,2. Tuttavia, alcuni sottoinsiemi di microglia possono avere una maggiore espressione cd45 e questo è particolarmente vero durante lo sviluppo o in condizioni di malattia. Per garantire un'analisi imparziale dell'espressione genica microgliale, i immunofenotipi alti e CD45 sono registrati tramite l'ordinamento degli indici ed entrambe le popolazioni raccolte per il sequenziamento e l'analisi a valle. Inoltre, l'espressione superficiale di TMEM119 può essere utilizzata per indirizzare la popolazione microgliale omeostatica (cfr. passo 5.2) e analizzata insieme ai livelli di CD45 e ai risultati del sequenziamento. - Ordinare le microglie singole (con un ugello di 100 m) in piastre di reazione a catena di polimerasi 96-well (PCR), contenenti 4 l'lofilisi tamponare ogni pozzo (vedere il protocollo pubblicato14 per i dettagli).
NOT: Il mix di RNA spike-in (Tabella dei materiali) del Consorzio esterno per il controllo dell'RNA (ERCC) può essere aggiunto a 1:2,4 x 107 nel buffer di lisi per il controllo della qualità e la normalizzazione2. - Vorticare brevemente le piastre e girare verso il basso utilizzando una centrifuga panca-top.
- Congelare immediatamente i campioni sul ghiaccio secco. Conservare le piastre a -80 gradi centigradi fino alla preparazione della biblioteca.
NOT: In alternativa, più cellule possono essere raccolte in tubi da 1,5 mL con buffer di estrazione dell'RNA per RNA-seq sfuso. Secondo l'esperienza degli autori, 3.000 cellule sono sufficienti per generare librerie di buona qualità seguendo il protocollo pubblicato2,14.
7. Preparazione della libreria di sequenziamento di RNA a cella singola
NOT: Qui, il protocollo pubblicato14 è seguito per generare librerie scRNA-seq con l'aiuto della robotica di movimentazione dei liquidi e alcune modifiche. In questo articolo, la procedura viene descritta solo brevemente e le differenze vengono evidenziate. La lavorazione simultanea di 4 piastre richiede circa 2,5 giorni.
- Scongelare le piastre sul ghiaccio ed eseguire la trascrizione inversa con il primer Oligo-dT30VN (nel buffer di lisi) per generare cDNA con riciclati termici (Tabella 1): 42 C 90 min; 70 s 5 min; attesa a 4 gradi centigradi. Quindi amplificare cDNA con un ulteriore passo di digestione di eonucleale all'inizio (Tabella 2) utilizzando il mix master PCR e primer in situ PCR (ISPCR) ( Tabelladei materiali) e la seguente condizione pcR: 37 . 95 C 3 min; 23 cicli di 98 s C 20 s, 67 c 15 s, 72 c 4 min; 72 c 5 min.
- Purificare il cDNA utilizzando 18 l'l di perline magnetiche per pozzo (rapporto 0,7:1). Incubare la piastra su un supporto magnetico per 5 min e lavare i campioni due volte con l'80% di etanolo appena fatto, 80 l per ogni volta. Dopo aver asciugato la piastra per 15-20 min, elute cDNA con 20 l di tampone di eluizione per pozzo.
NOT: Per il controllo della qualità, utilizzare un analizzatore di frammenti (analisi dei frammenti di nuova generazione ad alta sensibilità , 1,6.000 bp) per controllare le distribuzioni delle dimensioni e le concentrazioni di cDNA, e solo ulteriori campioni di processo con uno striscio compreso tra 500,5.000 bp e superiore a 0,05 ng/L. - Per generare librerie, mescolare 0,4 l di ogni campione di cDNA con 1,2 di reagenti di tagmenttazione Tn5 dal kit di preparazione della libreria (Tabella dei materiali) in una piastra di 384 pozzetti con l'aiuto di una macchina di tubi nanoliteri, a 55 c 10 min.
NOT: In questo caso, viene aggiunto 1/12,5 del volume di reazione suggerito (5 campione L e 15 l di reagenti di tagmentation) al fine di ridurre i costi e nel frattempo aumentare la produttività. Una macchina di pipettatura nanolitera (Tabella dei materiali) viene utilizzata per trasferire reagenti (questo e seguendo passaggi) da e a 384 pozze. - Aggiungete 0,4 l di buffer di neutralizzazione per fermare la reazione di tagment a RT per 5 min.
- Aggiungere 384 indici (Tabella dei materiali, 0,4 L in avanti e 0,4 ll di miscela PCR su campioni (2 ll ciascuno) e amplificare le librerie utilizzando la seguente condizione: 72 C 3 min; 95 s 30 s; 10 cicli di 95 gradi centigradi, 55 gradi centigradi 30 s, 72 c 1 min; 72 c 5 min.
- Raggruppare insieme tutte le singole librerie (prendere 1 X) dalla stessa piastra 384-po' e utilizzare perline magnetiche (Rapporto Tabella dei materiali, 0,7:1) per purificare le librerie raggruppate finali.
- Utilizzare un fluorometro (Tabella dei materiali) per misurare le concentrazioni e un bioanalisi ( Tabella deimateriali) per esaminare le distribuzioni delle dimensioni delle librerie raggruppate prima del sequenziamento. Puntare la profondità di sequenziamento a 1 milione di letture non elaborate per cella.
- Seguire le procedure bioinformatiche standard per filtrare e tagliare le letture di sequenziamento ed eseguire l'allineamento2. Utilizzare la tabella di conteggio e i metadati come input per eseguire l'analisi del clustering con il pacchetto Seurat15.
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Representative Results
Questo protocollo descrive un metodo per isolare e ordinare microglia da diverse regioni del cervello in un emisfero cerebrale perfuso adulto, seguito da scRNA-seq. Usiamo il douncing per creare sospensioni a singola cellula e anche come primo passo per arricchire la microglia. Insufficiente o sovradosso riduce la resa. Inoltre, cervelli di topi adulti contengono alti livelli di mielina, che può anche ridurre l'efficienza di selezione e la resa se non rimosso correttamente. Pertanto, esaminiamo la sospensione cellulare al microscopio utilizzando trypan blu e un emocitometro per stimare la resa, la vitalità cellulare e l'efficacia della rimozione della mielina (passaggio 4.9) prima di eseguire la colorazione degli anticorpi (Figura 1). Il numero totale di cellule a questo punto dovrebbe essere superiore a 30.000 per la corteccia e oltre 5.000 per altri tessuti. Oltre il 90% delle cellule dovrebbe essere vitale con piccoli detriti di mielina.
Usiamo una macchina FACS per smistare microglia (o cellule mieloidi), che sono tipicamente CD45 basso e CD11b positivo. Almeno per il tessuto corticale, un isolamento riuscito dovrebbe generare oltre l'80% di microglia da tutte le singole cellule vive (Figura 2). La popolazione morta/morta rappresenta solo una piccola frazione della preparazione (circa il 10%).
Una volta che le microglie individuali vengono catturate nel buffer di lisi, l'RNA viene rilasciato e successivamente invertito in cDNA, che viene poi amplificato per 23 cicli. È importante controllare la qualità di questi campioni di cDNA, almeno una parte di essi, prima di creare librerie. Come piattaforma di elettroforesi capillare, l'analizzatore di frammenti e i kit di frammenti NGS ad alta sensibilità (1,6000 bp) forniscono informazioni rapide e accurate sulla distribuzione delle dimensioni e sulla quantità di molecole di cDNA presenti in ogni pozzo di una piastra di 96 pozzetti (Figura 3A). Per creare librerie possono essere utilizzati campioni che mostrano uno striscio (500-5.000 bp) e al di sopra di una determinata soglia di concentrazione (ad esempio, 0,05 ng/L). Analogamente, le librerie in pool devono essere testate su un bioanalizzatore prima del sequenziamento (Figura 3B).
Sequenziamo i campioni ad una profondità di oltre 1 milione di letture grezze per cellula, che satura la potenza di rilevamento di questa metodologia scRNA-seq16. Con circa il 60% di velocità di mappatura, è possibile rilevare oltre 2.000 geni per cellula microgliale. Abbiamo ottenuto dati pubblicati che sono stati generati utilizzando questo metodo di isolamento17, e dimostrano la sua riproducibilità da esperimenti indipendenti e sensibilità per rilevare geni specifici della microglia attraverso la popolazione sequenziata (Figura 4).
Figura 1: Stima della resa di isolamento della microglia, vitalità cellulare ed efficienza della rimozione della mielina. Il pannello sinistro mostrava l'immagine del campo luminoso (4x ingrandimento) delle cellule colorate blu trypan (dalla corteccia) dopo aver attraversato le colonne di rimozione della mielina. I risultati per altre regioni appariranno simili ma con un numero inferiore di celle. La stragrande maggioranza (se non tutte) delle cellule è apparso luminoso (non macchiato) e rotondo a causa della perdita di processi. L'immagine a destra era lo zoom-in (20x) della zona in scatola e piccoli detriti di mielina era presente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Cancelli utilizzati per lo smistamento della microglia. I dati hanno mostrato la strategia di selezione delle microglia dalla corteccia e la stessa strategia è stata utilizzata per altre regioni. I detriti cellulari sono stati prima esclusi dal grafico a dispersione e le singole celle sono state sbarrate dall'area di dispersione in avanti (FSC-A)/larghezza di dispersione in avanti (FSC-W). Le cellule vive sono state gateed da PI colorazione negativa, che erano da circa 90% di tutte le singole cellule. Microglia, che rappresenta circa l'80% delle cellule vive, sono stati ordinati dal cancello CD45 basso CD11b. Un totale di 30.000 dollari di microglia potrebbe essere isolato e smistato dal tessuto della corteccia (da un emisfero di un topo vecchio di 3 mesi). L'ordinamento degli indici è stato eseguito su una macchina FACS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Risultati rappresentativi del controllo qualità per cDNA amplificato da una singola cellula microgliale e da un'eventuale libreria in pool. (A) Utilizzando un analizzatore di frammenti, tutti i frammenti vengono tracciati con le loro dimensioni sull'asse X e relativa intensità di fluorescenza sull'asse Y, a significare l'abbondanza di una determinata dimensione cDNA. LM (marcatore inferiore, 1 bp) e UM (marcatore superiore, 6.000 bp) stanno caricando marcatori con concentrazioni note utilizzate per misurare la quantità cDNA. L'amplificazione del cDNA da una cellula microgliale rappresentativa forma una curva (linea tratteggiata verde) sul grafico di distribuzione delle dimensioni o uno striscio (parentesi etichettata) sul grafico del gel tra 500 bp e 5.000 bp. Altri picchi etichettati sono stati amplificati da molecole di punta ERCC o RNA ribosomico. La concentrazione di cDNA tra 500 bp e 5.000 bp può essere quantificata, e quei campioni con concentrazioni superiori a 0,05 ng/L e che mostrano tali curve tipiche vengono mantenute per la preparazione della libreria. RFU, unità di fluorescenza relativa. (B) Il controllo di qualità rappresentativo è il risultato di un bioanalizzatore che mostra la distribuzione delle dimensioni di una biblioteca in pool finale (con circa 380 celle). In genere, varia da 200 bp a 2.000 bp con una dimensione media di 400-600 bp. I due picchi taglienti erano indicatori di carico. FU, unità di fluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: analisi scRNA-seq della microglia isolata da 4 regioni cerebrali di due topi maschi. (A) grafico tSNE che mostra un modello di microglia regionale (sono state evidenziate solo le cellule del #1 del topo). Non formano cluster distinti in base alle origini delle regioni oltre il sottile spostamento in aree concentrate sul grafico tSNE (eventualmente a causa di effetti di lotto). Questa osservazione è coerente con la limitata eterogeneità regionale della microglia basata sull'espressione genica globale nei topi adulti (vedi una recente pubblicazione2 per ulteriori discussioni su questo argomento). (B) tSNE grafico che mostra modelli sovrapposti di microglia da due singoli topi che sono stati elaborati in modo indipendente. Anche se possono esistere piccoli effetti batch (cellule che si concentrano in alcune aree del terreno), queste cellule non formano ammassi distinti in base alle origini animali. Questo risultato suggerisce la riproducibilità del protocollo per il confronto dei dati tra esperimenti. (C) Espressione dei geni della firma della microglia rilevata da scRNA-seq che mostra oltre il 95% del tasso di rilevamento per marcatori specifici, come Tmem119 e P2ry12, e oltre l'80% del tasso di rilevamento per fattori di trascrizione noti come Sall1 e Pu.1. I dati sono stati rianalizzati dalla letteratura pubblicata17. (D) La stragrande maggioranza delle microglia isolate non è espressione di geni specifici di altri tipi di cellule, come Tubb3 (neuroni), Aldh1l1 (astrociti), Gjb1 (oligodendrociti) e Tie1 (cellule endoteliali). (E) Espressione dell'attivazione o dello stress microgliale correlati ai geni. I marcatori classici, Tnf, Il1b, Nos2e Nfkb2, che sono espressi in modo basso, sono mostrati nella parte superiore. I geni di risposta precoce, Egr1 e Fos, sono mostrati in basso (vedi discussione). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Reagente | Volume (L) |
| Lisi cellulare | 4 |
| Trascrizione inversa (100 U/L) | 0.95 |
| Inibitore dell'rnase | 0.25 |
| 5x Primo cuscinetto a filo | 2 |
| Dithiothreitol (DTT; 100 mM) | 0.5 |
| Betaina (5 M) | 2 |
| MgCl2 (1 M) | 0.06 |
| Modello switch oligo (TSO; 100 M) | 0.1 |
| H2O | 0.14 |
| Totale | 10 |
Tabella 1: Condizione di trascrizione inversa. Vengono forniti volumi di reagente per una reazione di trascrizione inversa.
| Reagente | Volume (L) |
| Prodotto di trascrizione inversa | 10 |
| 2x mix master PCR | 12.5 |
| Primer ISPCR (10 m) | 0.25 |
| Eonuclease lambda | 0.1125 |
| H2O | 2.1375 |
| Totale | 25 |
Tabella 2: condizione di amplificazione PCR. Vengono forniti volumi di reagente per un'amplificazione PCR di cDNA da una singola cellula.
| Basato su lamiera (questo protocollo) | Basato su droplet (10 volte Genomica) | |
| Sensibilità | Più geni rilevati | Meno geni rilevati |
| Lunghezza completa | Sì | No (5' o 3' fine) |
| Flessibilità per il numero/popolazione di cellule | Adatto per la caratterizzazione di sottopopolazioni piccole o rare | Adatto per un'ampia categorizzazione di grandi popolazioni di cellule |
| Velocità effettiva | Fino a diverse migliaia di celle | Da centinaia a decine di migliaia di cellule |
| Identificatore molecolare univoco | No | Sì |
| Costo per cella | N. 1 / 5 USD | meno di 1 USD |
| Difficoltà sperimentale | Più passi e di solito richiedono la robotica di movimentazione dei liquidi | Semplice da eseguire con macchine commercializzate |
| Popolazioni cellulari | Destinato allo smistamento FACS | Imparziale |
Tabella 3: Confronto tra i metodi scRNA-seq a base di piastra e di gocciolamento. In questo articolo, viene fornita la procedura scRNA-seq a piena lunghezza a base di lamiere, che presenta i vantaggi di una maggiore sensibilità, sequenziamento a lunghezza completa e flessibilità per un piccolo numero di cellule come input. I metodi basati sulle gocciolanti offrono i vantaggi di una maggiore produttività, costi inferiori, facili da eseguire e dati in identificatori molecolari univoci. Essi sono complementari a seconda dello scopo degli esperimenti.
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Discussion
Microglia interagiscono attivamente con altri tipi di cellule nel SNC, e sono molto sensibili agli stimoli ambientali. Al fine di ridurre al minimo le risposte infiammatorie e i cambiamenti aberranti nella loro espressione genica durante il processo di isolamento, questo protocollo è stato semplificato da un metodoprecedentementepubblicato 9 ed è ora adatto per isolare la microglia da più regioni di un singolo emisfero cerebrale del topo in parallelo. I tessuti e i reagenti sono tenuti a temperatura fredda e gli esperimenti vengono eseguiti in modo tempestivo (circa 3,5 h dalla dissezione allo smistamento) con meno lavamenti e meno reagenti in base a dimensioni di tessuto limitate. Scegliamo di fare il doungazione su altri metodi di omogeneizzazione, come la digestione enzimatica, perché la dissociazione meccanica può uccidere e quindi rimuovere neuroni e altre cellule gliali causando piccoli danni o attivazione alla microglia9,18. L'eccesso di douncing, tuttavia, può ridurre la resa della microglia e dovrebbe essere evitato. È stato precedentemente dimostrato che la dissociazione meccanica e la rimozione mielina basata su perline seguite dallo smistamento FACS introducono meno attivazione alla microglia, basata sull'espressione minima di geni infiammatori classici, ad esempio, Tnf, Il1b, Nos2e Nfkb29 (Figura 4E). Tuttavia, la microglia potrebbe ancora rispondere alle condizioni di ex vivo durante la dissociazione e lo smistamento mediante l'upregolazione di geni di risposta precoce come Fos ed Egr1 (Figura 4E), che normalmente non sono espressi dalla microglia in vivo2,19, e tali cambiamenti da studi trascrittomici dovrebbero sempre essere convalidati nelle sezioni istologiche.
Qui forniamo procedure per isolare la microglia dalla corteccia, dal cervelletto, dall'ippocampo e dallo striato da un emisfero cerebrale adulto, e questo protocollo può essere facilmente adattato ad altre regioni o stadi. Ciò è utile per le situazioni, ad esempio, quando la microglia colpita dalla malattia è limitata a determinate aree del cervello che possono essere sezionate, o negli studi di invecchiamento, in cui il raggruppamento di campioni è inappropriato a causa di significative variazioni individuali. Con la disponibilità di anticorpi contro epitopi microgliali (o immuni pan innati), questo protocollo potrebbe anche essere adattato per isolare la microglia nei tessuti ratti o umani9. Quando si regola per tessuti più grandi o più vecchi, è importante considerare e testare il volume di perline di rimozione della mielina e il tipo di colonne utilizzate. Un approccio alternativo per la rimozione della mielina è la centrifugazione del gradiente di densità nei media commerciali a bassa viscosità20. Nel complesso, questi due metodi sono comparabili nella loro efficienza, anche se il metodo di centrifugazione del gradiente di densità può fornire rese leggermente più elevate, e d'altra parte, il metodo delle perline magnetiche è meno probabile che introduca endotossine, che possono attivare la microglia21,22.
A causa della piccola percentuale di microglia tra le cellule cerebrali totali, è spesso essenziale arricchire o purificare la microglia prima di eseguire studi trascrittomici a singola cellula. Usiamo FACS come approccio sensibile per catturare i tipi di cellule rappresentate e selezioniamo la microglia in base all'espressione di superficie CD11b e CD45. Da un emisfero, otteniamo regolarmente 30.000 dollari di microglia per la corteccia e 5.000 microglia per cervelletto, ippocampo o striato. Queste rese sono sufficienti per la maggior parte delle applicazioni a cella singola e per l'RNA-seq sfuso (possono essere utilizzate 3.000 o più cellule). Vale la pena ricordare che la microglia può regolare l'immunoreattività CD45 durante lo sviluppo o la malattia2, nel qual caso le cellule con livelli sia bassi che alti di CD45 devono essere registrate e indicizzate per l'analisi. Un'altra opzione per arricchire la microglia è quella di utilizzare lo smistamento di celle magnetiche mediato da perline CD11b dopo la rimozione della mielina, ma questo limiterebbe lo scRNA-seq ai metodi delle goccioline.
Per studiare l'espressione genica microgliale a risoluzione una singola cellula, di solito smistiamo le cellule in almeno 2-3 piastre di 96 pozzetti per campione ed eseguiamo la preparazione della libreria con macchine per la movimentazione dei liquidi. È stato dimostrato che questo approccio di preparazione della libreria a lunga lunghezza a piastre è uno dei metodi scRNA-seq più sensibili nel limite di rilevamento, consentendo una quantificazione accurata di trascrizioni rare, come i fattori di trascrizione13,14,16. A causa del sequenziamento a lunghezza intera, questo approccio non è soggetto a una distorsione di 5' o 3' e può essere utilizzato per analizzare le varianti di giunzione (Tabella 3). Inoltre, a differenza dei metodi a base di gocciole, che di solito richiedono centinaia o migliaia di cellule in una reazione, questo protocollo a base di piastre ha la flessibilità di includere un piccolo numero di celle in ogni esperimento ed espandere gradualmente la dimensione della popolazione aggiungendo più piastre nel progetto in seguito. Questo è vantaggioso quando si studiano piccoli sottoinsiemi di microglia in determinate condizioni come lo sviluppo embrionale.
Mentre questo protocollo genera riproducibilmente librerie scRNA-seq di alta qualità per la microglia regionale del cervello, è spesso adatto solo per studi su piccola scala a causa del costo relativamente elevato (circa 5 dollari / cella per la preparazione della libreria, ancora più economico di 23 dollari / cella se si utilizza il off the shelf SmartSeq v4 kit). Diverse strategie possono contribuire a ridurre i costi e aumentare la velocità effettiva. In primo luogo, le celle possono essere ordinate in piastre 384-well con un minimo di 0,5 lofazioni di lisi tampone, e questo richiede solo 1/8 volumi di reagenti per la trascrizione inversa iniziale e le fasi di amplificazione PCR. In secondo luogo, è possibile produrre trasposasi Tn5 in-house che ha una qualità simile a quella di un kit23disponibile in commercio. Queste due modifiche potrebbero ridurre il costo di preparazione della biblioteca fino a 1 USD/cella. In terzo luogo, utilizzando indici personalizzati, migliaia di celle possono essere raggruppate insieme per il sequenziamento su un sistema senza sacrificare la profondità di sequenziamento (>1 milioni di letture /celle)17. Questi miglioramenti, insieme all'incorporazione di robot automatizzati per la movimentazione dei liquidi, consentiranno di mettere a conoscenza di microrna-seq profondi ad alto throughput di microglia isolati da quasi tutte le regioni definite.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno e Spyros Darmanis per il loro aiuto durante lo sviluppo di questo protocollo. Ringraziamo anche lo Stanford Shared FACS Facility, in particolare Meredith Weglarz e Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart di Stanford Protein and Nucleic Acid Facility (PAN) per il loro grande supporto per le riprese. Questo lavoro è finanziato dalla Fondazione JPB e dalla Fondazione Vincent J. Coates.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base) |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS buffer | Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red | ||
| Plates | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenizer, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 |
References
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