Summary
Proporcionamos un protocolo para el aislamiento de la microglia de diferentes regiones diseccionadas de un hemisferio cerebral de ratón adulto, seguido de la preparación de la biblioteca semiautomática para la secuenciación profunda de ARN de una sola célula de transcriptomes de longitud completa. Este método ayudará a dilucidar la heterogeneidad funcional de la microglia en salud y enfermedad.
Abstract
Como macrófagos residentes en el sistema nervioso central, la microglia controla activamente el desarrollo cerebral y la homeostasis, y sus disfunciones pueden impulsar enfermedades humanas. Se han realizado avances considerables para descubrir las firmas moleculares de la microglia homeostática, así como las alteraciones de su expresión génica en respuesta a los estímulos ambientales. Con el advenimiento y la maduración de metodologías genómicas de una sola célula, se reconoce cada vez más que la microglia heterogénea puede subyacen a las diversas funciones que desempeñan en diferentes condiciones de desarrollo y patológicas. La disección adicional de dicha heterogeneidad puede lograrse mediante el aislamiento eficiente de la microglia de una región determinada de interés, seguido de perfiles sensibles de células individuales. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento rápido de la microglia de diferentes regiones cerebrales en un solo hemisferio cerebral de ratón adulto. También demostramos cómo utilizar estas microglia ordenadas para la secuenciación de ARN de una sola célula profunda a base de placas. Discutimos la adaptabilidad de este método a otros escenarios y proporcionamos directrices para mejorar el sistema para adaptarse a estudios a gran escala.
Introduction
Microglia, que representa el 5% al 10% de todas las células neuronales, son macrófagos residentes dispersos por todo el sistema nervioso central (SNC)1. Protegida detrás de la barrera hematoencefálica, la microglia típica en un cerebro adulto sano contiene muchos procesos finos que se extienden y se retraen rápidamente para interactuar con las neuronas y otras células gliales en el parénquima. Microglia también puede adoptar la morfología amoeboides asociada con el aumento de la función fagocítica durante etapas específicas del desarrollo o ante los desafíos inmunológicos en lesiones y enfermedades1,2,3,4. Descubrimientos emocionantes recientes han demostrado claramente que la microglia no son de ninguna manera transeúntes pasivos a señales derivadas del cerebro o patológicas, pero desempeñan un papel fundamental en el control del desarrollo cerebral y la homeostasis, por ejemplo, apoyando la supervivencia neuronal, podando sysese inmaduros, promoviendo la diferenciación de las células del linaje de oligodendrocitos, así como la angiogénesis1. A medida que se aclaran más funciones de la microglia, la excitación se alimenta aún más de estudios de genética humana, que mostraron que muchos genes de riesgo de enfermedades neurodegenerativas, como TREM2, se expresan predominante o exclusivamente por microglia5,6,7. Dada su importancia en el desarrollo y los roles plausibles de conducción de enfermedades, recientemente se ha hecho un enorme esfuerzo para nuestra comprensión de la regulación y función de los genes microgliales con la esperanza de encontrar nuevas dianas terapéuticas para las enfermedades neurodegenerativas1,8.
La secuenciación de ARN (RNA-seq) permite la caracterización imparcial de la expresión génica específica del tipo de célula, que a su vez guía a los científicos para investigar las funciones genéticas en redes celulares densas7. ARN-seq se había hecho principalmente en muestras a granel, lo que llevó al descubrimiento de una firma de genes microgliales homeostáticos que las distingue de otras células neuronales e inmunitarias9. Sin embargo, este enfoque podría pasar por alto las diferencias moleculares y funcionales entre la microglia, especialmente las presentes transitoriamente en el desarrollo, o asociadas con el envejecimiento y la enfermedad. De hecho, el ARN-seq de una sola célula (scRNA-seq) ofrece la sensibilidad y la resolución que han revolucionado el campo al revelar la heterogeneidad previamente poco apreciada de la microglia en una variedad de contextos2,3,10. Además, debido a la presencia de otras células inmunitarias similares en la interfaz de circulación del SNC, scRNA-seq proporciona información que ayuda al diseño de nuevas herramientas para separar y diseccionar funcionalmente estas células relacionadas con poco conocimiento previo2,11.
Se ha inventado una amplia gama de plataformas scRNA-seq, cada una adecuada para ciertas aplicaciones12. En general, los métodos basados en gotas, como 10x Genomics, son mayores en rendimiento con (decenas de) miles de celdas secuenciadas en cada ejecución, y son menos selectivos para la entrada que puede contener poblaciones de células mixtas que requieren una categorización amplia. Los métodos basados en placas proporcionan una mayor sensibilidad y profundidad de lectura13,14, por lo general dirigidos a poblaciones específicas de la clasificación celular para revelar diferencias sutiles o transcripciones raras. Dado el pequeño porcentaje de células microglia, en particular las subpoblaciones asociadas al desarrollo o a la enfermedad, entre todos los tipos de células del SNC, a menudo es deseable aislar la microglia de una región específica de interés y obtener información transcriptomica profunda y completa para comprender su heterogeneidad.
Aquí, proporcionamos detalles sobre cómo aislar la microglia de diferentes regiones cerebrales de ratón diseccionadas de un solo hemisferio, que se utilizan para ARN-seq de una sola célula (o a granel) siguiendo un procedimiento de preparación de biblioteca ssemi-automatizado basado en placas. El otro hemisferio se puede utilizar para la validación histológica. Simplificado a partir de un método publicado anteriormente9, este protocolo de aislamiento tiene como objetivo maximizar el rendimiento de una pequeña cantidad de materiales de partida, y mientras tanto mantener perfiles de expresión génica microglial endógenos. Utilizamos la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para enriquecer la microglia (u otras células inmunitarias relacionadas de interés) en placas de 96 pocillos y miniaturizar los volúmenes de reactivos para la preparación de la biblioteca con el fin de aumentar el rendimiento. Destacamos esta plataforma sensible scRNA-seq, aunque se pueden aplicar otras estrategias basadas en placas. Este método se puede adaptar fácilmente para aislar la microglia de otros tejidos diseccionados, como lesiones o focos de enfermedad, y la edad del ratón puede variar en casi cualquier etapa postnatal. El aislamiento eficiente de la microglia regional para estudios de transcriptomica de una sola célula facilitará una mejor comprensión de sus funciones en salud y enfermedades.
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Protocol
Todos los procedimientos que involucran roedores se ajustan a las directrices de la Universidad de Stanford, que cumplen con las leyes y políticas nacionales y estatales. Todos los procedimientos de animales fueron aprobados por el Panel Administrativo de La Universidad de Stanford sobre Cuidado de Animales de Laboratorio.
NOTA: Todas las composiciones de solución y tampón se proporcionan en la Tabla de Materiales.
1. Preparación en el Día del Aislamiento Celular
- Preparar los siguientes reactivos y enfriarlos en hielo: medio A (50 ml), tampón de clasificación de células activada sormicas magnéticamente (MCS) (30 ml), tampón FACS (25 ml), solución salina con fosfato (PBS; 30 ml), DNase (320 l) e inhibidor de la rnasa (30 l).
NOTA: Los volúmenes proporcionados aquí son suficientes para aislar la microglia de 4 regiones cerebrales (por ejemplo, corteza, cerebelo, hipocampo y estriado) de un solo hemisferio cerebral de ratón. Escalar verticalmente si se utilizan más tejidos. - Colocar cuatro homogeneizadores de Dounce limpios de 2 ml sobre hielo y añadir 2 ml de medio A con 80 ml de DNase (12.500 unidades/ml) y 5 ml de inhibidor de la rnalosa en cada homogeneizador Dounce. Enfríe los pistones en tubos de 15 ml.
- Etiquetar cuatro platos Petri de 6 cm con regiones cerebrales para la recolección de tejidos y añadir 200 ml de medio frío A en cada plato sobre hielo. Añadir unos 5 ml de medio A en una placa Petri de 6 cm para la disección.
NOTA: Antes de su uso, asegúrese de que todos los reactivos sean estériles y adecuados para aplicaciones de ARN. Las herramientas de banco y disección deben limpiarse y rociarse con la solución de descontaminación RNase(Tabla de materiales).
2. Disección de la región cerebral
NOTA: Este paso debe tomar 30 min.
- Inyectar 400 a 500 l de ketamina/xilazina (24 mg/ml de ketamina y 2,4 mg/ml de xilazina) en el peritoneo de un ratón de etapa de menor a adulto (>1 mes de edad).
NOTA: Un ratón macho se utiliza aquí para la ilustración, pero cualquiera de los dos géneros es adecuado. - Espere 5 minutos y pellizca una pata trasera para asegurar la falta de retracción.
- Utilice inmediatamente una aguja de 26 G x 3/8 para realizar perfusión transcardial con 20 a 30 ml de PBS helado hasta que el tampón se agote sin sangre visible.
- Decapita el ratón con un par de tijeras quirúrgicas. Usa tijeras pequeñas para abrir la piel para exponer el cráneo debajo, y luego corta a través de la sutura sagital, sutura lambdoidal y sutura coronal. Use fórceps para extraer ambos lados del hueso parietal y el hueso interparietal sin dañar el tejido, y mueva cuidadosamente el cerebro a la disección Petri plato con medio A.
- Usa una hoja preenfriada para cortar el cerebro a través de la línea media en dos hemisferios.
NOTA: Las cuatro regiones cerebrales descritas aquí desde un solo hemisferio producen un número suficiente de microglia para aplicaciones de ARN-seq de una sola célula o a granel. El otro hemisferio se puede utilizar para inmunohistoquímica o validación in situ de ARN. - Separe el cerebelo del lóbulo cortical y el tallo cerebral con #55 fórceps y transfiera el tejido a una placa Petri de colección.
- Use #55 fórceps para diseccionar cuidadosamente el hipocampo y el estriado de la corteza y transferir cada tejido a una placa Petri de colección.
3. Disociación mecánica de tejidos
NOTA: Mantenga las células y los reactivos frescos todo el tiempo, excepto durante los pasos de tinción. Este paso debe tomar 30 min.
- Pica cada tejido cerebral con una cuchilla de afeitar en <1 mm3 piezas finas.
- Utilice una pipeta de 1 ml (con las puntas cortadas) para transferir piezas de tejido a los homogeneizadores Dounce pre-enfriados, cada uno de los cuales contiene 2 ml de medio A con DNase e inhibidor de la RNase.
- Homogeneizar el tejido girando lentamente el pistón dentro y fuera del homogeneizador Dounce para 6 x 10 trazos completos, hasta que no haya trozos visibles presentes.
NOTA: Douncing mata las neuronas y la mayoría de las otras células gliales, pero deja las células microgliales bastante intactas. Tanto la insuficiencia como el exceso de douncción pueden conducir a un bajo rendimiento de las células. - Transfiera los tejidos disociados a tubos de 50 ml a través de coladores de 70 m.
- Enjuague cada homogeneizador y pistón Dounce con un total de 6 ml de medio frío A y filtre la solución de enjuague a través del mismo colador en el tubo correspondiente.
- Transfiera las suspensiones de una sola célula (alrededor de 8 ml cada una) en tubos cónicos de 15 ml y centrífuga a 400 x g durante 5 min a 4 oC con freno 5.
4. Eliminación de mielina
NOTA: Este paso debe tomar 60 min.
- Preparar 1 columna de agotamiento grande (LD) (para corteza) y 3 columnas de selección grande (LS) (para las otras 3 regiones) en un separador magnético(Tabla de materiales). Enjuague cada columna con 3 ml de búfer MCS.
- Una vez finalizada la centrifugación, descarte y deseche el sobrenadante sin molestar el pellet. Para los tejidos de corteza y cerebelo, resuspendan las células en 850 ml de tampón de MCS con 1,8 ml de inhibidor de la RNase. Para los tejidos del hipocampo y del estriado, resuspenda las células en 400 ml de tampón de MCS con 0,9 ml de inhibidor de la RNase.
NOTA: Las columnas (LD vs LS) y el volumen utilizado para la resuspensión se optimizan en función de la cantidad de mielina presente en el tejido. Si se ensayan otras regiones cerebrales, estas condiciones pueden necesitar ser ajustadas dependiendo del tamaño del tejido y la cantidad de mielina puede existir. Eficacia de la eliminación de mielina se puede estimar en el paso 4.9. - Añadir 100 s l de cuentas de eliminación de mielina cada una en las células de la corteza y el cerebelo y añadir 50 s de cuentas de eliminación de mielina cada una en las células del hipocampo y el estriado.
- Mezclar suavemente las células con cuentas e incubar los tubos sobre hielo durante 10 min.
- Lleve el volumen del tubo con células corticales a 2 ml con tampón MCS, y todos los demás a 1 ml (es decir, agregue 1 ml para las células corticales; 500 l para las células hipocampales y estriales; no hay necesidad de agregar tampón a las células cerebelosas).
- Una vez que las columnas estén vacías de tampón de enrteo, coloque un tubo de 15 ml debajo de cada columna. Cargue las células corticales (2 mL) en la columna LD, y todas las demás (1 mL cada una) en las columnas LS. Utilice inmediatamente 1 ml de búfer MCS cada uno para lavar los tubos originales y cargar la solución en las columnas correspondientes.
- Lave la columna LD una vez con 1 mL del buffer MCS y lave cada columna LS dos veces con 1 mL del buffer MCS cada lavado. Continúe recogiendo la solución de flujo a través durante el lavado.
- Filtre las células en tubos FACS de fondo redondo a través de tapas de colador de 35 m.
NOTA: Cada tubo debe recoger unos 4 ml de suspensión de una sola célula agotada de mielina. - Opcionalmente, tome 10 s de la suspensión celular y mezcle con 10 sL de solución azul trypan al 0,4%. Examine las células bajo un microscopio de campo brillante 10x para estimar el rendimiento, la tasa de supervivencia y el nivel de mielina residual.
NOTA: Una preparación exitosa debe generar más del 90% de células vivas (redondas en forma y excluyendo el tinte azul) con poco o ningún residuo de mielina. - Células de pelet en los tubos FACS a 400 x g durante 5 min a 4oC, con freno a 5. Vierta lentamente el sobrenadante y aterve el borde del tubo en papel tisú. Resuspenda las células de cada tubo con 300 ml de tampón FACS.
NOTA: Si se prefiere la clasificación MCS, se pueden utilizar perlas CD11b para seleccionar microglia y otras células mieloides después de la eliminación de mielina. Estas células se pueden utilizar para scRNA-seq no a base de placas, así como ARN-seq a granel. La advertencia de este enfoque alternativo es que las cuentas CD11b no separan la microglia de otras células inmunitarias relacionadas que también son positivas para este antígeno.
5. Tinción para clasificación celular activada por fluorescencia
NOTA: Este paso debe tomar 40 min.
- Añadir 5 l de reactivo de bloque de receptores Fc de ratón(Tabla de materiales)en cada tubo. Incubar durante 5 minutos sobre hielo.
- Añadir 1 l de CD45-PE-Cy7 y 1 l de CD11b-BV421 en cada tubo.
NOTA: Se pueden utilizar anticuerpos con otros fluoróforos conjugados. También se pueden incluir anticuerpos contra TMEM119, un marcador específico para la microglia homeostática9,pero se recomienda utilizar junto con CD45 y CD11b, ya que ciertas subpoblaciones de microglia pueden perder la expresión superficial TMEM119. - Incubar los tubos en una coctelera durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT).
- Agregue 2 mL de tampón FACS para lavar.
- Células de pelet a 4 oC, 400 x g durante 5 min. Vierta lentamente el sobrenadante y vierta el borde del tubo en papel tisú. Resuspender las células en cada tubo utilizando 400 ml de tampón de FACS con 1 l de inhibidor de la RNase y 0,5 ml de yoduro de propidio (PI, 1:1.000 dilución).
6. Clasificación de FACS de índice
NOTA: Este paso debe tomar 1 h.
- Siguiendo el procedimiento FACS estándar, dibuje compuertas basadas en dispersión (excluyendo desechos), celdas individuales, células vivas (PI negativo), células microglia y células mieloides (CD45+, CD11b+).
NOTA: Las células microgliales típicas expresan CD45 a niveles más bajos en comparación con otros macrófagos asociados a los fronteras, como los macrófagos perivasculares y meningeales, y por lo tanto la medición de CD45 bajo CD11b+ debería ser suficiente si el enfoque de la investigación son los perfiles de expresión génica en estas microglia clásicas1,2. Sin embargo, ciertos subconjuntos de microglia pueden tener una expresión CD45 más alta y esto es particularmente cierto durante el desarrollo o en condiciones de enfermedad. Para garantizar un análisis imparcial de la expresión génica microglial, se pueden registrar inmunofenotipos altos cd45 y CD45 bajos a través de la clasificación de índices y ambas poblaciones recopiladas para la secuenciación y el análisis posterior. Además, la expresión superficial TMEM119 puede utilizarse para dirigirse a la población microglial homeostática (véase el paso 5.2) y analizarse junto con los niveles de CD45 y los resultados de la secuenciación. - Ordenar una sola microglia (con una boquilla de 100 m) en placas de reacción en cadena de polimerasa (PCR) de 96 pocillos, que contengan 4 ml de tampón de lisis cada pocil (consulte el protocolo publicado14 para obtener más información).
NOTA: El mix de espiga de ARN del Consorcio de Control de ARN Externo (ERCC)(Tabla de Materiales) se puede añadir a 1:2.4 x 107 en el tampón de lisis para fines de control de calidad y normalización2. - Reórtca brevemente las placas y gire hacia abajo usando una centrífuga de sobremesa.
- Congele inmediatamente las muestras en hielo seco. Conservar las placas a -80oC hasta la preparación de la biblioteca.
NOTA: Alternativamente, se pueden recolectar más células en tubos de 1,5 ml con tampón de extracción de ARN para ARN-seq a granel. Según la experiencia de los autores, 3.000 celdas son suficientes para generar bibliotecas de buena calidad siguiendo el protocolo publicado2,14.
7. Preparación de la biblioteca de secuenciación de ARN de una sola célula
NOTA: Aquí, el protocolo publicado14 se sigue para generar bibliotecas scRNA-seq con la ayuda de la robótica de manipulación de líquidos y algunas modificaciones. En este artículo, el procedimiento solo se describe brevemente y se resaltan las diferencias. El procesamiento de 4 placas simultáneamente toma alrededor de 2,5 días.
- Descongelar las placas sobre hielo y realizar la transcripción inversa con imprimación Oligo-dT30VN (en el tampón de lisis) para generar ADNc cDNA con ciclodores térmicos(Tabla 1): 42 oC 90 min; 70 oC 5 min; 4 oC de espera. A continuación, amplifique el ADNc con un paso adicional de digestión exonucleasina al principio(Tabla 2) utilizando la mezcla maestra de PCR y las imprimaciones de PCR in situ (ISPCR)(Tabla de materiales)y la siguiente condición de PCR: 37 oC 30 min; 95 oC 3 min; 23 ciclos de 98 oC 20 s, 67 oC 15 s, 72 oC 4 min; 72oC 5 min.
- Purificar el ADNC usando 18 s de perlas magnéticas por pozo (relación 0.7:1). Incubar la placa en un soporte magnético durante 5 minutos y lavar las muestras dos veces con etanol recién hecho 80%, 80 ol por pocal cada vez. Después de secar la placa durante 15-20 min, eluda elAD con 20 s de tampón de elución por pocal.
NOTA: Para el control de calidad, utilice un analizador de fragmentos (análisis de fragmentos de secuenciación de próxima generación de alta sensibilidad [NGS], 1 a 6.000 bp) para comprobar las distribuciones de tamaño y las concentraciones de ADNc, y solo otras muestras de proceso con un frotis entre 500 a 5.000 bp y superior a 0,05 ng/L. - Para generar bibliotecas, mezcle 0,4 ml de cada muestra de ADNc con 1,2 l de reactivos de etiquetado Tn5 a partir del kit de preparación de la biblioteca(Tabla de materiales)en una placa de 384 pocillos con la ayuda de una máquina de pipeteo de nanolitros, a 55 oC 10 min.
NOTA: Aquí, se añade 1/12.5 del volumen de reacción sugerido (muestra de 5 l y 15 l de reactivos de etiquetado) con el fin de reducir el costo y mientras tanto aumentar el rendimiento. Una máquina de pipeteo de nanolitros(Tabla de materiales)se utiliza para transferir reactivos (este y los siguientes pasos) desde y hacia 384 placas de pozos. - Añadir 0,4 l de búfer de neutralización para detener la reacción de etiquetación en RT durante 5 min.
- Añadir 384 índices(Tabla de Materiales, 0,4 l hacia delante y 0,4 l hacia atrás), 1,2 ml de mezcla de PCR a muestras (2 l cada una) y amplificar las bibliotecas utilizando la siguiente condición: 72 oC 3 min; 95 oC 30 s; 10 ciclos de 95 oC 10 s, 55 oC 30 s, 72 oC 1 min; 72oC 5 min.
- Agrupe todas las bibliotecas individuales (tome 1 l cada una) de la misma placa de 384 pocillos, y utilice cuentas magnéticas(Tabla de materiales,proporción 0.7:1) para purificar las bibliotecas agrupadas finales.
- Utilice un fluorómetro(Tabla de materiales)para medir las concentraciones y un bioanalizador(Tabla de materiales)para examinar las distribuciones de tamaño de las bibliotecas agrupadas antes de la secuenciación. Apunte a la profundidad de secuenciación en 1 millón de lecturas sin procesar por celda.
- Siga los procedimientos bioinformáticos estándar para filtrar y recortar las lecturas de secuenciación y realizar la alineación2. Utilice la tabla de recuento y los metadatos como entradas para realizar el análisis de agrupación en clústeres con el paquete Seurat15.
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Representative Results
Este protocolo describe un método para aislar y clasificar la microglia de diferentes regiones cerebrales en un hemisferio cerebral perfundido adulto, seguido de scRNA-seq. Utilizamos la douncing para crear una suspensión de una sola célula y también como un primer paso para enriquecer la microglia. Insuficiente o excesivamente douncing reduce el rendimiento. Además, los cerebros adultos del ratón contienen altos niveles de mielina, que también pueden reducir la eficiencia de clasificación y el rendimiento si no se eliminan correctamente. Por lo tanto, examinamos la suspensión celular bajo microscopio utilizando el color azul de la tripa y un hemocitómetro para estimar el rendimiento, la viabilidad celular y la eficacia de la eliminación de mielina (paso 4.9) antes de realizar la tinción de anticuerpos(Figura 1). El recuento total de células en este punto debe ser de más de 30.000 para la corteza, y más de 5.000 para otros tejidos. Más del 90% de las células deben ser viables con pocos restos de mielina.
Utilizamos una máquina FACS para clasificar la microglia (o células mieloides), que son típicamente CD45 baja y CD11b positiva. Al menos para el tejido cortical, el aislamiento exitoso debe generar más del 80% de microglia de todas las células individuales vivas(Figura 2). La población moribunda/muerta representa sólo una pequeña fracción de la preparación (alrededor del 10%).
Una vez que la microglia individual se captura en el tampón de lisis, el ARN se libera y posteriormente se transcribe a ADNc, que luego se amplifica durante 23 ciclos. Es importante comprobar la calidad de estas muestras de ADNc (al menos una parte de ellas) antes de hacer bibliotecas. Como plataforma de electroforesis capilar, el analizador de fragmentos y los kits de fragmentos NGS de alta sensibilidad (1-6.000 bp) proporcionan información rápida y precisa sobre la distribución del tamaño, así como la cantidad de moléculas de ADNc presentes en cada pocadero de una placa de 96 pocillos(Figura 3A). Las muestras que muestran un frotis (500 a 5.000 bp) y por encima de cierto umbral de concentración (por ejemplo, 0,05 ng/L) se pueden utilizar para crear bibliotecas. Del mismo modo, las bibliotecas agrupadas deben probarse en un bioanalizador antes de la secuenciación(Figura 3B).
Secuenciamos las muestras a una profundidad de más de 1 millón de lecturas crudas por célula, lo que satura el poder de detección de esta metodología scRNA-seq16. Con aproximadamente 60% de tasa de mapeo, se pueden detectar más de 2.000 genes por célula microglial. Obtuvimos datos publicados que se generaron utilizando este método de aislamiento17y demostramos su reproducibilidad de experimentos independientes y sensibilidad para detectar genes específicos de microglia en toda la población secuenciada(Figura 4).
Figura 1: Estimación del rendimiento de aislamiento de microglia, viabilidad celular y eficiencia de la eliminación de mielina. El panel izquierdo mostró la imagen de campo brillante (aumento de 4x) de las células teñidas azules de trypan (de la corteza) después de pasar a través de las columnas de eliminación de mielina. Los resultados para otras regiones se verían similares pero con menos celdas. La gran mayoría (si no todas) de las células parecían brillantes (no manchadas) y redondas debido a la pérdida de procesos. La imagen correcta era el zoom (20x) de la zona en caja y pocos restos de mielina estaban presentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Puertas utilizadas para la clasificación de microglia. Los datos mostraron la estrategia de gating para clasificar la microglia de la corteza, y se utilizó la misma estrategia para otras regiones. Los desechos celulares se excluyeron primero de la gráfica de dispersión, y las celdas individuales fueron cerradas por el área de dispersión hacia adelante (FSC-A)/ancho de dispersión hacia adelante (FSC-W). Las células vivas fueron cerradas por la tinción negativa de PI, que eran de aproximadamente el 90% de todas las células individuales. Microglia, que representa aproximadamente el 80% de las células vivas, se clasificaron desde la puerta CD45 baja CD11b+. Un total de 30.000 microglia podría aislarse y clasificarse del tejido de la corteza (de un hemisferio de un ratón de 3 meses). La clasificación de índices se realizó en una máquina FACS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados representativos de control de calidad para el ADNC amplificado de una sola célula microglial y una biblioteca agrupada final. (A) Utilizando un analizador de fragmentos, todos los fragmentos se trazan con sus tamaños en el eje X, y la intensidad de fluorescencia relativa en el eje Y, lo que significa la abundancia de un ADNC de tamaño determinado. LM (marcador inferior, 1 bp) y UM (marcador superior, 6.000 bp) son marcadores de carga con concentraciones conocidas utilizadas para medir la cantidad de ADNc cDNA. El ADNc amplificado con éxito a partir de una célula microglial representativa forma una curva (línea de puntos verde) en el gráfico de distribución de tamaño o un frotis (corchete etiquetado) en el gráfico de gel entre 500 bp y 5.000 bp. Otros picos etiquetados se amplificaron a partir de moléculas de espiga de ERCC o ARN ribosomal. La concentración de ADNc entre 500 bp y 5.000 bp se puede cuantificar, y aquellas muestras con concentraciones superiores a 0,05 ng/L y que muestran tales curvas típicas se conservan para la preparación de la biblioteca. RFU, unidad de fluorescencia relativa. (B) Resultado representativo del control de calidad en un bioanalizador que muestra la distribución del tamaño de una biblioteca final agrupada (con unas 380 celdas). Típicamente, oscila entre 200 bp y 2,000 bp con un tamaño promedio de 400-600 bp. Los dos picos afilados eran marcadores de carga. FU, unidad de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: análisis scRNA-seq de microglia aislada de 4 regiones cerebrales de dos ratones machos. (A) gráfica tSNE que muestra el patrón entremezclado de microglia regional (sólo se resaltaron las celdas de la #1 del ratón). No forman racimos distintos según los orígenes de la región más allá del cambio sutil en áreas concentradas en la gráfica tSNE (posiblemente debido a efectos por lotes). Esta observación es coherente con la heterogeneidad regional limitada de la microglia basada en la expresión génica global en ratones adultos (véase una publicación reciente2 para seguir debatiendo sobre este tema). (B) gráfica tSNE que muestra el patrón superpuesto de microglia de dos ratones individuales que se procesaron de forma independiente. Aunque pueden existir pequeños efectos por lotes (células que se concentran en ciertas áreas de la gráfica), estas células no forman racimos distintos según los orígenes animales. Este resultado sugiere la reproducibilidad del protocolo para comparar datos entre experimentos. (C) Expresión de genes de la firma de microglia detectados por scRNA-seq que muestra n.o de 85% de tasa de detección para marcadores específicos, como Tmem119 y P2ry12,y más del 80% de tasa de detección para factores de transcripción conocidos como Sall1 y Pu.1. Los datos fueron re-analizados de la literatura publicada17. (D) La gran mayoría de la microglia aislada carece de expresión de genes específicos de otros tipos de células, como Tubb3 (neuronas), Aldh1l1 (astrocitos), Gjb1 (oligodendrocitos) y Tie1 (células endoteliales). (E) Expresión de activación microglial o estrés relacionados con genes. Los marcadores clásicos, Tnf, Il1b, Nos2y Nfkb2,que se expresan de forma humilde, se muestran en la parte superior. Los genes de respuesta temprana, Egr1 y Fos,se muestran en la parte inferior (ver discusión). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Reactivo | Volumen (L) |
| Lisis celular | 4 |
| Transcriptasa inversa (100 U/L) | 0.95 |
| Inhibidor de la nanmasa | 0.25 |
| 5x Búfer de primera hebra | 2 |
| Ditiothreitol (TDT; 100 mM) | 0.5 |
| Betaína (5 M) | 2 |
| MgCl2 (1 M) | 0.06 |
| Interruptor de plantilla oligo (TSO; 100 M) | 0.1 |
| H2O | 0.14 |
| Total | 10 |
Tabla 1: Invierta la condición de transcripción. Se proporcionan volúmenes de reactivos para una reacción de transcripción inversa.
| Reactivo | Volumen (L) |
| Producto de transcripción inversa | 10 |
| 2x mezcla maestra pcR | 12.5 |
| Imprimación ISPCR (10 M) | 0.25 |
| Exonucleasa de Lambda | 0.1125 |
| H2O | 2.1375 |
| Total | 25 |
Tabla 2: Condición de amplificación de PCR. Se proporcionan volúmenes de reactivos para una amplificación PCR de ADNc desde una sola célula.
| Basado en placas (este protocolo) | Basado en gotas (10x Genómica) | |
| Sensibilidad | Se han detectado más genes | Menos genes detectados |
| Longitud completa | Sí | No (5' o 3' extremo) |
| Flexibilidad para números de células/poblaciones | Adecuado para la caracterización de subpoblaciones pequeñas o raras | Adecuado para la categorización amplia de poblaciones de células grandes |
| Rendimiento | Hasta varios miles de células | Cientos a decenas de miles de células |
| Identificador molecular único | No | Sí |
| Costo por celda | $1 a $5 | menos de $1 |
| Dificultad experimental | Más pasos y por lo general requieren robótica de manipulación de líquidos | Fácil de realizar con máquinas comercializadas |
| Poblaciones celulares | Objetivo de clasificación FACS | Imparcial |
Tabla 3: Comparación entre los métodos scRNA-seq basados en placas y gotas. En este artículo, se proporciona el procedimiento scRNA-seq de longitud completa basado en placas, que tiene las ventajas de una mayor sensibilidad, secuenciación de longitud completa y flexibilidad para un pequeño número de celdas como entradas. Los métodos basados en gotas ofrecen las ventajas de un mayor rendimiento, menor costo, fácil de realizar y datos en identificadores moleculares únicos. Son complementarios dependiendo del propósito de los experimentos.
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Discussion
Microglia interactúa activamente con otros tipos de células en el SNC, y son muy sensibles a los estímulos ambientales. Con el fin de minimizar las respuestas inflamatorias y los cambios aberrantes en su expresión génica durante el proceso de aislamiento, este protocolo se ha simplificado a partir de un método publicado previamente9,y ahora es adecuado aislar la microglia de múltiples regiones de un solo hemisferio cerebral de ratón en paralelo. Los tejidos y reactivos se mantienen a temperatura fría y los experimentos se realizan de manera oportuna (aproximadamente 3,5 h desde la disección hasta la clasificación) con menos lavados y menos reactivos basados en tamaños de tejido limitados. Elegimos la eliminación de otros métodos de homogeneización, como la digestión enzimática, porque la disociación mecánica puede matar y así eliminar las neuronas y otras células gliales mientras causa poco daño o activación a la microglia9,18. Sin embargo, el exceso de dounción puede reducir el rendimiento de la microglia y debe evitarse. Se ha demostrado previamente que la disociación mecánica y la eliminación de mielina basada en perlas seguidas de la clasificación FACS introducen menos activación en la microglia, basada en la expresión mínima de genes inflamatorios clásicos, por ejemplo, Tnf, Il1b, Nos2y Nfkb29 (Figura 4E). No obstante, la microglia todavía podría responder a las condiciones ex vivo durante la disociación y clasificación mediante la regulación de genes de respuesta temprana como Fos y Egr1 (Figura 4E),que normalmente no se expresan mediante microglia in vivo2,19, y dichos cambios de estudios transcriptómicos siempre deben validarse en las secciones de histología.
Aquí proporcionamos procedimientos para aislar la microglia de corteza, cerebelo, hipocampo y estriado de un hemisferio cerebral de ratón adulto, y este protocolo se puede adaptar fácilmente a otras regiones o etapas. Esto es útil para situaciones, por ejemplo, cuando la microglia afectada por la enfermedad se limita a ciertas áreas del cerebro que se pueden diseccionar, o en estudios de envejecimiento, donde la agrupación de muestras es inapropiada debido a variaciones individuales significativas. Con la disponibilidad de anticuerpos contra los epítopos microgliales (o inmunes innatos pan), este protocolo también podría adaptarse para aislar la microglia en ratas o tejidos humanos9. Al ajustar para tejidos más grandes o más antiguos, es importante tener en cuenta y probar el volumen de las cuentas de eliminación de mielina y el tipo de columnas utilizadas. Un enfoque alternativo para la eliminación de mielina es por centrifugación de gradiente de densidad en medios comerciales de baja viscosidad20. En general, estos dos métodos son comparables en su eficiencia, aunque el método de centrifugación de gradiente de densidad puede proporcionar rendimientos ligeramente más altos, y por otro lado, el método de cuentas magnéticas es menos probable que introduzca endotoxinas, que pueden activar microglia21,22.
Debido al pequeño porcentaje de microglia entre las células cerebrales totales, a menudo es esencial enriquecer o purificar la microglia antes de realizar estudios transcriptomicos de una sola célula. Utilizamos FACS como un enfoque sensible para capturar tipos de celdas con poca representación y seleccionar microglia basada en la expresión de superficie CD11b y CD45. De un hemisferio, obtenemos rutinariamente 30.000 euros de microglia para la corteza, y 5.000 euros de microglia para cerebelo, hipocampo o estriado. Estos rendimientos son suficientes para la mayoría de las aplicaciones de una sola célula, así como arnal-seq a granel (se pueden utilizar 3.000 o más células). Vale la pena mencionar que la microglia puede regular la inmunoreactividad CD45 durante el desarrollo o la enfermedad2, en cuyo caso se deben registrar células con niveles bajos y altos de CD45 y ordenar el índice para su análisis. Otra opción para enriquecer la microglia es utilizar la clasificación de células activadas magnéticamente mediadas por perlas CD11b después de la eliminación de mielina, pero esto limitaría los métodos de gotas de scRNA-seq.
Para estudiar la expresión génica microglial con resolución de una sola célula, normalmente ordenamos las células en al menos 2 x 3 placas de 96 pocillos por muestra y realizamos la preparación de la biblioteca con máquinas de manipulación de líquidos. Se ha demostrado que este enfoque de preparación de bibliotecas de longitud completa basado en placas es uno de los métodos scRNA-seq más sensibles en el límite de detección, permitiendo la cuantificación precisa de transcripciones raras, como los factores de transcripción13,14,16. Debido a la secuenciación de longitud completa, este enfoque no está sujeto a sesgo de 5' o 3' y se puede utilizar para analizar variantes de empalme(Tabla 3). Además, a diferencia de los métodos basados en gotas, que normalmente requieren cientos o miles de celdas en una reacción, este protocolo basado en placas tiene la flexibilidad de incluir un pequeño número de celdas en cada experimento, y ampliar gradualmente el tamaño de la población agregando más placas en el diseño más adelante. Esto es ventajoso cuando se estudian pequeños subconjuntos de microglia en ciertas condiciones como el desarrollo embrionario.
Si bien este protocolo genera reproduciblemente bibliotecas scRNA-seq de alta calidad para la microglia regional del cerebro, a menudo sólo es adecuado para estudios a pequeña escala debido al costo relativamente alto (alrededor de $5/célula para la preparación de la biblioteca, todavía más barato que $23/célula si se utiliza el kit SmartSeq v4 fuera del estante). Varias estrategias pueden ayudar a reducir el costo y aumentar el rendimiento. En primer lugar, las células se pueden clasificar en placas de 384 pocillos con tan solo 0,5 ml de tampón de lisis, y esto solo requiere 1/8 volúmenes de reactivos para los pasos iniciales de transcripción inversa y amplificación de PCR. En segundo lugar, es posible producir transposasa Tn5 interna que tenga una calidad similar a la de un kit disponible comercialmente23. Estas dos modificaciones podrían reducir el costo de preparación de la biblioteca a $1/celda. En tercer lugar, utilizando índices personalizados, miles de celdas se pueden agrupar juntas para la secuenciación en un sistema sin sacrificar la profundidad de secuenciación (>1 millón de lecturas/célula)17. Estas mejoras junto con la incorporación de robots automatizados de manipulación de líquidos, permitirán un scRNA-seq profundo de alto rendimiento de microglia aislada de casi cualquier región definida.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno y Spyros Darmanis por su ayuda durante el desarrollo de este protocolo. También agradecemos el Stanford Shared FACS Facility, particularmente Meredith Weglarz y Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart de Stanford Protein y Nucleic Acid Facility (PAN) por su gran apoyo al rodaje. Este trabajo está financiado por la Fundación JPB y la Fundación Vincent J. Coates.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base) |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS buffer | Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red | ||
| Plates | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenizer, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 |
References
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