Summary
Nous fournissons un protocole pour l'isolement des microglies de différentes régions disséquées d'un hémisphère de cerveau de souris adulte, suivi de la préparation semi-automatisée de bibliothèque pour le séquençage profond d'ARN unicellulaire des transcriptomes pleine longueur. Cette méthode aidera à élucider l'hétérogénéité fonctionnelle des microglies dans la santé et la maladie.
Abstract
Comme macrophages résidents dans le système nerveux central, microglies contrôlent activement le développement du cerveau et l'homéostasie, et leurs dysfonctionnements peuvent conduire les maladies humaines. Des progrès considérables ont été réalisés pour découvrir les signatures moléculaires des microglies homéostatiques ainsi que des altérations de leur expression génique en réponse à des stimuli environnementaux. Avec l'avènement et la maturation des méthodologies génomiques unicellulaires, il est de plus en plus reconnu que les microglies hétérogènes peuvent sous-tendre les divers rôles qu'elles jouent dans différentes conditions développementales et pathologiques. Une dissection plus poussée d'une telle hétérogénéité peut être obtenue par un isolement efficace des microglies d'une région d'intérêt donnée, suivie d'un profilage sensible des cellules individuelles. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour l'isolement rapide des microglies de différentes régions du cerveau dans un seul hémisphère de cerveau de souris adulte. Nous démontrons également comment utiliser ces microglies triées pour le séquençage profond d'ARN à cellule profonde à base de plaque. Nous discutons de l'adaptabilité de cette méthode à d'autres scénarios et fournissons des lignes directrices pour améliorer le système afin de tenir compte des études à grande échelle.
Introduction
Les microglies, qui représentent 5 % à 10 % de toutes les cellules neurales, sont des macrophages résidents dispersés dans tout le système nerveux central (SNC)1. Protégées derrière la barrière hémato-encéphalique, les microglies typiques d'un cerveau adulte en bonne santé contiennent de nombreux processus fins qui s'étendent rapidement et se rétractent pour interagir avec les neurones et autres cellules gliales du parenchyme. Microglia peut également adopter la morphologie amoeboid associée à une fonction phagocytique accrue au cours de stades de développement spécifiques ou sur les défis immunitaires dans les blessures et la maladie1,2,3,4. De récentes découvertes passionnantes ont clairement démontré que les microglies ne sont en aucun cas des spectateurs passifs aux signaux dérivés du cerveau ou pathologiques, mais jouent un rôle central dans le contrôle du développement du cerveau et de l'homéostasie, par exemple, en soutenant la survie neuronale, en élagant des synapses immatures, en favorisant la différenciation des cellules de lignée d'oligodendrocytes ainsi qu'en angiogenèse1. Comme plus de fonctions de microglies sont élucidés, l'excitation est encore alimentée par des études de génétique humaine, qui ont montré que de nombreux gènes de risque de maladie neurodégénérative, tels que TREM2, sont principalement ou exclusivement exprimés par microglies5,6,7. Compte tenu de leur importance dans le développement et des rôles plausibles de la maladie-moteur, des efforts énormes ont été récemment mis en vue de notre compréhension de la régulation et de la fonction des gènes microglials dans l'espoir de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies neurodégénératives1,8.
Le séquençage de l'ARN (ARN-seq) permet une caractérisation impartiale de l'expression génétique spécifique au type cellulaire, qui guide à son tour les scientifiques pour étudier les fonctions génétiques dans les réseaux cellulaires denses7. L'ARN-seq avait été principalement fait sur des échantillons en vrac, menant à la découverte d'une signature de gène microglial homéostatique qui les distingue des autres cellules neurales et immunitaires9. Cependant, une telle approche pourrait négliger les différences moléculaires et fonctionnelles entre les microglies, en particulier celles qui sont présentes de façon transitoire dans le développement, ou associées au vieillissement et à la maladie. En effet, l'ARN-seq unicellulaire (scRNA-seq) offre la sensibilité et la résolution qui ont révolutionné le domaine en révélant l'hétérogénéité précédemment sous-estimée des microglies dans une variété de contextes2,3,10. En outre, en raison de la présence d'autres cellules immunitaires similaires à l'interface de circulation du SNS, scRNA-seq fournit des informations aidant à la conception de nouveaux outils pour séparer et disséquer fonctionnellement ces cellules connexes avec peu de connaissances préalables2,11.
Une gamme variée de plates-formes scRNA-seq ont été inventées, chacune adaptée à certaines applications12. En général, les méthodes à base de gouttelettes, telles que la génomique 10x, sont plus élevées dans le débit avec (des dizaines de) milliers de cellules séquencées dans chaque course, et ils sont moins sélectifs pour l'entrée qui peut contenir des populations de cellules mixtes nécessitant une catégorisation large. Les méthodes basées sur les plaques fournissent une sensibilité plus élevée et lisent la profondeur13,14, ciblant habituellement des populations spécifiques du tri cellulaire pour révéler des différences subtiles ou des transcriptions rares. Étant donné le faible pourcentage de cellules microgliales, en particulier celles qui sont associées au développement ou à la maladie, parmi tous les types de cellules du SNC, il est souvent souhaitable d'isoler les microglies d'une région d'intérêt spécifique et d'obtenir des informations transcriptomiques profondes et complètes afin de comprendre leur hétérogénéité.
Ici, nous fournissons des détails sur la façon d'isoler les microglies de différentes régions du cerveau de souris disséqués à partir d'un seul hémisphère, qui sont utilisés pour une seule cellule (ou en vrac) ARN-seq suivant une procédure semi-automatisée de préparation de bibliothèque à base de plaques. L'autre hémisphère peut alors être utilisé pour la validation histologique. Simplifié à partir d'une méthode9déjà publiée, ce protocole d'isolement vise à maximiser le rendement à partir d'une petite quantité de matériaux de départ, et en attendant maintenir des profils d'expression microgliale endogène. Nous utilisons le tri des cellules activées par la fluorescence (FACS) pour enrichir les microglies (ou d'autres cellules immunitaires connexes d'intérêt) en plaques de 96 puits et miniaturiser les volumes de réactifs pour la préparation de la bibliothèque afin d'augmenter le débit. Nous mettons en évidence cette plate-forme sensible scRNA-seq, bien que d'autres stratégies basées sur les plaques puissent être appliquées. Cette méthode peut être facilement adaptée pour isoler les microglies d'autres tissus disséqués, tels que les blessures ou les foyers de la maladie, et l'âge de la souris peut varier selon presque tous les stades postnatals. L'isolement efficace des microglies régionales pour les études de transcriptomique unicellulaire facilitera une meilleure compréhension de leurs fonctions en santé et en maladie.
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Protocol
Toutes les procédures impliquant des rongeurs étaient conformes aux directives de l'Université Stanford, qui sont conformes aux lois et aux politiques nationales et étatiques. Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité administratif sur les soins aux animaux de laboratoire de l'Université Stanford.
REMARQUE: Toutes les compositions de solution et de mémoire tampon sont fournies dans tableau des matériaux.
1. Préparation le jour de l'isolement cellulaire
- Préparer les réactifs suivants et les refroidir sur la glace : moyen A (50 mL), tampon de tri cellulaire à activation magnétique (MCS) (30 mL), tampon FACS (25 mL), saline tamponnée en phosphate (PBS; 30 mL), DNase (320 l) et inhibiteur de la RNase (30 l).
REMARQUE: Les volumes fournis ici sont suffisants pour isoler les microglies de 4 régions du cerveau (par exemple, cortex, cervelet, hippocampe et striatum) d'un seul hémisphère cérébral de souris. Échelle si plus de tissus sont utilisés. - Placer quatre homogénéisateurs d'once propre de 2 ml sur la glace et ajouter 2 ml de Moyen A avec 80 l de DNase (12 500 unités/mL) et 5 l d'inhibiteur de la RNase dans chaque homogénéisateur Dounce. Refroidir les pistons dans des tubes de 15 ml.
- Étiqueter quatre plats Petri de 6 cm avec des régions cérébrales pour la collecte des tissus et ajouter 200 l de moyen froid A dans chaque plat sur glace. Ajouter environ 5 ml de Moyen A dans un plat Petri de 6 cm pour la dissection.
REMARQUE: Avant d'être utilisé, assurez-vous que tous les réactifs sont stériles et adaptés aux applications d'ARN. Les outils de banc et de dissection doivent être nettoyés et pulvérisés avec la solution de décontamination de RNase (Tableau des matériaux).
2. Dissection de région de cerveau
REMARQUE: Cette étape devrait prendre 30 min.
- Injecter 400 à 500 l de kétamine/xylazine (24 mg/mL de kétamine et 2,4 mg/mL de xylazine) dans le péritoine d'une souris de stade juvénile à adulte (1 mois).
REMARQUE: Une souris mâle est utilisée ici pour l'illustration, mais l'un ou l'autre sexe est approprié. - Attendez 5 min et pincez une patte postérieure pour assurer le manque de rétraction.
- Utilisez immédiatement une aiguille de 26 G x 3/8 pour effectuer la perfusion transcardique avec 20 à 30 ml de PBS glacé jusqu'à ce que le tampon s'épuise sans sang visible.
- Décapiter la souris avec une paire de ciseaux chirurgicaux. Utilisez de petits ciseaux pour ouvrir la peau pour exposer le crâne sous-le-champ, puis coupez à travers la suture sagittale, la suture lambdoidal et la suture coronale. Utilisez des forceps pour retirer les deux côtés de l'os pariétal et de l'os interpariétal sans endommager le tissu, et déplacez soigneusement le cerveau dans le plat Petri de dissection avec A moyen.
- Utilisez une lame pré-réfrigérée pour couper le cerveau à travers la ligne médiane en deux hémisphères.
REMARQUE: Les quatre régions de cerveau décrites ici d'un seul hémisphère produisent des nombres suffisants de microglies pour des applications d'ARN-seq unicellulaires ou en vrac. L'autre hémisphère peut être utilisé pour l'immunohistochimie ou la validation in situ de l'ARN. - Séparez le cervelet du lobe cortical et du tronc cérébral avec #55 forceps et transférez le tissu dans un plat Petri de collection.
- Utilisez #55 forceps pour disséquer soigneusement l'hippocampe et le striatum du cortex et transférer chaque tissu dans un plat Petri collection.
3. Dissociation des tissus mécaniques
REMARQUE: Gardez les cellules et les réactifs au frais tout le temps, sauf pendant les étapes de coloration. Cette étape devrait prendre 30 min.
- Hacher chaque tissu cérébral à l'arme de rasoir en morceaux fins de3 mm.
- Utilisez une pipette de 1 ml (avec des pointes coupées) pour transférer des morceaux de tissu dans les homogénéisateurs Dounce préréfrigérés, contenant chacun 2 ml de Moyenne A avec inhibiteur de la DNase et de la NAse.
- Homogériser le tissu en tordant lentement le piston dans et hors de l'homogénéisateur Dounce pendant 6 à 10 coups complets, jusqu'à ce qu'aucun morceau visible ne soit présent.
REMARQUE: Douncing tue les neurones et la plupart des autres cellules gliales, mais laisser les cellules microgliales plutôt intactes. L'insuffisance et le sur-douncing peuvent mener au faible rendement des cellules. - Transférer les tissus dissociés dans des tubes de 50 ml à travers des passoires de 70 m.
- Rincer chaque homogénéisateur Dounce et piston avec un total de 6 ml de milieu a froid et filtrer la solution de rinçant e à travers la même passoire dans le tube correspondant.
- Transférer les suspensions à une seule cellule (environ 8 ml chacune) dans des tubes coniques de 15 ml et une centrifugeuse à 400 x g pendant 5 min à 4 oC avec frein 5.
4. Enlèvement de myéline
REMARQUE: Cette étape devrait prendre 60 min.
- Préparer 1 grande colonne d'épuisement (LD) (pour le cortex) et 3 colonnes de grande sélection (LS) (pour les 3 autres régions) dans un séparateur magnétique (Tableau des matériaux). Rincer chaque colonne avec 3 ml de tampon MCS.
- Une fois la centrifugation terminée, sortir la pipette et jeter le supernatant sans déranger la pastille. Pour les tissus du cortex et du cervelet, resuspendre les cellules dans 850 l'amorti MCS avec 1,8 l d'inhibiteur de la RNase. Pour les tissus de l'hippocampe et du striatum, resuspendre les cellules dans 400 l'amorti MCS avec 0,9 l d'inhibiteur de la RNase.
REMARQUE: Les colonnes (LD vs LS) et le volume utilisé pour la resuspension sont optimisés en fonction de la quantité de myéline présente dans le tissu. Si d'autres régions du cerveau sont astoyées, ces conditions peuvent devoir être ajustées en fonction de la taille du tissu et de la quantité de myéline qui peut exister. L'efficacité de l'élimination de la myéline peut être estimée à l'étape 4.9. - Ajoutez 100 l de perles d'ablation de myéline chacune dans les cellules du cortex et du cervelet et ajoutez 50 l de perles d'ablation de la myéline chacune dans les cellules de l'hippocampe et du striatum.
- Mélanger délicatement les cellules avec des perles et incuber les tubes sur la glace pendant 10 min.
- Porter le volume du tube avec des cellules corticales à 2 ml avec tampon MCS, et tous les autres à 1 ml (c.-à-d., ajouter 1 mL pour les cellules corticales; 500 l pour les cellules hippocampales et striatal; pas besoin d'ajouter un tampon aux cellules cérévelaires).
- Une fois que les colonnes sont vides de tampon de rinçant, placez un tube de 15 ml au-dessous de chaque colonne. Chargez les cellules corticales (2 ml) sur la colonne LD, et toutes les autres (1 ml chacune) sur les colonnes LS. Utilisez immédiatement 1 mL de tampon MCS chacun pour laver les tubes d'origine et charger la solution sur les colonnes correspondantes.
- Laver la colonne LD une fois avec 1 mL de tampon MCS et laver chaque colonne LS deux fois avec 1 ml de tampon MCS chaque lavage. Continuer à recueillir la solution de flux pendant le lavage.
- Filtrer les cellules dans des tubes FACS à fond rond à travers des bouchons de passoire de 35 m.
REMARQUE: Chaque tube doit recueillir environ 4 ml de suspension à cellule unique appauvrie de la myéline. - En option, prenez 10 L de la suspension de la cellule et mélangez-la avec 10 l de la solution bleu trypan de 0,4 %. Examinez les cellules sous un microscope de champ lumineux de 10x pour estimer le rendement, le taux de survie et le niveau de myéline résiduelle.
REMARQUE: Une préparation réussie devrait générer plus de 90% de cellules vivantes (de forme ronde et à l'exclusion du colorant bleu) avec peu ou pas de débris de myéline. - Cellules de pellet dans les tubes FACS à 400 x g pendant 5 min à 4 oC, avec frein 5. Versez lentement le supernatant et tamponnez le bord du tube sur du papier de soie. Resuspendre les cellules dans chaque tube avec 300 l de tampon FACS.
REMARQUE: Si le tri MCS est préférable, les perles de CD11b peuvent être employées pour sélectionner des microglies et d'autres cellules myéloïdes suivant l'enlèvement de myéline. Ces cellules peuvent ensuite être utilisées pour le scRNA-seq non-plat-basé aussi bien que l'ARN-seq en vrac. La mise en garde de cette approche alternative est que les perles de CD11b ne séparent pas les microglies des autres cellules immunitaires connexes qui sont également positives pour cet antigène.
5. Staining pour le tri cellulaire activé par fluorescence
REMARQUE: Cette étape devrait prendre 40 min.
- Ajouter 5 ll de souris fc récepteurs bloquer réactif (Tableau des matériaux) dans chaque tube. Incuber 5 min sur glace.
- Ajouter 1 l de CD45-PE-Cy7 et 1 l de CD11b-BV421 dans chaque tube.
REMARQUE: Des anticorps avec d'autres fluorophores conjugués peuvent être utilisés. Les anticorps contre TMEM119, un marqueur spécifique pour les microglies homéostatiques9, peuvent également être inclus, mais il est recommandé d'être utilisé avec CD45 et CD11b, parce que certaines sous-populations de microglies peuvent perdre l'expression de surface TMEM119. - Incuber les tubes sur un shaker pendant 10 min à température ambiante (RT).
- Ajouter 2 mL de tampon FACS pour laver.
- Les cellules pelleteuses à 4 oC, 400 x g pendant 5 min. Verser lentement le supernatant et tamponner le bord du tube sur du papier de soie. Resuspendre les cellules de chaque tube à l'aide de 400 l de tampon FACS avec 1 l d'inhibiteur de la RNase et 0,5 l d'iodure de propidium (PI, 1:1 000 dilution).
6. Index FACS Tri
REMARQUE: Cette étape devrait prendre 1 h.
- Suivant la procédure FACS standard, dessinez des portes basées sur la dispersion (à l'exclusion des débris), les cellules individuelles, les cellules vivantes (PI négatif), les microglies et les cellules myéloïdes (CD45,CD11b).
REMARQUE: Les cellules microgliales typiques expriment CD45 à des niveaux inférieurs comparés à d'autres macrophages frontaliers, tels que les macrophages périvasculaires et méningés, et donc gating sur CD45 faible CD11b- devrait être suffisant si l'accent de la recherche est des profils d'expression génique dans ces microglies classiques1,2. Cependant, certains sous-ensembles de microglies peuvent avoir une expression CD45 plus élevée et cela est particulièrement vrai pendant le développement ou dans des conditions de maladie. Afin d'assurer une analyse impartiale de l'expression des gènes microglial, les immunophénotypes cD45 élevés et cD45 faibles peuvent être enregistrés par le biais du réglage du tri de l'indice et des deux populations recueillies pour le séquençage et l'analyse en aval. En outre, l'expression de surface TMEM119 peut être utilisée pour cibler la population microgliale homéostatique (voir l'étape 5.2) et analysée avec les niveaux de CD45 et les résultats de séquençage. - Trier une seule microglie (avec une buse de 100 m) dans des plaques de réaction en chaîne de polymérase (PCR) de 96 puits, contenant 4 ll de tampon de lyse chaque puits (voir le protocole publié14 pour plus de détails).
REMARQUE: Le mélange de pointe d'ARN externe du Consortium (ERCC)(tableau des matériaux)peut être ajouté à 1:2.4 x 107 dans le tampon de lyse pour le contrôle de la qualité et la normalisation2. - Vortex brièvement les plaques et tourner vers le bas à l'aide d'une centrifugeuse banc-dessus.
- Congeler immédiatement les échantillons sur de la glace sèche. Conserver les assiettes à -80 oC jusqu'à la préparation de la bibliothèque.
REMARQUE: Alternativement, plus de cellules peuvent être rassemblées dans des tubes de 1.5 ml avec tampon d'extraction d'ARN pour l'ARN-seq en vrac. Selon l'expérience des auteurs, 3 000 cellules sont suffisantes pour générer des bibliothèques de bonne qualité suivant le protocole publié2,14.
7. Préparation de la bibliothèque à séquençage de l'ARN à cellule unique
REMARQUE: Ici, le protocole publié14 est suivi pour générer des bibliothèques scRNA-seq à l'aide de la robotique de manipulation liquide et quelques modifications. Dans cet article, la procédure n'est décrite que brièvement, et les différences sont mises en évidence. Le traitement simultané de 4 plaques prend environ 2,5 jours.
- Décongeler les plaques sur la glace et effectuer la transcription inverse avec l'amorce Oligo-dT30VN (dans le tampon de lyse) pour générer de l'ADNc avec des cycleurs thermiques (tableau 1) : 42 oC 90 min; 70 oC 5 min; 4 oC. Ensuite, amplifiez l'ADNc avec une étape supplémentaire de digestion exonuclée au début (tableau 2) en utilisant le mix maître PCR et les amorces IN situ PCR (ISPCR) ( Tableaudes matériaux) et l'état PCR suivant : 37 oC 30 min; 95 oC 3 min; 23 cycles de 98 oC 20 s, 67 oC 15 s, 72 oC 4 min; 72 oC 5 min.
- Purifez l'ADNc à l'aide de 18 l de perles magnétiques par puits (rapport de 0,7:1). Incuber la plaque sur un support magnétique pendant 5 min et laver les échantillons deux fois avec de l'éthanol fraîchement préparé à 80 %, 80 l par puits à chaque fois. Après le séchage de la plaque pendant 15-20 min, élifier l'ADNc avec 20 l de tampon d'élution par puits.
REMARQUE: Pour le contrôle de la qualité, utilisez un analyseur de fragments (analyse de fragments de séquençage de nouvelle génération à haute sensibilité, 1 à 6 000 pb) pour vérifier les distributions de taille et les concentrations d'ADNc, et ne traitez que d'autres échantillons avec un frottis compris entre 500 et 5 000 pb, et supérieur à 0,05 ng/L. - Pour générer des bibliothèques, mélanger 0,4 L de chaque échantillon d'ADNc avec 1,2 L de réactifs tn5 de tagmentation du kit de préparation de la bibliothèque (Table of Materials) dans une plaque de 384 puits à l'aide d'une machine à pipetage nanolitre, à 55 oC 10 min.
REMARQUE: Ici, 1/12.5 du volume de réaction suggéré (5 échantillons ll et 15 l de réactifs de tagmentation) est ajouté afin de réduire les coûts et, entre-temps, d'augmenter le débit. Une machine de pipetage de nanolitre (Table des matériaux)est employée pour transférer des réactifs (ceci et les étapes suivantes) des plaques et à 384 puits. - Ajouter 0,4 L de tampon de neutralisation pour arrêter la réaction de tagmentation à RT pendant 5 min.
- Ajouter 384 index(tableau des matériaux, 0,4 L à l'avant et 0,4 l inverse), 1,2 l de mélange PCR aux échantillons (2 l chacun), et amplifier les bibliothèques en utilisant la condition suivante : 72 oC 3 min; 95 oC 30 s; 10 cycles de 95 oC 10 s, 55 oC 30 s, 72 oC 1 min; 72 oC 5 min.
- Regroupez toutes les bibliothèques individuelles (prendre 1 l chacune) à partir de la même plaque de 384 puits ensemble, et utilisez des perles magnétiques(tableau des matériaux,0,7:1 ratio) pour purifier les bibliothèques finales mises en commun.
- Utiliser un fluoromètre (Tableau des matériaux) pour mesurer les concentrations et un bioanalyseur (Tableau des matériaux) pour examiner les distributions de taille des bibliothèques mises en commun avant le séquençage. Ciblez la profondeur de séquençage à 1 million de lectures brutes par cellule.
- Suivez les procédures bioinformatiques standard pour filtrer et couper les lectures de séquençage et effectuer l'alignement2. Utilisez le tableau de comptage et les métadonnées comme entrées pour effectuer l'analyse de clustering avec le paquet Seurat15.
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Representative Results
Ce protocole décrit une méthode pour isoler et trier les microglies de différentes régions du cerveau dans un hémisphère cérébral perfused adulte, suivie de scRNA-seq. Nous utilisons le douncing pour créer une suspension à cellule unique et aussi comme première étape pour enrichir les microglies. L'insuffisance ou le sur-douncing réduit le rendement. En outre, les cerveaux adultes de souris contiennent des niveaux élevés de myéline, qui peut également réduire l'efficacité de tri et le rendement s'il n'est pas enlevé correctement. Par conséquent, nous examinons la suspension cellulaire au microscope en utilisant le bleu trypan et un hémocytomètre pour estimer le rendement, la viabilité cellulaire et l'efficacité de l'élimination de la myéline (étape 4.9) avant d'effectuer la coloration des anticorps (figure 1). Le nombre total de cellules à ce stade devrait être plus de 30.000 pour le cortex, et plus de 5.000 pour d'autres tissus. Plus de 90% des cellules devraient être viables avec peu de débris de myéline.
Nous utilisons une machine FACS pour trier les microglies (ou cellules myéloïdes), qui sont généralement CD45 faible et CD11b positif. Au moins pour le tissu cortical, l'isolement réussi devrait produire plus de 80% de microglies de toutes les cellules individuelles vivantes (figure 2). La population mourante/morte ne représente qu'une petite fraction de la préparation (environ 10 %).
Une fois que les microglies individuelles sont capturées dans le tampon de lyse, l'ARN est libéré et ensuite inversé transcrit à l'ADNc, qui est ensuite amplifié pendant 23 cycles. Il est important de vérifier la qualité de ces échantillons d'ADNc— au moins une partie d'entre eux — avant de faire des bibliothèques. En tant que plate-forme d'électrophorèse capillaire, l'analyseur de fragments et les kits de fragments NGS très sensibles (1 à 6 000 pb) fournissent des informations rapides et précises sur la distribution de la taille ainsi que sur la quantité de molécules d'ADNc présentes dans chaque puits d'une plaque de 96 puits(figure 3A). Des échantillons montrant un frottis (500 à 5 000 pb) et au-dessus de certains seuils de concentration (p. ex., 0,05 ng/L) peuvent être utilisés pour fabriquer des bibliothèques. De même, les bibliothèques mises en commun doivent être testées sur un bioanalyseur avant le séquençage (figure 3B).
Nous séquencer les échantillons à une profondeur de plus de 1 million de lectures brutes par cellule, ce qui sature la puissance de détection de cette méthodologie scRNA-seq16. Avec un taux de cartographie d'environ 60 %, plus de 2 000 gènes par cellule microgliale peuvent être détectés. Nous avons obtenu des données publiées qui ont été générées à l'aide de cette méthode d'isolement17, et démontrons sa reproductibilité à partir d'expériences indépendantes et de sensibilité pour détecter des gènes spécifiques aux microglies dans la population séquentée (Figure 4).
Figure 1 : Estimation du rendement d'isolement des microglies, viabilité cellulaire et efficacité de l'élimination de la myéline. Le panneau gauche a montré l'image lumineuse de champ (grossissement 4x) des cellules teintées bleues de trypan (du cortex) après avoir passé par des colonnes d'enlèvement de myéline. Les résultats pour d'autres régions se ressembleraient, mais avec moins de cellules. La grande majorité (sinon la totalité) des cellules sont apparues brillantes (non tachées) et rondes en raison de la perte de processus. La bonne image était le zoom-in (20x) de la zone en boîte et peu de débris de myéline était présent. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Portes utilisées pour le tri des microglies. Les données ont montré la stratégie de gating pour trier les microglies du cortex, et la même stratégie a été utilisée pour d'autres régions. Les débris cellulaires ont d'abord été exclus de la parcelle de dispersion, et les cellules simples ont été fermées par la zone de dispersion vers l'avant (FSC-A)/largeur de diffusion vers l'avant (FSC-W). Les cellules vivantes ont été fermées par la coloration négative de PI, qui étaient d'environ 90% de toutes les cellules simples. Les microglies, qui représentent environ 80 % des cellules vivantes, ont été triées à partir de la porte CD45 low CD11bMD. Un total de 30 000 microglies pourrait être isolé et trié à partir du tissu du cortex (à partir d'un hémisphère d'une souris de 3 mois). Le tri d'index a été effectué sur une machine FACS. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Résultats représentatifs du contrôle de la qualité pour l'ADNc amplifié d'une seule cellule microgliale et d'une éventuelle bibliothèque mise en commun. (A) À l'aide d'un analyseur de fragments, tous les fragments sont tracés avec leurs tailles sur l'axe X, et l'intensité relative de fluorescence sur l'axe Y, signifiant l'abondance d'un ADNC de taille donnée. LM (marqueur inférieur, 1 bp) et UM (marqueur supérieur, 6 000 pb) sont des marqueurs de chargement dont les concentrations connues sont utilisées pour mesurer la quantité d'ADNc. L'ADNc amplifié avec succès à partir d'une cellule microgliale représentative forme une courbe (ligne pointillée verte) sur le graphique de distribution de taille ou un frottis (support étiqueté) sur le graphique de gel entre 500 bp et 5 000 bp. D'autres pics étiquetés ont été amplifiés à partir de molécules de pointe ERCC ou d'ARN ribosomal. La concentration d'ADNc entre 500 bp et 5 000 pb peut être quantifiée, et les échantillons dont les concentrations sont supérieures à 0,05 ng/L et montrant ces courbes typiques sont conservés pour la préparation de la bibliothèque. RFU, unité relative de fluorescence. (B) Résultat représentatif de contrôle de la qualité sur un bioanalyseur montrant la distribution de la taille d'une bibliothèque finale mise en commun (avec environ 380 cellules). En règle générale, il varie de 200 à 2 000 pb avec une taille moyenne de 400 à 600 pb. Les deux pics pointus étaient des marqueurs de chargement. FU, unité de fluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : analyse scRNA-seq de microglies isolées de 4 régions de cerveau de deux souris mâles. (A) tSNE parcelle montrant le modèle entremêlé de microglies régionales (seules les cellules de la souris #1 ont été mis en évidence). Ils ne forment pas des amas distincts selon les origines de la région au-delà du déplacement subtil dans les zones concentrées sur la parcelle tSNE (peut-être en raison d'effets de lot). Cette observation est compatible avec l'hétérogénéité régionale limitée des microglies basée sur l'expression globale de gène chez les souris adultes (voir une publication récente2 pour une discussion plus approfondie sur ce sujet). (B) trace tSNE montrant le modèle de chevauchement des microglies de deux souris individuelles qui ont été traitées indépendamment. Bien que de petits lots puissent exister (cellules se concentrant dans certaines zones de la parcelle), ces cellules ne forment pas des amas distincts selon les origines animales. Ce résultat suggère la reproductibilité du protocole pour comparer les données entre les expériences. (C) Expression des gènes de signature de microglies détectés par scRNA-seq montrant plus de 95% de taux de détection pour des marqueurs spécifiques, tels que Tmem119 et P2ry12, et plus de 80% de taux de détection pour les facteurs de transcription connus tels que Sall1 et Pu.1. Les données ont été réanalysées à partir de la littérature publiée17. (D) La grande majorité des microglies isolées manquent d'expression de gènes spécifiques à d'autres types de cellules, tels que Tubb3 (neurones), Aldh1l1 (astrocytes), Gjb1 (oligodendrocytes) et Tie1 (cellules endothéliales). (E) Expression des gènes liés à l'activation microgliale ou au stress. Les marqueurs classiques, Tnf, Il1b, Nos2, et Nfkb2, qui sont exprimés humblement, sont affichés sur le dessus. Les gènes de réponse précoce, Egr1 et Fos, sont montrés en bas (voir discussion). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Réactif | Volume (L) |
| Lyse cellulaire | 4 |
| Transcriptase inversée (100 U/L) | 0.95 |
| Inhibiteur de l'arnse | 0.25 |
| 5x Premier tampon de brin | 2 |
| Dithiothreitol (TNT; 100 mM) | 0.5 |
| Betaine (5 M) | 2 |
| MgCl2 (1 M) | 0.06 |
| Oligo de commutateur de modèle (TSO ; 100 M) | 0.1 |
| H2O | 0.14 |
| Total | 10 |
Tableau 1 : État de transcription inversée. Des volumes de réactif pour une réaction de transcription inversée sont fournis.
| Réactif | Volume (L) |
| Produit de transcription inversée | 10 |
| 2x PCR master mix | 12.5 |
| Amorce ISPCR (10 M) | 0.25 |
| Lambda exonuclée | 0.1125 |
| H2O | 2.1375 |
| Total | 25 |
Tableau 2 : Condition d'amplification du PCR. Des volumes de réactif pour une amplification pcR de l'ADNc à partir d'une seule cellule sont fournis.
| Plate-basé (ce protocole) | Droplet-based (10x Genomics) | |
| Sensibilité | Plus de gènes détectés | Moins de gènes détectés |
| Pleine longueur | Oui | Non (5' ou 3' fin) |
| Flexibilité pour le nombre de cellules/populations | Convient à la caractérisation des sous-populations petites ou rares | Convient à une catégorisation large des grandes populations de cellules |
| Débit | Jusqu'à plusieurs milliers de cellules | Des centaines à des dizaines de milliers de cellules |
| Identificateur moléculaire unique | non | Oui |
| Coût par cellule | 1 $ à 5 $ | moins de 1 $ |
| Difficulté expérimentale | Plus d'étapes et nécessitent généralement la manipulation liquide robotique | Simple à réaliser avec des machines commercialisées |
| Populations cellulaires | Ciblé par le tri FACS | Impartiale |
Tableau 3 : Comparaison entre les méthodes scRNA-seq à base de plaques et de gouttelettes. Dans cet article, la procédure scRNA-seq à base de plaque est fournie, qui a les avantages d'une sensibilité plus élevée, le séquençage intégral et la flexibilité pour un petit nombre de cellules comme intrants. Les méthodes basées sur les gouttelettes offrent les avantages d'un débit plus élevé, d'un coût inférieur, d'une facilité d'exécution et de données dans des identificateurs moléculaires uniques. Ils sont complémentaires selon le but des expériences.
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Discussion
Les microglies interagissent activement avec d'autres types de cellules du SNC, et elles sont très sensibles aux stimuli environnementaux. Afin de minimiser les réponses inflammatoires et les changements aberrants dans leur expression génique au cours du processus d'isolement, ce protocole a été simplifié à partir d'une méthode publiée précédemment9, et il est maintenant approprié d'isoler les microglies de plusieurs régions d'un seul hémisphère du cerveau de souris en parallèle. Les tissus et les réactifs sont conservés à température froide et les expériences sont effectuées en temps opportun (environ 3,5 h de la dissection au tri) avec moins de lavages et moins de réactifs basés sur des tailles de tissus limitées. Nous choisissons douncing au-dessus d'autres méthodes d'homogénéisation, telles que la digestion enzymatique, parce que la dissociation mécanique peut tuer et ainsi enlever des neurones et d'autres cellules gliales tout en causant peu de dommages ou d'activation aux microglies9,18. Le sur-douncing, cependant, peut réduire le rendement des microglies et devrait être évité. Il a déjà été démontré que la dissociation mécanique et l'élimination de la myéline à base de perles suivies d'un tri FACS introduisent moins d'activation dans les microglies, basées sur l'expression minimale de gènes inflammatoires classiques, par exemple, Tnf, Il1b, Nos2, et Nfkb29 (Figure 4E). Néanmoins, les microglies pourraient encore répondre aux conditions ex vivo pendant la dissociation et le tri en régulant les gènes de réponse précoce tels que Fos et Egr1 (Figure 4E), qui ne sont pas normalement exprimés par microglies in vivo2,19, et de tels changements des études transcriptomic devraient toujours être validés sur les sections histologiques.
Ici nous fournissons des procédures pour isoler des microglies du cortex, du cervelet, de l'hippocampe et du striatum d'un hémisphère de cerveau de souris adulte, et ce protocole peut être facilement adapté à d'autres régions ou étapes. Ceci est utile pour les situations, par exemple, lorsque les microglies affectées par la maladie sont limitées à certaines zones du cerveau qui peuvent être disséquées, ou dans les études sur le vieillissement, où la mise en commun des échantillons est inappropriée en raison de variations individuelles importantes. Avec la disponibilité d'anticorps contre les épitopes microgliales (ou pan innés immunisés), ce protocole pourrait également être adapté pour isoler les microglies dans les tissus des rats ou des tissus humains9. Lors de l'ajustement pour les tissus plus grands ou plus anciens, il est important d'examiner et de tester le volume de perles d'élimination de la myéline et le type de colonnes utilisées. Une approche alternative pour l'enlèvement de la myéline est par centrifugation de gradient de densité dans les médias commerciaux à faible viscosité20. Dans l'ensemble, ces deux méthodes sont comparables dans leur efficacité, bien que la méthode de centrifugation de gradient de densité puisse fournir des rendements légèrement plus élevés, et d'autre part, la méthode de perles magnétiques est moins susceptible d'introduire des endotoxines, qui peuvent activer des microglies21,22.
En raison du faible pourcentage de microglies parmi les cellules totales du cerveau, il est souvent essentiel d'enrichir ou de purifier les microglies avant d'effectuer des études transcriptomiques unicellulaires. Nous utilisons FACS comme une approche sensible pour capturer les types de cellules peu représentées, et sélectionnons des microglies basées sur l'expression de surface CD11b et CD45. D'un hémisphère, nous obtenons systématiquement 30 000 microglies pour le cortex, et 5 000 microglies pour le cervelet, l'hippocampe ou le striatum. Ces rendements sont suffisants pour la plupart des applications unicellulaires ainsi que l'ARN-seq en vrac (3 000 cellules ou plus peuvent être utilisées). Il convient de mentionner que les microglies peuvent réguler l'immunoréactivité CD45 pendant le développement ou la maladie2, auquel cas les cellules avec des niveaux faibles et élevés de CD45 devraient être enregistrées et l'indice trié pour analyse. Une autre option pour enrichir les microglies est d'utiliser des perles CD11b-négociées à médiation magnétique-activé eillage cellulaire de tri après l'élimination de la myéline, mais cela limiterait scRNA-seq aux méthodes de gouttelette.
Pour étudier l'expression des gènes microglial à la résolution d'une seule cellule, nous trions habituellement les cellules dans au moins 2 à 3 plaques de 96 puits par échantillon et effectuons la préparation de la bibliothèque avec des machines de manipulation liquides. Il a été démontré que cette approche de préparation de bibliothèque pleine longueur à base de plaques est l'une des méthodes de détection scRNA-seq les plus sensibles, permettant une quantification précise des transcriptions rares, telles que les facteurs de transcription13,14,16. En raison du séquençage intégral, cette approche n'est pas soumise à un biais de 5 ou 3' et peut être utilisée pour analyser les variantes d'épissage (tableau 3). En outre, contrairement aux méthodes à base de gouttelettes, qui nécessitent généralement des centaines ou des milliers de cellules dans une réaction, ce protocole à base de plaque a la flexibilité d'inclure un petit nombre de cellules dans chaque expérience, et d'augmenter progressivement la taille de la population en ajoutant plus de plaques dans la conception plus tard. Ceci est avantageux lors de l'étude de petits sous-ensembles de microglies dans certaines conditions telles que le développement embryonnaire.
Bien que ce protocole génère de façon reproductible de haute qualité scRNA-seq bibliothèques pour les microglies régionales du cerveau, il est souvent seulement adapté pour les études à petite échelle en raison du coût relativement élevé (environ 5 $/cellule pour la préparation de la bibliothèque, encore moins cher que 23 $ / cellule si l'utilisation de la hors de l'étagère SmartSeq v4 kit). Plusieurs stratégies peuvent aider à réduire les coûts et à augmenter le débit. Tout d'abord, les cellules peuvent être triées en plaques de 384 puits avec aussi peu que 0,5 l de tampon de lyse, ce qui ne nécessite que 1/8 volumes de réactifs pour la transcription inverse initiale et les étapes d'amplification PCR. Deuxièmement, il est possible de produire en interne Tn5 transposase qui a la même qualité que celle dans un kit disponible dans le commerce23. Ces deux modifications pourraient réduire le coût de préparation de la bibliothèque à 1 $ par cellule. Troisièmement, à l'aide d'index personnalisés, des milliers de cellules peuvent être regroupées pour le séquençage d'un système sans sacrifier la profondeur de séquençage (1 million de lectures/cellule)17. Ces améliorations ainsi que l'incorporation de robots automatisés de manipulation liquide, permettra à haut débit scRNA-seq profonde de microglies isolés de presque toutes les régions définies.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno et Spyros Darmanis pour leur aide lors de l'élaboration de ce protocole. Nous remercions également le Stanford Shared FACS Facility, en particulier Meredith Weglarz et Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart de Stanford Protein and Nucleic Acid Facility (PAN) pour leur grand soutien pour le tournage. Ce travail est financé par la Fondation JPB et la Fondation Vincent J. Coates.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base) |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS buffer | Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red | ||
| Plates | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenizer, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 |
References
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