Summary
Nós fornecemos um protocolo para o isolamento da microglia de diferentes regiões dissecadas de um hemisfério cerebral de camundongo adulto, seguido de preparação de biblioteca semi-automatizada para sequenciamento profundo de RNA unicelular de transcrições completas. Este método ajudará a elucidar a heterogeneidade funcional da microglia na saúde e na doença.
Abstract
Como macrófagos residentes no sistema nervoso central, microglia controlar ativamente o desenvolvimento do cérebro e homeostase, e suas disfunções podem conduzir doenças humanas. Avanços consideráveis foram feitos para descobrir as assinaturas moleculares da microglia homeostática, bem como alterações de sua expressão gênica em resposta a estímulos ambientais. Com o advento e maturação de metodologias genômicas unicelulares, é cada vez mais reconhecido que a microglia heterogênea pode estar subjacente aos diversos papéis que desempenham em diferentes condições de desenvolvimento e patológicas. Uma dissecção mais adicional de tal heterogeneity pode ser conseguida com a isolação eficiente do microglia de uma região de interesse dada, seguida pelo perfil sensível de pilhas individuais. Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para o rápido isolamento da microglia de diferentes regiões cerebrais em um único hemisfério cerebral adulto do rato. Também demonstramos como usar essas microglias classificadas para sequenciamento de RNA de células únicas profundas à base de placa. Discutimos a adaptabilidade deste método a outros cenários e fornecemos diretrizes para melhorar o sistema para acomodar estudos em larga escala.
Introduction
Microglia, representando 5%−10% de todas as células neurais, são macrófagos residentes espalhados por todo o sistema nervoso central (SNC)1. Protegido atrás de barreira sangue-cérebro, microglia típica em um cérebro adulto saudável contêm muitos processos finos que se estendem rapidamente e se retraem para interagir com neurônios e outras células gliais na parenchyma. Microglia também pode adotar a morfologia ameboiídea associada ao aumento da função fagocítica durante estágios específicos de desenvolvimento ou sobre desafios imunológicos em lesão e doença1,2,3,4. Recentes descobertas emocionantes demonstraram claramente que a microglia não são de forma passiva para sinais patológicos ou derivados do cérebro, mas desempenham papéis fundamentais no controle do desenvolvimento cerebral e homeostase, por exemplo, apoiando a sobrevivência neuronal, podar sinapses imaturas, promover a diferenciação de células de linhagem de oligodendrocyte, bem como angiogênese1. À medida que mais funções da microglia são elucidadas, a excitação é ainda mais alimentada por estudos de genética humana, que mostraram que muitos genes de risco de doenças neurodegenerativas, como trem2, são predominantemente ou exclusivamente expressos pela microglia5,6,7. Dada a sua importância no desenvolvimento e plausíveis papéis de condução de doenças, um enorme esforço foi recentemente colocado para a nossa compreensão da regulação do gene microglial e função na esperança de encontrar novos alvos terapêuticos para doenças neurodegenerativas1,8.
O sequenciamento de RNA (RNA-seq) permite caracterização imparcial da expressão gênica específica do tipo celular, que por sua vez orienta os cientistas a investigar as funções gênicas em redes celulares densas7. RNA-seq tinha sido feito principalmente em amostras a granel, levando à descoberta de uma assinatura do gene microglial homeostático que os distingue de outras células neurais e imunes9. No entanto, tal abordagem poderia ignorar as diferenças moleculares e funcionais entre a microglia, especialmente aqueles que estão transitoriamente presentes no desenvolvimento, ou associados ao envelhecimento e à doença. Na verdade, rna-seq de célula única (scRNA-seq) oferece a sensibilidade e resolução que revolucionaram o campo, revelando a heterogeneidade anteriormente subestimada da microglia em uma variedade de contextos2,3,10. Além disso, devido à presença de outras células imunes semelhantes na interface de circulação do SNC, a scRNA-seqs fornece informações que auxiliam o projeto de novas ferramentas para separar e dissecar funcionalmente essas células relacionadas com pouco conhecimento prévio2,11.
Uma disposição diversa de plataformas do scRNA-seq foi inventada, cada um apropriada para determinadas aplicações12. Em geral, os métodos baseados em gotículas, como 10x Genômica, são mais elevados em taxa de rendimento com (dezenas de) milhares de células sequenciadas em cada corrida, e são menos seletivas para a entrada que pode conter populações de células mistas que exigem uma categorização ampla. Métodos baseados em placas fornecem maior sensibilidade e ler profundidade13,14, geralmente visando populações específicas de classificação celular para revelar diferenças sutis ou transcrições raras. Dada a pequena porcentagem de células microgliais, particularmente aquelas subpopulações associadas ao desenvolvimento ou à doença, entre todos os tipos de células do SNC, muitas vezes é desejável isolar a microglia de uma região específica de interesse e obter informações transcriomicas profundas e completas para entender sua heterogeneidade.
Aqui, fornecemos detalhes sobre como isolar a microglia de diferentes regiões cerebrais do camundongo dissecadas de um único hemisfério, que são usados para RNA-seq de célulaúnica (ou a granel) após um procedimento de preparação de biblioteca semi-automatizado baseado em placa. O outro hemisfério pode então ser usado para validação histológica. Simplificado a partir de um método publicado anteriormente9,este protocolo de isolamento visa maximizar o rendimento de uma pequena quantidade de materiais de partida e, entretanto, manter perfis endógenos de expressão gênica microglial. Usamos a classificação celular ativada por fluorescência (FACS) para enriquecer a microglia (ou outras células imunes de interesse relacionadas) em placas de 96 poços e miniaturizar os volumes de reagentes para a preparação da biblioteca, a fim de aumentar a taxa de transferência. Destacamos essa plataforma scRNA-seq sensível, embora outras estratégias baseadas em placas possam ser aplicadas. Este método pode ser facilmente adaptado para isolar a microglia de outros tecidos dissecados, como lesões ou focos de doença, e a idade do rato pode variar em quase todos os estágios pós-natais. O isolamento eficiente da microglia regional para estudos de transcriptômica unicelular facilitará uma melhor compreensão de suas funções na saúde e na doença.
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Protocol
Todos os procedimentos envolvendo roedores se conformaram com as diretrizes da Universidade de Stanford, que cumprem as leis e políticas nacionais e estaduais. Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Painel Administrativo de Cuidados Com Animais laboratoriais da Universidade de Stanford.
Nota: Todas as composições de solução e tampão são fornecidas na Tabela de Materiais.
1. Preparação no Dia do Isolamento Celular
- Prepare os seguintes reagentes e refrigere-os no gelo: médio A (50 mL), tampão de classificação de células ativadas magnéticas (MCS) (30 mL), tampão FACS (25 mL), soro lógico tampão de fosfato (PBS; 30 mL), DNase (320 μL) e inibidor de RNase (30 μL).
Nota: Os volumes fornecidos aqui são suficientes para isolar a microglia de 4 regiões cerebrais (por exemplo, córtex, cerebelo, hipocampo e estriado) de um único hemisfério cerebral de camundongos. Aumente se mais tecidos forem usados. - Coloque quatro homogeneizadores Limpos de 2 mL Dounce no gelo e adicione 2 mL de médio A com 80 μL de DNase (12.500 unidades/mL) e 5 μL de inibidor de RNase em cada homogeneizador Dounce. Chill os pistões em tubos de 15 mL.
- Rotular quatro pratos de Petri de 6 cm com regiões cerebrais para coleta de tecidos e adicione 200 μL de meio frio A em cada prato no gelo. Adicione cerca de 5 mL de médio A em uma placa de Petri de 6 cm para dissecação.
Nota: Antes de usar, certifique-se de que todos os reagentes são estéreis e adequados para aplicações de RNA. Ferramentas de bancada e dissecação precisam ser limpas e pulverizadas com solução de descontaminação rnase(Tabela de Materiais).
2. Dissecção da região do cérebro
Nota: Este passo deve levar ~ 30 min.
- Injete 400 a 500 μL de cetamina/xilazine (24 mg/mL quetamina e 2,4 mg/mL xilázine) no peritônio de um rato de estágio juvenil a adulto (>1 mês de idade).
Nota: Um rato masculino é usado aqui para ilustração, mas qualquer sexo é adequado. - Espere por 5 min e beliscar uma pata traseira para garantir a falta de retratação.
- Use imediatamente uma agulha 26 G x 3/8 para realizar perfusão transcárdica com 20 a 30 mL de PBS gelada até que o tampão se esgote sem sangue visível.
- Decapite o rato com uma tesoura cirúrgica. Use pequenas tesouras para abrir a pele para expor o crânio por baixo, e depois cortar a sutura sulácida, sutura lambdoidal e sutura coronal. Use fórceps para retirar ambos os lados do osso parietal e osso interparietal sem danificar o tecido, e mover cuidadosamente o cérebro para a placa de Petri dissecação com médio A.
- Use uma lâmina pré-refrigerada para cortar o cérebro através da linha média em dois hemisférios.
Nota: As quatro regiões cerebrais descritas aqui a partir de um único hemisfério produzem um número suficiente de microglia para aplicações de RNA-seq unicelulares ou em massa. O outro hemisfério pode ser usado para imunohistoquímica ou rna in situ validação. - Separe o cerebelo do lobo cortical e da haste do cérebro com #55 fórceps e transfira o tecido em um prato de Petri da coleção.
- Use #55 fórceps para dissecar cuidadosamente o hipocampo e o estriado do córtex e transfira cada tecido para uma placa de Petri de coleção.
3. Dissociação de tecido mecânico
Nota: Mantenha as células e reagentes esfriar o tempo todo, exceto durante os passos de coloração. Este passo deve levar ~ 30 min.
- Pique cada tecido cerebral com uma lâmina de barbear em 3mm.
- Use 1 pipette mL (com dicas cortadas) para transferir pedaços de tecido para os homogeneizadores Dounce pré-refrigerados, cada um contendo 2 mL de médio A com inibidor de DNase e RNase.
- Homogeneize o tecido lentamente torcendo o pistão dentro e fora do homogeneizador Dounce por 6-10 traços completos, até que nenhum pedaço visível esteja presente.
Nota: Douncing mata neurônios e a maioria das outras células gliais, mas deixar as células microgliais bastante intacta. Tanto insuficiente e over-douncing pode levar a baixo rendimento das células. - Transfira tecidos dissociados em tubos de 50 mL através de 70 filtros μm.
- Lave cada homogeneizador e pistão Dounce com um total de 6 mL de frio médio A e filtrar a solução de lavagem através do mesmo filtro no tubo correspondente.
- Transfira as suspensões de célula única (cerca de 8 mL cada) em tubos cônicos de 15 mL e centrífuga a 400 x g por 5 minutos a 4 °C com freio = 5.
4. Remoção de mielina
Nota: Este passo deve levar ~ 60 min.
- Prepare 1 grande coluna de esgotamento (LD) (para córtex) e 3 colunas de grande seleção (LS) (para as outras 3 regiões) em um separador magnético(Tabela de Materiais). Lave cada coluna com 3 mL de tampão MCS.
- Uma vez que a centrífugação é terminada, pipeta para fora e descarte o supernatant sem perturbar a pelota. Para os tecidos do córtex e do cerebelo, resuspenda as células em 850 μL de tampão de SMC com 1,8 μL de inibidor de RNase. Para tecidos do hipocampo e do estriado, resuspenda pilhas em 400 μL do amortecedor de MCS com 0.9 μL do inibidor de RNase.
Nota: As colunas (LD vs LS) e o volume utilizado para resuspensão são otimizados com base na quantidade de mielina presente no tecido. Se outras regiões cerebrais são analisadas, essas condições podem precisar ser ajustadas dependendo do tamanho do tecido e quanta mielina pode existir. A eficácia da remoção da mielina pode ser estimada na etapa 4.9. - Adicione 100 μL de contas de remoção de mielina cada um em células de córtex e cerebelo e adicione 50 μL de contas de remoção de mielina cada um em células do hipocampo e estriado.
- Misture delicadamente as pilhas com os grânulos e incuba os tubos no gelo por 10 min.
- Traga o volume do tubo com células corticais para 2 mL com tampão MCS, e todos os outros para 1 mL (ou seja, adicionar 1 mL para células corticais; 500 μL para células hipocampais e estriais; não há necessidade de adicionar buffer para células cerebelares).
- Uma vez que as colunas estão vazias de enxaguamento tampão, coloque um tubo de 15 mL abaixo de cada coluna. Carregue células corticais (2 mL) na coluna LD, e todas as outras (1 mL cada) nas colunas ls. Use imediatamente 1 mL de tampão MCS cada um para lavar os tubos originais e carregar a solução nas colunas correspondentes.
- Lave a coluna LD uma vez com 1 mL de tampão MCS e lave cada coluna LS duas vezes com 1 mL de tampão MCS cada lavagem. Continue a recolher a solução de fluxo durante a lavagem.
- Filtrar as células em tubos facs inferiores redondos através de 35 tampas de filtro μm.
Nota: Cada tubo deve coletar cerca de 4 mL de suspensão de célula única esgotada de mielina. - Opcionalmente, pegue 10 μL da suspensão celular e misture-a com 10 μL de 0,4% solução azul trypan. Examine as células um microscópio de campo brilhante de 10x para estimar o rendimento, a taxa de sobrevivência e o nível de mielina residual.
Nota: Uma preparação bem sucedida deve gerar mais de 90% de células vivas (redondas em forma e excluindo o tinuoso azul) com pouco ou nenhum detrito de mielina. - Células de pelotas nos tubos FACS a 400 x g por 5 min a 4 °C, com freio = 5. Lentamente despeje supernatant e dab a borda do tubo em papel de seda. Resuspenda as células em cada tubo com 300 μL de tampão FACS.
Nota: Se a classificação mcs é preferido, contas CD11b pode ser usado para selecionar microglia e outras células mieloides após a remoção de mielina. Estas células podem então ser usadas para scRNA-seq não baseado em placa, bem como rna-seq em massa. A ressalva desta abordagem alternativa é que as contas CD11b não separam a microglia de outras células imunes relacionadas, que também são positivas para este antígeno.
5. Coloração para triagem celular ativada por fluorescência
Nota: Este passo deve levar ~ 40 min.
- Adicione 5 μL de receptores do mouse Fc bloquear reagente(Tabela de Materiais)em cada tubo. Incubar por 5 min no gelo.
- Adicione 1 μL de CD45-PE-Cy7 e 1 μL de CD11b-BV421 em cada tubo.
Nota: Os anticorpos com outros fluorophores conjugados podem ser usados. Os anticorpos contra o TMEM119, um marcador específico para microglia homeostática9,também podem ser incluídos, mas recomenda-se que sejam usados em conjunto com CD45 e CD11b, pois certas subpopulações de microglia podem perder a expressão superficial TMEM119. - Incubar os tubos em uma coqueteleira por 10 min à temperatura ambiente (RT).
- Adicione 2 mL de buffer FACS para lavar.
- Células de pelotas a 4 °C, 400 x g por 5 min. Lentamente despeje supernatant e dab a borda do tubo em papel de seda. Resuspenda as células em cada tubo usando 400 μL de tampão FACS com 1 μL de inibidor de RNase e 0,5 μL de iodeto propidium (PI, 1:1,000 diluição).
6. Classificação facs índice
Nota: Este passo deve levar ~ 1 h.
- Seguindo o procedimento facs padrão, desenhar portões com base na dispersão (excluindo detritos), células individuais, células vivas (PI negativo), microglia e células mieloides (CD45+, CD11b+).
Nota: As células microgliais típicas expressam CD45 em níveis mais baixos em comparação com outros macrófagos associados à fronteira, como macrófagos perivasculares e meningeais, e, portanto, gating em CD45 CD11b baixo+ deve ser suficiente se o foco da pesquisa é perfis de expressão gênica nestes microglia clássico1,2. No entanto, certos subconjuntos de microglia podem ter maior expressão de CD45 e isso é particularmente verdadeiro durante o desenvolvimento ou em condições da doença. Para garantir a análise imparcial da expressão do gene microglial, os imunofenótipos baixos cd45 altos e cd45 podem ser registrados por meio da configuração de classificação de índices e ambas as populações coletadas para sequenciamento e análise a jusante. Além disso, a expressão superficial tmem119 pode ser usada para atingir a população microglial homeostática (ver passo 5.2) e analisada juntamente com os níveis de CD45 e os resultados de sequenciamento. - Classifique a microglia única (com um bico de 100 μm) em placas de reação em cadeia de polimerase de 96 poços (PCR), contendo 4 μL de lume de lise cada poço (veja o protocolo publicado14 para detalhes).
Nota: O RNA External Control Consortium (ERCC) RNA spike-in mix(Tabela de Materiais)pode ser adicionado em 1:2.4 x 107 no buffer de lyse para controle de qualidade e fins de normalização2. - Vórtice brevemente as placas e girar para baixo usando uma centrífuga banco-top.
- Congele imediatamente as amostras em gelo seco. Guarde as placas a -80 °C até a preparação da biblioteca.
Nota: Alternativamente, mais células podem ser coletadas em tubos de 1,5 mL com buffer de extração de RNA para RNA-seq em massa. De acordo com a experiência dos autores, 3.000 células são suficientes para gerar bibliotecas de boa qualidade após o protocolo publicado2,14.
7. Preparação da Biblioteca de Sequenciamento de RNA unicelular
Nota: Aqui, o protocolo publicado14 é seguido para gerar bibliotecas scRNA-seq com o auxílio de robótica de manuseio de líquidos e algumas modificações. Neste artigo, o procedimento é descrito apenas brevemente, e as diferenças são destacadas. O processamento de 4 placas simultaneamente leva cerca de 2,5 dias.
- Descongelar placas no gelo e realizar transcrição reversa com primer Oligo-dT30VN (no tampão de lise) para gerar cDNA com cyclers térmicos (Tabela 1): 42 °C 90 min; 70 °C 5 min; 4 °C espera. Em seguida, amplificar cDNA com um passo de digestão exonuclease adicional no início (Tabela 2) usando a mistura mestre PCR e primers in situ PCR (ISPCR)(Tabela de Materiais)e a seguinte condição pcr: 37 °C 30 min; 95 °C 3 min; 23 ciclos de 98 °C 20 s, 67 °C 15 s, 72 °C 4 min; 72 °C 5 min.
- Purificar cDNA usando 18 μL de contas magnéticas por poço (0,7:1 ratio). Incubar a placa em um suporte magnético por 5 min e lavar amostras duas vezes com recém-feito 80% etanol, 80 μL por poço de cada vez. Depois de secar a placa por 15-20 min, cDNA elute com 20 μL de tampão de elução por poço.
Nota: Para controle de qualidade, use um analisador de fragmentos (análise de fragmentos de sequenciamento de alta sensibilidade de próxima geração [NGS], 1 a 6.000 bp) para verificar distribuições de tamanho e concentrações de CDNA, e apenas mais amostras de processo com uma mancha entre 500 e 5.000 bp e superior a 0,05 ng/μL. - Para gerar bibliotecas, misture 0,4 μL de cada amostra de cDNA com 1,2 μL de reagentes de tagmentation Tn5 do kit de preparação da biblioteca(Mesa de Materiais)em uma placa de 384 poços com o auxílio de uma máquina de pipetting nanolitro, a 55 °C 10 min.
Nota: Aqui, 1/12.5 do volume de reação sugerido (5 μL amostra e 15 μL de reagentes de tagmentation) é adicionado a fim de reduzir o custo e, entretanto, aumentar a taxa de rendimento. Uma máquina de tubulação de nanolitros(Mesa de Materiais)é usada para transferir reagentes (este e a seguir passos) de e para placas de 384 poços. - Adicione 0,4 μL de buffer de neutralização para parar a reação de tagmentation no RT por 5 min.
- Adicionar 384 índices(Tabela de Materiais, 0,4 μL para a frente e 0,4 μL reverso), 1,2 μL de mix de PCR para amostras (2 μL cada), e amplificar as bibliotecas usando a seguinte condição: 72 °C 3 min; 95 °C 30 s; 10 ciclos de 95 °C 10 s, 55 °C 30 s, 72 °C 1 min; 72 °C 5 min.
- Reúna todas as bibliotecas individuais (pegue 1 μL cada) da mesma placa de 384 poços juntas, e use contas magnéticas(Tabela de Materiais,proporção de 0,7:1) para purificar as bibliotecas juntas finais.
- Use um fluorometer(Tabela de Materiais)para medir as concentrações e um bioanalisador(Tabela de Materiais)para examinar as distribuições de tamanho de bibliotecas agrupadas antes do sequenciamento. Alvo a profundidade de sequenciamento em 1 milhão de leituras cruas por célula.
- Siga os procedimentos bioinformatic padrão para filtrar e aparar leituras de sequenciamento e realizar alinhamento2. Use a tabela de contagem e meta dados como entradas para fazer análise de agrupamento com o pacote Seurat15.
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Representative Results
Este protocolo descreve um método para isolar e classificar microglia de diferentes regiões cerebrais em um hemisfério cerebral adulto perfundido, seguido por scRNA-seq. Usamos douncing para criar suspensão de célula única e também como um primeiro passo para enriquecer microglia. Insuficiente ou excesso de douncing reduz o rendimento. Além disso, os cérebros de camundongos adultos contêm altos níveis de mielina, o que também pode reduzir a eficiência de classificação e o rendimento se não for removido corretamente. Portanto, examinamos a suspensão celular microscópio usando o teu tempo azul e um hemocytometer para estimar o rendimento, viabilidade celular e eficácia da remoção da mielina (passo 4.9) antes de realizar a coloração de anticorpos (Figura 1). Contagens totais de células neste momento deve ser mais de 30.000 para córtex, e mais de 5.000 para outros tecidos. Mais de 90% das células devem ser viáveis com pequenos detritos de mielina.
Usamos uma máquina FACS para classificar microglia (ou células mieloides), que normalmente são cd45 baixas e cd11b positivas. Pelo menos para o tecido cortical, o isolamento bem sucedido deve gerar mais de 80% microglia de todas as células vivas únicas (Figura 2). A população moribunda/morta representa apenas uma pequena fração da preparação (cerca de 10%).
Uma vez que a microglia individual é capturada no amortecedor da lyse, o RNA é liberado e subseqüentemente reverso transcrito ao cDNA, que é amplificado então por 23 ciclos. É importante verificar a qualidade dessas amostras de CDNA - pelo menos uma parte deles- antes de fazer bibliotecas. Como uma plataforma de eletroforese capilar, o analisador de fragmentos e kits de fragmentos NGS de alta sensível (1 a 6.000 bp) fornecem informações rápidas e precisas sobre a distribuição de tamanho, bem como a quantidade de moléculas de cDNA presentes em cada poço de uma placa de 96 poços(Figura 3A). Amostras que mostram uma mancha (500-5.000 bp) e acima de certo limiar de concentração (por exemplo, 0,05 ng/μL) podem ser usadas para fazer bibliotecas. Da mesma forma, as bibliotecas agrupadas devem ser testadas em um bioanalisador antes do sequenciamento(Figura 3B).
Sequenciamos as amostras a uma profundidade de mais de 1 milhão de leituras cruas por célula, o que satura o poder de detecção desta metodologia scRNA-seq16. Com cerca de 60% de taxa de mapeamento, mais de 2.000 genes por célula microglial podem ser detectados. Obtivemos dados publicados que foram gerados usando esse método de isolamento17,e demonstramos sua reprodutibilidade de experimentos independentes e sensibilidade para detectar genes específicos da microglia em toda a população sequenciada (Figura 4).
Figura 1: Estimativa do rendimento de isolamento da microglia, viabilidade celular e eficiência da remoção de mielina. O painel esquerdo mostrou a imagem de campo brilhante (ampliação 4x) de células manchadas azuis trippan (do córtex) depois de passar por colunas de remoção de mielina. Os resultados para outras regiões seriam semelhantes, mas com menos células. A grande maioria (se não todas) das células parecia brilhante (não manchada) e redonda devido à perda de processos. A imagem direita era o zoom-in (20x) da área encaixotada e pequenos detritos de mielina estavam presentes. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 2: Portões usados para triagem de microglia. Os dados mostraram a estratégia gating para classificar microglia do córtex, e a mesma estratégia foi usada para outras regiões. Os detritos celulares foram excluídos pela primeira vez da trama de dispersão, e as células individuais foram fechadas pela área de dispersão frontal (FSC-A)/largura de dispersão frontal (FSC-W). As células vivas foram fechadas por c. manchas negativas, que eram de cerca de 90% de todas as células individuais. Microglia, representando cerca de 80% das células vivas, foram classificados a partir do CD45 baixo CD11b + portão. Um total de ~ 30.000 microglia poderia ser isolado e classificado a partir do tecido do córtex (de um hemisfério de um rato de 3 meses de idade). A classificação do índice foi realizada em uma máquina FACS. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 3: Resultados representativos do controle de qualidade para cDNA amplificado de uma única pilha microglial e de uma biblioteca agrupada eventual. Usandoum analisador de fragmentos, todos os fragmentos são traçados com seus tamanhos no eixo X e a intensidade relativa da fluorescência no eixo Y, significando a abundância de um determinado cDNA de tamanho. LM (marcador inferior, 1 bp) e UM (marcador superior, 6.000 bp) são marcadores de carregamento com concentrações conhecidas usadas para medir a quantidade de cDNA. CDNA amplificado com sucesso de uma célula microglial representativa forma uma curva (linha pontilhada verde) no gráfico de distribuição de tamanho ou uma mancha (suporte rotulado) no gráfico de gel entre 500 bp e 5.000 bp. Outros picos rotulados foram amplificados a partir de moléculas de spike-in ercc ou RNA ribossômico. A concentração de cDNA entre 500 bp e 5.000 bp pode ser quantificada, e aquelas amostras com concentrações superiores a 0,05 ng/μL e mostrando tais curvas típicas são mantidas para preparação da biblioteca. RFU, unidade relativa da fluorescência. (B) Resultado representativo do controle de qualidade em um bioanalyzer que mostra a distribuição do tamanho de uma biblioteca agrupada final (com aproximadamente 380 pilhas). Normalmente, varia de 200 bp a 2.000 bp com um tamanho médio de 400-600 bp. Os dois picos afiados eram marcadores de carregamento. FU, unidade de fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
Figura 4: análise scRNA-seq de microglia isolada de 4 regiões cerebrais de dois camundongos machos. (A) enredo tSNE mostrando padrão misturado de microglia regional (apenas células de #1 do rato foram destacadas). Eles não formam clusters distintos de acordo com as origens da região além da mudança sutil para áreas concentradas na trama tSNE (possivelmente devido a efeitos em lote). Esta observação é consistente com a heterogeneidade regional limitada da microglia baseada na expressão global do gene nos ratos adultos (veja uma publicação recente2 para uma discussão mais adicional neste tópico). (B) enredo tSNE mostrando padrão sobreposto de microglia de dois camundongos individuais que foram processados de forma independente. Embora pequenos efeitos em lotes possam existir (células concentradas em certas áreas da trama), essas células não formam aglomerados distintos de acordo com as origens animais. Esse resultado sugere a reprodutibilidade do protocolo para comparar dados entre experimentos. (C) Expressão de genes de assinatura de microglia detectados pela scRNA-seq mostrando mais de 95% da taxa de detecção para marcadores específicos, como Tmem119 e P2ry12,e mais de 80% da taxa de detecção de fatores de transcrição conhecidos, como Sall1 e Pu.1. Os dados foram reanalisados a partir da literatura publicada17. (D)Grande maioria da microglia isolada falta expressão de genes específicos para outros tipos de células, como Tubb3 (neurônios), Aldh1l1 (astrócitos), Gjb1 (oligodendrócitos) e Tie1 (células endotélias). (E)Expressão de genes relacionados com ativação microglial ou estresse. Marcadores clássicos, Tnf, Il1b, Nos2e Nfkb2,que são humildemente expressos, são mostrados no topo. Os genes de resposta precoce, Egr1 e Fos,são mostrados na parte inferior (veja discussão). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
| Reagente | Volume (μL) |
| Linésia celular | 4 |
| Transcrição reversa (100 U/μL) | 0.95 |
| Inibidor de RNASE | 0.25 |
| 5x Primeiro tampão da costa | 2 |
| Dithiothreitol (DTT; 100 mM) | 0.5 |
| Betaína (5 M) | 2 |
| MgCl2 (1 M) | 0.06 |
| Modelo interruptor oligo (TSO; 100 μM) | 0.1 |
| H2O | 0.14 |
| Total | 10 |
Tabela 1: Condição de transcrição reversa. Os volumes do reagente para uma reação reversa da transcrição são fornecidos.
| Reagente | Volume (μL) |
| Produto de transcrição reversa | 10 |
| Mix mestre pcr 2x | 12.5 |
| Primer ISPCR (10 μM) | 0.25 |
| Lambda exonuclease | 0.1125 |
| H2O | 2.1375 |
| Total | 25 |
Tabela 2: Condição de amplificação de PCR. Os volumes do reagente para uma amplificação do PCR do cDNA de uma única pilha são fornecidos.
| Baseado em placa (este protocolo) | Baseado em gotículas (10x Genômica) | |
| Sensibilidade | Mais genes detectados | Menos genes detectados |
| Duração total | Sim | Não (5' ou 3' final) |
| Flexibilidade para números/populações celulares | Adequado para caracterização de subpopulações pequenas ou raras | Adequado para a ampla categorização de populações de grandes células |
| Transferência | Até vários milhares de células | Centenas a dezenas de milhares de células |
| Identificador molecular único | Não | Sim |
| Custo por célula | $1−$5 | menos de US$ 1 |
| Dificuldade experimental | Mais passos e geralmente requerem robótica de manuseio líquido | Simples de executar com máquinas comercializadas |
| Populações celulares | Alvo de classificação facs | Imparcial |
Tabela 3: Comparação entre métodos scRNA-seq baseados em placas e gotículas. Neste artigo, o procedimento scRNA-seq de corpo inteiro baseado em placa é fornecido, que tem as vantagens de maior sensibilidade, sequenciamento completo e flexibilidade para um pequeno número de células como entradas. Os métodos baseados em gotículas oferecem as vantagens de uma taxa de rendimento mais alta, menor custo, fácil de executar e dados em identificadores moleculares exclusivos. Eles são complementares, dependendo do propósito dos experimentos.
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Discussion
Microglia interage ativamente com outros tipos de células no SNC, e eles são muito sensíveis a estímulos ambientais. A fim de minimizar as respostas inflamatórias e as mudanças aberrantes em sua expressão gênica durante o processo de isolamento, este protocolo foi simplificado a partir de um método publicado anteriormente9, e agora é adequado para isolar microglia de várias regiões de um único hemisfério cerebral do rato em paralelo. Os tecidos e reagentes são mantidos em temperatura fria e os experimentos são realizados em tempo hábil (cerca de 3,5 h da dissecação à triagem) com menos lavagens e menos reagentes com base em tamanhos limitados de tecido. Escolhemos douncing sobre outros métodos de homogeneização, tais como a digestão enzimática, porque a dissociação mecânica pode matar e, assim, remover os neurônios e outras células gliais, causando pouco dano ou ativação para microglia9,18. Over-douncing, no entanto, pode reduzir o rendimento da microglia e deve ser evitado. Foi demonstrado anteriormente que a dissociação mecânica e a remoção de mielina baseada em contas, seguida pela classificação facs, introduzem menos ativação à microglia, com base na expressão mínima de genes inflamatórios clássicos, por exemplo, Tnf, Il1b, Nos2, e Nfkb29 (Figura 4E). No entanto, a microglia ainda poderia responder às condições ex vivo durante a dissociação e classificação, upregulando genes de resposta precoce, como Fos e Egr1 (Figura 4E), que normalmente não são expressos pela microglia in vivo2,19, e tais mudanças de estudos transcriptômicos devem sempre ser validadas em seções de histologia.
Aqui nós fornecemos procedimentos para isolar microglia do córtex, cerebelo, hipocampo e estriado de um hemisfério cérebro adulto do rato, e este protocolo pode ser facilmente adaptado a outras regiões ou estágios. Isso é útil para situações, por exemplo, quando a microglia afetada pela doença é limitada a certas áreas do cérebro que podem ser dissecadas, ou em estudos de envelhecimento, onde coletar amostras é inadequada devido a variações individuais significativas. Com a disponibilidade de anticorpos contra microglial (ou pan inatimune) epítopos, este protocolo também pode ser adaptado para isolar microglia em ratos ou tecidos humanos9. Ao ajustar para tecidos maiores ou mais velhos, é importante considerar e testar o volume de grânulos da mielina-remoção e o tipo de colunas usadas. Uma abordagem alternativa para a remoção de mielina é por densidade centocentente gradiente na mídia comercial de baixa viscosidade20. No geral, estes dois métodos são comparáveis em sua eficiência, embora o método de centrifugação gradiente densidade pode fornecer rendimentos ligeiramente mais elevados, e por outro lado, o método de contas magnéticas é menos propensos a introduzir endotoxinas, que podem ativar microglia21,22.
Devido à pequena porcentagem de microglia entre as células cerebrais totais, muitas vezes é essencial para enriquecer ou purificar microglia antes de realizar estudos transcriptômicos unicelulares. Usamos facs como uma abordagem sensível para capturar tipos de células mal representadas, e selecionar microglia com base em CD11b e CD45 expressão de superfície. De um hemisfério, nós rotineiramente obter ~ 30.000 microglia para córtex, e ~ 5.000 microglia para cerebelo, hipocampo ou estriado. Estes rendimentos são suficientes para a maioria das aplicações unicelulares, bem como rna-seq em massa (3.000 ou mais células podem ser usadas). Vale a pena mencionar que a microglia pode upregulate a imunoreatividade CD45 durante o desenvolvimento ou a doença2,caso em que as pilhas com baixos e altos níveis de CD45 devem ser gravadas e o índice classificado para a análise. Outra opção para enriquecer a microglia é usar a classificação de células ativadas magnéticas mediada por contas CD11b após a remoção da mielina, mas isso limitaria o scRNA-seq aos métodos de gotículas.
Para estudar a expressão do gene microglial na resolução unicelular, geralmente classificamos as células em pelo menos 2 a 3 96 placas de poço por amostra e realizamos a preparação da biblioteca com máquinas de manuseio de líquidos. Tem sido demonstrado que esta abordagem de preparação de biblioteca de corpo inteiro baseada em placas é um dos métodos mais sensíveis scRNA-seq no limite de detecção, permitindo quantificação precisa de transcrições raras, como fatores de transcrição13,14,16. Devido ao sequenciamento completo, essa abordagem não está sujeita a viés de 5 ou 3' e pode ser usada para analisar variantes de emenda(Tabela 3). Além disso, ao contrário dos métodos baseados em gotículas, que geralmente exigem centenas ou milhares de células em uma reação, este protocolo baseado em placa tem a flexibilidade de incluir um pequeno número de células em cada experimento e, gradualmente, expandir o tamanho da população, adicionando mais placas no projeto mais tarde. Isso é vantajoso ao estudar pequenos subconjuntos de microglia em certas condições, como o desenvolvimento embrionário.
Embora este protocolo reproduzivelmente gera bibliotecas scRNA-seq de alta qualidade para microglia regional do cérebro, muitas vezes só é adequado para estudos de pequena escala devido ao custo relativamente elevado (cerca de US $ 5 / célula para a preparação da biblioteca, ainda mais barato do que US $ 23 / célula se usando o off-the kit SmartSeq v4 prateleira). Várias estratégias podem ajudar a reduzir o custo e aumentar a taxa de entrada. Primeiro, as células podem ser classificadas em placas de 384 poços com apenas 0,5 μL de tampão de lyse, e isso requer apenas 1/8 volumes de reagentes para as etapas iniciais de transcrição reversa e amplificação de PCR. Em segundo lugar, é possível produzir transposase Tn5 interna que tem qualidade semelhante à de um kit23comercialmente disponível. Estas duas modificações poderiam reduzir o custo da preparação da biblioteca para baixo a $1/cell. Em terceiro lugar, usando índices personalizados, milhares de células podem ser agrupadas para sequenciamento em um sistema sem sacrificar a profundidade de sequenciamento (>1 milhão de leituras/células)17. Essas melhorias, juntamente com a incorporação de robôs automatizados de manuseio de líquidos, permitirão scRNA-seq de microglia profunda de alta produtividade isolada de quase todas as regiões definidas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno e Spyros Darmanis por sua ajuda durante o desenvolvimento deste protocolo. Agradecemos também à Instalação FACS Compartilhada de Stanford, particularmente Meredith Weglarz e Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart de Stanford Protein and Nucleic Acid Facility (PAN) por seu grande apoio para as filmagens. Este trabalho é financiado pela Fundação JPB e pela Fundação Vincent J. Coates.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base) |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS buffer | Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red | ||
| Plates | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenizer, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 |
References
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