Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Isolering av regionspecifika Microglia från en vuxen mus hjärnhalva halvklotet för djup Single-cell RNA sekvensering

Published: December 3, 2019 doi: 10.3791/60347

Summary

Vi tillhandahåller ett protokoll för isolering av mikroglia från olika dissekerade regioner i en vuxen mus hjärnhalva, följt av semi-automatiserad bibliotek förberedelse för djup Single-cell RNA sekvensering av fullängds transcriptomes. Denna metod kommer att bidra till att belysa funktionella heterogenitet av mikroglia i hälsa och sjukdom.

Abstract

Som bosatt makrofager i centralanervsystemet, mikroglia aktivt kontrollera hjärnans utveckling och homeostas, och deras dysfunktioner kan driva mänskliga sjukdomar. Avsevärda framsteg har gjorts för att avslöja de molekylära signaturerna för homeostatiska mikroglia samt förändringar av deras genuttryck som svar på miljömässiga stimuli. Med tillkomsten och mogningen av encelliga genomiska metoder, är det alltmer erkänt att heterogena mikroglia kan ligga till grund för de olika roller de spelar i olika utvecklings-och sjukdomstillstånd. Ytterligare dissektion av sådan heterogenitet kan uppnås genom effektiv isolering av mikroglia från en given region av intresse, följt av känslig profilering av enskilda celler. Här ger vi ett detaljerat protokoll för snabb isolering av mikroglia från olika hjärnregioner i en enda vuxen mus hjärnhalva. Vi visar också hur man använder dessa sorterade mikroglia för plattbaserade djupa encellig RNA-sekvensering. Vi diskuterar anpassbarhet av denna metod till andra scenarier och ge riktlinjer för att förbättra systemet för att rymma storskaliga studier.

Introduction

Microglia, som representerar 5% − 10% av alla neurala celler, är bosatta makrofager spridda över hela centralanervsystemet (CNS)1. Skyddad bakom blod-hjärnbarriären, typiska mikroglia i en frisk vuxen hjärna innehåller många fina processer som snabbt utvidga och dra tillbaka för att interagera med nervceller och andra gliaceller i parenkymet. Microglia kan också anta Amoeboid morfologi i samband med ökad fagocytos funktion under specifika utvecklingsstadier eller på immun utmaningar i skada och sjukdom1,2,3,4. Senaste spännande upptäckter har tydligt visat att mikroglia är ingalunda passiva åskådare till hjärnan-derived eller patologiska signaler, men spelar centrala roller i att kontrollera hjärnans utveckling och homeostas, till exempel genom att stödja neuronala överlevnad, beskärning omogna synapser, främja oligodendrocyte härstamning celler differentiering samt angiogenes1. Eftersom fler funktioner av mikroglia är klarlagda, är spänningen ytterligare drivet av humangenetik studier, som visade att många neurodegenerativa sjukdomar riskgener, såsom TREM2, huvudsakligen eller uteslutande uttrycks av mikroglia5,6,7. Med tanke på deras betydelse i utvecklingen och sannolika sjukdoms drivande roller, har enorma ansträngningar nyligen satts mot vår förståelse av mikrogliala genreglering och funktion i hopp om att hitta nya terapeutiska mål för neurodegenerativa sjukdomar1,8.

RNA-sekvensering (RNA-SEQ) möjliggör en opartisk karakterisering av celltypspecifika genuttryck, som i sin tur vägleder forskarna att undersöka gen funktioner i täta cellulära nätverk7. RNA-SEQ hade mestadels gjorts på bulkprover, vilket ledde till upptäckten av en homeostatisk mikroglial gensignatur som skiljer dem från andra neurala och immunceller9. En sådan strategi kan dock förbise molekylära och funktionella skillnader mellan mikroglia, särskilt de som transitivt förekommer i utvecklingen, eller i samband med åldrande och sjukdom. I själva verket erbjuder Single-cell RNA-SEQ (scrna-SEQ) den känslighet och upplösning som har revolutionerat området genom att avslöja tidigare underskattade heterogenitet av mikroglia i en mängd olika sammanhang2,3,10. Dessutom, på grund av närvaron av andra liknande immunceller vid CNS-cirkulation gränssnitt, scRNA-SEQ ger information hjälpa utformningen av nya verktyg för att separera och funktionellt dissekera dessa relaterade celler med lite tidigare kunskap2,11.

Ett varierat utbud av scRNA-SEQ plattformar har uppfunnits, var och en lämplig för vissa tillämpningar12. I allmänhet är droplet-baserade metoder, till exempel 10X genomik, högre i dataflödet med (tiotals) tusentals celler sekvenserade i varje körning och de är mindre selektiva för indata som kan innehålla blandade cellpopulationer som kräver bred kategorisering. Plattbaserade metoder ger högre känslighet och Läs djup13,14, som vanligtvis riktar sig till specifika populationer från cell sortering för att avslöja subtila skillnader eller sällsynta utskrifter. Med tanke på den lilla andelen mikrogliala celler, särskilt de utvecklings-eller sjukdomsassocierade subpopulationer, bland alla CNS-celltyper, är det ofta önskvärt att isolera mikroglia från en specifik region av intresse och få djupgående och fullängds transcriptomic information för att förstå deras heterogenitet.

Här ger vi information om hur man isolerar mikroglia från olika mus hjärnregioner dissekeras från en enda halvklotet, som används för Single-cell (eller bulk) RNA-SEQ efter en semi-automatiserad plattbaserade bibliotek förberedelse förfarande. Den andra halvklotet kan sedan användas för histologisk validering. Detta isolerings protokoll effektiviseras från en tidigare publicerad metod9och syftar till att maximera avkastningen från små mängder utgångsmaterial, och samtidigt bibehålla endogena mikrogliala genuttrycksprofiler. Vi använder fluorescensaktiverad cell sortering (FACS) för att berika mikroglia (eller andra relaterade immunceller av intresse) i 96-well plattor och miniatyrisera volymerna av reagenser för biblioteks beredning för att öka genomströmningen. Vi lyfter fram denna känsliga plattform för scRNA-SEQ, även om andra plattbaserade strategier kan tillämpas. Denna metod kan lätt anpassas för att isolera mikroglia från andra dissekerade vävnader, såsom skada eller sjukdom Foci, och ålder av musen kan variera över nästan alla postnatal stadier. Effektiv isolering av regionala mikroglia för encellig transkriptomik studier kommer att underlätta bättre förståelse för deras funktioner i hälsa och sjukdom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla procedurer som involverar gnagare överensstämde med Stanford Universitys riktlinjer, som följer nationella och statliga lagar och policyer. Alla djurförsök godkändes av Stanford Universitys administrativa panel för laboratorie djurs vård.

Anmärkning: Alla lösnings-och buffertsammansättningar finns i tabell över material.

1. förberedelse på dagen för cell isolering

  1. Förbered följande reagenser och kyla dem på is: medium A (50 mL), magnetisk aktiverad cell sortering (MCS) buffert (30 mL), FACS buffert (25 mL), fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 30 mL), DNase (320 μL), och RNase inhibitor (30 μL).
    Anmärkning: De volymer som anges här är tillräckliga för att isolera mikroglia från 4 hjärnregioner (t. ex., cortex, cerebellum, Hippocampus och striatum) av en enda mus hjärnhalva. Skala upp om fler vävnader används.
  2. Placera fyra rena 2 mL Dounce Homogenisatorer på is och tillsätt 2 mL medium A med 80 μL DNase (12 500 enheter/mL) och 5 μL RNase hämmare i varje Dounce Homogenisatorer. Kyla kolvarna i 15 mL rör.
  3. Etikett fyra 6 cm petriskålar med hjärnregioner för vävnad insamling och tillsätt 200 μL av kallt medium A i varje maträtt på isen. Tillsätt ca 5 mL medium A till en 6 cm petriskål för dissektion.
    Anmärkning: Innan användning, se till att alla reagenser är sterila och lämpliga för RNA-tillämpningar. Bänk och dissekering verktyg måste vara rena och sprayas med RNase sanering lösning (tabell över material).

2. hjärn region dissektion

Anmärkning: Detta steg bör ta ~ 30 min.

  1. Injicera 400 − 500 μL ketamin/xylazin (24 mg/mL ketamin och 2,4 mg/mL xylazin) i bukhinnan hos en ung till vuxen stadie mus (> 1 månad gammal).
    Anmärkning: En manlig mus används här för illustration, men antingen kön är lämplig.
  2. Vänta 5 min och nypa en baktass för att säkerställa bristande återdragning.
  3. Använd omedelbart en 26 G x 3/8 nål för att utföra transcardial perfusion med 20 − 30 mL iskall PBS tills bufferten rinner ut utan synligt blod.
  4. Halshugga musen med ett par kirurgiska sax. Använd liten sax för att skära öppna huden för att exponera den under skalle, och sedan skära genom sagittal suturen, lambdoidal suturen och koronala suturen. Använd pinkoppar att dra bort båda sidor av parietalbenet och interparietal ben utan att skada vävnaden, och försiktigt flytta hjärnan i dissektion petriskål med medium A.
  5. Använd en pre-kyld blad för att skära hjärnan genom mittlinjen i två halvklot.
    Anmärkning: De fyra hjärnregioner som beskrivs här från en enda halvklotet ger tillräckligt många mikroglia för Single-cell eller bulk RNA-SEQ applikationer. Den andra halvklotet kan användas för immunohistokemi eller RNA in situ validering.
  6. Separera lillhjärnan från kortikala LOB och hjärnstammen med #55 tång och överföra vävnaden till en samling petriskål.
  7. Använd #55 tång för att försiktigt dissekera ut hippocampus och striatum från cortex och överföra varje vävnad till en samling petriskål.

3. mekanisk vävnad dissociation

Anmärkning: Håll celler och reagenser svala hela tiden utom under färgning steg. Detta steg bör ta ~ 30 min.

  1. Hacka varje hjärnvävnad med ett rakblad i < 1 mm3 fina bitar.
  2. Använd 1 mL pipett (med spetsar avskurna) för att överföra Vävnadsdelar till före kyld Dounce Homogenisatorer, vardera innehållande 2 mL medium A med DNase och RNase inhibitor.
  3. Homogenisera vävnaden genom att sakta vrida kolven in och ut ur Dounce Homogenisatorer för 6 − 10 full stroke, tills inga synliga bitar är närvarande.
    Anmärkning: Douncing dödar nervceller och de flesta andra gliaceller celler men lämnar mikrogliala celler ganska intakt. Både otillräcklig och över-douncing kan leda till låg avkastning av celler.
  4. Överför separerade vävnader till 50 mL-rör genom 70 μm-silar.
  5. Skölj varje Dounce homogenisator och kolv med totalt 6 mL kallt medium A och filtrera Sköljlösningen genom samma SIL i motsvarande röret.
  6. Överför encellig suspensioner (ca 8 mL vardera) till 15 mL koniska rör och centrifugera vid 400 x g i 5 min vid 4 ° c med broms = 5.

4. myelin avlägsnande

Anmärkning: Detta steg bör ta ~ 60 min.

  1. Förbered 1 stor utarmning (LD) kolumn (för cortex) och 3 stora urval (LS) kolumner (för de andra 3 regioner) i en magnetisk separator (tabell över material). Skölj varje kolumn med 3 mL MCS-buffert.
  2. När centrifugering är klar, Pipettera ut och Kassera supernatanten utan att störa pelleten. För cortex och lillhjärnan vävnader, Omsuspendera celler i 850 μl av MCS buffert med 1,8 μl av RNase inhibitor. För hippocampus-och striatum-vävnader, Omsuspendera cellerna i 400 μL MCS-buffert med 0,9 μL RNase-hämmare.
    Anmärkning: Kolumnerna (LD vs. LS) och volymen som används för resuspension optimeras baserat på mängden myelin som finns i vävnaden. Om andra hjärnregioner analyseras, dessa villkor kan behöva justeras beroende på storleken på vävnaden och hur mycket myelin kan existera. Effektiviteten av myelin avlägsnande kan uppskattas i steg 4,9.
  3. Tillsätt 100 μl av myelin Removal beads i cellerna från cortex och lillhjärnan och tillsätt 50 μl myelin-borttagningsceller i celler från hippocampus och striatum.
  4. Blanda försiktigt cellerna med pärlor och inkubera rören på isen i 10 min.
  5. Bringa volymen av röret med kortikala celler till 2 mL med MCS buffert, och alla andra till 1 mL (dvs., tillsätt 1 mL för kortikala celler; 500 μL för hippocampus och striatala celler; inget behov av att lägga till buffert till cerebellär celler).
  6. När kolumnerna är tomma av sköljbufferten, placera en 15 mL tub under varje kolumn. Ladda kortikala celler (2 mL) på LD-kolonnen, och alla andra (1 mL vardera) på LS-kolonnerna. Använd omedelbart 1 mL MCS-buffert vardera för att tvätta de ursprungliga rören och ladda lösningen på motsvarande kolonner.
  7. Tvätta LD-kolonnen en gång med 1 mL MCS-buffert och tvätta varje LS-kolonn två gånger med 1 mL MCS-buffert varje tvätt. Fortsätt att samla in genomflödeslösningen vid tvättning.
  8. Filtrera celler i runda botten FACS rör genom 35 μm SIL mössor.
    Anmärkning: Varje tub bör samla in ca 4 mL encellig suspension utarmat myelin.
  9. Du kan också ta 10 μL av cellsuspensionen och blanda den med 10 μL 0,4% trypan Blue-lösning. Undersök cellerna under ett 10X ljust fält Mikroskop för att uppskatta avkastningen, överlevnaden och nivån av kvarvarande myelin.
    Anmärkning: En lyckad beredning bör generera över 90% levande celler (runda i form och exklusive den blå färgämnet) med liten eller ingen myelin skräp.
  10. Pellets celler i FACS rören vid 400 x g i 5 min vid 4 ° c, med broms = 5. Häll långsamt ut supernatanten och klappa kanten av röret på mjukpapper. Omsuspendera cellerna i varje tub med 300 μL FACS-buffert.
    Anmärkning: Om MCS sortering är att föredra, CD11b pärlor kan användas för att välja mikroglia och andra myeloida celler efter myelin avlägsnande. Dessa celler kan sedan användas för icke-plattbaserade scRNA-SEQ samt bulk RNA-SEQ. Förbehållet med denna alternativa metod är att CD11b pärlor inte separera mikroglia från andra relaterade immunceller som också är positiva för detta antigen.

5. färgning för fluorescens-aktiverad cell sortering

Anmärkning: Detta steg bör ta ~ 40 min.

  1. Tillsätt 5 μL av mus-FC-receptorerna block reagens (tabell över material) i varje tub. Inkubera i 5 minuter på isen.
  2. Tillsätt 1 μL CD45-PE-Cy7 och 1 μL CD11b-BV421 i varje tub.
    Anmärkning: Antikroppar med andra konjugerade fluorofomedel kan användas. Antikroppar mot TMEM119, en specifik markör för homeostatisk mikroglia9, kan också inkluderas, men det rekommenderas att användas tillsammans med CD45 och CD11b, eftersom vissa mikroglia subpopulationer kan förlora TMEM119 ytan uttryck.
  3. Inkubera rören i en shaker i 10 minuter vid rumstemperatur (RT).
  4. Tillsätt 2 mL FACS-buffert för att tvätta.
  5. Pellets celler vid 4 ° c, 400 x g i 5 min. Häll långsamt ut supernatanten och klappa kanten av röret på mjukpapper. Omsuspendera cellerna i varje tub med 400 μL FACS-buffert med 1 μL Rnashämmare och 0,5 μL propidiumjodid JODID (Pi, 1:1000 spädning).

6. index FACS sortering

Anmärkning: Detta steg bör ta ~ 1 h.

  1. Efter standard FACS förfarande, rita grindar baserat på scatter (exklusive skräp), enstaka celler, levande celler (PI-negativa), mikroglia och myeloida celler (CD45+, CD11b+).
    Anmärkning: Typiska mikrogliala celler uttrycka CD45 på lägre nivåer jämfört med andra gräns-associerade makrofager, såsom perivaskulär och meningeal makrofager, och därför gating på CD45 låg CD11b+ bör vara tillräckligt om fokus för forskningen är genuttrycksprofiler i dessa klassiska mikroglia1,2. Vissa undergrupper av mikroglia kan dock ha högre CD45 uttryck och detta gäller särskilt under utveckling eller sjukdomstillstånd. För att säkerställa opartisk analys av mikrogliala genuttryck, CD45 hög och CD45 låg immunophenotypes kan registreras genom index sortering inställning och både populationer samlas in för sekvensering och nedströms analys. Dessutom kan TMEM119 yta uttryck användas för att rikta den homeostatiska mikrogliala populationen (se steg 5,2) och analyseras tillsammans med CD45 nivåer och sekvenserings resultat.
  2. Sortera Single mikroglia (med ett 100 μm munstycke) i 96-och polymeras kedjereaktion (PCR) plattor, som innehåller 4 μl lyseringsbuffert varje brunn (se det publicerade protokollet14 för detaljer).
    Anmärkning: Den externa RNA Control Consortium (ERCC) RNA Spike-in mix (tabell över material) kan läggas till 1:2.4 x 107 i lysis buffert för kvalitetskontroll och normalisering ändamål2.
  3. Kort Vortex plattorna och snurra med hjälp av en bänk-Top centrifug.
  4. Frys omedelbart proverna på torris. Förvara plattorna vid-80 ° c tills biblioteket förberedelse.
    Anmärkning: Alternativt kan fler celler samlas i 1,5 mL-rör med RNA-extraktionsbuffert för bulk RNA-SEQ. Enligt författarnas erfarenhet, 3 000 celler är tillräckliga för att generera bra kvalitet bibliotek efter det publicerade protokollet2,14.

7. Single-cell RNA-sekvensering bibliotek förberedelse

Anmärkning: Här följs det publicerade protokoll14 för att generera scrna-SEQ bibliotek med hjälp av vätskehantering Robotics och några ändringar. I den här artikeln beskrivs proceduren endast kortfattat och skillnaderna markeras. Bearbetning 4 plattor samtidigt tar ca 2,5 dagar.

  1. Tina plattor på is och utför omvänd Transkription med oligo-dT30VN primer (i lyseringsbufferten) för att generera cDNA med termiska cyklers (tabell 1): 42 ° c 90 min; 70 ° c 5 min; 4 ° c håll. Förstärka sedan cDNA med ett ytterligare Exonuklease-rötnings steg i början (tabell 2) med hjälp av PCR Master Mix och in situ PCR (ispcr) primers (tabell över material) och följande PCR-villkor: 37 ° c 30 min; 95 ° c 3 min; 23 cykler av 98 ° c 20 s, 67 ° c 15 s, 72 ° c 4 min; 72 ° c 5 min.
  2. Rengör cDNA med 18 μL magnetiska pärlor per brunn (0,7:1 ratio). Inkubera plattan på ett magnetiskt stativ i 5 min och tvätta proverna två gånger med nytillverkad 80% etanol, 80 μL per brunn varje gång. Efter torkning av plattan för 15-20 min, eluera cDNA med 20 μl elueringbuffert per brunn.
    Anmärkning: För kvalitetskontroll, Använd en fragmentanalysator (hög känslighet nästa generations sekvensering [NGS] fragment analys, 1 − 6000 BP) att kontrollera storleks fördelningar och koncentrationer av cDNA, och endast ytterligare process prover med ett utstryk mellan 500 − 5000 BP, och högre än 0,05 ng/μL.
  3. För att generera bibliotek, blanda 0,4 μL av varje cDNA prov med 1,2 μL av Tn5 tagmentation reagenser från biblioteket beredning Kit (tabell över material) i en 384-bra tallrik med hjälp av en nanoliter pipettering maskin, vid 55 ° c 10 min.
    Anmärkning: Här tillsätts 1/12,5 av den föreslagna reaktions volymen (5 μL prov och 15 μL reagenser för tagmentation) för att minska kostnaderna och samtidigt öka genomströmningen. En nanoliterpipettering maskin (tabell över material) används för att överföra reagenser (detta och följande steg) från och till 384-well tallrikar.
  4. Tillsätt 0,4 μL neutraliseringsbuffert för att stoppa tagmentation reaktionen vid RT i 5 min.
  5. Lägg till 384 index (tabell över material, 0,4 μl framåt och 0,4 μl omvänt), 1,2 μl PCR-blandning till prover (2 μl vardera) och komplettera biblioteken med följande tillstånd: 72 ° c 3 min; 95 ° c 30 s; 10 cykler av 95 ° c 10 s, 55 ° c 30 s, 72 ° c 1 min; 72 ° c 5 min.
  6. Pool alla enskilda bibliotek (ta 1 μL vardera) från samma 384-bra tallrik tillsammans, och använda magnetiska pärlor (tabell över material, 0.7:1 ratio) för att rena de slutliga poolade biblioteken.
  7. Använd en fluorometer (tabell över material) för att mäta koncentrationerna och en bioanalyzer (tabell över material) för att undersöka storleksfördelningen av poolade bibliotek före sekvensering. Rikta sekvenserings djupet på 1 000 000 rå läsningar per cell.
  8. Följ standardiserade bioinformatiska procedurer för att filtrera och trimma sekvenserings läsningar och utföra justering2. Använd räknetabellen och meta-data som indata för att göra klusteranalys med Seurat-paketet15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokoll beskriver en metod för att isolera och sortera mikroglia från olika hjärnregioner i en vuxen parfymiserad hjärnhalva, följt av scrna-SEQ. Vi använder douncing för att skapa en enda cellsuspension och även som ett första steg för att berika microglia. Otillräcklig eller över-douncing minskar avkastningen. Dessutom, vuxna mus hjärnor innehåller höga halter av myelin, som också kan minska sortering effektivitet och avkastning om den inte avlägsnas på rätt sätt. Därför undersöker vi cellsuspensionen under Mikroskop genom att använda trypan Blue och en hemocytometern för att uppskatta avkastningen, cellernas lönsamhet och effekten av myelin Removal (steg 4,9) innan du utför antikropps färgning (figur 1). Totalt antal celler på denna punkt bör vara över 30 000 för cortex, och över 5 000 för andra vävnader. Över 90% av cellerna bör vara livskraftiga med lite myelin skräp.

Vi använder en FACS-maskin för att sortera mikroglia (eller myeloida celler), som normalt är CD45 låga och CD11b positiva. Åtminstone för den kortikala vävnaden, bör lyckad isolering generera över 80% mikroglia av alla levande enskilda celler (figur 2). Den döende/döda befolkningen utgör endast en liten del av preparatet (cirka 10%).

När enskilda mikroglia fångas in i lyseringsbufferten, är RNA frigörs och därefter omvänd transkriberas till cDNA, som sedan förstärks för 23 cykler. Det är viktigt att kontrollera kvaliteten på dessa cDNA-prover-åtminstone en del av dem-innan bibliotek. Som en kapillär elektrofores plattform, fragmentanalysatorn och högkänsliga NGS fragment Kits (1 − 6000 BP) ger snabb och korrekt information om storleksfördelning samt kvantitet av cDNA molekyler som finns i varje brunn av en 96-bra tallrik (figur 3a). Prover som visar ett utstryk (500 − 5000 BP) och över vissa koncentrations trösklar (t. ex. 0,05 ng/μL) kan användas för att göra bibliotek. På samma sätt bör de poolade biblioteken testas på en bioanalyzer före sekvensering (figur 3B).

Vi sekvenserar proverna till ett djup av över 1 000 000 rå läsningar per cell, vilket mättar detekterings kraften hos denna scRNA-SEQ-metod16. Med ca 60% kartläggnings hastighet, över 2 000 gener per mikrogliala cell kan upptäckas. Vi erhöll publicerade data som genererades med denna isoleringsmetod17, och demonstrerar dess reproducerbarhet från oberoende experiment och känslighet för detektering av mikroglia-specifika gener i den sekvenserade populationen (figur 4).

Figure 1
Figur 1: uppskattning av mikroglias isolerings kapacitet, cellernas lönsamhet och effektiviteten av myelin-avlägsnande. Den vänstra panelen visade den ljusa fältet bild (4x förstoring) av trypan blå färgade celler (från cortex) efter att ha passerat genom myelin avlägsnande kolumner. Resultaten för andra regioner skulle se likadana ut men med färre celler. De allra flesta (om inte alla) celler verkade ljusa (icke-färgade) och runda på grund av förlust av processer. Den högra bilden var zoom-in (20x) i boxed området och lite myelin skräp var närvarande. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: grindar som används för att sortera microglia. Data visade den gating strategi för sortering mikroglia från cortex, och samma strategi användes för andra regioner. Cell skräp uteslöts först från spridningsområdet, och enstaka celler var gated av framåt spridningsområde (FSC-A)/Forward scatter-width (FSC-W). Levande celler var gated av PI negativ färgning, som var från cirka 90% av alla enskilda celler. Microglia, som representerar ungefär 80% av levande celler, sorterades från CD45 Low CD11b + Gate. Totalt ~ 30 000 mikroglia kan isoleras och sorteras från cortex vävnad (från en halvklot av en 3-månaders gammal mus). Index sortering utfördes på en FACS-maskin. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3

Figure 3
Figur 3: representativa Kvalitetskontrollresultat för amplifierad cDNA från en enda mikroglialcell och ett eventuellt poolat bibliotek. (A) med hjälp av en fragmentanalysator ritas alla fragment med sina storlekar på X-axeln och relativ fluorescensintensitet på Y-axeln, vilket betecknar överflödet av en given storlek av cDNA. LM (undre markör, 1 BP) och UM (övre markör, 6 000 BP) är lastning markörer med kända koncentrationer som används för att mäta cDNA kvantitet. Framgångsrikt förstärkt cDNA från en representativ mikrogliala cell bildar en kurva (grön prickad linje) på storleksfördelning grafen eller ett smeta (märkt fäste) på gelen grafen mellan 500 BP och 5 000 BP. Andra märkta toppar förstärks från ERCC Spike-i molekyler eller ribosomalt RNA. Koncentrationen av cDNA mellan 500 BP och 5 000 BP kan kvantifieras, och de prover med koncentrationer som är högre än 0,05 ng/μL och som uppvisar sådana typiska kurvor behålls för biblioteks beredning. RFU, relativ fluorescensenhet. B) representativa Kvalitetskontrollresultat på en bioanalyzer som visar storleksfördelning av ett slutligt poolat bibliotek (med ca 380 celler). Typiskt, det varierar från 200 BP till 2 000 BP med en genomsnittlig storlek på 400 − 600 BP. De två skarpa topparna var lastning markörer. FU, fluorescensenhet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: scrna-SEQ-analys av mikroglia isolerad från 4 hjärnregioner av två manliga möss. (A) tsne tomt som visar sammanblandade mönster av regionala mikroglia (endast celler från mus #1 belystes). De bildar inte distinkta kluster enligt regionens ursprung bortom subtil förskjutning i koncentrerade områden på tSNE tomt (möjligen på grund av batcheffekter). Denna observation är förenlig med begränsad regional heterogenitet av mikroglia baserat på globala genuttryck hos vuxna möss (se en nyligen publikation2 för vidare diskussion om detta ämne). Btsne-diagram som visar överlappande mönster av mikroglia från två enskilda möss som behandlades självständigt. Även om det kan finnas små batcheffekter (celler som koncentreras till vissa delar av observationsområdet), bildar dessa celler inte distinkta kluster enligt djurens ursprung. Detta resultat antyder reproducerbarheten av protokollet för att jämföra data mellan experiment. (C) uttryck för mikroglia signaturgener som upptäcks av scrna-SEQ som visar över 95% detektions frekvens för specifika markörer, såsom Tmem119 och P2ry12, och över 80% detektions frekvens för kända transkriptionsfaktorer som Sall1 och PU. 1. Uppgifterna analyserades på nytt från publicerad litteratur17. (D) en stor majoritet av isolerade mikroglia saknar uttryck för gener som är specifika för andra celltyper, såsom Tubb3 (neuroner), Aldh1l1 (astrocyter), Gjb1 (oligodendrocyter) och Tie1 (endotelceller). E) uttryck för gener som är relaterade till mikroglial aktivering eller stress. Klassiska markörer, TNF, Il1b, Nos2, och Nfkb2, som är ödmjuk uttrycks, visas på toppen. Tidiga responsgener, Egr1 och FOS, visas längst ner (se diskussion). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Reagens Volym (μL)
Cell lysis 4
Omvänt transkriptas (100 U/μL) 0,95
RNase inhibitor 0,25
5x första strand buffert 2
Ditiothreitol (DTT; 100 mM) 0,5
Betaine (5 M) 2
MgCl2 (1 M) 0,06
Mallbrytare oligo (TSO; 100 μM) 0,1
H2O 0,14
Totala 10

Tabell 1: omvänd Transkription villkor. Reagensvolymer för en omvänd transkriptionsreaktion tillhandahålls.

Reagens Volym (μL)
Omvänd transkriptionsprodukt 10
2x PCR Master Mix 12,5
ISPCR primer (10 μM) 0,25
Lambda-exonukleas 0,1125
H2O 2,1375
Totala 25

Tabell 2: villkor för PCR-amplifiering. Reagensvolymer för en PCR-amplifiering av cDNA från en enda cell tillhandahålls.

Plattbaserad (detta protokoll) Droplet-baserade (10X genomik)
Känslighet Fler gener upptäcks Färre gener upptäcktes
Full längd Ja Nej (5 ' eller 3 ' slut)
Flexibilitet för cell nummer/populationer Lämplig för karakterisering av små eller sällsynta subpopulationer Lämplig för bred kategorisering av stora cellpopulationer
Genomströmning Upp till flera tusen celler Hundratals till tiotusentals celler
Unik molekylär identifierare Nej Ja
Kostnad per cell $1 − $5 mindre än $1
Experimentella svårigheter Fler steg och kräver vanligtvis vätskehantering Robotics Enkel att utföra med kommersialiserade maskiner
Cell populationer Mål med FACS sortering Opartisk

Tabell 3: jämförelse mellan plattbaserade och droplet-baserade scRNA-SEQ-metoder. I denna artikel, plattbaserade fullängd scRNA-SEQ förfarande tillhandahålls, som har fördelarna med högre känslighet, full längd sekvensering och flexibilitet för ett litet antal celler som indata. Droplet-baserade metoder erbjuder fördelarna med högre genomströmning, lägre kostnad, lätt att utföra och data i unika molekylära identifierare. De kompletterar varandra beroende på syftet med experimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Microglia interagerar aktivt med andra celltyper i CNS, och de är mycket känsliga för miljömässiga stimuli. För att minimera inflammatoriska reaktioner och avvikande förändringar i deras genuttryck under isolerings processen, har detta protokoll effektiviserats från en tidigare publicerad metod9, och det är nu lämpligt att isolera mikroglia från flera regioner i en enda mus hjärnhalva i parallella. Vävnaderna och reagenser hålls vid kall temperatur och experiment utförs i tid (ca 3,5 h från dissektion till sortering) med färre tvättar och mindre reagenser baserade på begränsade vävnads storlekar. Vi väljer att douncing över andra homogenisering metoder, såsom enzymatisk matsmältning, eftersom mekanisk dissociation kan döda och därmed ta bort nervceller och andra gliaceller celler samtidigt orsakar liten skada eller aktivering till mikroglia9,18. Over-douncing, dock, kan minska avkastningen av mikroglia och bör undvikas. Det har tidigare visats att mekanisk dissociation och pärlbaserad myelin-borttagning följt av FACS sortering införa mindre aktivering till microglia, baserat på minimalt uttryck av klassiska inflammatoriska gener, t. ex. , TNF, Il1b, Nos2, och Nfkb29 (figur 4e). Icke desto mindre kan mikroglia fortfarande reagera på ex vivo-förhållandena under dissociation och sortering genom att Upregulating tidiga responsgener som FOS och Egr1 (figur 4E), som normalt inte uttrycks med mikroglia in vivo2,19, och sådana förändringar från transkriptomiska studier bör alltid valideras på histologiska avsnitt.

Här ger vi procedurer för att isolera mikroglia från cortex, cerebellum, Hippocampus och striatum från en vuxen mus hjärnhalva, och detta protokoll kan enkelt anpassas till andra regioner eller stadier. Detta är användbart för situationer, till exempel när sjukdomsdrabbade mikroglia är begränsade till vissa områden i hjärnan som kan dissekeras ut, eller i åldrande studier, där poolprov är olämpligt på grund av betydande individuella variationer. Med tillgången på antikroppar mot mikrogliala (eller Pan medfödda immun) epitopes, detta protokoll kan också anpassas för att isolera mikroglia i råtta eller mänsklig vävnad9. Vid justering för större eller äldre vävnader är det viktigt att överväga och testa volymen av myelin-avlägsnande pärlor och vilken typ av kolonner som används. Ett alternativt tillvägagångssätt för myelin avlägsnande är genom densitet gradient centrifugering i kommersiella lågviskositet Media20. Sammantaget dessa två metoder är jämförbara i sin effektivitet, även om densitetsgradienten centrifugering metod kan ge något högre avkastning, och å andra sidan, den magnetiska pärlor metoden är mindre benägna att införa endotoxiner, som kan aktivera mikroglia21,22.

På grund av den lilla andelen mikroglia bland totala hjärnceller, är det ofta viktigt att berika eller rena mikroglia innan du utför encellig transcriptomic studier. Vi använder FACS som en känslig metod för att fånga ringa representerade celltyper och välj mikroglia baserat på CD11b och CD45 yta uttryck. Från en halvklotet, vi rutinmässigt få ~ 30 000 mikroglia för cortex, och ~ 5 000 mikroglia för cerebellum, Hippocampus eller striatum. Dessa avkastningar är tillräckliga för de flesta encellig applikationer samt bulk RNA-SEQ (3 000 eller fler celler kan användas). Det är värt att nämna att mikroglia kan upregulate CD45 immunoreaktivitet under utveckling eller sjukdom2, i vilket fall celler med både låga och höga nivåer av CD45 bör registreras och index sorteras för analys. Ett annat alternativ för berikande mikroglia är att använda CD11b pärlmedierad magnetisk-aktiverad cell sortering efter myelin avlägsnande, men detta skulle begränsa scrna-SEQ till dropp metoder.

För att studera mikrogliala genuttryck vid Single-cell upplösning, vi brukar sortera celler i minst 2 − 3 96-väl plattor per prov och utföra bibliotek beredning med vätskehantering maskiner. Det har visats att den här plattbaserade fullängdsförberedande metoden är en av de känsligaste scrna-SEQ-metoderna inom detektionsgränsen, vilket möjliggör korrekt kvantifiering av sällsynta utskrifter, såsom transkriptionsfaktorerna13,14och16. På grund av full längd sekvensering, denna metod är inte föremål för 5 ' eller 3 ' bias och kan användas för att analysera skarvning varianter (tabell 3). Dessutom, till skillnad från droplet-baserade metoder, som vanligtvis kräver hundratals eller tusentals celler i en reaktion, detta plattbaserade protokoll har flexibiliteten att inkludera ett litet antal celler i varje experiment, och gradvis expandera befolkningsstorleken genom att lägga till fler plattor i designen senare. Detta är fördelaktigt när man studerar små undergrupper av mikroglia under vissa förhållanden, såsom embryonal utveckling.

Även om detta protokoll reproducerbart genererar högkvalitativa scRNA-SEQ bibliotek för hjärnans regionala mikroglia, är det ofta bara lämpar sig för småskaliga studier på grund av den relativt höga kostnaden (ca $5/cell för bibliotek förberedelse, fortfarande billigare än $23/cell om du använder off hyllan SmartSeq v4 Kit). Flera strategier kan bidra till att minska kostnaderna och öka dataflödet. Först, celler kan sorteras i 384-väl plattor med så lite som 0,5 μL av lysis buffert, och detta kräver endast 1/8 volymer av reagens för den initiala omvänd Transkription och PCR amplifiering steg. För det andra, det är möjligt att producera in-House Tn5 transposase som har liknande kvalitet som en i en kommersiellt tillgänglig kit23. Dessa två ändringar kan minska bibliotekets förberedelse kostnad ner till $1/cell. Tredje, med hjälp av anpassade index, tusentals celler kan slås samman för sekvensering på ett system utan att offra sekvenserings djupet (> 1 miljon läsningar/celler)17. Dessa förbättringar tillsammans med införlivandet av automatiserade vätskehantering robotar, kommer att möjliggöra hög genomströmning djupa scrna-SEQ av mikroglia isolerade från nästan alla definierade regioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno, och Spyros Darmanis för deras hjälp under utvecklingen av detta protokoll. Vi tackar också Stanford Shared FACS-anläggningen, särskilt Meredith Weglarz och Lisa Nichols; Yen Tran, Michael Eckart från Stanford protein och nukleinsyra Facility (PAN) för deras stora stöd för inspelningen. Detta arbete finansieras av JPB Foundation och Vincent J. Coates Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5 M Betaine Sigma-Aldrich Cat# B0300-5VL
10 mM dNTP mix Thermo Fisher Scientific Cat# R0192
0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific Cat# 15575020
10X Hanks’ Balanced Salt Solution Thermo Fisher Scientific Cat# 14185-052
1 M HEPES Thermo Fisher Scientific Cat# 15630080
1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix Kapa Biosciences Cat# KK2602
5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap Corning Cat# 352235
AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) Advanced Analytical Cat# DNF-474-1000
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich Cat# A8806
DNase I Worthington Cat# LS002007 Working solution: 12500 units/ml
DTT, Molecular Grade Promega Cat# P1171
ERCC RNA Spike-In Mix Thermo Fisher Scientific Cat# 4456740
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific Cat# 10437-028
Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) Illumina Cat# FC-131-2001
Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) Illumina Cat# FC-131-2002
Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) Illumina Cat# FC-131-2003
Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) Illumina Cat# FC-131-2004
Lambda Exonuclease (5 U/μl) New England BioLabs Cat# M0262S
Mouse Fc block BD Pharmingen Cat# 553142
Myelin removal beads Miltenyl Biotec Cat# 130-096-433
Nextera XT DNA Sample Prep Kit Illumina Cat# FC-131-1096
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) Illumina Cat# 20024907
PBS (10X), pH 7.4 Thermo Fisher Scientific Cat# 70011044
PCRClean DX beads Aline Biosciences Cat# C-1003-50
Propidium Iodide Thermo Fisher Scientific Cat# P3566 Staining: 1:1000
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermal Fisher Scientific Cat# Q32851
Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) BioLegend Cat# 101236; RRID: AB_11203704 Staining: 1:300
Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) Thermo Fisher Scientific Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 Staining: 1:300
Recombinant RNase Inhibitor Takara Bio Cat# 2313B
SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) Clontech Cat# 639538 Containing 5x First strand buffer
Oligonucleotides
0.1 μM ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA
CGCAGAGT-3'
(Picelli et al., 2014)
Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA
GAGTACT 30 VN-3'
(Picelli et al., 2014)
TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA
GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base)
(Picelli et al., 2014)
Solutions
FACS buffer Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS
MCS buffer Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS
Medium A Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red
Plates
384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific VWR 89005-556
Hard-shell 96-well PCR plates Bio-Rad HSP9631
Others
Dumont #55 forceps Fine Science Tools 11295-51
Dounce homogenizer, 2 ml Wheaton 357422
Large depletion column Miltenyi Biotec 130-042-901
Large selection column Miltenyi Biotec 130-042-401
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976
RNAzap Thermo Fisher Scientific AM9780
Strainer (70 μm) Falcon 352350
Equipment
BD FACSAria II BD Biosciences http://www.bdbiosciences.com/
Bioanalyzer Agilent 2100
Fragment Analyzer Agilent 5300
Mosquito HTS nanoliter pipetting robot TTP Labtech https://www.ttplabtech.com/
Qubit 4 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33226

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  2. Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing. Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).
  3. Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
  4. Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
  5. Guerreiro, R., et al. TREM2 variants in Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).
  6. Jonsson, T., et al. Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).
  7. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
  8. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
  9. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  10. Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
  11. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  12. Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
  13. Svensson, V., et al. Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments. Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).
  14. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
  15. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  16. Ziegenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
  17. Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
  18. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2018).
  19. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  20. Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium. Journal of Visualized Experiments. (133), e57122 (2018).
  21. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
  22. Swartzlander, D. B., et al. Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer's disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109 (2018).
  23. Hennig, B. P., et al. Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol. G3. 8 (1), Bethesda. 79-89 (2018).

Tags

Neurovetenskap microglia isolering hjärnregion fluorescens-aktiverad cell sortering encellig RNA-sekvensering Neuroimmunologi heterogenitet
Isolering av regionspecifika Microglia från en vuxen mus hjärnhalva halvklotet för djup Single-cell RNA sekvensering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhou, L., Li, Q. Isolation ofMore

Zhou, L., Li, Q. Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (154), e60347, doi:10.3791/60347 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter