Summary
Biz yetişkin bir fare beyin yarımkürenin farklı parçalanmış bölgelerinden mikroglia izolasyoniçin bir protokol sağlamak, tam uzunlukta transkripsiyon derin tek hücreli RNA sıralama için yarı otomatik kütüphane hazırlık izledi. Bu yöntem, sağlık ve hastalık mikroglia fonksiyonel heterojenite açıklığa kavuşturmak için yardımcı olacaktır.
Abstract
Merkezi sinir sisteminde yerleşik makrofajlar olarak, mikroglia aktif beyin gelişimi ve homeostaz kontrol, ve onların işlev bozuklukları insan hastalıkları sürücü olabilir. Homeostatik mikroglianın moleküler imzalarının yanı sıra çevresel uyaranlara yanıt olarak gen ekspresyonunda yapılan değişiklikleri ortaya çıkarmak için önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Tek hücreli genomik metodolojilerin gelişi ve olgunlaşmasıyla, heterojen mikroglianın farklı gelişimsel ve patolojik koşullarda oynadıkları çeşitli rollerin altında yattığı giderek daha fazla kabul edilmektedir. Bu tür heterojenliğin daha fazla diseksiyonu, mikroglianın belirli bir ilgi bölgesinden etkin bir şekilde izole edilmesi ve ardından tek tek hücrelerin hassas profilinin alınması yla elde edilebilir. Burada, tek bir yetişkin fare beyin yarımkürede farklı beyin bölgelerinden mikroglia hızlı izolasyon için ayrıntılı bir protokol sağlar. Ayrıca bu sıralanmış mikroglianın plaka bazlı derin tek hücreli RNA dizilimi için nasıl kullanılacağını da gösteriyoruz. Bu yöntemin diğer senaryolara uyarlanabilirliğini tartışır ve büyük ölçekli çalışmalara uyum sağlayacak şekilde sistemin iyileştirilmesi için yönergeler sağlarız.
Introduction
Tüm sinir hücrelerinin %5−%10'unu temsil eden mikroglia, merkezi sinir sistemi (CNS)1'edağılmış yerleşik makrofajlardır. Kan-beyin bariyerinin arkasında korunan, sağlıklı bir yetişkin beyin tipik mikroglia hızla genişletmek ve parankim nöronlar ve diğer glial hücreleri ile etkileşime geri birçok ince süreçler içerir. Mikroglia da belirli gelişimaşamalarında veya yaralanma ve hastalık1bağışıklık sorunları üzerine artan fagositik fonksiyon ile ilişkili amipoid morfolojisi benimseyebilir 1,2,3,4. Son heyecan verici keşifler açıkça mikroglia beyin kaynaklı veya patolojik sinyaller için pasif seyirci olduğunu göstermiştir, ama beyin gelişimi ve homeostaz kontrolünde önemli roller oynamak, örneğin, nöronal sağkalım destekleyerek, budama olgunlaşmamış sinapslar, oligodendrocyte soy hücrelerinin farklılaşması teşvik yanı sıra anjiyogenez1. Mikroglia daha fonksiyonları açıklığa kavuştururken, heyecan daha fazla insan genetik çalışmaları ile körüklenir, hangi birçok nörodejeneratif hastalık risk genleri gösterdi, TREM2 gibi, ağırlıklı olarak veya sadece microglia tarafından ifade5,6,7. Geliştirme ve makul hastalık sürüş rolleri onların önemi göz önüne alındığında, muazzam çaba son zamanlarda nörodejeneratif hastalıklar için yeni terapötik hedefler bulma umuduyla mikroglial gen regülasyonu ve fonksiyonu anlayışımıza doğru konulmuştur1,8.
RNA dizilemesi (RNA-seq) hücre tipine özgü gen ekspresyonunun tarafsız karakterizasyonuna izin verir, bu da bilim adamlarına yoğun hücresel ağlardaki gen fonksiyonlarını araştırmaya rehberlik eder7. RNA-seq çoğunlukla toplu örnekler üzerinde yapılmış, diğer nöral ve bağışıklık hücrelerinden ayıran bir homeostatik mikroglial gen imzası keşfiyol açan9. Ancak, böyle bir yaklaşım mikroglia arasındaki moleküler ve fonksiyonel farklılıkları göz ardı edebilir, özellikle de geçici olarak geliştirme mevcut, ya da yaşlanma ve hastalık ile ilişkili. Nitekim, tek hücreli RNA-seq (scRNA-seq) çeşitli bağlamlarda mikroglia daha önce az takdir heterojenlik ortaya çıkararak alanında devrim var duyarlılık ve çözünürlük sunuyor2,3,10. Buna ek olarak, CNS-dolaşım arayüzüdiğer benzer bağışıklık hücrelerinin varlığı nedeniyle, scRNA-seq çok az ön bilgi ile bu ilgili hücreleri ayırmak ve işlevsel olarak bu ilgili hücrelerin diseksiyon yeni araçların tasarımına yardımcı bilgi sağlar2,11.
ScRNA-seq platformları çeşitli bir dizi icat edilmiştir, her belirli uygulamalar için uygun12. Genel olarak, 10x Genomik gibi damlacık tabanlı yöntemler, her çalıştırmada dizili (on) binlerce hücre ile elde etme açısından daha yüksektir ve geniş kategorizasyon gerektiren karışık hücre popülasyonları içerebilecek girdi için daha az seçicidir. Plaka tabanlı yöntemler daha yüksek duyarlılık sağlamak ve derinliği13okumak,14, genellikle ince farklılıklar veya nadir transkript ortaya çıkarmak için hücre sıralama belirli popülasyonları hedefleme. Mikroglial hücrelerin küçük yüzdesi göz önüne alındığında, özellikle bu gelişme- veya hastalık la ilişkili alt popülasyonlar, tüm CNS hücre tipleri arasında, genellikle ilgi belirli bir bölgeden mikroglia izole etmek ve onların heterojenlik anlamak için derin ve tam uzunlukta transkripsiyonik bilgi elde etmek için arzu edilir.
Burada, yarı otomatik plaka tabanlı kütüphane hazırlama prosedürü nden sonra tek hücreli (veya toplu) RNA-seq için kullanılan tek bir yarımküreden parçalanmış farklı fare beyin bölgelerinden mikroglia izole etmek için nasıl ayrıntıları sağlar. Diğer yarımküre daha sonra histolojik doğrulama için kullanılabilir. Daha önce yayınlanmış bir yöntem9aerodinamik, Bu izolasyon protokolü başlangıç malzemelerin in verimi maksimize etmeyi amaçlamaktadır, ve bu arada endojen mikroglial gen ekspresyonu profilleri korumak. Mikrogliayı (veya diğer ilgili bağışıklık hücrelerini) 96 kuyuplakaya dönüştürmek ve üretim hacmini artırmak için kitaplık hazırlama için reaktif lerin hacimlerini minyatürleştirmek için floresan tarafından aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) kullanıyoruz. Diğer plaka tabanlı stratejiler uygulansa da bu hassas scRNA-seq platformuna vurgu yapıyoruz. Bu yöntem, mikroglia'yı yaralanma veya hastalık odakları gibi diğer diseksiyon lu dokulardan izole etmek için kolayca uyarlanabilir ve farenin yaşı hemen hemen her doğum sonrası evreye kadar değişebilir. Tek hücreli transkripsiyon çalışmaları için bölgesel mikrogliaverimli izolasyon sağlık ve hastalık fonksiyonlarının daha iyi anlaşılmasını kolaylaştıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kemirgenlerle ilgili tüm prosedürler, ulusal ve eyalet yasalarına ve politikalarına uygun olan Stanford Üniversitesi yönergelerine uygundur. Tüm hayvan prosedürleri Stanford Üniversitesi'nin Laboratuvar Hayvan Bakımı İdari Paneli tarafından onaylandı.
NOT: Tüm çözelti ve tampon kompozisyonları Malzeme Tablosu'ndaverilmiştir.
1. Hücre İzolasyon Günü'ne Hazırlık
- Aşağıdaki reaktifleri hazırlayın ve buz üzerinde soğutun: orta A (50 mL), manyetik aktif hücre sıralama (MCS) tampon (30 mL), FACS tampon (25 mL), fosfat tamponlu salin (PBS; 30 mL), DNase (320 μL) ve RNase inhibitörü (30 μL).
NOT: Burada sağlanan hacimler tek bir fare beyin yarımkürenin 4 beyin bölgesinden (örn. korteks, beyincik, hipokampus ve striatum) mikrogliayı izole etmek için yeterlidir. Daha fazla doku kullanılırsa ölçeklendirin. - Buz üzerine dört temiz 2 mL Damlahomogenizer yerleştirin ve her Dounce homogenizer içine 80 μL DNase (12.500 birim/mL) ve 5 μL RNase inhibitörü ile orta A'dan 2 mL ekleyin. 15 mL tüplerde pistonları soğutun.
- Doku toplama için beyin bölgeleri ile etiket dört 6 cm Petri yemekleri ve buz üzerinde her çanağı içine soğuk orta A 200 μL ekleyin. Diseksiyon için 6 cm Petri kabına yaklaşık 5 mL orta A ekleyin.
NOT: Kullanmadan önce, tüm reaktiflerin steril ve RNA uygulamaları için uygun olduğundan emin olun. Tezgah ve diseksiyon aletlerinin temizlenmesi ve RNase dekontaminasyon çözeltisi(Tablo Malzemeler)ile püskürtülmesi gerekmektedir.
2. Beyin Bölgesi Diseksiyonu
NOT: Bu adım ~ 30 dk almalıdır.
- 400−500 μL ketamin/ksilazin (24 mg/mL ketamin ve 2.4 mg/mL xylazine) bir çocuk tan yetişkin evre fareye (>1 aylık) periton enjekte edin.
NOT: Bir erkek fare burada illüstrasyon için kullanılır, ancak her iki cinsiyet uygundur. - 5 dakika bekleyin ve geri çekme eksikliği sağlamak için bir arka pençe çimdik.
- Tampon görünür kan olmadan bitene kadar 20−30 mL buz gibi PBS ile transkardiyal perfüzyon yapmak için hemen 26 G x 3/8 iğne kullanın.
- Farenin kafasını bir çift cerrahi makasla ayırın. Kafatasının altında ortaya çıkarmak için deri açık kesmek için küçük makas kullanın, ve sonra sagittal sütür ile kesilmiş, lambdoidal sütür ve koronal sütür. Dokuya zarar vermeden parietal kemik ve interparietal kemiğin her iki tarafını da çıkarmak için forseps kullanın ve beyni orta A ile diseksiyon Petri kabına dikkatlice hareket ettirin.
- Beyni orta hattan iki yarımküreye kesmek için önceden soğutulmuş bir bıçak kullanın.
NOT: Burada tek bir yarımküreden tanımlanan dört beyin bölgesi, tek hücreli veya toplu RNA-seq uygulamaları için yeterli sayıda mikroglia verir. Diğer hemisfer immünohistokimya veya RNA in situ doğrulama için kullanılabilir. - Serebellum kortikal lob ve beyin sapı #55 forceps ile ayırın ve bir koleksiyon Petri çanak içine doku transferi.
- Dikkatle hipokampus ve korteksten striatum incelemek ve bir koleksiyon Petri çanak içine her doku transferi için #55 forceps kullanın.
3. Mekanik Doku Dissociasyonu
NOT: Boyama adımları dışında hücreleri ve reaktifleri her zaman serin tutun. Bu adım ~ 30 dk almalıdır.
- Her beyin dokusunu bir jiletle doğrayın <1 mm3 ince parçalar halinde.
- Doku parçalarını önceden soğutulmuş Dounce homogenizers'e aktarmak için 1 mL pipet (uçları kesilmiş) kullanın, her biri DNase ve RNase inhibitörüile 2 mL orta A içeren.
- Görünür parçalar bulununcaya kadar, pistonu Dounce homogenizer'ine yavaşça 6−10 tam vuruş için bükerek dokuyu homojenize edin.
NOT: Douncing nöronlar ve diğer birçok glial hücreleri öldürür ama mikroglial hücreleri oldukça bozulmamış bırakın. Hem yetersiz hem de aşırı douncing hücrelerin düşük verim yol açabilir. - Ayrık dokuları 70 m süzgeç aracılığıyla 50 mL tüplere aktarın.
- Her bir Homogenizer ve pistontoplam 6 mL soğuk orta A ile durulayın ve ilgili tüp içine aynı süzgeç ile durulama çözeltisi filtre.
- Tek hücreli süspansiyonları (her biri yaklaşık 8 mL) 15 mL konik tüplere ve santrifüjü 400 x g'de 4 °C'de fren = 5 ile aktarın.
4. Myelin Kaldırma
NOT: Bu adım ~ 60 dk almalıdır.
- 1 büyük tükenme (LD) sütun (korteks için) ve 3 büyük seçim (LS) sütun (diğer 3 bölge için) bir manyetik ayırıcı(Malzeme Tablosu)hazırlayın. Her sütunu 3 mL MCS arabelleğiyle durulayın.
- Santrifüj bittikten sonra, pipet dışarı ve pelet rahatsız etmeden supernatant atın. Korteks ve serebellum dokuları için, 850 μL MCS tamponundaki hücreleri 1.8 μL RNase inhibitörü ile yeniden askıya alın. Hipokampus ve striatum dokuları için, 0.9 μL RNase inhibitörü ile 400 μL MCS tampon hücreleri resuspend.
NOT: Sütunlar (LD vs LS) ve resuspension için kullanılan hacim dokuda bulunan miyelin miktarına göre optimize edilmiştir. Diğer beyin bölgeleri taranırsa, bu koşulların dokunun büyüklüğüne ve miyelinin ne kadar var olabileceğine bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Miyelin giderme etkinliği adım 4.9 olarak tahmin edilebilir. - Korteks ve beyincik hücrelerine her 100 μL miyelin kaldırma boncukekleyin ve hipokampus ve striatum hücrelere her 50 μL miyelin kaldırma boncuk ekleyin.
- Hücreleri boncuklarla hafifçe karıştırın ve tüpleri 10 dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yatırın.
- McS tamponu ile kortikal hücrelere sahip tüpün hacmini 2 mL'ye, diğer tüm lerini 1 mL'ye getirin (kortikal hücreler için 1 mL ekleyin; hipokampal ve striatal hücreler için 500 μL; serebel hücrelerine tampon eklemenize gerek yok).
- Sütunlar durulama arabelleği boş aldıktan sonra, her sütunun altına 15 mL'lik bir tüp yerleştirin. Kortikal hücreleri (2 mL) LD sütununa ve diğer tüm hücreleri (her biri 1 mL) LS sütunlarına yükleyin. Orijinal tüpleri yıkamak ve çözümü ilgili kolonlarüzerine yüklemek için hemen 1 mL MCS tampon kullanın.
- LD sütunu 1 mL MCS tamponuyla bir kez yıkayın ve her LS sütunu her yıkamada 1 mL MCS tamponile iki kez yıkayın. Yıkama sırasında akış yoluyla çözelti toplamaya devam edin.
- Hücreleri 35 μm süzgeç kapağı ile yuvarlak alt FACS tüpleri halinde filtreleyin.
NOT: Her tüp miyelin tükenmiş tek hücreli süspansiyon yaklaşık 4 mL toplamak gerekir. - İsteğe bağlı olarak, hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve 10 μL %0,4 trypan mavi çözeltisi ile karıştırın. Verim, sağkalım oranı ve kalıntı miyelin düzeyini tahmin etmek için 10x parlak alan mikroskobu altındaki hücreleri inceleyin.
NOT: Başarılı bir hazırlık üzerinde% 90 canlı hücreler (yuvarlak şeklinde ve mavi boya hariç) çok az ile hiçbir miyelin enkaz ile üretmelidir. - FACS tüplerinde 400 x g'de 4 °C'de 5 dk, fren = 5 ile pelet hücreleri. Yavaş yavaş supernatant dökün ve doku kağıt üzerinde tüp kenarına dab. 300 μL FACS tamponu ile her tüpteki hücreleri yeniden askıya alın.
NOT: MCS sıralama tercih edilirse, CD11b boncuk lar miyelin çıkarılmasından sonra mikroglia ve diğer miyeloid hücreleri seçmek için kullanılabilir. Bu hücreler daha sonra plaka tabanlı olmayan scRNA-seq yanı sıra toplu RNA-seq için kullanılabilir. Bu alternatif yaklaşımın uyarı CD11b boncuklar da bu antijen için olumlu diğer ilgili bağışıklık hücrelerinden microglia ayrı değildir.
5. Floresan aktive Hücre Sıralama için Boyama
NOT: Bu adım ~ 40 dk almalıdır.
- Her tüpe 5 μL fare Fc reseptörleri blok reaktifi(Malzeme Tablosu)ekleyin. Buz üzerinde 5 dakika kuluçka.
- Her tüpe 1 μL CD45-PE-Cy7 ve 1 μL CD11b-BV421 ekleyin.
NOT: Diğer konjuge floropores ile antikorlar kullanılabilir. TMEM119 karşı antikorlar, homeostatik mikroglia için özel bir belirteç9, ayrıca dahil edilebilir, ancak CD45 ve CD11b ile birlikte kullanılması tavsiye edilir, Bazı mikroglia alt popülasyonları TMEM119 yüzey ekspresyonu kaybedebilir çünkü. - Tüpleri oda sıcaklığında (RT) 10 dakika çalkalayıcı üzerine tüplerle inkübedin.
- Yıkamak için 2 mL FACS arabelleği ekleyin.
- 4 °C' de pelet hücreleri, 5 dk. 5 dk. 1 μL RNase inhibitörü ve 0.5 μL propidium iyodür (PI, 1:1.000 seyreltme) ile 400 μL FACS tamponu kullanarak her tüpteki hücreleri yeniden askıya alın.
6. Dizin FACS Sıralama
NOT: Bu adım ~ 1 saat almalıdır.
- Standart FACS prosedüründen sonra, dağılıma (enkaz hariç), tek hücrelere, canlı hücrelere (PI negatif), mikroglia ve miyeloid hücrelere (CD45+, CD11b+ )dayalı kapılar çizin.
NOT: Tipik mikroglial hücreler, perivasküler ve meningeal makrofajlar gibi diğer sınırilişkili makrofajlar ile karşılaştırıldığında düşük seviyelerde CD45 ifade, ve bu nedenle CD45 düşük CD11b gating+ araştırmanın odak bu klasik mikroglia gen ekspresyon profilleri ise yeterli olmalıdır1,2. Ancak, mikroglia bazı alt kümeleri yüksek CD45 ekspresyonu olabilir ve bu özellikle geliştirme sırasında veya hastalık koşullarında doğrudur. Mikroglial gen ekspresyonunun tarafsız analizini sağlamak için, CD45 yüksek ve CD45 düşük immünfenotipleri indeks sıralama ayarı ve sıralama ve aşağı akım analizi için toplanan her iki popülasyon ile kaydedilebilir. Buna ek olarak, TMEM119 yüzey ekspresyonu homeostatik mikroglial popülasyonu hedeflemek için kullanılabilir (bkz. adım 5.2) ve CD45 düzeyleri ve sıralama sonuçları ile birlikte analiz edilir. - Tek mikrogliayı (100 μm nozullu) 96 kuyulu polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) plakalarına sıralayın, her kuyuda 4 μL lysis tamponu içeren (ayrıntılar için yayınlanan protokol14'e bakın).
NOT: Harici RNA Kontrol Konsorsiyumu (ERCC) RNA çivili karışım(Malzeme Tablosu)kalite kontrol ve normalizasyon amacıyla lysis tamponuna 1:2.4 x 107 olarak eklenebilir2. - Kısaca plakaları girdap ve bir tezgah üstü santrifüj kullanarak aşağı spin.
- Örnekleri hemen kuru buz üzerinde dondurun. Plakaları kütüphane hazırlığına kadar -80 °C'de saklayın.
NOT: Alternatif olarak, daha fazla hücre toplu RNA-seq için RNA ekstraksiyon tampon ile 1,5 mL tüpler içine toplanabilir. Yazarların deneyimlerine göre, 3.000 hücreleri yayınlanan protokol2,14aşağıdaki kaliteli kütüphaneler oluşturmak için yeterlidir.
7. Tek hücreli RNA-sıralama Kütüphane Hazırlama
NOT: Burada, yayınlanan protokol14 sıvı işleme robotik ve birkaç değişiklik yardımı ile scRNA-seq kütüphaneleri oluşturmak için takip edilir. Bu makalede, yordam yalnızca kısa bir süre açıklanmıştır ve farklar vurgulanır. 4 plakanın aynı anda işlenmesi yaklaşık 2,5 gün sürer.
- Buz üzerinde plakaları eritin ve Oligo-dT30VN astar (lysis tampon) ile ters transkripsiyon gerçekleştirmek termal döngücüler ile cDNA oluşturmak için (Tablo 1): 42 °C 90 dk; 70 °C 5 dk; 4 °C tutun. Daha sonra pcr ana karışımını ve yerinde PCR (ISPCR) astarlarınıkullanarakcDNA'yı başında ek bir ekoneksikle sindirimi adımı(Tablo 2) ve aşağıdaki PCR durumu ile yükseltin: 37 °C 30 dk; 95 °C 3 dk; 98 °C 20 s, 67 °C 15 s, 72 °C 4 dk 23 devir; 72 °C 5 dk.
- CDNA'yı kuyu başına 18 μL manyetik boncuk kullanarak arındırın (0.7:1 oranı). Plakayı manyetik bir standüzerinde 5 dakika boyunca kuluçkaya yatırın ve numuneleri her seferinde %80 etanol, 80°L'lik taze olarak yapılan iki kez yıkayın. Plaka15-20 dk kuruduktan sonra, kuyu başına 20 μL elüsyon tamponu ile cDNA'yı elüsi ile elüt.
NOT: Kalite kontrol için, boyut dağılımlarını ve cDNA konsantrasyonlarını kontrol etmek için bir parça çözümleyici (yüksek duyarlılık yeni nesil [NGS] parça analizi, 1−6.000 bp) kullanın ve sadece 500−5.000 bp arasında ve 0.05 ng/μL'den daha yüksek yayma içeren daha ileri proses örnekleri kullanın. - Kütüphaneoluşturmak için, her cDNA numunesinin 0,4 μL'sini kütüphane hazırlama kitinden(Malzeme Tablosu)1,2 μL Tn5 tagmentation reaktifleriyle 55 °C 10 dk.'lık bir nanolitre borulama makinesi yardımıyla 384 kuyuluk bir plakaya karıştırın.
NOT: Burada, maliyeti azaltmak ve bu arada üretim hacmini artırmak için önerilen reaksiyon hacminin 1/12.5'i (5 μL numune ve 15 μL tagmentasyon reaktifleri) eklenir. Bir nanoliter pipetleme makinesi(Tablo Malzemeler)reaktifleri transfer etmek için kullanılır (bu ve aşağıdaki adımlar) ve 384-iyi plakalar. - 5 dakika boyunca RT'deki etiketleme reaksiyonunu durdurmak için 0,4 μL nötralizasyon tamponu ekleyin.
- 384 indeks(Malzeme Tablosu, 0,4 l ileri ve 0,4 μL ters), 1,2 μL PCR karışımını numunelere ekleyin (her biri 2 μL) ve kütüphaneleri aşağıdaki koşulla yükseltin: 72 °C 3 dk; 95 °C 30 s; 95 °C 10 s, 55 °C 30 s, 72 °C 1 dk 10 devir; 72 °C 5 dk.
- Havuz tüm bireysel kütüphaneler (1 μL her almak) aynı 384-iyi plaka birlikte, ve manyetik boncuklar kullanın(Tablo Malzemeler, 0.7:1 oranı) son havuzlu kütüphaneleri arındırmak için.
- Sıralamadan önce havuzlu kütüphanelerin boyut dağılımlarını incelemek için konsantrasyonları ve bir biyoanalizör(Malzeme Tablosu)ölçmek için bir florometre(Malzeme Tablosu)kullanın. Hücre başına 1 milyon ham okuma da sıralama derinliği hedefleyin.
- Sıralama okumalarını filtrelemek ve süslemek için standart biyoinformatik prosedürleri izleyin ve hizalama2'yigerçekleştirin. Seurat paketi15ile kümeleme analizi yapmak için giriş olarak sayım tablosu nu ve meta verileri kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, bir yetişkin perfüzyon beyin yarımkürede farklı beyin bölgelerinden mikroglia izole etmek ve sıralamak için bir yöntem açıklar, scRNA-seq takip. Biz tek hücreli süspansiyon oluşturmak için douncing kullanın ve aynı zamanda mikroglia zenginleştirmek için ilk adım olarak. Yetersiz veya aşırı douncing verimi azaltır. Buna ek olarak, yetişkin fare beyinleri miyelin yüksek düzeyde içerir, aynı zamanda düzgün kaldırılmazsa sıralama verimliliği ve verimazaltabilir. Bu nedenle, antikor boyama yapmadan önce miyelin çıkarmaverim, hücre canlılığı ve etkinliğini (adım 4.9) tahmin etmek için trippan mavisi ve hemositometre kullanarak mikroskop altında hücre süspansiyonu inceleriz(Şekil 1). Bu noktada toplam hücre sayısı korteks için 30.000'den fazla, diğer dokular için 5.000'den fazla olmalıdır. Hücrelerin %90'Dan fazlası az miyelin enkazıyla birlikte yaşayabilir.
Biz genellikle CD45 düşük ve CD11b pozitif olan mikroglia (veya miyeloid hücreleri), sıralamak için bir FACS makine kullanın. En azından kortikal doku için, başarılı izolasyon tüm canlı tek hücrelerden %80'in üzerinde mikroglia üretmelidir(Şekil 2). Ölen/ölü popülasyon, hazırlığın sadece küçük bir kısmını (%10 civarında) temsil eder.
Bireysel mikroglia lysis tamponuna yakalandıktan sonra, RNA serbest bırakılır ve daha sonra cDNA'ya aktarılır ve daha sonra 23 döngü boyunca yükseltilir. Kitaplıklar oluşturmadan önce bu cDNA örneklerinin kalitesini kontrol etmek önemlidir. Kapiller elektroforez platformu olarak, parça analizörü ve yüksek duyarlı NGS parça kitleri (1−6.000 bp) boyut dağılımı ve 96 kuyulu bir plakanın her kuyusunda bulunan cDNA molekülleri hakkında hızlı ve doğru bilgi sağlar(Şekil 3A). Kitaplıklar yapmak için smear (500−5.000 bp) ve belirli konsantrasyon eşiğinin (örn. 0.05 ng/μL) üzerinde olan örnekler kullanılabilir. Benzer şekilde, havuzlu kitaplıklar sıralamadan önce bir biyoanalizör üzerinde test edilmelidir (Şekil 3B).
Örnekleri hücre başına 1 milyondan fazla ham okuma derinliğine dizileriz, bu scRNA-seq metodolojisinin algılama gücünü doygunlaştırır16. Yaklaşık %60 haritalama oranı ile mikroglial hücre başına 2.000'den fazla gen tespit edilebilir. Bu izolasyon yöntemi17kullanılarak oluşturulan yayınlanmış veriler elde ettik ve sıralı popülasyonda mikroglia'ya özgü genleri tespit etmek için bağımsız deneylerden ve duyarlılıktan tekrarlanabilirliğini gösterdik(Şekil 4).
Şekil 1: Mikroglia izolasyon veriminin tahmini, hücre canlılığı ve miyelin giderme verimliliği. Sol panel, miyelin kaldırma sütunlarından geçtikten sonra trippan mavisi lekeli hücrelerin (korteksten) parlak alan görüntüsünü (4x büyütme) gösterdi. Diğer bölgelerin sonuçları benzer görünür, ancak daha az hücre ile. Hücrelerin büyük çoğunluğu (hepsi değilse) süreçlerin kaybı nedeniyle parlak (lekesiz) ve yuvarlak göründü. Doğru görüntü, kutulu alanın yakınlaştırması (20x) ve küçük miyelin enkazı mevcuttu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mikroglianın ayıklanmasında kullanılan kapılar. Veriler, mikroglianın korteksten ayıklanması için gating stratejisini gösterdi ve aynı strateji diğer bölgeler için de kullanıldı. Hücre enkazı ilk olarak dağılım çiziminden dışlandı ve tek hücreler ileri dağılım alanı (FSC-A)/ileri dağılım genişliği (FSC-W) tarafından geçitlendi. Canlı hücreler, tüm tek hücrelerin yaklaşık %90'ından gelen PI negatif boyama ile kaplandı. Canlı hücrelerin kabaca %80'ini temsil eden Microglia, CD45 düşük CD11b+ kapısından sıralandı. Toplam ~ 30.000 mikroglia izole edilebilir ve korteks dokusundan sıralanır (3 aylık bir farenin bir yarımküresinden). Bir FACS makinesinde dizin sıralama işlemi gerçekleştirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Tek bir mikroglial hücreden ve nihai bir havuzlu kütüphaneden güçlendirilmiş cDNA için temsili kalite kontrol sonuçları. (A) Bir parça çözümleyicisi kullanılarak, tüm parçalar X ekseninde boyutları ve Y ekseninde göreceli floresan yoğunluğu ile çizilir, belirli bir boyutlu cDNA bolluğunu ifade eder. LM (alt marker, 1 bp) ve UM (üst marker, 6,000 bp) cDNA miktarını ölçmek için kullanılan bilinen konsantrasyonlarda belirteçleri yükleniyor. Temsili bir mikroglial hücreden başarıyla güçlendirilmiş cDNA, boyut dağılım grafiğinde bir eğri (yeşil noktalı çizgi) veya jel grafiğinde 500 bp ile 5.000 bp arasında bir yayma (etiketli braket) oluşturur. Diğer etiketli zirveler ERCC spike-in molekülleri veya ribozomal RNA amplifiye edildi. 500 bp ile 5,000 bp arasındaki cDNA konsantrasyonu ölçülebilir ve konsantrasyonları 0,05 ng/μL'den yüksek olan ve bu tür tipik eğrileri gösteren numuneler kütüphane hazırlığı için muhafaza edilir. RFU, bağıl floresan ünitesi. (B) Son bir havuzlu kütüphanenin (yaklaşık 380 hücreli) boyut dağılımını gösteren bir biyoanalizörde temsili kalite kontrol sonucu. Tipik olarak, 400−600 bp ortalama boyutu ile 200 bp ile 2.000 bp arasında değişmektedir. İki keskin tepe işaretleri yüklüyorlardı. FU, floresan ünitesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Iki erkek farenin 4 beyin bölgesinden izole edilen mikroglianın scRNA-seq analizi. (A) bölgesel mikroglia nın içsel deseni gösteren tSNE çizimi (sadece fare #1 hücreler vurgulanmıştır). TSNE çiziminde (muhtemelen toplu iş efektleri nedeniyle) yoğunlaşmış alanlara ince kaymanın ötesinde bölge kökenlerine göre farklı kümeler oluşturmaz. Bu gözlem, yetişkin farelerde küresel gen ekspresyonuna dayalı mikroglianın sınırlı bölgesel heterojenitesiyle tutarlıdır (bu konu hakkında daha fazla tartışma için yeni bir yayın2'ye bakınız). (B) bağımsız olarak işlenen iki ayrı fareden gelen mikroglia nın üst üste binme deseni gösteren tSNE çizimi. Küçük toplu iş efektleri (çizimin belirli alanlarında yoğunlaşan hücreler) mevcut olsa da, bu hücreler hayvansal kökenlere göre farklı kümeler oluşturmaz. Bu sonuç, denemeler arasındaki verileri karşılaştırmak için protokolün tekrarlanabilirliğini göstermektedir. (C) ScRNA-seq tarafından saptanan mikroglia imza genlerinin tmem119 ve P2ry12gibi belirli belirteçler için %95'in üzerinde algılama oranı ve Sall1 ve Pu.1gibi bilinen transkripsiyon faktörleri için %80'in üzerinde algılama oranı nın ekspresyonu. Veriler yayınlanmış literatür17'denyeniden analiz edilmiştir. (D) İzole mikroglia büyük çoğunluğu tubb3 (nöronlar), Aldh1l1 (astrositler), Gjb1 (oligodendrocytes) ve Tie1 (endotel hücreleri) gibi diğer hücre tipleri, özgü genlerin ekspresyonu eksikliği. (E) Genlerin mikroglial aktivasyon veya stresle ilgili ifadesi. Klasik belirteçler, Tnf, Il1b, Nos2, ve Nfkb2, hangi düşük ifade edilir, üst gösterilir. Erken yanıt genleri, Egr1 ve Fos, alt kısmında gösterilir (tartışmaya bakın). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Reaktif | Hacim (3L) |
| Hücre lisisi | 4 |
| Ters transkriptaz (100 U/μL) | 0.95 |
| Rnase inhibitörü | 0.25 |
| 5x İlk iplikçik arabelleği | 2 |
| Dithiothreitol (DTT; 100 mM) | 0.5 |
| Betain (5 M) | 2 |
| MgCl2 (1 M) | 0.06 |
| Şablon anahtarı oligo (TSO; 100 μM) | 0.1 |
| H2O | 0.14 |
| Toplam | 10 |
Tablo 1: Ters transkripsiyon durumu. Bir ters transkripsiyon reaksiyonu için reaktif hacimleri sağlanır.
| Reaktif | Hacim (3L) |
| Ters transkripsiyon ürünü | 10 |
| 2x PCR ana karışım | 12.5 |
| ISPCR astar (10 μM) | 0.25 |
| Lambda exonuclease | 0.1125 |
| H2O | 2.1375 |
| Toplam | 25 |
Tablo 2: PCR amplifikasyon durumu. Tek bir hücreden cDNA'nın bir PCR amplifikasyonu için reaktif hacimleri sağlanır.
| Plaka tabanlı (bu protokol) | Damlacık bazlı (10x Genomik) | |
| Duyarlılık | Daha fazla gen tespit edildi | Daha az gen tespit edildi |
| Tam uzunlukta | Evet | Hayır (5' veya 3' sonu) |
| Hücre sayıları/popülasyonları için esneklik | Küçük veya nadir alt popülasyonların karakterizasyonu için uygundur | Büyük hücre popülasyonlarının geniş kategorize si için uygundur |
| Verim | Binlerce hücreye kadar | Yüz ila on binlerce hücre |
| Benzersiz moleküler tanımlayıcı | № | Evet |
| Hücre başına maliyet | $1−$5 | 1 $'dan az |
| Deneysel zorluk | Daha fazla adım ve genellikle sıvı işleme robotik gerektirir | Ticarileştirilmiş makinelerle gerçekleştirmek için basit |
| Hücre popülasyonları | FACS sıralama tarafından hedeflenen | Tarafsız |
Tablo 3: Plaka esaslı ve damlacık esaslı scRNA-seq metotları arasında karşılaştırma. Bu makalede, giriş olarak az sayıda hücre için daha yüksek hassasiyet, tam uzunlukta sıralama ve esneklik avantajlarına sahip olan plaka tabanlı tam uzunlukta scRNA-seq prosedürü sağlanmaktadır. Damlacık tabanlı yöntemler, daha yüksek iş elde etme, daha düşük maliyet, kolay performans ve benzersiz moleküler tanımlayıcılarda veri avantajları sunar. Deneylerin amacına bağlı olarak tamamlayıcıdırlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroglia aktif CNS diğer hücre tipleri ile etkileşim, ve çevresel uyaranlara çok duyarlıdır. İzolasyon işlemi sırasında gen ekspresyonundaki inflamatuar yanıtları ve anormal değişiklikleri en aza indirmek için, bu protokol daha önce yayınlanmış bir yöntem9'dandüzene sokulmuştur ve artık mikroglia'yı tek bir fare beyninin birçok bölgesinden paralel olarak izole etmek uygundur. Dokular ve reaktifler soğuk sıcaklıkta tutulur ve sınırlı doku boyutlarına göre daha az yıkama ve daha az reaktif ile zamanında (diseksiyondan sıralamaya yaklaşık 3,5 saat) deneyler yapılır. Mekanik dissosyasyon öldürmek ve böylece mikroglia9çok az hasar veya aktivasyon neden olurken nöronlar ve diğer glial hücreleri kaldırmak çünkü biz, enzimatik sindirim gibi diğer homojenizasyon yöntemleri üzerinde douncing seçin ,18. Aşırı douncing, ancak, mikroglia verimini azaltabilir ve kaçınılmalıdır. Daha önce mekanik ayrışma ve boncuk bazlı miyelin kaldırma FACS sıralama takip, klasik inflamatuar genlerin minimal ifade dayalı mikroglia daha az aktivasyon tanıtmak, örneğin, Tnf, Il1b, Nos2, ve Nfkb29 (Şekil 4E)gösterilmiştir. Bununla birlikte, mikroglia hala ayrışma sırasında ex vivo koşullara yanıt verebilir ve Fos ve Egr1 gibi erken yanıt genleri yükselterek sıralama(Şekil 4E), normalde in vivo 2 microglia tarafından ifade edilmez ,19, ve transkripsiyon çalışmalardan bu tür değişiklikler her zaman histoloji bölümlerinde doğrulanmalıdır.
Burada korteks, beyincik, hipokampus ve striatum yetişkin bir fare beyin yarımküreden mikroglia izole etmek için prosedürler sağlamak, ve bu protokol kolayca diğer bölgelere veya aşamalarına adapte edilebilir. Bu durum için yararlıdır, örneğin, hastalıktan etkilenen mikroglia dışarı kesilebilir beynin belirli alanları ile sınırlı olduğunda, ya da yaşlanma çalışmalarda, burada havuz örnekleri önemli bireysel varyasyonları nedeniyle uygunsuz olduğu. Mikroglial karşı antikorların durumu ile (veya pan doğuştan bağışıklık) epitoplar, Bu protokol de sıçan veya insan dokularında mikroglia izole için adapte edilebilir9. Daha büyük veya daha büyük dokular için ayarlama yaparken, miyelin kaldırma boncuklarının hacmini ve kullanılan sütun ların türünü göz önünde bulundurmak ve test etmek önemlidir. Miyelin giderme için alternatif bir yaklaşım ticari düşük viskozite medya20yoğunluk gradyan santrifüj gereğidir. Genel olarak bu iki yöntem kendi verimliliği karşılaştırılabilir, yoğunluk gradyan santrifüj yöntemi biraz daha yüksek verim sağlayabilir rağmen, ve diğer taraftan, manyetik boncuk yöntemi endotoksinler tanıtmak için daha az olasıdır, hangi mikroglia etkinleştirebilir21,22.
Toplam beyin hücreleri arasında mikroglia küçük bir yüzdesi nedeniyle, genellikle tek hücreli transkripsiyonçalışmaları yapmadan önce mikroglia zenginleştirmek veya arındırmak için gereklidir. Düşük temsil edilen hücre türlerini yakalamak ve CD11b ve CD45 yüzey ifadesine dayalı mikroglia seçmek için HASSAS bir yaklaşım olarak FACS'ı kullanıyoruz. Bir yarımküreden, rutin olarak korteks için ~30.000 mikroglia ve beyincik, hipokampus veya striatum için ~5.000 mikroglia elde ediyoruz. Bu verimler çoğu tek hücreli uygulamaların yanı sıra toplu RNA-seq (3.000 veya daha fazla hücre kullanılabilir) için yeterlidir. Bu mikroglia geliştirme veya hastalık sırasında CD45 immünreaktivite upregulate olabilir belirtmeye değer2, CD45 hem düşük hem de yüksek düzeyde olan bu durumda hücreleri kaydedilmeli ve indeks analiz için sıralanır. Mikroglia zenginleştirmek için başka bir seçenek cd11b boncuk aracılı manyetik aktif hücre sıralama miyelin çıkarılması ndan sonra kullanmaktır, ancak bu damlacık yöntemleri scRNA-seq sınırlayacak.
Mikroglial gen ekspresyonunu tek hücreli çözünürlükte incelemek için, hücreleri genellikle numune başına en az 2−3 96-kuyu plakalarına ayırıyoruz ve sıvı işleme makineleriyle kütüphane hazırlığı yapıyoruz. Bu plaka tabanlı tam uzunlukta kütüphane hazırlama yaklaşımı algılama sınırı en hassas scRNA-seq yöntemlerinden biri olduğu gösterilmiştir, transkripsiyon faktörleri gibi nadir transkript doğru nicel izin13,14,16. Tam uzunlukta sıralama nedeniyle, bu yaklaşım 5' veya 3' önyargısına tabi değildir ve birleştirme çeşitlerini analiz etmek için kullanılabilir(Tablo 3). Buna ek olarak, genellikle bir reaksiyon içinde yüzlerce veya binlerce hücre gerektiren damlacık tabanlı yöntemlerin aksine, bu plaka tabanlı protokol her deneyde az sayıda hücre ekleme esnekliğine sahiptir ve daha sonra tasarıma daha fazla plaka ekleyerek popülasyon boyutunu kademeli olarak genişletir. Bu, embriyonik gelişim gibi belirli koşullarda küçük mikroglia alt kümelerini incelerken avantajlıdır.
Bu protokol tekrartekrar beyin bölgesel microglia için yüksek kaliteli scRNA-seq kütüphaneler üretir iken, genellikle sadece nispeten yüksek maliyet nedeniyle küçük ölçekli çalışmalar için uygundur (kütüphane hazırlama için yaklaşık $ 5/hücre, hala daha ucuz $23/hücre kapalı raf SmartSeq v4 kiti kullanıyorsanız). Çeşitli stratejiler maliyeti azaltmaya ve iş maliyetini artırmaya yardımcı olabilir. İlk olarak, hücreler 0,5 μL'lik lysis tamponu kadar az olan 384 kuyulu plakalara sıralanabilir ve bu sadece ilk ters transkripsiyon ve PCR amplifikasyon adımları için 1/8 hacimli reaktif gerektirir. İkinci olarak, ticari olarak mevcut bir kit23biri gibi benzer kaliteye sahip şirket içi Tn5 transposase üretmek mümkündür. Bu iki değişiklik, kitaplık hazırlama maliyetini $1/cell'e düşürebilir. Üçüncü olarak, özelleştirilmiş dizinler kullanılarak, binlerce hücre sıralama derinliğinden ödün vermeden bir sistemde sıralama için bir araya getirilebilir (>1 milyon okuma/hücre)17. Otomatik sıvı işleme robotlarının dahil edilmesiyle birlikte bu iyileştirmeler, hemen hemen her tanımlanmış bölgeden izole edilmiş mikroglianın yüksek iş yapma derinliğinde scRNA-seq'sini sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Mariko L. Bennett, Liana Nicole Bonanno ve Spyros Darmanis'e bu protokolün geliştirilmesi sırasında ki yardımları için teşekkür ederiz. Ayrıca Stanford Paylaşılan FACS Tesisi, özellikle Meredith Weglarz ve Lisa Nichols teşekkür ederiz; Yen Tran, Michael Eckart Stanford Protein ve Nükleik Asit Tesisi (PAN) filme için büyük destek için. Bu çalışma JPB Vakfı ve Vincent J. Coates Vakfı tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 M Betaine | Sigma-Aldrich | Cat# B0300-5VL | |
| 10 mM dNTP mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# R0192 | |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15575020 | |
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14185-052 | |
| 1 M HEPES | Thermo Fisher Scientific | Cat# 15630080 | |
| 1X KAPA HIFI Hotstart Master Mix | Kapa Biosciences | Cat# KK2602 | |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tube, with Cell Strainer Cap | Corning | Cat# 352235 | |
| AATI, High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit (1 bp – 6,000 bp) | Advanced Analytical | Cat# DNF-474-1000 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | Cat# A8806 | |
| DNase I | Worthington | Cat# LS002007 | Working solution: 12500 units/ml |
| DTT, Molecular Grade | Promega | Cat# P1171 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Thermo Fisher Scientific | Cat# 4456740 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | Cat# 10437-028 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set A (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2001 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set B (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2002 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set C (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2003 | |
| Illumina XT Index Kit v2 Set D (96 indexes) | Illumina | Cat# FC-131-2004 | |
| Lambda Exonuclease (5 U/μl) | New England BioLabs | Cat# M0262S | |
| Mouse Fc block | BD Pharmingen | Cat# 553142 | |
| Myelin removal beads | Miltenyl Biotec | Cat# 130-096-433 | |
| Nextera XT DNA Sample Prep Kit | Illumina | Cat# FC-131-1096 | |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (150 Cycles) | Illumina | Cat# 20024907 | |
| PBS (10X), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 70011044 | |
| PCRClean DX beads | Aline Biosciences | Cat# C-1003-50 | |
| Propidium Iodide | Thermo Fisher Scientific | Cat# P3566 | Staining: 1:1000 |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermal Fisher Scientific | Cat# Q32851 | |
| Rat monoclonal anti mouse/human CD11b, Brilliant Violet 421 (clone M1/70) | BioLegend | Cat# 101236; RRID: AB_11203704 | Staining: 1:300 |
| Rat monoclonal anti mouse CD45, PE/Cy7 (clone 30-F11) | Thermo Fisher Scientific | Cat# 25-0451-82; RRID: AB_469625 | Staining: 1:300 |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara Bio | Cat# 2313B | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase (100 U/μl) | Clontech | Cat# 639538 | Containing 5x First strand buffer |
| Oligonucleotides | |||
| 0.1 μM ISPCR Oligo: 5' - AAGCAGTGGTATCAA CGCAGAGT-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Oligo-dT30VN primer: 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCA GAGTACT 30 VN-3' |
(Picelli et al., 2014) | ||
| TSO 5' - AAGCAGTGGTATCAACGCAGA GTACATrGrG+G-3' ("r" is forribobases and "+" is for an LNA base) |
(Picelli et al., 2014) | ||
| Solutions | |||
| FACS buffer | Recipe: sterile-filtered 1% FBS, 2 mM EDTA, 25 mM HEPES in 1X PBS | ||
| MCS buffer | Recipe: sterile-filtered 0.5% BSA, 2 mM EDTA in 1X PBS | ||
| Medium A | Recipe: 15 mM HEPES, 0.5% glucose in 1X HBSS without phenol red | ||
| Plates | |||
| 384-well Rigi-Plate PCR Microplates, Axygen Scientific | VWR | 89005-556 | |
| Hard-shell 96-well PCR plates | Bio-Rad | HSP9631 | |
| Others | |||
| Dumont #55 forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Dounce homogenizer, 2 ml | Wheaton | 357422 | |
| Large depletion column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Large selection column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| RNAzap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Strainer (70 μm) | Falcon | 352350 | |
| Equipment | |||
| BD FACSAria II | BD Biosciences | http://www.bdbiosciences.com/ | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| Fragment Analyzer | Agilent | 5300 | |
| Mosquito HTS nanoliter pipetting robot | TTP Labtech | https://www.ttplabtech.com/ | |
| Qubit 4 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 |
References
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Li, Q., et al. Developmental Heterogeneity of Microglia and Brain Myeloid Cells Revealed by Deep Single-Cell RNA Sequencing. Neuron. 101 (2), 207-223 (2019).
- Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Guerreiro, R., et al. TREM2 variants in Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 117-127 (2013).
- Jonsson, T., et al. Variant of TREM2 associated with the risk of Alzheimer's disease. New England Journal of Medicine. 368 (2), 107-116 (2013).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 34 (36), 11929-11947 (2014).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Hammond, T. R., et al. Single-Cell RNA Sequencing of Microglia throughout the Mouse Lifespan and in the Injured Brain Reveals Complex Cell-State Changes. Immunity. 50 (1), 253-271 (2019).
- Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
- Chen, G., Ning, B., Shi, T. Single-Cell RNA-Seq Technologies and Related Computational Data Analysis. Frontiers in Genetics. 10, 317 (2019).
- Svensson, V., et al. Power analysis of single-cell RNA-sequencing experiments. Nature Methods. 14 (4), 381-387 (2017).
- Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature Protocols. 9 (1), 171-181 (2014).
- Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Ziegenhain, C., et al. Comparative Analysis of Single-Cell RNA Sequencing Methods. Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).
- Tabula Muris, C., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris. Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2018).
- Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
- Collins, H. Y., Bohlen, C. J. Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium. Journal of Visualized Experiments. (133), e57122 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Swartzlander, D. B., et al. Concurrent cell type-specific isolation and profiling of mouse brains in inflammation and Alzheimer's disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (13), 121109 (2018).
- Hennig, B. P., et al. Large-Scale Low-Cost NGS Library Preparation Using a Robust Tn5 Purification and Tagmentation Protocol. G3. 8 (1), Bethesda. 79-89 (2018).
