Summary
שחזור הוושט הוא הליך מאתגר, ופיתוח של הוושט רקמה מהונדסים המאפשרת התחדשות של רירית הוושט ואת השריר, כי ניתן להשתיל כמו שתל מלאכותי הוא הכרחי. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקול שלנו כדי ליצור ושט מלאכותי, כולל ייצור פיגום, טיפוח ביוריאקטור, וטכניקות ניתוח שונות.
Abstract
השימוש בחומרים ביולוגיים לשיקום הוושט הוא משימה מאתגרת מבחינה טכנית בחולדות ודורשת טכניקת שתל אופטימלית עם תמיכה תזונתית. לאחרונה, היו ניסיונות רבים הנדסת רקמת הוושט, אבל שיעור ההצלחה הוגבלה בשל קושי הרקמות המוקדמות בסביבה מיוחדת של פריסטלזיס. כאן, פיתחנו ושט מלאכותי שיכול לשפר את התחדשות רירית הוושט ואת שכבות השריר דרך פיגום שני שכבתית, תא גזע mesenchymal מבוססי מערכת, וטכניקת האכלה מעקף עם שינוי . הכול בסדר הפיגום עשוי פוליאוריתן (PU) ננו סיבים בצורת גליל עם תלת מימדי (3D) מודפס גדיל polycalacטונוס עטוף סביב הקיר החיצוני. לפני ההשתלה, בתאי גזע של mesenchymal, שנגזרו על ידי בני אדם הפכו לתוך לומן הפיגום, והטיפוח הביולוגי בוצע כדי לשפר את הפעילות החוזרת התאית. שיפרנו את שיעור ההישרדות של השתל על ידי החלת השקה כירורגי וכיסוי תותבת מושתל עם דש בלוטת התריס, ואחריו האכלה זמנית שאינם אוראלי הזנה. שתלים אלה הצליחו ללכוד את הממצאים של האפיתל הראשונית התחדשות שרירים סביב האתרים מושתל, כפי שניתן להדגים על ידי ניתוח היסטולוגית. בנוסף, הגדילו את סיבי האלסטין ו ניאוואסקולריזציה נצפו בפריפריה של השתל. לכן, מודל זה מציג טכניקה חדשה פוטנציאלית לשיקום הוושט.
Introduction
הטיפול בהפרעות הוושט, כגון מומים מולדים וקרצינומות הוושט, יכול להוביל לאובדן קטע מבניים של הוושט. ברוב המקרים, שתלי החלפת אוטוולוגי, כגון תעלות משיכה בקיבה או המעי הגס, בוצעו1,2. עם זאת, אלה מחליפים הוושט יש מגוון של סיבוכים כירורגיים הפעלה מחדש סיכונים3. כך, השימוש ברקמות מהונדסים הוושט פיגומים קפלי מחקה את הוושט יליד יכול להיות אסטרטגיה חלופית מבטיח בסופו של דבר מתחדשות רקמות איבד4,5,6.
למרות הוושט מהונדסים רקמות פוטנציאלי מציע חלופה לטיפולים הנוכחיים של פגמים הוושט, יש מחסומים משמעותיים עבור שלה ביישום vivo. פוסט anastomotic דליפה ונמק של הגרדום הוושט מושתל בהכרח להוביל זיהום קטלני של מרחב אספטי שמסביב, כגון קרומי7. לכן, חשוב מאוד למנוע זיהום של מזון או רוק בפצע ושפופרת הקיבה. יש לשקול את הטיפול בחלזונות או בעירוי עד להשלמת ריפוי הפצע הראשוני. עד כה, הנדסת רקמת הוושט בוצעה במודלים בעלי חיים גדולים, כי בעלי חיים גדולים ניתן להאכיל רק על ידי ורידי hyperalimentation עבור 2-4 שבועות לאחר השרטת של הגרדום8. עם זאת, מודל כזה האכלה ללא אוראלי לא הוקמה להישרדות מוקדמת לאחר השתלת הוושט בבעלי חיים קטנים. זה בגלל החיות היו פעילים מאוד בלתי נשלט, כך הם לא יכלו לשמור את צינור האכלה בבטן שלהם למשך זמן ממושך. מסיבה זו, היו מקרים מעטים של השתלת הוושט מוצלחת בבעלי חיים קטנים.
לאור הנסיבות של הנדסת רקמת הוושט, עיצבנו בשני שכבות פיגום צינורי המורכב של אלקטרוסיבי ננו (השכבה הפנימית; איור 1א) ו-גדיל מודפס תלת-ממדי (שכבה חיצונית; איור 1ב) כולל טכניקת הגמניפולציה שהשתנתה. הננו סיבים פנימיים עשוי פו, פולימר לא תכלה, ומונע דליפת המזון והרוק. הגדילים החיצוניים תלת-ממדיים עשויים מסיבי פוליקטטון מתכלה (PCL), אשר יכולים לספק גמישות מכנית ולהסתגל לתנועה הפריסטלטית. בתאי גזע האדם הנגזרים משומן האנושי (היה-MSCs) הופרה על השכבה הפנימית של הפיגום כדי לקדם את האפיתל החדש. מבנה nanofiber יכול להקל על התחדשות המקורי רירית ידי מתן מטריצה מבניים (ecm) הסביבה להעברת תאים.
כמו כן הגבירו את שיעור ההישרדות ואת הפעילות הביואקטיביות של התאים שחוסנו באמצעות טיפוח ביוריאקטור שחקן. הגרדום המושתל היה מכוסה בכנף בלוטת התריס כדי לאפשר התחדשות יציבה יותר של רירית הוושט ושכבת השריר. בדוח זה, אנו מתארים פרוטוקולים עבור טכניקות הנדסת רקמת הוושט, כולל ייצור הפיגום, mesenchymal גזע תא מבוסס וטיפוח ביוריאקטור, טכניקת האכלה מעקף עם הגסטרו שונה, ו כירורגי שונה טכניקת ההשקה לשיקום שחזור הוושט במודל חולדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC No. 17-0164-S1A0) של האוניברסיטה הלאומית של סיאול בית החולים.
1. ייצור פיגום
הערה: שני פיגומים על הוושט מיוצרים על ידי שילוב אלקטרורוטווד והדפסת תלת מימד. הקרום הפנימי של הפיגום הכרישים היה מפוברק על ידי אלקטרוטווייה פוליאוריטן (פו) עם מסתובב מפלדת אל-חלד כמו האספנים9.
- להכנת הננו סיבים הכרישים הצינורי, להכין 20% (w/v) פתרון של הפוליאורטן פולימר על ידי ערבוב ב N, N-diמתילטופסממיד (DMF) עבור 8 h בטמפרטורת החדר.
- מניחים את התמיסה פוליאורטן על המזרק עם מחט מתכת קהה (22 גרם), ו אלקטרוספין על סיבוב מנגו פלדת אל-חלד (קוטר = 2 מ"מ) במרחק של 30 ס מ בין קצה המחט והאספן המסתובב.
הערה: ספק הכוח מוגדר כזרם ישיר במתח גבוה של 15 kV פוטנציאל. שיעור ההזנה של הפתרון הוא קבוע ב 0.5 mL/h באמצעות משאבת מזרק. - הפוך את שכבת ננו-סיב צינורי על פני השטח של המנל מסתובבת ב-3.14 m.
- יבש את ה-ננוסיב הפוליאורטן בתנור ואקום ב-40 ° c למשך הלילה כדי להסיר לחלוטין את הממס השיורי.
הערה: הקיר החיצוני המודפס בתלת-ממד של פיגום הוושט מוכן באמצעות מערכת אבי טיפוס מהירה. ציוד ההדפסה התלת-ממדי כולל מנפק, זרבובית, בקרי דחיסה/חום, שלב המרה של 3 צירים ומערכת תוכנה. - כדורי PCL מומסים ב-100 ° c בצילינדר חימום ולאחר מכן מודפסים על פני השטח של הננו-סיבים בלחץ גבוה (7 bar) תחת שליטתה של מערכת ביוביויובית. גודל החרירים הוא 300 יקרומטר ומרחק הגדיל הוא 700 יקרומטר.
- לאחר הסרת הפיגום שתי שכבות מן mandrel, לעקר על ידי הטבילה ב 70% אתנול תחת אור אולטרה סגול.
הערה: מאפיינים מפורטים יותר של הפיגום דווחו במחקרים קודמים10.
2. שזריעת תאים על השתלים וטיפוח ביוריאקטור
הערה: בתאי גזע האדם הנגזרים מהאדיפוז (hMSCs) שנרכשו מחברה שימשו ללא שינוי.
- לפני השתלת תאים, לחטא את הוושט המודפס 3D לגרדום 1 h תחת אור אולטרה סגול, רטוב זה עבור 10 דקות עם אתנול, ולשטוף אותו 3d עם מלוחים מאגור פוספט (PBS).
- תרבות ולהרחיב את hMSCs בינונית צמיחה (בסיס בינוני/גדילה תוסף). שתי שכבות של פיגומים עם כיריים הועברו ללוחות לוחיות התרבות של הרקמות.
- כדי לחבר את התאים למשטח הפנימי של הפיגום, הוסף בעדינות את ההשעיה של hMSC בצפיפות של 1 x 106 תאים/mL במטריצת מרתף ממברנה המכילה את מדיום הגידול.
- הפקדה אחידה הבולם המרתף ממברנה ההשעיה על פני השטח הפנימי של הגרדום שני שכבתית.
- מתקן בחוזקה את הפיגום הצינורי של hMSC עד למחזיק האקריליק בחדר התרבות של הביוריאקטור באמצעות מערכת זרימה ביוריאקטור.
הערה: מערכת ביוריאקטור חקן מעוצב בהתאמה אישית כוללת משאבה, מלכודת בועה, תא זרימה, מד לחץ, שסתום לשליטה, ומאגר בינוני. בעת החלת לחץ הטיה בחדר התרבות, לאפשר זמן מנוחה של 1-2 מינימום11. - להוסיף מדיום צמיחה לחדר התרבות ולהחיל 0.1 דיין/cm2 זרימה הנגרמת הלחץ הטיה תחת אווירה מחולל לחות המכיל 5% CO210.
הערה: הערך של מתח הטיה מושרה בזרימה מחושב על ידי הדמיית הפריסטלזיס של רקמת הוושט הנגזרת מהגוף האנושי ממחקרים קודמים10. - לקבוע את התגובות התאים על המשטחים הפנימיים של שכבות הפיגומים הכרישים בעלי שני השכבות מבלי לטפח ולאחר 5 ימים באמצעות ערכת שיטת הכדאיות החי/מת בהתאם להוראות היצרן. השיגו תמונות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בעזרת הכלי מחסנית Z.
- ביום השלישי, שימו לב למבנה פני השטח של הפיגום הצינורי הנזרע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני סריקה (SEM).
- תקן את הפיגום שהיה מודל עם hMSC עם 2.5% גלוטארלדהיד ו OsO4 עבור 24 שעות ומייבשים עם אתנול.
- מעיל hMSCs קבוע עם פלטינה באמצעות coater אטר התאים בתנאים אטמוספרי ארגון ולהשיג תמונות SEM במתח מואץ של 25 kV.
3. הכנה כירורגית לניתוחי בעלי חיים
הערה: תרופות כירורגיות מוחלות לפני השתלת הגסטרו והוושט.
- הגדר את כלי הניתוח סטרילי: להב האזמל, מפסק Weitlaner, microneedle, מלקחיים מיקרותפרים, מלקחיים מיקרורקמות, מיקרו מספריים, מחזיק המחט מאיו-Hegar, מספריים הפעלה, איריס מספריים, מלקחיים ההלבשה, מלקחיים רקמות, מלקחיים קיסם, מלקחיים איריס, 5 מ ל מזרק (21 גרם מחט), 10 מ"ל מזרק (22 גרם מחט), 9-0 תפר פוליאמיד, 4-0 polyglactin תפר.
- לסמם את בעל החיים עם זריקה שרירית של tiletamine/זאזפם (50 mg/g מינון) ו 2% xylazine הידרוכלוריד (2 מ"ג/ק"ג מינון).
הערה: למבוגרים ספראג-דאולי (SD) חולדות במשקל 398-420 g שימשו השתלת הוושט. - לפני המעבר אל העטוף כירורגי, לבדוק את המצב הרדמה המתאים של החיה על ידי צובט את הזנב עם מלקחיים.
- מניחים את החיה בתנוחה פרקדן על העטוף הסטרילי ולהשתמש בקוצץ כדי להסיר את השיער מהצוואר (עבור השתלת הוושט) או בטן (עבור החלזונות). ואז לקרצף את האתר הכירורגי. עם בטאדין ו70% אתנול
- לפני החיתוך, תת-עורי להזריק כאבים כגון בופרנורפין (0.05-0.1 מ"ג/ק"ג) עבור הקלה בכאב.
4. כירורגיה של חלזונות באמצעות T-tube בחולדות
הערה: בעלי החיים הניסיוניים בוצעו בכל החיות הנסיוניות כדי לאפשר הזנה זמנית של צינור מעקפים (n = 5).
- יש חולדות מהר יום לפני הניתוח. . הכן ניתוח בסעיף 3
- לחשוף את הבטן דרך חתך באמצע קו של העור ואת שרירי הבטן של החולדות מורדם.
- צור מפתח 3 מ"מ בקיר הקיבה הקדמי עם להב אזמל.
- הכנס את קצה T-tube הסיליקון לתוך האתר פגם כדי לתקן את זה לקיר הקיבה.
- תפר כראוי כך T-tube אינו ניתוק מהקיר הקיבה.
- הוצא את הקצה המרוחק של הצינור המושתל דרך המנהרה התת עורית אל גב הצוואר.
- הכנס את כובע הפארין לקצה ה-T כדי למנוע מתכולת הקיבה לזרום אחורנית.
הערה: השתמש ב-אנגיוקטטר כדי לחבר את הקצה של T-tube עם כובע הפארין. - תפר את כל השכבות של קיר הבטן והעור באמצעות 4-0 polyglactin תפרים.
- לשמור את כל העכברושים הניסיוניים נפרדים בכלוב מטבולית לאחר השלמת החלזונות.
5. השתלת הוושט
הערה: השתלת הוושט של הפיגום בעל שתי שכבות מבוצעת כשבוע לאחר הגמעי (n = 5). לפני ההשתלה, חסן (צפיפות תא: 1 x 106 תאים/mL בתוך מטריצה ממברנה מרתף) לתוך הקיר הפנימי של כל פיגום ו דגירה עבור 3 ימים במערכת ביוריאקטור שחקן. ההליך הכירורגי הוא כדלקמן.
- הסר את שיער הצוואר של חיות המודל ולבצע כורכת רגיל של האתר כירורגי לניתוח אספטי.
הערה: ליצור שטח גילוח גדול מומלץ לשמור על ניתוח מעקפים על החיה. - לאחר החתך החציוני הקדמי של הצוואר, הפרד את שרירי הרצועה וחשוף את מבנה הוושט.
- במיומנות לנתח את העצב תועה מן הוושט לפני מחדש את הקטע, אחרת הנשימה של החיה הוא נפרץ.
- תחת הגדלה, לבודד את הצד השמאלי של הוושט מקנה הנשימה ולהפריד בזהירות את החלק העליון של בלוטת התריס.
- צור 5 מילימטר מלוא מלא פגם המכיל את כל השכבות של הוושט באמצעות מספריים כירורגי.
הערה: לפני השתלת הוושט, חותכים את הפיגומים המוכנים בעזרת מספריים כירורגיים כדי להתאים לאורך אתר ההשתלה. - תחת מיקרוסקופ, לבצע השקה מיקרולשני הקצוות של פגם הוושט המרוחק באמצעות חוט תפר 9-0. מניחים את התפר הראשון בין השוליים inferoposterior הנכון של הוושט העליון השריד. המשך לעבור מימין לשמאל בין שארית הוושט העליון לבין הפיגום. Anastomose הפיגום באותו אופן כמו השוליים העליונים של הוושט התחתון.
הערה: בצע השקה מיקרוכלי דם כפי שנעשה בניתוח קליני לצורך השתלת הוושט. לעבוד עם מיקרוסקופ עבור מדויק, האטומה לאחר הצורך של אתר השתל. - לאחר מכן, להניח את בלוטת התריס המקיף דש מעל האתר מושתלים כדי להבטיח תחזוקה יציבה של אספקת כלי דם לשתלים.
- לאחר ההשתלה, תפר את השריר התת עורית ואת רקמת העור עם תפר 4-0.
- לשמור את כל החולדות הנסיוניות באופן אינדיבידואלי בכלובים מטבוליים.
6. הליכים שלאחר הניתוח
הערה: הליכים שלאחר הניתוח מבוצעים לאחר השתלת הגסטרו והוושט.
- לאחר סגירת פצע הבטן, לשים את החולדות לתוך כלובים מטבולית בודדים ולמקם את הכלובים על התקני התחממות אינפרא אדום כדי למנוע היפותרמיה.
- עקוב אחר בעלי החיים עד שהם משיגים ושומרים על שכיבה משנית (כלומר, שוכב זקוף על החזה).
- כדי למזער את הדלקת באתר כירורגי, ניהול gentamicin אנטיביוטי (20 מ"ג/ק"ג) מדי יום לחולדות.
- התחל נוזל אוראלי האכלה ביום השלישי שלאחר העבודה עד נקודת הקצה של המחקר. לספק את נוסחת התזונה כולה (20.6 g/100 מ"ל [g%] פחמימות, 3.8 g% חלבון, 0.2 g% fat) דרך כובע הפארין 3x ליום מתחיל יום אחרי הניתוח.
- בדוק את המראה של בעלי החיים ואת משקל הגוף מדי יום. בדוק כדי לנהל את ההתנהגות, כגון הפגיעה עצמית באתר או התנגדות לצריכת הצינורית, כמו גם סיבוכים כירורגיים שונים. כאשר משקל הגוף של מודלים חולדה פוחתת במהירות על ידי 20% או יותר, לבצע המתת חסד על ידי CO2 שאיפת.
7. היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה
הערה: לניתוח היסטולוגית, כל רקמת הוושט של בעלי החיים המורדמים מופק באמצעות מספריים כירורגיים. המטאוקסילין והאאוזין והצביעת התלת-כרום של מאסנה בוצעו באמצעות טכניקות היסטולוגית סטנדרטיות. אימונוהיסטוכימיה בוצעה על פי הפרוטוקול הבא.
- תקן את הוושט כולו המכיל את האתרים המושתלים ב 4% פאראמפורמלדהיד. יצירת בלוק פרפין וחותכים 4 יקרומטר סעיפים עבים.
- . ומייבשים אותם בסדרת אתנול הישאב את שקופיות הרקמה לתוך מאגר ציטראט וחום במשך 10 דקות במיקרוגל. מגניב את התאים עם PBS קר עבור 20 דקות. לטבול ב 3% חמצן מימן עבור 6 דקות, ולשטוף עם PBS עבור 10 דקות.
- מודדת ב 3% בסרום שור (BSA) עבור 1 h בטמפרטורת החדר כדי לחסום תגובות שאינן ספציפיות של מקטעי רקמות.
- לשטוף את 3x עם PBS עבור 5 דקות. הדגירה עם נוגדנים העיקרי נגד Desmin (מדולל כדי 1:200), קרטין 13 (מדולל כדי 1:100), ו פון Willebrand פקטור (vWF; מדולל ל 1:100) לילה ב 4 ° c.
- לשטוף את 3x עם PBS עבור 15 דקות. מודקרת עם הנוגדן המשני המתאים בריכוז של 1:500 עבור Desmin ו קרטין 13 בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטוף את השקופיות פעמיים עם PBS במשך 10 דקות.
הערה: מקטעי רקמות עבור vWF היו מודבטים באמצעות ערכת peroxidase-מצוחזרת (ראה טבלת חומרים) ולאחר מכן דמיינו שימוש ב-3, 3 '-diaminobenzidine (טיפה). - הר באמצעות שמיכות זכוכית ו 4 ', 6-diamidino-2-פנייולדול (DAPI) המכיל הרכבה בינונית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מציג תרשים סכמטי של תהליך הייצור של הפיגום הצינורי הדו-PCL שני שכבות. הפתרון PU היה אלקטרוסובב מ 18 גרם מחט לעשות מבנה פנימי גלילי עם עובי של 200 μm. לאחר מכן, PCL מומס הודפס על הקיר החיצוני של nanofiber PU במרווחי זמן קבועים. ניתן לראות את המבנה הפנימי של הקירות הפנימיים והחיצוניים של הפיגום הצינורי המלא בסריקת תמונות המיקרוסקופיה האלקטרונים.
איור 2 מראה את תהליך הכנסת צינור הגמעי בחולדה לאספקת חומרים תזונתיים חיצוניים (איור 2א). שפופרת הסיליקון בצורת T הוכנס לתוך קיר הקיבה והשמים (איור 2ב'). הצינור הועבר לאחר מכן דרך המנהרה התת עורית לחלק האחורי של הצוואר והתחבר עם כובע הפארין (איור 2ג). הצינורית מקלה על הזרקה של מזון נוזלי. זה גם אוסר על הזרימה הפוכה של תכולת הקיבה דרך הצינורות.
איור 3 מראה את התהליך של החיסון לתא על הקיר הפנימי של הגרדום, הטיפוח-תרגול והשתלת הוושט. ה-hMSC-מוטבע מטריצת קרום המרתף הוחל באופן שווה על הקיר הפנימי של הגרדום באמצעות הזרקה (איור 3א). תמונת ה-SEM מציגה את המבנה של המשטח הפנימי המחובר לתא. חי/מת מכתים לנתח את הכדאיות התאית על שני שכבות פיגום הכרישים (משטח הלומיאל) מציין כי רוב התאים היו קיימא, והם התפשטו היטב על מבנה ננו סיבים בתוך 5 ימים. הפיגום שחוסנו עם התאים היה קבוע לביוריאקטור, ומתח ההטיה הוחל על ידי המשאבה (איור 3ב). ה-hMSC-הזורע פיגומים, כולל טיפוח-תרגול, הושתלים בחולדות עם פגמים מלאים בוושט באמצעות טכניקות מיקרו-תפרים. השתל היה מכוסה עם דש בלוטת התריס עבור קיבעון יציב ואספקת כלי דם של האתר מושתל (איור 3ג). שינוי המשקל של חולדות לאחר ההשתלה נצפתה עד סוף הניסוי. חולדות המושתלים הוושט נשארו ב 340 g עד היום התשיעי, אבל אז ירד במהירות במשקל בשל גורמים שונים (איור 3ד). כתוצאה מכך, רוב החיות מתו תוך 15 ימים.
איור 4 מראה התחדשות הוושט לאחר השתלת שתל. למרות שרוב העכברושים פיתחו חסם הוושט הנגרם על ידי כדורי שיער, לא הייתה כל ראיה מגעילה של ניקוב, השקה מפיסטולה, הצטברות סרומה, היווצרות מוגלה, או נמק מסביב לרקמות הרכות בעכברוש ניסיוני כלשהו. האפיתל מחדש של האתר השתלת אושרה על-ידי immunofluorescence כתמים עבור קרטין 13. המבנה של שכבת הקולגן וסיבי האלסטין אושרו בבירור באתר ההתחדשות. הנוכחות של אלסטין שופע סיבי קולגן יכולים לתרום תכונות מכניות טוב יותר. התחדשות שכבת שריר הוושט הוצגה על ידי desmin אימונוהיסטוכימיה, ו ניאוואסקולריזציה שופע נצפתה באתר זה.
איור 1: המחשה סכמטית של התהליך המשמש להמציא 2 שכבות של פיגומים צינורי. לאחר בדיית הקרום הפנימי על ידי אלקטרולטווייה באמצעות פו (א), את החוזק המבני של הגרדום הכרישים חיזק על ידי הוספת קווצות למשטח החיצוני של קרום באמצעות מערכת הדפסה תלת-ממד ללא הממס (ב). תמונת ה-SEM מציגה את המבנה של השכבות הפנימיות והחיצוניות של הגרדום הצינורי השני בשכבות. (קיצורים: PU = פוליאוריטן). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מעשה החלזונות. (א) דיאגרמת סכמטית המציגה טכניקות הגאוטיות באמצעות החדרת צינור T בדופן הקיבה. (ב) חור ניקוב מורכב באמצע היער, והקצה T-tube מוכנס לתוך היער. (ג) חלק ה-c של הצינורית T ממוקם עם כובע הפארין באמצע occiput. האיור שלהלן מציג מכשיר הגטותרפיה בצינור T עם רכיבים שונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: השתלת הוושט. (א) hMSCs כופרה בתוך מטריצת ממברנה מרתף הופרה על הרבדים הפנימיים של הגרדום שני שכבתית. תמונת ה-SEM מציגה את המבנה של הhMSCs על הקיר הפנימי. הכדאיות של תאים מחוסן אושרה גם על ידי חי מת מכתים (ירוק = תאים חיים). מקפלים את hmsc-הזורע היו מודבטים מיד במערכת ביוריאקטור שחקן (ב), ולאחר מכן את הרקמה מהונדסים הוושט מושתלים לתוך הוושט צוואר הרחם (ג). האתר הושתל מכוסה בכנף בלוטת התריס עבור שחזור יציב של הוושט (חיצים). (ד) לימודי ירידה במשקל לאחר השתלת הוושט. ירידה במשקל נקבע כשינוי מוחלט מן המשקל הראשוני של החולדות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: היסטולוגיה שלם של הוושט שוחזר 2 שבועות לאחר השרשה הפיגום. הצבע התלת-כרום של מסון מראה את תצהיר הקולגן סביב האתרים המושתלת. רגנרציה של שריר הוושט ושכבות ריריות אושרה על ידי desmin (ירוק) ו קרטין 13 (אדום) חיסוני, בהתאמה. בנוסף, נאובאסקולריזציה (חיצים) נצפתה בבירור סביב שכבת רירית שנוצר מחדש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לימודי בעלי חיים קיימים בושט מלאכותי עדיין מוגבלים במספר גורמים קריטיים. לפיגום הוושט המלאכותי האידיאלי צריך להיות ביולוגי ולהיות בעל סגולות פיזיות מצוינות. זה אמור להיות מסוגל לחדש את האפיתל רירית בתקופה הפוסט מוקדם כדי למנוע דליפה anastomotic. התחדשות של שכבות המעגל הפנימי העגול החיצוני שרירי הוא גם חשוב עבור הפריסטלזיס פונקציונלי12,13.
מאפיינים מכניים של הוושט הם חיוניים כי הוושט מתמוטט במהלך הנשימה ופותח במהלך הבליעה, עם חשיפה מתמדת מתיחה מקסימלית עם תופעת רתע14. הגרדום המושתל חייבים לכלול גם את התכונות המכאניות הללו. אלסטיות והגמישות של הוושט מושתל צריך להיות מספיק עבור שיפוע חוזר-הרפיה של התנועה הפריסטלטית דרך הוושט. הפיגומים חלשים מדי עלולים להיקרע או לדלוף ולגרום למצבים חמורים (למשל, מדיניטיס) במטופל. לעומת זאת, הפיגום נוקשה מדי יכול לחדור לתוך לומן הוושט ולמנוע מעבר מזון. לסיבי ננו יש תכונות פיזיות. חיוביות מאוד לשיקום הוושט הטבע הטופוגרפי של ECM מספק סביבה נוחה להגירה והבידול של תאי האפיתל בשכבות הוושט15. יש לו גם מבנה nanopore המונע דליפה של רוק ופתוגנים שונים16. עם זאת, הפיגומים העשויים אלקטרוסיבי ננו שימוש מוגבל עקב תכונות מכניות רכות שלהם. כדי לפתור בעיה זו, שיפרנו את הכוח המכני שלהם באמצעות טכנולוגיית הדפסה תלת-ממדית. 3D מודפס סטרנד על השכבה החיצונית של ננוסיב יש רוחב של 780 μm, ואת המבנה נקבובית הפנימי הוא רחב למדי. היא מספקת תמיכה פיזית להתערבות הוושט ולא הנחיית התחדשות הרקמה הסובבת.
במחקר זה, מומים הוושט מלאה החלימו באופן מלא בשתלים מתרבות ביוריאקטור שחקן עד 2 שבועות, אבל כל החולדות ניסיוני מת בתוך 15 ימים לאחר הניתוח. רוב מקרי המוות נגרמו על ידי הצפקת ותת-תזונה הנגרמת על ידי הדלפות מזון ורוק הצפויים לאתר ההשקה. כל החיות צרכו בחופשיות דיאטה נוזלית עד שבוע, אבל כאשר הריפוי הפצע התקדם, חסימה מכנית לא מכוונת התרחשה הוושט שוחזר בשל בליעה כדור הפרווה. תופעה זו הוכח לגרום להפרעת עיכול מלאה בתוך הפיגומים הלא דינמיים המושתלת. קיימות מספר אפשרויות להתגבר על בעיות טכניות אלה. שיכולה לחקות. הרדמה של הוושט שנית, לימודי בעלי חיים באמצעות חולדות שיער כדי למנוע בליעה. שלישית, סטנט המרה יכול להיות מיושם בו זמנית עם הפיגום כדי למזער את קריסת השתל והשקה נזק. בנוסף, השימוש במיקרו-כלי לחיבור להשרשה של הוושט חשוב למנוע לחלוטין את דליפת הרוק. טכניקת תפר קונבנציונאלי באמצעות העיניים בעירום הוא מאוד קשה לעשות אטומה מודלים חולדה.
כלי רכב אמין חיוני עבור חומרים מזינים, גורמי גדילה, ואספקת חמצן בשלבים המוקדמים של התחדשות. בלוטת התריס היא רקמה כלי דם הממוקם ליד הוושט. השתמשנו הכנף בלוטת התריס לאחר כריתת ושט הלימפה בגלל הנגישות הקלה שלה במודל חולדה. לסיכום, אנו מציעים טכניקות קדם-קליניות שונות כדי להתגבר על קשיי שחזור הוושט במודל החולדה. מחקר זה מציג חלופה טובה כדי להתגבר על מגבלות של השתלת הוושט בעלי חיים קטנים קונבנציונליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
מערכת ביוריאקטור שחקן שתוכננה עבור מחקר זה ממוסחר (מספר דגם: acbf-100).
Acknowledgments
מחקר זה היה נתמך על ידי קוריאה טכנולוגיה בריאות R & הפרויקט באמצעות המכון לפיתוח בריאות קוריאה (קהידי), ממומן על ידי משרד הבריאות & רווחה, הרפובליקה של קוריאה (מספר המענק: HI16C0362) ומחקר בסיסי המדע תוכנית באמצעות קרן המחקר הלאומי של קוריאה (NRF) ממומן על ידי משרד החינוך (2017R1C1B2011132). הביודגימות והנתונים המשמשים במחקר זה סופקו על ידי Biobank של האוניברסיטה הלאומית של סאול החולים, חבר של קוריאה Biobank רשת.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
| Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Power Supply | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
References
- Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
- Flanagan, J. C., et al. Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications. Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).
- Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review. Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942 (2017).
- Luc, G., et al. Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model. Biomaterials. 175, 1-18 (2018).
- Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).
- La Francesca, S., et al. Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells. Scientific Reports. 8 (1), 4123 (2018).
- Ponten, J. E., et al. Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication. Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).
- Catry, J., et al. Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs. Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).
- Lee, S. J., et al. Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).
- Kim, I. G., et al. Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction. Tissue Engineering Part A. , (2019).
- Wu, Y., et al. Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation. Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).
- Jensen, T., et al. Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model. Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).
- Nakase, Y., et al. Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).
- Kwiatek, M. A., et al. Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).
- Anjum, F., et al. Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure. Scientific Reports. 7 (1), 10291 (2017).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions. Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).
