Summary
食管重建是一个具有挑战性的过程，开发一个组织工程食道，使食管粘组织和肌肉再生，可以植入人工移植是必要的。在这里，我们提出我们的协议，以生成人工食道，包括脚手架制造，生物反应器培养，和各种手术技术。
Abstract
在大鼠中，使用生物相容材料进行圆食管重建是一项技术上具有挑战性的任务，需要具有营养支持的最佳植入技术。近年来，食管组织工程尝试多次，但由于在蠕动特殊环境下早期上皮的难度，成功率有限。在这里，我们开发了一种人工食道，通过双层管状支架、基于间质干细胞的生物反应器系统和经过改良的旁路喂养技术，可以改善食管粘膜和肌肉层的再生。胃切除术。支架由聚氨酯 （PU） 纳米纤维制成，呈圆柱形，外壁缠绕为三维 （3D） 印刷聚苯乙烯链。在移植之前，将人类衍生的等位干细胞播种到脚手架的流明中，并进行了生物反应器培养，以提高细胞反应能力。我们通过应用手术麻醉术和用甲状腺皮瓣覆盖植入的假肢，然后进行临时非口腔胃切除喂养，提高了移植存活率。这些移植物能够重述植入部位周围初始上皮和肌肉再生的发现，组织学分析证明了这一点。此外，在移植物的外围观察到增加的乳化纤维和新血管化。因此，该模型提出了一种潜在的圆食管重建新技术。
Introduction
食管疾病的治疗，如先天性畸形和食管癌，可导致食道的结构部分损失。在大多数情况下，自体置换移植物，如胃上拉导管或结肠插合，已执行1，2。然而，这些食管置换物有各种手术并发症和再手术风险3。因此，使用组织工程食道支架模仿原生食道可以是一个有前途的替代策略，最终再生丢失的组织4，5，6。
尽管组织工程食道可能为目前食管缺陷的治疗提供替代方案，但其体内应用存在重大障碍。术后麻醉性渗漏和植入的食管支架坏死不可避免地导致周围无菌空间的致命感染，如中管7。因此，防止伤口和鼻胃管中的食物或唾液污染是非常重要的。胃切除术或静脉营养应考虑，直到主要伤口愈合完成。迄今为止，食管组织工程已经在大型动物模型中进行，因为大型动物在植入脚手架8后，只能通过静脉过度过敏喂养2-4周。然而，这种非口腔喂养模式尚未建立，以在小动物食管移植后的早期生存。这是因为动物非常活跃，无法控制，所以他们不能长时间把喂食管放在胃里。因此，在小型动物中成功进行食管移植的案例很少。
针对食管组织工程的情况，设计了由电旋纳米纤维（内层;图1A）和3D打印链（外层;图1B）包括经过改良的胃切除术技术。内部纳米纤维由PU（一种不可降解的聚合物）制成，可防止食物和唾液泄漏。外部 3D 打印链由可生物降解的多氯酰氨酰氨铁 （PCL） 制成，可提供机械灵活性并适应蠕动运动。人类脂肪衍生的等位干细胞（hAD-MSCs）被播种在支架的内层，以促进再表皮化。纳米纤维结构可为细胞迁移提供结构细胞外基质（ECM）环境，从而促进初始粘膜再生。
我们还通过生物反应器培养提高了接种细胞的存活率和生物活性。植入的脚手架覆盖甲状腺皮瓣，使食管粘和肌肉层更稳定地再生。在本报告中，我们描述了食管组织工程技术的协议，包括脚手架制造、基于中生干细胞的生物反应器培养、带改性胃切除术的旁路喂养技术以及经过改造的外科手术大鼠模型中圆周食管重建的麻醉技术。
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Protocol
此处描述的所有方法均已获得首尔国立大学医院的机构动物护理和使用委员会（IACUC No. 17-0164-S1A0）的批准。
1. 脚手架制造
注：双层食管支架采用电纺和3D打印相结合。管状支架的内膜由电纺聚氨酯（PU）制成，旋转不锈钢芯作为收集器9。
- 对于管状聚氨酯纳米纤维的制备，在室温下，在N、N-二甲基甲酰胺（DMF）中搅拌8小时，制备20%（w/v）聚氨酯聚合物溶液。
- 用钝金属针（22 G）将聚氨酯溶液放在注射器上，用电针在旋转的不锈钢芯上（直径 = 2 mm），在针尖和旋转收集器之间30厘米的距离。
注：电源设置为 15 kV 电位的高压直流电。使用注射器泵，溶液的进给速率固定为0.5 mL/h。 - 在芯轴表面以 3.14 m/s 旋转的管状纳米纤维层。
- 在真空烤箱中干燥 PU 纳米纤维，在 40°C 下过夜，以完全去除残留溶剂。
注：食管支架的3D打印外墙使用快速原型设计系统进行制备。3D 打印设备包括分配器、喷嘴、压缩/热控制器、3 轴转换级和软件系统。 - PCL 颗粒在加热缸中溶解在 100°C 下，然后在生物绘图系统的控制下，在高压（7 bar） 下印在纳米纤维表面。喷嘴尺寸为300μm，绞线距离为700μm。
- 从芯架上取下双层脚手架后，在紫外线下浸泡70%乙醇进行灭菌。
注：脚手架的更详细特性已在以前的研究中报告10。
2. 移植物和生物反应器培养的细胞播种
注：从公司购买的人类脂肪衍生的间质干细胞（hMSCs）未经修改即可使用。
- 在细胞移植之前，在紫外线照射下对3D打印食道支架进行1小时消毒，用乙醇将其浸湿10分钟，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗3倍。
- 培养和扩展生长介质中的 hMSCs（基础介质/生长补充）。双层管状支架被转移到非粘附24孔组织培养板中。
- 要将细胞连接到支架的内表面，在含有生长培养基的基底膜基质中，以1 x 106细胞/mL的密度轻轻添加hMSC悬浮液。
- 将基底膜基质悬架均匀地沉积在双层管状支架的内表面。
- 使用脉动流生物反应器系统，将 hMSC 种子管状支架牢固地固定在生物反应器培养室的丙烯酸支架上。
注：定制设计的生物反应器系统由泵、气泡陷阱、流量室、压力表、可控阀和中型储液罐组成。在培养室中施加剪切应力时，允许1-2分钟11的休息时间。 - 在含有5%CO210的加湿气氛下，向培养室添加生长介质，并应用0.1 dyne/cm2流诱导的剪切应力。
注：流诱导剪切应力的值是通过模拟从先前研究10中从人体获得的食管组织的蠕动来计算的。 - 根据制造商的说明，使用 LIVE/DEAD 可行性测定套件，在 5 天后使用 LIVE/DEAD 可行性测定套件，确定没有生物反应器培养的双层管状支架内表面的细胞反应。使用 Z 堆栈工具通过共聚焦显微镜获取图像。
- 第三天，通过扫描电子显微镜（SEM）观察hMSC种子管状支架的表面形态。
- 用hMSC和2.5%谷醛和OsO4将孵育的脚手架固定24小时，用乙醇脱水。
- 在大气条件下使用溅射涂层器将固定 hMSC 涂上铂，并在 25 kV 的加速电压下获取 SEM 图像。
3. 动物外科手术准备
注：在胃切除术和食管移植前应用手术制剂。
- 设置无菌手术器械：刀刃、Weitlaner缩回器、微针支架、微针钳、显微组织钳、微剪刀、梅奥-赫格针支架、手术剪刀、虹膜剪刀、敷料钳、组织钳、裂解钳，虹膜钳，5 mL注射器（21 G针），10 mL注射器（22G针），9-0聚酰胺缝合，4-0聚酰胺缝合。
- 用肌肉注射瓷砖胺/佐拉西平（50毫克/克剂量）和2%盐酸西兰辛（2毫克/千克剂量）对动物进行麻醉。
注：成年斯普拉格-道利（SD）大鼠体重398-420克用于食管移植。 - 在转移到手术窗帘之前，用钳子捏住尾巴，检查动物的合适麻醉条件。
- 将动物置于无菌窗帘上的上垂位置，并使用剪子从颈部（食管移植）或腹部（胃切除术）上取下头发。然后用贝他当和70%乙醇擦洗手术部位。
- 在切口之前，皮下注射镇痛剂，如丁丙诺啡（0.05-0.1毫克/千克）以缓解疼痛。
4. 在大鼠中使用T管的胃切除术
注：在所有实验动物身上进行了经过修改的胃切除术，允许临时旁路非口腔管喂养（n = 5）。
- 让老鼠在手术前一天禁食。如第3节所述准备手术。
- 通过麻醉大鼠的皮肤和腹部肌肉的中线切口暴露胃。
- 使用手术刀在前胃壁上创建一个 3 mm 孔。
- 将硅胶 T 管的尖端插入缺陷部位，将其固定在胃壁上。
- 正确缝合，使 T 型管不会从胃壁上分离。
- 通过皮下隧道将植入的T型管的远端伸入颈部后部。
- 将肝素盖插入 T 管的末端，以防止胃内内容物向后流动。
注：使用血管测量仪将 T 型管的末端与肝素盖连接。 - 使用 4-0 聚酰格素缝合线缝合腹部壁和皮肤的所有层。
- 完成胃切除术后，将所有实验鼠分开在代谢笼中。
5. 食管移植
注：两层管状支架的食管移植在胃切除术（n = 5）后1周进行。在移植之前，将hMSCs（细胞密度：1 x 106细胞/mL在基底膜基质中）接种到每个支架的内壁，并在生物反应器系统中孵育3天。手术如下。
- 去除模型动物的颈部毛发，并执行无菌手术的手术部位的标准拖曳。
注意：建议创建一个大型剃须区，以保持对动物的怀疑手术。 - 颈部前中位切口后，分离表带肌肉并暴露气管食管结构。
- 在切除食道之前，要对食道的迷走神经进行模糊解剖，否则动物的呼吸会受到影响。
- 在放大倍率下，将食道的左侧与气管分离，并小心地将上部与甲状腺分离。
- 使用手术剪刀创建包含食道所有层的 5 mm 长全圆周缺陷。
注：在食管移植之前，使用手术剪刀切割准备好的脚手架，以匹配移植部位的长度。 - 在显微镜下，使用9-0缝合线在远端食管缺陷的两端进行微血管化。在上食道残存物和脚手架的右推断边缘之间放置第一个缝合线。继续从右到左在上食道残留物和脚手架之间缝合。以与下食道残渣上边缘相同的方式对支架进行麻醉。
注：执行用于食管移植的临床手术中的微血管血管麻醉。与显微镜一起工作，对植入物部位进行精确、防水的缝合。 - 之后，将周围的甲状腺皮瓣放在移植部位，以确保移植物的稳定维护和血管供应。
- 移植后，用4-0的维丽尔缝合皮下肌肉和皮肤组织。
- 将所有实验鼠单独关在代谢笼子里。
6. 术后程序
注：术后手术在胃切除术和食管移植后进行。
- 腹部伤口闭合后，将大鼠放入单独的代谢笼中，并将笼子放在红外加热装置上，以防止体温过低。
- 监测动物，直到它们达到并保持胸腔，（即，直立躺在胸部）。
- 为了尽量减少手术部位的炎症，每天给大鼠服用抗生素gentamicin（20毫克/千克）。
- 在术后第三天开始口服液体喂食，直到研究结束。通过肝素帽每天3次，在手术后的第二天开始，通过肝素帽供应整个营养配方（20.6克/100毫升[g%]碳水化合物、3.8克蛋白质、0.2克脂肪）。
- 每天检查动物的外观和体重。检查管理行为，如自残切口部位或对管摄入量的阻力，以及各种手术并发症。当大鼠模型的体重迅速减少20%或更多时，通过CO2吸入进行安乐死。
7. 方法学和免疫化学
注：对于组织学分析，使用手术剪刀提取安乐死动物的所有食管组织。血氧林和欧辛染色和马森的三铬染色采用标准组织学技术进行。免疫性化学按照以下方案进行。
- 将含有移植部位的整个食道固定在4%的甲醛中。创建石蜡块并切割 4 μm 厚的部分。
- 在乙醇系列中对组织部分进行脱氧除氧脱水。将组织滑入云酸盐缓冲液中，在微波炉中加热 10 分钟。用冷PBS冷却细胞20分钟，浸入3%过氧化氢6分钟，用PBS洗涤10分钟。
- 在室温下孵育3%牛血清白蛋白（BSA）1小时，以阻止组织部分的非特异性反应。
- 用PBS洗涤3次，用原抗体孵育5分钟，在4°C下过夜，对Desmin（稀释至1：200）、角蛋白13（稀释至1：100）和冯·威尔布兰德因子（vWF;稀释至1：100）。
- 用PBS清洗3次，用适当的二级抗体孵育3次，在室温下，Desmin和Keratin13的浓度为1：500。然后，用 PBS 清洗幻灯片两次，10 分钟。
注：vWF的组织部分使用马萝卜过氧化物酶结合试剂盒孵育，然后使用3，3'-二氨基苯甲胺（DAB）可视化。 - 使用玻璃盖玻片和包含安装介质的 4'，6-二酰胺-2-苯酚 （DAPI） 安装。
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Representative Results
图 1显示了 PU-PCL 双层管式支架制造工艺的示意图。PU 溶液是从 18 G 针头电旋，以制造厚度为 200 μm 的圆柱形内部结构。然后，将熔化的PCL定期印在PU纳米纤维的外墙上。在扫描电子显微镜图像中可以看到已完成管状支架内壁和外壁的表面形态。
图2显示了在大鼠中插入胃切除术管以提供外部营养供应的过程（图2A）。T形硅胶管插入胃壁并缝合（图2B）。然后，管子通过皮下隧道移动到颈部后部，并与肝素帽相连（图2C）。管子有利于液体食物的注射。它还禁止胃内内容物通过管子反向流动。
图3显示了脚手架内壁细胞接种、生物反应器培养和食管移植的过程。通过注射将hMSC嵌入式基底膜基质均匀地应用于脚手架的内壁（图3A）。SEM 图像显示了细胞附着的内表面的形态。活/死染色来分析双层管状支架（光面）上的细胞活力表明，大多数细胞是可行的，在5天内在纳米纤维结构上分布良好。用细胞接种的支架固定在生物反应器上，剪切应力由泵施加（图3B）。hMSC种子管状支架，包括生物反应器培养，通过微孔技术移植到具有全圆食管缺陷的大鼠体内。移植物覆盖于甲状腺活门，用于稳定固定和植入部位的血管供应（图3C）。在实验结束之前，观察了移植后大鼠的体重变化。食管移植大鼠在9日之前保持在340克，但随后由于各种原因体重迅速下降（图3D）。结果，大多数动物在15天内死亡。
图4显示了移植植入后的食管再生。虽然大多数大鼠因毛球而出现新食管阻塞，但没有任何实验鼠穿孔、腹腔外溢、流肿积累、脓肿形成或周围软组织坏死的严重证据。通过角蛋白13的免疫荧光染色，证实了移植部位的再表皮化。胶原蛋白层和乳胶纤维的形态在再生部位得到明确确认。丰富的电子莱他和胶原纤维的存在有助于提高机械性能。食管肌肉层的再生通过德明免疫组织化学表现出来，并在此部位观察到大量新血管化。
图 1：用于制造 2 层管状支架的工艺图解。使用PU（A）电纺机制造内膜后，管状支架的结构强度通过使用无溶剂的3D打印系统在膜的外表面添加绞线来增强。SEM 图像显示了 2 层管式支架的内部和外部层的形态。（缩写：聚氨酯）。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：胃切除术。（A） 通过T管插入胃壁显示胃切除术技术的示意图。（B） 前胃中间有一个穿刺孔，T管尖插入前胃。（C） T 型管的入口部分位于肝素盖的中间。下图显示了具有不同成分的 T 管胃切除术装置。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：食管移植。（A） 封装在地下室膜基质中的 hMSCs 被播种在双层管状支架的内层上。SEM 图像显示了内壁上 hMSC 的形态。接种细胞的生存能力也通过活死染色（绿色+活细胞）得到证实。hMSC种子脚手架立即在生物反应器系统（B）中孵育，然后将组织工程的食道植入颈椎食道（C）。植入部位覆盖着甲状腺活门，用于稳定的食管重建（箭头）。（D） 食管移植后的减肥研究.减肥被确定为与大鼠的初始体重的绝对变化。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：在正交脚手架植入后2周重建食道的整个组织学。马森的三铬染色显示胶原蛋白沉积周围的植入部位。食管肌肉和粘膜层的再生分别通过desmin（绿色）和角蛋白13（红色）免疫染色得到确认。此外，在再生的粘膜层周围清楚地观察到新血管化（箭头）。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
现有的人工食道动物研究仍然受到几个关键因素的限制。理想的人工食管支架应具有生物相容性，具有优异的物理性能。它应该能够在术后早期再生粘膜上皮，以防止麻醉性渗漏。内圆形和外纵向肌肉层的再生对于功能蠕动12、13也很重要。
食道的机械特性是必不可少的，因为食道在呼吸过程中崩溃，在吞咽过程中打开，不断接触最大拉伸与反冲现象14。植入的脚手架也必须具有这些机械特性。植入的食道的粘度应足以通过食道重复的蠕动运动斜坡松弛。太弱的脚手架可能会破裂或泄漏，并在接收者中造成严重条件（例如，介质炎）。相反，过于僵硬的脚手架会膨胀到食管流明中，并阻止食物通过。电旋纳米纤维对食管重建具有非常有利的物理性能。ECM的地形性质为食管层15中上皮细胞的迁移和分化提供了有利的环境。它还有一个纳米孔结构，防止唾液和各种病原体的泄漏16。然而，由电旋纳米纤维制成的脚手架由于其柔软的机械性能而使用有限。为了解决这个问题，我们利用3D打印技术提高了它们的机械强度。纳米纤维外层的3D打印线宽度为780μm，内孔结构相当宽。它为食管干预提供物理支持，而不是指导周围组织的再生。
在这项研究中，圆周食管缺陷在生物反应器培养的移植物中完全愈合长达2周，但所有实验鼠在手术后15天内死亡。大多数死亡是由食管炎和营养不良引起的，因为食物和唾液泄漏接近麻醉病部位。所有动物都自由食用液体饮食长达一周，但随着伤口愈合的进展，由于毛球吞咽，重建的食道发生了意外的机械阻塞。这种现象已被证明在植入的非动态支架内引起完全的消化紊乱。有几个选项可以克服这些技术问题。首先，开发一种高度弹性的食管植入物，可以模仿食管蠕动蠕动。第二，动物研究使用无毛大鼠来防止头发吞咽。第三，胆体支架可与支架同时应用，以尽量减少植入物坍塌和麻醉损伤。此外，将微血管血管血管化应用于食管支架植入对完全防止唾液泄漏具有重要意义。在大鼠模型中，使用肉眼的传统缝合技术很难做到防水。
可靠的血管载体对于再生早期营养、生长因子和氧气供应至关重要。甲状腺是位于食道附近的血管组织。我们使用前食管切除术后的甲状腺皮瓣，因为它在大鼠模型中很容易接近。最后，提出了各种临床前技术，克服了大鼠模型中食管重建的困难。本研究为克服传统小型动物食道移植的局限性提供了很好的替代方法。
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Disclosures
为这项研究设计的生物反应器系统已经商业化（型号：ACBF-100）。
Acknowledgments
这项研究得到了韩国卫生技术研发项目的支持，该项目由韩国卫生福利部资助，由大韩民国卫生福利部资助（赠款号：HI16C0362）和基础科学研究通过由教育部资助的韩国国家研究基金会（NRF）计划（2017R1C1B2011132）。这项研究中使用的生物标本和数据由韩国生物银行网络成员首尔国立大学医院生物库提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
| Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Power Supply | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
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