Summary
Esophageal rekonstruktion er en udfordrende procedure, og udvikling af en væv-manipuleret spiserøret, der muliggør regenerering af esophageal slimhinde og muskler, og som kan implanteres som en kunstig graft er nødvendig. Her præsenterer vi vores protokol til at generere en kunstig spiserøret, herunder stilladsfremstilling, bioreaktordyrkning og forskellige kirurgiske teknikker.
Abstract
Brugen af biokompatible materialer til circumferential esophageal rekonstruktion er en teknisk udfordrende opgave hos rotter og kræver en optimal implantatteknik med ernæringsmæssig støtte. For nylig har der været mange forsøg på esophageal vævsteknik, men succesraten har været begrænset på grund af vanskeligheder med tidlig tilnavnisering i det særlige miljø af peristalsis. Her udviklede vi en kunstig spiserøret, der kan forbedre regenereringen af den esophageal slimhinde og muskel lag gennem en to-lags rørformede stillads, en mesenkymal stamceller-baserede bioreaktor system, og en bypass fodring teknik med modificeret Gastrostomi. Stilladset er lavet af polyurethan (PU) nanofibre i en cylindrisk form med en tredimensionel (3D) trykt polycaprolactone streng viklet rundt om den ydre væg. Før transplantation, menneskeskabte mesenkymale stamceller blev seedet ind i lumen af stilladset, og bioreaktor dyrkning blev udført for at øge cellulære reaktivitet. Vi forbedrede graft overlevelsesraten ved at anvende kirurgisk anastomose og dækker den implanterede protese med en skjoldbruskkirtel flap, efterfulgt af midlertidig nonoral gastrostomi fodring. Disse grafts var i stand til at opsummere resultaterne af indledende epitelisering og muskel regenerering omkring de implanterede steder, som det fremgår af histologisk analyse. Desuden blev øget elastinfibre og neovaskularisering observeret i graftens periferi. Derfor præsenterer denne model en potentiel ny teknik til circumferential esophageal rekonstruktion.
Introduction
Behandling af esophageal lidelser, såsom medfødte misdannelser og esophageal karcinomer, kan føre til strukturelle segment tab af spiserøret. I de fleste tilfælde er der udført autologe erstatningstransplantater, såsom gastrisk pull-up-ledninger eller koloninterpositioner,1,2. Men, disse esophageal udskiftninger har en række kirurgiske komplikationer og reoperation risici3. Således kan brugen af væv-manipuleret spiserøret stilladser efterligne den indfødte spiserøret være en lovende alternativ strategi for i sidste ende regenerere tabt væv4,5,6.
Selv om en væv-manipuleret spiserøret potentielt tilbyder et alternativ til de nuværende behandlinger af esophageal defekter, der er betydelige barrierer for sin in vivo ansøgning. Postoperativ anastomotisk lækage og nekrose af det implanterede esophageal stillads uundgåeligt føre til en dødelig infektion i det omkringliggende aseptiske rum, såsom mediastinum7. Derfor er det yderst vigtigt at forhindre mad eller spyt forurening i såret og nasogastrisk rør. Gastrostomi eller intravenøs ernæring bør overvejes, indtil primær sårheling er afsluttet. Til dato er der udført esophageal vævsteknik i store dyremodeller, fordi store dyr kun kan fodres ved intravenøs hyperalimentation i 2-4 uger efter implantation af stilladset8. En sådan nonoral fodringsmodel er imidlertid ikke blevet etableret for tidlig overlevelse efter esophageal transplantation hos små dyr. Dette skyldes, at dyrene var ekstremt aktive og ukontrollable, så de ikke kunne holde fodring røret i maven i en længere periode. Derfor har der kun været få tilfælde af vellykket esophageal transplantation hos små dyr.
I betragtning af omstændighederne ved esophageal vævsteknik, designede vi en to-lags rørformede stillads bestående af elektrospundet nanofibre (inderlag; Figur 1A) og en 3D-printet streng (ydre lag; Figur 1B), herunder en modificeret gastrostomiteknik. Den interne nanofiber er lavet af PU, en ikke-nedbrydelig polymer, og forhindrer lækage af mad og spyt. De eksterne 3D-printede tråde er lavet af bionedbrydelige polycaprolacton (PCL), som kan give mekanisk fleksibilitet og tilpasse sig peristaltic bevægelse. Menneskelige fedt-afledte mesenkymale stamceller (hAD-MSCs) blev seedet på det indre lag af stilladset til at fremme re-tilnavn. Nanofiberstrukturen kan lette den indledende fornyelse af slimhindeveden ved at give et strukturelt ekstracellulært matrixmiljø (ECM) til cellemigration.
Vi har også øget overlevelsesraten og bioaktiviteten i de podede celler gennem bioreaktordyrkning. Det implanterede stillads var dækket med en skjoldbruskkirtelflap for at muliggøre en mere stabil regenerering af den esophageal slimhinde og muskellag. I denne rapport beskriver vi protokoller for esophageal vævsteknik teknikker, herunder stilladsfremstilling, mesenkymale stamceller-baserede bioreaktor dyrkning, en bypass fodring teknik med modificeret gastrostomi, og en modificeret kirurgisk anastomose teknik til circumferential esophageal rekonstruktion i en rotte model.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af Den Institutionelle Dyrepleje- og Brugskomité (IACUC nr. 17-0164-S1A0) på Seoul National University Hospital.
1. Stilladsfremstilling
BEMÆRK: Tolags esophageal stilladser er fremstillet ved at kombinere elektrospinning og 3D-print. Den indvendige membran af rørformede stillads blev fremstillet af elektrospinning polyurethan (PU) med roterende rustfrit stål mandrels som samlere9.
- Til fremstilling af rørformede PU nanofibre, forberede en 20% (w / v) opløsning af PU polymer ved omrøring i N, N-dimethylformamid (DMF) i 8 timer ved stuetemperatur.
- Pu-opløsningen anbringes på sprøjten med en stump metalnål (22 G) og elektrospin på roterende mandrels i rustfrit stål (diameter = 2 mm) i en afstand af 30 cm mellem nålespidsen og den roterende opsamler.
BEMÆRK: Strømforsyningen er indstillet til en højspændingsjævn strøm på 15 kV-potentiale. Opløsningens fodringshastighed er fastsat til 0,5 ml/h ved hjælp af en sprøjtepumpe. - Lav et rørformet nanofiberlag på overfladen af mandrel roterende ved 3,14 m/s.
- Pu nanofiber en vakuumovn ved 40 °C natten over for helt at fjerne restopløsningsmiddel.
BEMÆRK: Den 3D-printede ydervæg på esophagealstilladset fremstilles ved hjælp af et hurtigt prototypesystem. 3D-printudstyr består af en dispenser, dyse, kompressions-/varmecontroller, 3-aksede konverteringstrin og softwaresystem. - PCL pellets opløses ved 100 °C i en varmecylinder og trykkes derefter på nanofibrenes overflade ved højt tryk (7 bar) under kontrol af et bioplotningssystem. Dysestørrelsen er 300 μm, og strandafstanden er 700 μm.
- Efter fjernelse af to-lags stillads fra mandrel, steriliseres ved iblødsætning i 70% ethanol under ultraviolet lys.
BEMÆRK: Der er rapporteret mere detaljerede egenskaber ved stilladset i tidligere undersøgelser10.
2. Cellesåning på dyrkning af transplantater og bioreaktorer
BEMÆRK: Humane fedt-afledte mesenkymale stamceller (HMSCs) købt fra en virksomhed blev brugt uden ændringer.
- Før celletransplantation, sterilisere 3D trykte spiserøret stillads for 1 time under ultraviolet lys, våd det i 10 min med ethanol, og vask det 3x med fosfat-buffered saltvand (PBS).
- Kultur og udvide HCI'erne i vækstmedium (basal medium/vækst supplement). Tolagsrørsstilladser blev overført til nonadherent 24 brøndvævkulturplader.
- For at fastgøre cellerne til stilladsets indre overflade tilsættes hMSC suspensionen forsigtigt ved en tæthed på 1 x 106 celler/ml i kældermembranmatrix, der indeholder vækstmediet.
- Læg ensartet kældermembranens matrixsuspension på indersiden af det tolagede rørformede stillads.
- Fastgør det hMSC-seedede rørstillads til akrylholderen i bioreaktorens kulturkammer ved hjælp af et pulsatilflowbioreaktorsystem.
BEMÆRK: Det specialdesignede bioreaktorsystem består af en pumpe, boblefælde, flowkammer, trykmåler, kontrollerbar ventil og medium reservoir. Når du anvender forskydningsstress i kulturkammeret, skal du give en hviletid på 1-2 min11. - Tilsæt vækstmedium til kulturkammeret, og anvend 0,1 dyne/cm2 flow-induceret forskydningsstress under en befugtet atmosfære, der indeholder 5% CO210.
BEMÆRK: Værdien af flow-induceret forskydningsstress blev beregnet ved at simulere peristalsisen af det esophageale væv, der stammer fra det menneskelige legeme fra tidligere undersøgelser10. - Celleresponser på de tolagsrørsstilladsers indvendige overflader uden dyrkning af bioreaktor efter 5 dage ved hjælp af et LIVE/DEAD-levedygtighedsanalysesæt i henhold til producentens anvisninger. Anskaffe billeder via konfokalmikroskopi ved hjælp af Z-stack-værktøjet.
- På den tredje dag, observere overflade morfologi af hMSC-seedede rørformede stillads gennem en scanning elektron mikroskop (SEM).
- Fix stilladset, der blev inkuberet med hMSC med 2,5% glutaraldehyd og OsO4 for 24 timer og dehydrere med ethanol.
- Coat de faste HMSCs med platin ved hjælp af en sputter coater under argon atmosfæriske forhold og få SEM billeder ved en accelererende spænding på 25 kV.
3. Kirurgisk forberedelse til dyreoperationer
BEMÆRK: Kirurgiske præparater anvendes før både gastrostomi og esophageal transplantation.
- Opsætning af sterile kirurgiske instrumenter: Skalpel klinge, Weitlaner retractor, mikronål indehaveren, mikrosutur pincet, mikrovæv pincet, mikrosaks, Mayo-Hegar nål holder, drift saks, iris saks, dressing pincet, væv pincet, splint pincet, iris pincet, 5 ml sprøjte (21 G nål), 10 ml sprøjte (22 G nål), 9-0 polyamid sutur, 4-0 polyglactin sutur.
- Bedøve dyret med en intramuskulær injektion af tiletamin/zolazepam (50 mg/g dosis) og 2% xylazine hydrochlorid (2 mg/kg dosis).
BEMÆRK: Voksne Sprague-Dawley (SD) rotter, der vejer 398-420 g, blev anvendt til esophageal transplantation. - Før du overfører til den kirurgiske drapere, kontrollere den relevante bedøvelsestilstand af dyret ved at klemme halen med pincet.
- Anbring dyret i en supine position på den sterile drapere og brug klippere til at fjerne håret fra halsen (til esophageal transplantation) eller maven (for gastrostomi). Derefter krat det kirurgiske sted med betadine og 70% ethanol.
- Før indsnit injiceres et smertestillende middel, såsom buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg) til smertelindring.
4. Gastrostomi kirurgi Ved hjælp af et T-rør i rotter
BEMÆRK: Der blev udført modificeret gastrostomi hos alle forsøgsdyr for at tillade midlertidig bypass nonoral rørfodring (n = 5).
- Har rotter hurtigt dagen før operationen. Forbered kirurgi som i afsnit 3.
- Eksponere maven gennem en midterlinjen snit i huden og mavemusklerne i de anæstesiiserede rotter.
- Opret en 3 mm åbning i den anterior gastriskvæg med en skalpel klinge.
- Sæt spidsen af silikone T-røret ind i defekten stedet for at fastgøre den til mavevæggen.
- Sutur korrekt, så T-røret ikke løsner sig fra den gastriske væg.
- Tag den distale ende af det implanterede T-rør gennem den subkutane tunnel ind i nakken.
- Sæt heparinhætten til enden af T-røret for at forhindre, at maveindholdet flyder baglæns.
BEMÆRK: Brug et angiokateter til at forbinde enden af T-røret med heparinhætten. - Sutur alle lag af bugvæggen og huden ved hjælp af 4-0 polyglactin suturer.
- Hold alle eksperimentelle rotter adskilt i et metabolisk bur, efter at gastrostomien er afsluttet.
5. Esofhageal Transplantation
BEMÆRK: Esophageal transplantation af tolags rørformede stillads udføres 1 uge efter gastrostomi (n = 5). Før transplantationen, vaccinere HMSCs (celletæthed: 1 x 106 celler / ml i kælderen membran matrix) i den indre væg af hvert stillads og inkubere i 3 dage i bioreaktorsystemet. Den kirurgiske procedure er som følger.
- Fjern hals hår af modellen dyr og udføre standard drapering af det kirurgiske sted for aseptisk kirurgi.
BEMÆRK: Opret et stort barberingsområde anbefales at opretholde asceptisk kirurgi på dyret. - Efter et gennemsnitligt mediansnit i nakken skal remmusklerne adskilles og udsættes for luftrørsophagealstrukturen.
- Rent ud dissekere vagus nerven fra spiserøret, før resecting segmentet, ellers dyrets vejrtrækning er kompromitteret.
- Under forstørrelse, isolere venstre side af spiserøret fra luftrøret og omhyggeligt adskille den øverste del fra skjoldbruskkirtlen.
- Opret en 5 mm lang fuld circumferential defekt, der indeholder alle lag af spiserøret ved hjælp af kirurgisk saks.
BEMÆRK: Før esophageal transplantation skæres de forberedte stilladser med kirurgisk saks, så de passer til transplantationsstedets længde. - Under et mikroskop, udføre mikroanastomose i begge ender af den distale esophageal defekt ved hjælp af en 9-0 sutur tråd. Placer den første sutur mellem højre inferoposterior margen af den øvre spiserøret rest og stillads. Fortsæt suturering fra højre mod venstre mellem den øverste spiserøret rest og stilladset. Anastomose stilladset på samme måde som den øverste margen af den nedre spiserøret rest.
BEMÆRK: Udfør mikrovaskulær anastomose som anvendt til klinisk kirurgi til esophageal transplantation. Arbejd med et mikroskop for præcis, vandtæt suturering af implantatstedet. - Derefter lægge den omgivende skjoldbruskkirtlen flap over det transplanterede sted for at sikre stabil vedligeholdelse af og vaskulære forsyning til transplantater.
- Efter transplantation, sy den subkutane muskel og hudvæv med en 4-0 vicryl sutur.
- Hold alle eksperimentelle rotter individuelt i metaboliske bure.
6. Postoperative procedurer
BEMÆRK: Postoperative procedurer udføres efter både gastrostomi og esophageal transplantation.
- Efter lukning af mavesåret, sætte rotterne i individuelle metaboliske bure og placere bure på infrarød opvarmning enheder for at forhindre hypotermi.
- Overvåg dyrene, indtil de opnår og opretholder sternal recumbency (dvs. liggende oprejst på brystet).
- For at minimere inflammation på operationsstedet, administrere antibiotika gentamicin (20 mg/kg) dagligt til rotterne.
- Begynd oral væskefodring på den tredje postoperative dag indtil studiets slutpunkt. Levere hele ernæring formel (20,6 g/100 ml [g%] kulhydrat, 3,8 g% protein, 0,2 g% fedt) gennem heparin cap 3x per dag begynder dagen efter operationen.
- Kontroller dyrenes udseende og kropsvægt dagligt. Kontroller at styre adfærd, såsom selvskadende snit site eller modstand mod røret indtag, samt forskellige kirurgiske komplikationer. Når kropsvægten af rottemodellerne falder hurtigt med 20% eller mere, udføre dødshjælp ved CO2 indånding.
7. Histologi og immunhistokemi
BEMÆRK: Til histologisk analyse udvindes alle de euthaniserede dyrs esophagealvæv ved hjælp af kirurgisk saks. Hematoxylin og eosin farvning og Masson's trichrome farvning blev udført ved hjælp af standard histologiske teknikker. Immunhistokemi blev udført i henhold til følgende protokol.
- Fix hele spiserøret indeholder de transplanterede steder i 4% paraformaldehyd. Opret en paraffin blok og skær 4 μm tykke sektioner.
- Deparaffiniser vævssektionerne og dehydreredem i en ethanolserie. Vævsdiasene nedsænkes i citratbuffer, og varm i 10 minutter i mikrobølgeovnen. Cellerne afkøles med kold PBS i 20 min. Nedsænkes i 3% hydrogenperoxid i 6 min og vaskes med PBS i 10 min.
- Inkuberi i 3% kvæg serum albumin (BSA) for 1 time ved stuetemperatur for at blokere uspecifikke reaktioner af væv sektioner.
- Vask 3x med PBS i 5 min. Inkubator med primære antistoffer mod Desmin (fortyndet til 1:200), keratin 13 (fortyndet til 1:100), og von Willebrand Factor (vWF; fortyndet til 1:100) natten over ved 4 °C.
- Vask 3x med PBS i 15 min. Inkuber med det relevante sekundære antistof i en koncentration på 1:500 for Desmin og Keratin 13 ved stuetemperatur. Vask derefter diasene to gange med PBS i 10 min.
BEMÆRK: Vævssektioner for vWF blev inkuberet ved hjælp af et peberrodperoxidase-konjugeret kit (se Tabel over materialer)og derefter visualiseret ved hjælp af 3,3'-diaminobenzidin (DAB). - Monter ved hjælp af en glasdæksel og 4',6-diamidino-2-phenolindole (DAPI), der indeholder monteringsmedium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et skemadiagram over fremstillingsprocessen for PU-PCL tolags rørformede stilladser. PU-opløsningen var elektrospundet fra en 18 G-nål for at lave en cylindrisk indvendig struktur med en tykkelse på 200 μm. Derefter blev den smeltede PCL trykt på PU nanofiberens ydervæg med jævne mellemrum. Overfladen morfologi af de indre og ydre vægge af den færdige rørformede stillads kan ses i scanning elektron mikroskopi billeder.
Figur 2 viser processen med at indsætte et gastrostomirør i en rotte til ekstern næringsstofforsyning (figur 2A). Det T-formede silikonerør blev indsat i mavevæggen og sutureret (figur 2B). Røret blev derefter flyttet gennem den subkutane tunnel til bagsiden af halsen og forbundet med en heparin hætte (Figur 2C). Røret letter injektionen af flydende fødevarer. Det forbyder også den omvendte strøm af det gastriske indhold gennem rørene.
Figur 3 viser processen med cellepodning på stilladsets indre væg, bioreaktordyrkning og esophagealtransplantation. Den hMSC-indlejrede kældermembranmatrix blev jævnt anvendt på stilladsets indervæg via injektion (figur 3A). SEM-billedet viser morfologien for den cellevedlagte indre overflade. Levende / døde farvning til at analysere celle levedygtighed på to-lags rørformede stillads (luminal overflade) viste, at de fleste celler var levedygtige, og de spredes godt på nanofiber struktur i 5 dage. Stilladset, der blev vaccineret med cellerne, blev fastgjort til bioreaktoren, og forskydningsbelastningen blev anvendt af pumpen (figur 3B). De hMSC-seedede rørformede stilladser, herunder bioreaktordyrkning, blev transplanteret til rotter med fuld circumferential esophageal defekter via mikrosuture teknikker. Transplantatet var dækket med en skjoldbruskkirtel flap for stabil fiksering og vaskulær forsyning af det implanterede sted (Figur 3C). Rotternes vægtændring efter transplantationblev observeret indtil forsøgets afslutning. Esophageal transplanterede rotter forblev på 340 g indtil den 9. Som følge heraf døde de fleste dyr inden for 15 dage.
Figur 4 viser esophageal regenerering efter graft implantation. Selv om de fleste rotter udviklet neoesofageal obstruktion forårsaget af hårkugler, var der ingen grove tegn på perforering, anastomose lækage med fistel, serom akkumulering, byld dannelse, eller omgivende blødt væv nekrose i nogen eksperimentel rotte. Re-tilsætning af transplantationsstedet blev bekræftet ved immunfluorescens farvning for keratin 13. Morfologien af kollagen lag og elastin fibre blev klart bekræftet på regenerering site. Tilstedeværelsen af rigelige elastin og kollagen fibre kan bidrage til bedre mekaniske egenskaber. Regenerering af esophageal muskel lag blev udstillet af desmin immunhistokemi, og rigelige neovascularization blev observeret på dette websted.
Figur 1: Skematisk illustration af den proces, der anvendes til at fremstille 2-lags rørformede stilladser. Efter fremstilling af indermembranen ved elektrospindrejning ved hjælp af PU (A)blev rørstilladsets strukturelle styrke forstærket ved at tilføje tråde til membranens ydre overflade ved hjælp af et 3D-printsystem uden opløsningsmiddel (B). SEM-billedet viser morfologien af de indre og ydre lag af det 2-lagede rørstillads. (Forkortelser: PU = polyurethan). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Gastrostomi. (A) Et skema, der viser gastrostomiteknikker gennem t-rørindsættelse i mavevæggen. (B) Der laves et punkteringshul midt i formaven, og T-rørspidsen indsættes i formaven. C) Indløbsdelen af T-røret er placeret med heparinhætten midt på occiputet. Figuren nedenfor præsenterer et T-rør gastrostomi apparat med forskellige komponenter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Esophageal transplantation. (A) HCCS indkapslet i kælderen membran matrix blev seedet på de indre lag af to-lags rørformede stillads. SEM-billedet viser hMSC'ernes morfologi på indervæggen. Levedygtigheden af de vaccinerede celler blev også bekræftet af levende-døde farvning (grøn = levende celler). De hMSC-seedede stilladser blev straks inkuberet i et bioreaktorsystem (B), og derefter blev det vævsfremstillede spiserør implanteret i livmoderhalsens spiserøret (C). Det implanterede sted var dækket med en skjoldbruskkirtel flap for stabil esophageal rekonstruktion (pile). (D) Vægttab undersøgelser efter esophageal transplantation. Vægttab blev bestemt som absolut ændring fra oprindelige vægt af rotterne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Hele histologien af den rekonstruerede spiserøret 2 uger efter ortotopisk stilladsimplantation. Masson's trichrome farvning viser kollagen deposition omkring de implanterede steder. Regenerering af esophageal musklen og slimhindelagene blev bekræftet af henholdsvis desmin (grøn) og keratin 13 (rød) immunfarvning. Derudover blev neovaskularisering (pile) tydeligt observeret omkring det regenererede slimhindelag. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksisterende dyreforsøg på kunstig spiserøret er stadig begrænset af flere kritiske faktorer. Den ideelle kunstige esophageal stillads bør være biokompatibel og har fremragende fysiske egenskaber. Det bør være i stand til at regenerere slimhinden epitel i den tidlige postoperative periode for at forhindre anastomotisk lækage. Regenerering af de indre cirkulære og ydre muskellag i længderetningen er også vigtig for funktionel peristalsis12,13.
Spiserørets mekaniske egenskaber er afgørende, fordi spiserøret kollapser under åndedrættet og åbner under synsning, med konstant eksponering for maksimal stretching med et rekylfænomen14. Det implanterede stillads skal også have disse mekaniske egenskaber. Den implanterede spiserørs viskoelasticitet bør være tilstrækkelig til gentagen rampelempelse af peristaltisk bevægelse gennem spiserøret. Stilladser, der er for svage, kan briste eller lække og forårsage svære forhold (f.eks. mediastinitis) hos modtageren. I modsætning hertil kan et stillads, der er for stiv, bule ind i spiserøret lumen og forhindre mad passage. Elektrospundet nanofibre har meget gunstige fysiske egenskaber for esophageal rekonstruktion. ECM's topografiske natur giver et gunstigt miljø for migration og differentiering af epitelceller i esophageallag15. Det har også en nanopore struktur, der forhindrer lækage af spyt og forskellige patogener16. Men stilladser lavet af elektrospundet nanofibre har begrænset brug på grund af deres bløde mekaniske egenskaber. For at løse dette problem forbedrede vi deres mekaniske styrke ved hjælp af 3D-printteknologi. Den 3D trykte streng på det ydre lag af nanofiber har en bredde på 780 μm, og den indre pore struktur er ganske bred. Det giver fysisk støtte til esophageal interventioner i stedet for at vejlede regenerering af det omgivende væv.
I denne undersøgelse, circumferential esophageal defekter blev fuldt helbredt i bioreaktor dyrkede grafts i op til 2 uger, men alle eksperimentelle rotter døde inden for 15 dage efter operationen. De fleste dødsfald var forårsaget af peritonitis og fejlernæring forårsaget af mad og spyt lækager proksimale til anastomose site. Alle dyr frit forbruges en flydende kost i op til en uge, men som såret healing skred frem, utilsigtet mekanisk obstruktion fandt sted i den rekonstruerede spiserøret på grund af hårbold synke. Dette fænomen har vist sig at forårsage fuldstændig fordøjelsesforstyrrelse inden for de implanterede ikke-dynamiske stilladser. Der er flere muligheder for at overvinde disse tekniske problemer. For det første, udviklingen af en meget elastisk esophageal implantat, der kan efterligne esophageal peristalsis. For det andet, dyreforsøg ved hjælp af hårløse rotter for at forhindre hår synke. For det tredje kan galdestent påføres samtidigmed stilladset for at minimere implantatkollaps og anastomoseskader. Desuden er anvendelsen af mikrovaskulær anastomose til esophageal stillads implantation vigtigt helt at forhindre lækage af spyt. Den konventionelle sutur teknik ved hjælp af de nøgne øjne er yderst vanskeligt at gøre vandtæt i rotte modeller.
En pålidelig vaskulær køretøj er afgørende for næringsstoffer, vækstfaktorer, og iltforsyning i de tidlige stadier af regenerering. Skjoldbruskkirtlen er vaskulært væv placeret i nærheden af spiserøret. Vi brugte skjoldbruskkirtlen flap efter circumferential esophagectomi på grund af sin nemme tilgængelighed i rotte model. Afslutningsvis foreslår vi forskellige prækliniske teknikker til at overvinde vanskelighederne ved esophageal rekonstruktion i rotte modellen. Denne undersøgelse udgør et godt alternativ til at overvinde begrænsningerne ved konventionel lille spiserørtransplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bioreaktorsystemet, der er designet til denne undersøgelse, er blevet kommercialiseret (modelnummer: ACBF-100).
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af Korea Health Technology R & U Project gennem Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finansieret af Ministeriet for Sundhed & Velfærd, Republikken Korea (tilskudnummer: HI16C0362) og Basic Science Research Program gennem National Research Foundation of Korea (NRF) finansieret af Undervisningsministeriet (2017R1C1B2011132). De bioprøver og data, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev leveret af Biobank of Seoul National University Hospital, et medlem af Korea Biobank Network.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
| Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Power Supply | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
References
- Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
- Flanagan, J. C., et al. Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications. Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).
- Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review. Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942 (2017).
- Luc, G., et al. Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model. Biomaterials. 175, 1-18 (2018).
- Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).
- La Francesca, S., et al. Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells. Scientific Reports. 8 (1), 4123 (2018).
- Ponten, J. E., et al. Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication. Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).
- Catry, J., et al. Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs. Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).
- Lee, S. J., et al. Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).
- Kim, I. G., et al. Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction. Tissue Engineering Part A. , (2019).
- Wu, Y., et al. Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation. Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).
- Jensen, T., et al. Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model. Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).
- Nakase, Y., et al. Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).
- Kwiatek, M. A., et al. Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).
- Anjum, F., et al. Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure. Scientific Reports. 7 (1), 10291 (2017).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions. Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).
