Summary
Die Ösophagusrekonstruktion ist ein anspruchsvolles Verfahren, und die Entwicklung einer gewebekonstruierten Speiseröhre, die die Regeneration von Speiseröhrenschleimhaut und Muskel ermöglicht und die als künstliches Transplantat implantiert werden kann, ist notwendig. Hier stellen wir unser Protokoll zur Erzeugung einer künstlichen Speiseröhre vor, einschließlich Gerüstherstellung, Bioreaktoranbau und verschiedenen chirurgischen Techniken.
Abstract
Die Verwendung biokompatibler Materialien für die umlaufende Ösophaver Rekonstruktion ist eine technisch anspruchsvolle Aufgabe bei Ratten und erfordert eine optimale Implantattechnik mit Ernährungsunterstützung. In letzter Zeit gab es viele Versuche der Ösophakengewebe-Engineering, aber die Erfolgsrate wurde aufgrund von Schwierigkeiten bei der frühen Epithelisierung in der speziellen Umgebung der Peristaltik begrenzt. Hier haben wir eine künstliche Speiseröhre entwickelt, die die Regeneration der Speiseröhrenschleimhaut und der Muskelschichten durch ein zweilagiges Röhrengerüst, ein mesenchymales Stammzell-basiertes Bioreaktorsystem und eine Bypass-Fütterungstechnik mit modifizierter Gastrostomie. Das Gerüst besteht aus Polyurethan (PU) Nanofasern in zylindrischer Form mit einem dreidimensionalen (3D) bedruckten Polycaprolactonstrang, der um die Außenwand gewickelt ist. Vor der Transplantation wurden vom Menschen abgeleitete mesenchymale Stammzellen in das Lumen des Gerüsts eingesät und Bioreaktorkultivierung durchgeführt, um die zelluläre Reaktivität zu verbessern. Wir verbesserten die Transplantat-Überlebensrate, indem wir eine chirurgische Anastomose aufwendeten und die implantierte Prothese mit einer Schilddrüsenklappe bedeckten, gefolgt von einer vorübergehenden nichtoralen Gastrostomiefütterung. Diese Transplantate konnten die Ergebnisse der anfänglichen Epithelisierung und Muskelregeneration rund um die implantierten Stellen rekapitulieren, wie eine histologische Analyse zeigt. Darüber hinaus wurden erhöhte Elastinfasern und Neovaskularisation in der Peripherie des Transplantats beobachtet. Daher stellt dieses Modell eine mögliche neue Technik für die umlaufende Ösophaarterienrekonstruktion dar.
Introduction
Die Behandlung von Ösophaguserkrankungen, wie angeborene Fehlbildungen und Ösophaguskarzinome, kann zu einem strukturellen Segmentverlust der Speiseröhre führen. In den meisten Fällen wurden autologe Ersatztransplantate, wie Zinnen-Pull-up-Leitungen oder Dickdarm-Interpositionen,1,2durchgeführt. Diese Ösophagenerationsersatze haben jedoch eine Vielzahl von chirurgischen Komplikationen und Reoperationsrisiken3. So kann die Verwendung von gewebetechnischen Speiseröhrengerüsten, die die einheimische Speiseröhre imitieren, eine vielversprechende Alternativstrategie zur letztendlichen Regeneration verlorener Gewebe4,5,6sein.
Obwohl eine gewebegefertigte Speiseröhre potenziell eine Alternative zu den aktuellen Behandlungen von Speiseröhrendefekten bietet, gibt es erhebliche Hindernisse für ihre In-vivo-Anwendung. Postoperative anastomotische Leckage und Nekrose des implantierten Speiseröhrengerüsts führen unweigerlich zu einer tödlichen Infektion des umgebenden aseptischen Raumes, wie dem Mediastinum7. Daher ist es äußerst wichtig, eine Kontamination von Lebensmitteln oder Speichel in der Wunde und der nasogastrischen Röhre zu verhindern. Gastrostomie oder intravenöse Ernährung sollte in Betracht gezogen werden, bis die primäre Wundheilung abgeschlossen ist. Bis heute wurde in großen Tiermodellen ösophageale Gewebetechnik durchgeführt, da große Tiere nur durch intravenöse Hyperalimentation für 2-4 Wochen nach der Implantation des Gerüstes8gefüttert werden können. Ein solches nicht-orales Fütterungsmodell wurde jedoch nach einer Ösophadentransplantation bei Kleintieren nicht für ein frühes Überleben etabliert. Das liegt daran, dass die Tiere extrem aktiv und unkontrollierbar waren, so dass sie das Futterrohr über einen längeren Zeitraum nicht im Magen halten konnten. Aus diesem Grund gab es nur wenige Fälle erfolgreicher Ösophaverderntransplantationen bei Kleintieren.
Unter den Gegebenheiten der Speiseröhrengewebetechnik haben wir ein zweilagiges Röhrengerüst aus elektrogesponnenen Nanofasern (Innenschicht; Abbildung 1A) und ein 3D-gedruckter Strang (äußere Schicht; Abbildung 1B) einschließlich einer modifizierten Gastrostomietechnik. Die interne Nanofaser besteht aus PU, einem nicht abbaubaren Polymer, und verhindert das Austreten von Lebensmitteln und Speichel. Die externen 3D-gedruckten Stränge bestehen aus biologisch abbaubarem Polycaprolacton (PCL), das mechanische Flexibilität bieten und sich an die peristaltische Bewegung anpassen kann. Menschliche, aus Fett gewonnene mesenchymale Stammzellen (hAD-MSCs) wurden auf der inneren Schicht des Gerüstes gesät, um die Reepithelisierung zu fördern. Die Nanofaserstruktur kann die anfängliche Schleimhautregeneration erleichtern, indem sie eine strukturelle extrazelluläre Matrixumgebung (ECM) für die Zellmigration bereitstellt.
Wir haben auch die Überlebensrate und Bioaktivität der geimpften Zellen durch Bioreaktorkultivierung erhöht. Das implantierte Gerüst wurde mit einer Schilddrüsenklappe abgedeckt, um eine stabilere Regeneration der Speiseröhrenschleimhaut und Muskelschicht zu ermöglichen. In diesem Bericht beschreiben wir Protokolle für ösophageale Gewebe-Engineering-Techniken, einschließlich Gerüstherstellung, mesenchymale Stammzell-basierte Bioreaktor-Anbau, eine Bypass-Fütterungstechnik mit modifizierter Gastrostomie und eine modifizierte chirurgische Anastomose-Technik zur umlaufenden Ösophatole Rekonstruktion in einem Rattenmodell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC No. 17-0164-S1A0) des Seoul National University Hospital genehmigt.
1. Gerüstherstellung
HINWEIS: Zweischichtige Speiseröhrengerüste werden durch die Kombination von Elektrospinnen und 3D-Druck hergestellt. Die Innenmembran des Rohrgerüstes wurde aus elektrospinnendem Polyurethan (PU) mit rotierenden Edelstahl-Mandrels als Kollektoren9hergestellt.
- Zur Herstellung von röhrenförmigen PU-Nanofasern eine 20%ige (w/v) Lösung von PU-Polymer unter Rühren in N,N-Dimethylformamid (DMF) für 8 h bei Raumtemperatur vorbereiten.
- Legen Sie die PU-Lösung mit einer stumpfen Metallnadel (22 G) und Elektrospin auf rotierende Edelstahldornen (Durchmesser = 2 mm) in einem Abstand von 30 cm zwischen der Nadelspitze und dem rotierenden Kollektor auf.
HINWEIS: Das Netzteil ist auf einen Hochspannungs-Gleichstrom von 15 kV Potential eingestellt. Die Zuführrate der Lösung wird mit einer Spritzenpumpe auf 0,5 ml/h festgelegt. - Machen Sie eine röhrenförmige Nanofaserschicht auf der Oberfläche des Dorns, der sich bei 3,14 m/s dreht.
- Trocknen Sie die PU-Nanofaser in einem Vakuumofen bei 40 °C über Nacht, um Restlösungsmittel vollständig zu entfernen.
HINWEIS: Die 3D-gedruckte Außenwand des Speiseröhrengerüsts wird mit einem Rapid Prototyping System hergestellt. Die 3D-Druckanlage besteht aus Einem Spender, einer Düse, einem Kompressions-/Wärmeregler, einer 3-Achsen-Umwandlungsstufe und einem Softwaresystem. - PCL-Pellets werden bei 100 °C in einem Heizzylinder gelöst und dann unter der Kontrolle eines Bioplottingsystems unter Hochdruck (7 bar) auf die Oberfläche der Nanofasern gedruckt. Die Düsengröße beträgt 300 m und der Strangabstand 700 m.
- Nach dem Entfernen des zweilagigen Gerüstes aus dem Dorn, sterilisieren, indem Sie 70% Ethanol unter ultraviolettem Licht einweichen.
HINWEIS: In früheren Studien wurden detailliertere Merkmale des Gerüstes berichtet10.
2. Zellsaatierung auf dem Grafts- und Bioreaktor-Anbau
HINWEIS: Menschliche mesenchymale Stammzellen (hMSCs), die von einem Unternehmen erworben wurden, wurden ohne Modifikation verwendet.
- Vor der Zelltransplantation das 3D-gedruckte Speiseröhrengerüst für 1 h unter ultraviolettem Licht sterilisieren, 10 min mit Ethanol befeuchten und 3x mit phosphatgepufferter Saline (PBS) waschen.
- Kultur und Erweiterung der hMSCs im Wachstumsmedium (Basalmedium/Wachstumszuschlag). Zweilagige Röhrengerüste wurden in nicht haftende 24 Brunnengewebekulturplatten übertragen.
- Um die Zellen an der Innenfläche des Gerüstes zu befestigen, fügen Sie die hMSC-Suspension mit einer Dichte von 1 x 106 Zellen/ml in der Kellermembranmatrix, die das Wachstumsmedium enthält, vorsichtig hinzu.
- Gleichmäßig die Kellermembranmatrixaufhängung auf der Innenfläche des zweilagigen Rohrgerüsts ablagern.
- Fixieren Sie das hMSC-saatierte Rohrgerüst mit einem pulsatilen Durchfluss-Bioreaktorsystem fest am Acrylhalter in der Kulturkammer des Bioreaktors.
HINWEIS: Das kundenspezifische Bioreaktorsystem besteht aus einer Pumpe, einer Blasenfalle, einer Durchflusskammer, einem Manometer, einem steuerbaren Ventil und einem mittleren Reservoir. Bei der Anwendung von Scherspannung in der Kulturkammer, erlauben Sie eine Ruhezeit von 1-2 min11. - Fügen Sie wachstumsmittel in die Kulturkammer ein und wenden Sie 0,1 Dyne/cm2 strömungsinduzierte Scherspannung unter einer befeuchteten Atmosphäre an, die 5%CO2 10enthält.
HINWEIS: Der Wert der strömungsinduzierten Scherspannung wurde berechnet, indem die Peristaltik des Speiseröhrengewebes aus früheren Studien simuliert wurde10. - Bestimmen Sie die Zellreaktionen auf den Innenflächen der zweilagigen Röhrengerüste ohne Bioreaktorkultivierung nach 5 Tagen mit einem LIVE/DEAD Viability Assay Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers. Erhalten Sie Bilder über konfokale Mikroskopie mit dem Z-Stack-Tool.
- Beobachten Sie am dritten Tag die Oberflächenmorphologie des hMSC-samen Röhrengerüsts durch ein Rasterelektronenmikroskop (SEM).
- Fixieren Sie das Gerüst, das mit hMSC mit 2,5% Glutaraldehyd und OsO4 für 24 h inkubiert wurde, und dehydrieren Sie mit Ethanol.
- Beschichten Sie die festen hMSCs mit Platin mit einem Sputterlackturm unter Argonatmosphärischen Bedingungen und erhalten Sie SEM-Bilder bei einer Beschleunigungsspannung von 25 kV.
3. Chirurgische Vorbereitung für Tierchirurgie
HINWEIS: Chirurgische Präparate werden sowohl vor der Gastrostomie als auch vor der Ösophade anwendung.
- Richten Sie die sterilen chirurgischen Instrumente ein: Skalpellklinge, Weitlaner Retraktor, Mikronadelhalter, Mikronahtzange, Mikrogewebezange, Mikroschere, Mayo-Hegar Nadelhalter, Operationsschere, Irisschere, Verbandszange, Gewebezange, Splitterzangen, Iriszange, 5 ml Spritze (21 G Nadel), 10 ml Spritze (22 G Nadel), 9-0 Polyamid-Nähte, 4-0 Polyglactin-Nähte.
- Anästhesisieren Sie das Tier mit einer intramuskulären Injektion von Tiletamin/Zolazepam (50 mg/g Dosis) und 2% Xylazinhydrochlorid (2 mg/kg Dosis).
HINWEIS: Erwachsene Sprague-Dawley (SD) Ratten mit einem Gewicht von 398-420 g wurden für die ÖsophaleTransplantation verwendet. - Vor der Übertragung auf den chirurgischen Vorhang, überprüfen Sie den entsprechenden Anästhesiezustand des Tieres, indem Sie den Schwanz mit der Zange kneifen.
- Legen Sie das Tier in eine supine Position auf dem sterilen Drap und verwenden Sie Clippers, um das Haar vom Hals (für Ösophadale Transplantation) oder Bauch (für Gastrostomie) zu entfernen. Dann schrubben Sie die chirurgische Stelle mit Betadin und 70% Ethanol.
- Vor dem Schnitt, subkutan injizieren ein Schmerzmittel wie Buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg) zur Schmerzlinderung.
4. Gastrostomie-Chirurgie mit einem T-Rohr in Ratten
HINWEIS: Bei allen Versuchstieren wurde eine modifizierte Gastrostomie durchgeführt, um eine vorübergehende Bypass-Nonoral-Rohrfütterung zu ermöglichen (n = 5).
- Lassen Sie Ratten am Tag vor der Operation fasten. Bereiten Sie die Operation wie in Abschnitt 3 vor.
- Setzen Sie den Magen durch einen Mittellinienschnitt der Haut und der Bauchmuskeln der anästhesierten Ratten aus.
- Erstellen Sie eine 3 mm Öffnung in der vorderen Magenwand mit einem Skalpellblatt.
- Setzen Sie die Spitze des Silikon-T-Rohrs in die Defektstelle ein, um sie an der Magenwand zu befestigen.
- Naht richtig, damit sich das T-Rohr nicht von der Magenwand löst.
- Nehmen Sie das distale Ende des implantierten T-Rohrs durch den subkutanen Tunnel in den Nacken.
- Legen Sie die Heparinkappe am Ende des T-Rohrs ein, um zu verhindern, dass der Mageninhalt nach hinten fließt.
HINWEIS: Verwenden Sie einen Angiokatheter, um das Ende des T-Rohrs mit der Heparinkappe zu verbinden. - Naht alle Schichten der Bauchwand und Haut mit 4-0 Polyglactin Nähte.
- Halten Sie alle experimentellen Ratten getrennt in einem metabolischen Käfig, nachdem die Gastrostomie abgeschlossen ist.
5. Ösophaale Transplantation
HINWEIS: Die Ösophavertransplantation des zweilagigen Röhrengerüsts wird 1 Woche nach der Gastrostomie (n = 5) durchgeführt. Vor der Transplantation impfen hMSCs (Zelldichte: 1 x 106 Zellen/ml in der Kellermembranmatrix) in die Innenwand jedes Gerüstes und brüten für 3 Tage im Bioreaktorsystem. Der chirurgische Eingriff ist wie folgt.
- Entfernen Sie die Halshaare der Modelltiere und führen Sie Standard-Drapieren der chirurgischen Stelle für aseptische Chirurgie.
HINWEIS: Erstellen Sie eine große Rasierfläche wird empfohlen, um asceptic Chirurgie auf dem Tier zu halten. - Nach dem vorderen Medianschnitt des Halses die Gurtmuskeln trennen und die tracheoösophageale Struktur freilegen.
- Sezieren Sie den Vagusnerv vor der Resektierung des Segments unverblümt von der Speiseröhre, sonst wird die Atmung des Tieres beeinträchtigt.
- Unter Vergrößerung die linke Seite der Speiseröhre von der Luftröhre isolieren und den oberen Teil vorsichtig von der Schilddrüse trennen.
- Erstellen Sie einen 5 mm langen vollständigen Umfangsdefekt, der alle Schichten der Speiseröhre mit einer chirurgischen Schere enthält.
HINWEIS: Schneiden Sie vor der Ösophadetransplantation die vorbereiteten Gerüste mit einer chirurgischen Schere, um die Länge der Transplantationsstelle zu entsprechen. - Führen Sie unter dem Mikroskop mikroanastomosis an beiden Enden des distalen Ösophaaldefekts mit einem 9-0-Nähteinstich aus. Legen Sie die erste Naht zwischen dem rechten inferoposterior Rand der oberen Speiseröhre Rest und Gerüst. Weiter von rechts nach links zwischen dem oberen Speiseröhrenrest und dem Gerüst. Anastomose das Gerüst in der gleichen Weise wie der obere Rand der unteren Speiseröhre Rest.
HINWEIS: Führen Sie mikrovaskuläre Anastomose, wie sie in der klinischen Chirurgie für ösophaale Transplantation verwendet wird. Arbeiten Sie mit einem Mikroskop für eine präzise, wasserdichte Naht der Implantatstelle. - Legen Sie anschließend die umgebende Schilddrüsenklappe über die transplantierte Stelle, um eine stabile Aufrechterhaltung und Gefäßversorgung der Transplantate zu gewährleisten.
- Nach der Transplantation den subkutanen Muskel und das Hautgewebe mit einer 4-0-Vicryl-Naht nähen.
- Halten Sie alle experimentellen Ratten einzeln in metabolischen Käfigen.
6. Postoperative Verfahren
HINWEIS: Postoperative Eingriffe werden sowohl nach Gastrostomie als auch nach Ösophadertransplantation durchgeführt.
- Nach Dem Schließen der Bauchwunde, legen Sie die Ratten in einzelne Stoffwechselkäfige und legen Sie die Käfige auf Infrarot-Wärmevorrichtungen, um Unterkühlung zu verhindern.
- Überwachen Sie die Tiere, bis sie die Brustruhe erreichen und aufrechterhalten (d. h. aufrecht auf der Brust liegend).
- Um Entzündungen an der chirurgischen Stelle zu minimieren, verabreichen Sie das Antibiotikum Gentamicin (20 mg/kg) täglich an die Ratten.
- Beginnen Sie mit der oralen Flüssigkeitsfütterung am dritten postoperativen Tag bis zum Endpunkt der Studie. Geben Sie die gesamte Nährwertnahrung (20,6 g/100 ml [g%] Kohlenhydrate, 3,8 g% Protein, 0,2 g% Fett) durch die Heparinkappe 3x pro Tag ab dem Tag nach der Operation.
- Überprüfen Sie das Aussehen und das Körpergewicht der Tiere täglich. Überprüfen Sie, um das Verhalten zu verwalten, wie selbstschädigende Schnittstelle oder Widerstand gegen die Rohraufnahme, sowie verschiedene chirurgische Komplikationen. Wenn das Körpergewicht der Rattenmodelle schnell um 20% oder mehr abnimmt, führen Sie Dieeuthanasie durch CO2-Inhalation durch.
7. Histologie und Immunhistochemie
HINWEIS: Für die histologische Analyse wird das gesamte Speiseröhrengewebe der eingeschläferten Tiere mit einer chirurgischen Schere extrahiert. Hämatoxylin- und Eosinfärbung und Massons trichrome Färbung wurden mit standard histologischen Techniken durchgeführt. Die Immunhistochemie wurde nach folgendem Protokoll durchgeführt.
- Fixieren Sie die gesamte Speiseröhre, die die transplantierten Stellen enthält, in 4% Paraformaldehyd. Erstellen Sie einen Paraffinblock und schneiden Sie 4 m dicke Abschnitte.
- Entparaffinisieren Sie die Gewebeabschnitte und dehydrieren Sie sie in einer Ethanolserie. Tauchen Sie das Gewebe gleitet in Citratpuffer und Wärme für 10 min in der Mikrowelle. Kühlen Sie die Zellen mit kalten PBS für 20 min. Tauchen Sie in 3% Wasserstoffperoxid für 6 min, und waschen Sie mit PBS für 10 min.
- Inkubieren Sie in 3% Rinderserumalbumin (BSA) für 1 h bei Raumtemperatur, um unspezifische Reaktionen von Gewebeabschnitten zu blockieren.
- 3x mit PBS 5 min waschen. Mit primären Antikörpern gegen Desmin (verdünnt auf 1:200), Keratin 13 (verdünnt auf 1:100) und von Willebrand Factor (vWF; verdünnt auf 1:100) über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- 3x mit PBS 15 min waschen. Mit dem entsprechenden Sekundärantikörper in einer Konzentration von 1:500 für Desmin und Keratin 13 bei Raumtemperatur inkubieren. Dann waschen Sie die Dias zweimal mit PBS für 10 min.
HINWEIS: Gewebeabschnitte für vWF wurden mit einem peroxidasehiven Set aus Meerrettich inkubiert (siehe Materialtabelle) und dann mit 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) visualisiert. - Montieren Sie mit einem Glasdeckel und 4',6-Diamidino-2-Phenolindole (DAPI) mit Montagemedium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Abbildung 1 zeigt ein schematisches Diagramm des Herstellungsprozesses des zweilagigen Pu-PCL-Rohrgerüsts. Die PU-Lösung wurde aus einer 18 G-Nadel elektrogesponnen, um eine zylindrische Innenstruktur mit einer Dicke von 200 m herzustellen. Anschließend wurde die geschmolzene PCL in regelmäßigen Abständen auf die Außenwand der PU-Nanofaser gedruckt. Die Oberflächenmorphologie der Innen- und Außenwände des fertigen Röhrengerüsts ist in den Rasterelektronenmikroskopiebildern zu sehen.
Abbildung 2 zeigt den Prozess des Einsetzens eines Gastrostomierohrs in eine Ratte zur externen Nährstoffversorgung (Abbildung 2A). Das T-förmige Silikonrohr wurde in die Magenwand eingeführt und vernässt (Abbildung 2B). Die Röhre wurde dann durch den subkutanen Tunnel bis zur Rückseite des Halses bewegt und mit einer Heparinkappe verbunden (Abbildung 2C). Die Röhre erleichtert die Injektion von flüssiger Nahrung. Es verbietet auch den umgekehrten Fluss des Mageninhalts durch die Rohre.
Abbildung 3 zeigt den Prozess der Zellimpfung an der Innenwand des Gerüsts, die Kultivierung von Bioreaktoren und die Ösophadaletransplantation. Die hMSC-eingebettete Kellermembranmatrix wurde durch Injektion gleichmäßig auf die Innenwand des Gerüstes aufgebracht (Abbildung 3A). Das SEM-Bild zeigt die Morphologie der zellgebundenen innenfläche. Lebende/tote Färbungen zur Analyse der Zelllebensfähigkeit auf dem zweilagigen Röhrengerüst (Luminaloberfläche) deuteten darauf hin, dass die meisten Zellen lebensfähig waren und sich innerhalb von 5 Tagen gut auf der Nanofaserstruktur ausbreiteten. Das mit den Zellen geimpfte Gerüst wurde am Bioreaktor befestigt und die Scherspannung von der Pumpe aufgebracht (Abbildung 3B). Die hMSC-samenrohrgerüste, einschließlich des Bioreaktoranbaus, wurden mittels Mikrosostauten in Ratten mit vollen umlaufenden Speiseröhrendefekten transplantiert. Das Transplantat wurde mit einer Schilddrüsenklappe für eine stabile Fixierung und Gefäßversorgung der implantierten Stelle bedeckt (Abbildung 3C). Die Gewichtsänderung der Ratten nach der Transplantation wurde bis zum Ende des Experiments beobachtet. Ösophade transplantierte Ratten blieben bis zum 9. Tag bei 340 g, nahmen dann aber aufgrund verschiedener Ursachen rapide an Gewicht ab (Abbildung 3D). Infolgedessen starben die meisten Tiere innerhalb von 15 Tagen.
Abbildung 4 zeigt die Ösophagenerationsregeneration nach der Transplantatplantation. Obwohl die meisten Ratten neoösophageale Obstruktion durch Haarbälle entwickelten, gab es keine groben Beweise für Perforation, Anastomose-Leckage mit Fistel, Serom-Akkumulation, Abszessbildung oder umgebende Weichgewebenekrose bei jeder experimentellen Ratte. Die Reepithelisierung der Transplantationsstelle wurde durch Immunfluoreszenzfärbung für Keratin 13 bestätigt. Die Morphologie der Kollagenschicht und der Elastinfasern wurde an der Regenerationsstelle eindeutig bestätigt. Das Vorhandensein von reichlich Elastin und Kollagenfasern kann zu besseren mechanischen Eigenschaften beitragen. Die Regeneration der Ösophagenerationsmuskelschicht wurde durch Desmin-Immunhistochemie gezeigt, und an dieser Stelle wurde eine reichliche Neovaskularisation beobachtet.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Prozesses zur Herstellung von zweilagigen Rohrgerüsten. Nach der Herstellung der Inneren Membran durch Elektrospinnen mit PU (A) wurde die Strukturelle Festigkeit des Rohrgerüsts durch Zugabe von Strängen an der Außenfläche der Membran mittels eines 3D-Drucksystems ohne Lösungsmittel (B) verstärkt. Das SEM-Bild zeigt die Morphologie der inneren und äußeren Schichten des zweilagigen Röhrengerüsts. (Abkürzungen: PU = Polyurethan). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Gastrostomie. (A) Ein schematisches Diagramm, das Gastrostomietechniken durch T-Rohreinfügung in die Magenwand zeigt. (B) In der Mitte des Vordermagens wird ein Einstichloch gemacht und die T-Rohrspitze in den Vordermagen eingeführt. (C) Der Einlassteil des T-Rohrs befindet sich mit der Heparinkappe in der Mitte des Okziputs. Die folgende Abbildung zeigt ein T-Rohr-Gastrostomiegerät mit verschiedenen Komponenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Ösophaale Transplantation. (A) Die in der Kellermembranmatrix eingekapselten hMSCs wurden auf die inneren Schichten des zweilagigen Rohrgerüsts gesät. Das SEM-Bild zeigt die Morphologie der hMSCs an der Innenwand. Die Lebensfähigkeit der geimpften Zellen wurde auch durch lebend tote Färbung (grün = lebende Zellen) bestätigt. Die hMSC-Samengerüste wurden sofort in einem Bioreaktorsystem (B) inkubiert und dann die gewebegefertigte Speiseröhre in die zervikale Speiseröhre implantiert (C). Die implantierte Stelle wurde mit einer Schilddrüsenklappe für eine stabile Ösophale Rekonstruktion (Pfeile) bedeckt. (D) Gewichtsverluststudien nach Ösophadentransplantation. Der Gewichtsverlust wurde als absolute Veränderung gegenüber dem ursprünglichen Gewicht der Ratten bestimmt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Gesamte Histologie der rekonstruierten Speiseröhre 2 Wochen nach orthotopischer Gerüstimplantation. Massons trichrome Färbung zeigt die Kollagenablagerung um die implantierten Stellen. Die Regeneration der Speiseröhrenmuskel- und Schleimschichten wurde durch Desmin (grün) bzw. Keratin 13 (rot) bestätigt. Zusätzlich wurde eine Neovaskularisation (Pfeile) um die regenerierte Schleimhautschicht deutlich beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bestehende Tierstudien über künstliche Speiseröhren sind nach wie vor durch mehrere kritische Faktoren begrenzt. Das ideale künstliche Speiseröhrengerüst sollte biokompatibel sein und hervorragende physikalische Eigenschaften aufweisen. Es sollte in der Lage sein, das Schleimhautepithel in der frühen postoperativen Periode zu regenerieren, um anastomotische Leckagen zu verhindern. Die Regeneration der inneren kreisförmigen und äußeren Längsmuskelschichten ist auch wichtig für die funktionelle Peristaltik12,13.
Die mechanischen Eigenschaften der Speiseröhre sind wesentlich, da die Speiseröhre während der Atmung zusammenbricht und sich während des Schluckens öffnet, mit konstanter Exposition gegenüber maximaler Dehnung mit einem Rückstoßphänomen14. Das implantierte Gerüst muss auch diese mechanischen Eigenschaften aufweisen. Die Viskoelastizität der implantierten Speiseröhre sollte für eine sich wiederholende Rampenentspannung der peristaltischen Bewegung durch die Speiseröhre ausreichen. Zu schwache Gerüste können brechen oder auslaufen und schwere Zustände (z. B. Mediastinitis) beim Empfänger verursachen. Im Gegensatz dazu könnte ein zu steifes Gerüst in das Speiseröhrenlumen wölben und den Durchgang von Lebensmitteln verhindern. Elektrogesponnene Nanofasern haben sehr günstige physikalische Eigenschaften für die Ösophakenrekonstruktion. Die topographische Natur des ECM bietet ein günstiges Umfeld für die Migration und Differenzierung von Epithelzellen in Ösophaalschichten15. Es hat auch eine Nanoporenstruktur, die das Austreten von Speichel und verschiedenen Krankheitserregern verhindert16. Gerüste aus elektrogesponnenen Nanofasern sind jedoch aufgrund ihrer weichen mechanischen Eigenschaften nur eingeschränkt einstraf. Um dieses Problem zu lösen, haben wir ihre mechanische Festigkeit mit 3D-Drucktechnologie verbessert. Der 3D-gedruckte Strang auf der äußeren Schicht der Nanofaser hat eine Breite von 780 m, und die innere Porenstruktur ist recht breit. Es bietet körperliche Unterstützung für ösophaale Interventionen, anstatt die Regeneration des umgebenden Gewebes zu leiten.
In dieser Studie wurden umlaufende Ösophaaldefekte in den bioreaktorkultivierten Transplantaten für bis zu 2 Wochen vollständig geheilt, aber alle experimentellen Ratten starben innerhalb von 15 Tagen nach der Operation. Die meisten Todesfälle wurden durch Peritonitis und Unterernährung verursacht durch Nahrung und Speichel Lecks proximal an der Anastomose-Stelle. Alle Tiere konsumierten eine flüssige Ernährung für bis zu einer Woche, aber mit fortschreitender Wundheilung kam es in der rekonstruierten Speiseröhre aufgrund von Haarballschlucken zu unbeabsichtigten mechanischen Hindernissen. Es hat sich gezeigt, dass dieses Phänomen eine vollständige Verdauungsstörung innerhalb der implantierten nicht-dynamischen Gerüste verursacht. Es gibt mehrere Möglichkeiten, diese technischen Probleme zu überwinden. Erstens, die Entwicklung eines hochelastischen Speiseröhrenimplantats, das die Ösophatale Peristalse imitieren kann. Zweitens, Tierstudien mit haarlosen Ratten, um Haarschlucken zu verhindern. Drittens kann der Gallenstents gleichzeitig mit dem Gerüst aufgetragen werden, um Denkollaps und Anastomoseschäden zu minimieren. Darüber hinaus ist die Anwendung der mikrovaskulären Anastomose auf die Implantation von Ösophatagengerüsten wichtig, um das Austreten von Speichel vollständig zu verhindern. Die herkömmliche Nahttechnik mit den nackten Augen ist extrem schwierig, wasserdicht in Rattenmodellen zu machen.
Ein zuverlässiges Gefäßfahrzeug ist für Nährstoffe, Wachstumsfaktoren und Sauerstoffversorgung in den frühen Stadien der Regeneration unerlässlich. Die Schilddrüse ist Gefäßgewebe in der Nähe der Speiseröhre. Wir verwendeten die Schilddrüsenklappe nach der umlaufenden Ösophaktomie wegen ihrer einfachen Zugänglichkeit im Rattenmodell. Abschließend schlagen wir verschiedene präklinische Techniken vor, um die Schwierigkeiten der Ösophagenerationsrekonstruktion im Rattenmodell zu überwinden. Diese Studie bietet eine gute Alternative, um die Grenzen der konventionellen Transplantation der kleinen Speiseröhre zu überwinden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Das für diese Studie entwickelte Bioreaktorsystem wurde kommerzialisiert (Modellnummer: ACBF-100).
Acknowledgments
Diese Forschung wurde vom Korea Health Technology R&D Project durch das Korea Health Industry Development Institute (KHIDI) unterstützt, das vom Ministerium für Gesundheit und Wohlfahrt, Republik Korea (Grant-Nummer: HI16C0362) und Basic Science Research finanziert wurde. Programm durch die National Research Foundation of Korea (NRF), finanziert vom Bildungsministerium (2017R1C1B2011132). Die in dieser Studie verwendeten Biospecimen und Daten wurden von der Biobank des Seoul National University Hospital, einem Mitglied des Korea Biobank Network, zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Metabolic cage | TEUNGDO BIO & PLANT | JD-C-66 | |
| Zoletil (50 mg/g dose) | Virbac | 1000000188 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 2% xylazine hydrochloride (Rumpun) | Byely | Q-0615-035 | |
| 4% paraformaldehyde | BIOSOLUTION | BP031 | |
| 4-0 Vicryl | ETHICON | W9443 | |
| 9-0 Vicryl | ETHICON | W2813 | |
| Antibiotic gentamicin (Septopal). | Septopal | 0409-1207-03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 5470 | |
| Citrate Buffer, ph6.0, 10X | Sigma | C9999 | |
| DAB PEROXIDASE SUBSTRATE KIT | VECTOR | SK4100 | |
| Desmin | Santa Cruz | sc-23879 | |
| Elastic stain kit | ScyTeK | ETS-1 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ethanol | Merck | 64-17-5 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Gibco | 16000-044 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 354400 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11001 | |
| Heparin cap | Hyupsung Medical | HS-T-05 | |
| hMSC (STEMPRO) / growth medium (MesenPRO RSTM) |
Invitrogen | R7788-110 | |
| Horseradish peroxidase-conjugated kit (Vectastain) | VECTOR | PK7800 | |
| Hydrogen peroxide | JUNSEI | 7722-84-1 | |
| Keratin13 | Novus | NBP1-97797 | |
| LIVE/DEAD Viability Assay Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| Matrigel | Corning | 354262 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma | 227056 | |
| Nonadherent 24-well tissue culture plates. |
Corning | 3738 | |
| OsO4 | Sigma | O5500 | |
| Petri dish | Eppendorf | 3072115 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-023 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), 10X | BIOSOLUTION | BP007a | |
| Polycaprolactone (PCL) polymer | Sigma | 440744 | |
| Polyurethane (PU+A2:A24) polymer | Lubrizol | 2363-80AE | |
| Power Supply | NanoNC | HV100 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36931 | |
| Rumpun | Bayer | Q-0615-035 | |
| Silicone T-tube | Sewoon Medical | 2206-005 | |
| Terramycin Eye Ointment | Pfizer Pharmaceutical Korea | W01890011 | |
| Tiletamine/Zolazepam (Zoletil) | Virbac Laboratories | Q-0042-058 | |
| Trichrome stain kit | ScyTeK | TRM-1 | |
| von Willebrand Factor (vWF) | Santa Cruz | sc 14014 |
References
- Irino, T., et al. Long-term functional outcomes after replacement of the esophagus with gastric, colonic, or jejunal conduits: a systematic literature review. Diseases of the Esophagus. 30 (12), 1-11 (2017).
- Flanagan, J. C., et al. Esophagectomy and Gastric Pull-through Procedures: Surgical Techniques, Imaging Features, and Potential Complications. Radiographics. 36 (1), 107-121 (2016).
- Liu, J., Yang, Y., Zheng, C., Dong, R., Zheng, S. Surgical outcomes of different approaches to esophageal replacement in long-gap esophageal atresia: A systematic review. Medicine. (Baltimore). 96 (21), e6942 (2017).
- Luc, G., et al. Decellularized and matured esophageal scaffold for circumferential esophagus replacement: Proof of concept in a pig model. Biomaterials. 175, 1-18 (2018).
- Wang, F., Maeda, Y., Zachar, V., Ansari, T., Emmersen, J. Regeneration of the oesophageal muscle layer from oesophagus acellular matrix scaffold using adipose-derived stem cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 271-277 (2018).
- La Francesca, S., et al. Long-term regeneration and remodeling of the pig esophagus after circumferential resection using a retrievable synthetic scaffold carrying autologous cells. Scientific Reports. 8 (1), 4123 (2018).
- Ponten, J. E., et al. Early severe mediastinal bleeding after esophagectomy: a potentially lethal complication. Journal of Thoracic Disease. 5 (2), E58-E60 (2013).
- Catry, J., et al. Circumferential Esophageal Replacement by a Tissue-engineered Substitute Using Mesenchymal Stem Cells: An Experimental Study in Mini Pigs. Cell Transplant. 26 (12), 1831-1839 (2017).
- Lee, S. J., et al. Characterization and preparation of bio-tubular scaffolds for fabricating artificial vascular grafts by combining electrospinning and a 3D printing system. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (5), 2996-2999 (2015).
- Kim, I. G., et al. Tissue-Engineered Esophagus via Bioreactor Cultivation for Circumferential Esophageal Reconstruction. Tissue Engineering Part A. , (2019).
- Wu, Y., et al. Combinational effects of mechanical forces and substrate surface characteristics on esophageal epithelial differentiation. Journal of Biomedical Materials Research A. 107, 552-560 (2019).
- Jensen, T., et al. Polyurethane scaffolds seeded with autologous cells can regenerate long esophageal gaps: An esophageal atresia treatment model. Journal of Pediatric Surgery. 3468 (18), 30685-30687 (2018).
- Nakase, Y., et al. Intrathoracic esophageal replacement by in situ tissue-engineered esophagus. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 136 (4), 850-859 (2008).
- Kwiatek, M. A., et al. Mechanical properties of the esophagus in eosinophilic esophagitis. Gastroenterology. 140 (1), 82-90 (2011).
- Anjum, F., et al. Biocomposite nanofiber matrices to support ECM remodeling by human dermal progenitors and enhanced wound closure. Scientific Reports. 7 (1), 10291 (2017).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. PCL and PCL-gelatin nanofibers as esophageal tissue scaffolds: optimization, characterization and cell-matrix interactions. Journal of Biomedical Nanotechnology. 9 (9), 1540-1555 (2013).
