Summary
يشرح هذا البروتوكول كيفيه اعداد وتركيب العينات البكتيرية للتصوير الحي ثلاثي الابعاد وكيفيه أعاده بناء الشكل ثلاثي الابعاد من كولاي من تلك الصور.
Abstract
شكل البكتيريا مهم لعلم وظائف الجسم. يمكن ان يتاثر العديد من جوانب فسيولوجيا الخلية مثل حركيه الخلية ، والنهب ، وإنتاج بيوفيلم بشكل الخلية. الخلايا البكتيرية هي الكائنات ثلاثية الابعاد (3D) ، علي الرغم من انها نادرا ما تعامل علي هذا النحو. تؤدي معظم تقنيات المجهر إلى صور ثنائيه الابعاد (ثنائيه الابعاد) تؤدي إلى فقدان البيانات المتعلقة بشكل الخلية ثلاثية الابعاد الفعلي وتوطين البروتينات. بعض المعلمات الشكل ، مثل انحناء غاوسي (المنتج من التقوسات الرئيسية اثنين) ، يمكن فقط ان تقاس في 3D لان الصور 2D لا تقيس كل من تقوسات الرئيسية. بالاضافه إلى ذلك ، لا تقع جميع الخلايا مسطحه عند التركيب والتصوير ثنائي الابعاد للخلايا المنحنية قد لا تمثل بدقه اشكال هذه الخلايا. يمكن ان يساعد قياس توطين البروتين بدقه في 3D علي تحديد التنظيم المكاني ووظيفة البروتينات. وقد تم تطوير تقنيه التواء الاماميه التي تستخدم وظيفة طمس من المجهر لأعاده بناء الاشكال الخلية 3D وبدقه توطين البروتينات. هنا ، يتم وصف بروتوكول لاعداد وتركيب عينات لتصوير الخلايا الحية من البكتيريا في 3D علي حد سواء لأعاده بناء شكل خليه دقيقه وتوطين البروتينات. ويستند هذا الأسلوب علي اعداد عينه بسيطه ، واكتساب صوره الفلورسنت ، ومعالجه الصور المستندة إلى MATLAB. يمكن تعديل العديد من المجاهر الفلورية عاليه الجودة ببساطه لاتخاذ هذه القياسات. هذه أعاده بناء الخلايا هي مكثفه حسابيا والوصول إلى الموارد الحاسوبية عاليه الانتاجيه ويوصي ، وان لم يكن ضروريا. وقد تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح علي العديد من الأنواع البكتيرية والمسوخ ، وطرائق التصوير الفلوري ، ومصنعي المجهر.
Introduction
الخلايا من جميع الأنواع تنظيم الاشكال الخاصة بهم لوظائف محدده. علي سبيل المثال ، تتشكل الخلايا العصبية بطريقه مختلفه عن كريات الدم ولها وظائف مختلفه. المثل ، تاتي الخلايا البكتيرية في مجموعه متنوعة من الاشكال والاحجام ، علي الرغم من ان الغرض من هذه الاشكال لا يعرف دائما1،2. ولذلك ، فمن المهم ان يتم تحديد شكل الخلايا البكتيرية بدقه. توضح الطريقة الموضحة طريقه سهله التنفيذ لجمع البيانات المناسبة للتحليل ثلاثي الابعاد لمعظم الخلايا البكتيرية الحية أو الثابتة.
الطريقة الموصوفة تمكن المرء من التقاط صور ثلاثية الابعاد للخلايا البكتيرية من أجل تمثيل شكل الخلية ثلاثية الابعاد بدقه في العينة وتحديد البروتينات داخل هذه الاشكال بدقه. التقنيات المجهرية التقليدية تاخذ الصور 2D ، والتي هي إشكاليه عند دراسة الخلايا التي لها اشكال غير طبيعيه أو غير متناظرة ، مثل طفرات القولونية، أو البكتيريا المنحنية مثل الكوليرا والملوية بيلوري. في حين ان الصور ثلاثية الابعاد ذات الدقة العالية هي المدخل الرئيسي لهذا الأسلوب ، فان الأسلوب لا يرجع صوره محسنه للقرار. بدلا من ذلك ، هذا الأسلوب يعيد إنشاء إحداثيات السطح ثلاثي الابعاد وشكل الخلية باستخدام خوارزميه التواء إلى الامام باستخدام المعالم النشطة ووظيفة ضبابية واضحة للمجهر3 (الشكل 1). وقد استخدمت لدراسة البكتيريا الاكتين homolog mreb في e. القولونية4,5,6,7, الرواية periskeletal عنصر crva في كوليرا8, والمفترض bactofilin CcmA في الملوية بيلوري9 (الشكل 2).
يمكن لتوطين البروتينات إعطاء نظره ثاقبه في وظائفهم. علي سبيل المثال ، البروتينات المشاركة في تقسيم الخلايا عاده ما تكون مترجمه إلى الخلية الوسطي10،11. وقد أجريت دراسات عاليه الانتاجيه لتوطين جميع البروتينات من بكتيريا علي أمل الحصول علي نظره ثاقبه في وظائفهم12. لسوء الحظ ، تم اجراء هذه الدراسات مع التصوير 2D و 1D أو 2D التحليل ، مما يجعل من المستحيل لقياس جوانب محدده من توطين البروتين ، مثل التعريب إلى الميزات الهندسية الخلوية.
علي سبيل المثال ، يتم الافتراض بان البروتين الديناميكي المطلوب لشكل قضيب العديد من البكتيريا ، للعمل عن طريق توجيه توطين الخلية التوليف الجدار ، والتعريب لها الترجمة التعريب جدار الخلية التوليف7،13. الملوخية من أنواع متعددة يظهر الإثراء الهندسي4،6،7،14،15. البوليمرات السطحية الديناميكية ، مثل MreB ، قد زوجين هندسه السطح إلى الوقت المتوسط تخصيب الملف الشخصي16 وقد تكون قادره علي توجيه لهندسي محدده عن طريق التقليل من الطاقة المرتبطة بالربط إلى الغشاء17. في حين ان اهميه التواء ، والتجميع ، والانحناء ، والديناميكية لم يتم حلها بالبالكامل بالنسبة لشركه MreB ، من المهم ملاحظه ان القياسات الدقيقة لتقوسات الرئيسية للسطح تتطلب تمثيلا كاملا ثلاثي الابعاد للخلية. ولذلك ، لقياس أكثر دقه تقوسات التي البروتينات تعريب ، فمن التفضيلية لاستخدام 3D ، بدلا من التصوير 2D. التصوير ثلاثي الابعاد يلغي الحاجة إلى التقدير الحسابي لتلك التقوسات التي لا يمكن قياسها في 2D ، وهو تقدير قد لا يكون دقيقا في الخلايا غير المتناظرة18.
علي الرغم من ان التصوير ثنائي الابعاد للخلايا أسرع ولا يتطلب قدرا كبيرا من العمل الحسابي ، فان التصوير ثلاثي الابعاد يوفر تمثيلا أدق للخلية ، فضلا عن القدرة علي قياس الخصائص السطحية ، مثل الانحناء ، والتي لا يمكن قياسها في 2D. ولذلك ، كما يصبح التصوير ثلاثي الابعاد أكثر شيوعا ، سيصبح من الممكن رؤى جديده في شكل الخلية وتوطين البروتين.
Protocol
1. اعداد العينات
- جعل e. القولونية الفلورسنت للتصوير اما عن طريق الهندسة لهم للتعبير عن بروتين فلوري سيتوبلازمي6 أو باستخدام صبغ غشاء5. ويمكن استخدام الأنواع البكتيرية الأخرى بدلا من e. كولاي.
- تحويل الخلايا عن طريق الكهرباء مع البلازميد ان يشفر بروتين الفلورسنت mcherry سيتوبلازمي.
ملاحظه: يمكن استخدام البروتينات الفلورية المختلفة من ألوان الأخرى. - تنمو ترانسفورمانتس علي لوحه LB مع المضادات الحيوية المناسبة في 37 درجه مئوية. الحصول علي مستعمرات واحده وتحديد المستنسخات الايجابيه عن طريق المجهر. المستعمرات المقاومة للمضادات الحيوية التي تظهر حمراء تحت المجهر تحتوي علي البلازميد تحمل mcherry.
- تحويل الخلايا عن طريق الكهرباء مع البلازميد ان يشفر بروتين الفلورسنت mcherry سيتوبلازمي.
- تنمو 2 مل من الثقافة بين عشيه وضحيها في وسائل الاعلام السائل LB مع المضادات الحيوية المناسبة في 37 درجه مئوية في حاضنه الاهتزاز. استخدام اما مستعمره من لوحه أو كميه صغيره من الأسهم الفريزر كالعجان.
ملاحظه: استخدم الوسائط الضرورية للخلايا البكتيرية المحددة للتجربة. - الثقافة الفرعية الثقافة الليلية 1:1000 إلى 5 مل من وسائل الاعلام الطازجة LB والسماح للخلايا تنمو إلى المرحلة الاسيه في 37 درجه مئوية في حاضنه تهتز ل 3 − 4 ح. قياس600 OD من الخلايا للتاكد من انها في المرحلة الاسيه (اي ، OD600 = 0.2 − 0.4).
ملاحظه: يمكن اجراء التصوير في اي مرحله نمو اعتمادا علي التجربة التي يتم تنفيذها.
2. اعداد الشريحة
ملاحظه: من المهم استخدام وسائل الاعلام التي لديها انخفاض الفلورية. اي المتوسطة التي لديها انخفاض الفلورية يمكن استخدامها. في هذه التجربة ، 1 ٪ اجنشا M63 الحد الأدنى من منصات الوسائط وختم مع VaLaP19 مطلوب لخلايا الصورة في 3d.
-
اعداد محلول 1 ٪ من اجنشا في 20 مل من وسائل الاعلام الحد الأدنى.
- الميكروويف الحل حتى يتم حلها تماما والحل يبدو واضحا.
- الحفاظ علي الحل في حمام ماء 60 درجه مئوية حتى تصبح جاهزه للاستخدام.
ملاحظه: هذا الحل يمكن ان تكون عززت وذابت حسب الحاجة أو يمكن نقلها إلى كميات أصغر التي ذابت حسب الحاجة. بعد استخدامات متعددة قد تصبح الوسائط مشوه ويجب استبدالها.
- تذوب VaLaP تسرب علي صفيحه ساخنه في 80 − 100 درجه مئوية.
ملاحظه: اعداد VaLaP ، لاستخدامها كماده مانعه للتسرب ، عن طريق ذوبان 50 g كل من هلام البترول ، lanolin ، والبارافين معا في كوب علي صفيحه ساخنه في 80 − 100 درجه مئوية. هذا كميه كبيره من VaLaP يمكن تخزينها في درجه حرارة الغرفة إلى أجل غير مسمي ، وسوف يكون كافيا ل > 500 الشرائح. التدفئة في > 100 درجه مئوية سوف يسبب لها ان تتحلل ولونه سوف تغميق. - وضع اثنين من مداخن كل من 3 20 مم × 20 مم الغطاء ينزلق علي نهايات المعاكس للشريحة (سته مجموع الشفتين).
- ماصه 200 μL من محلول الوسادة اجنشا علي الشريحة.
ملاحظه: في حاله عدم استخدام وصمه الفلورسنت المهندسة ، يمكن أضافه صبغه غشائية إلى محلول الوسادة قبل هذه الخطوة. أعاده تعليق الصبغة في الماء وأضافه صبغه إلى 1 مل من محلول الوسادة التي نشات للتركيز النهائي من 5 ميكروغرام/مل. - علي الفور وبحزم وضع الشريحة الثانية لأسفل علي كومه من زلة الغطاء لتسطيح أجار والسماح لها يصلب لمده 1 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
- الشريحة بعناية قباله الشريحة العليا.
- استخدم الطرف الكبير من طرف ماصه 200 μL لقطع الوسادات الفردية من الجل (قطرها 5 مم تقريبا) علي الشريحة وتخلص من الهلام التالف أو غير الضروري.
ملاحظه: إذا كانت الصور متعددة السلالات أو الظروف ، ستكون هناك حاجه إلى لوحه منفصلة لكل واحد. إذا كانت سلاله واحده فقط هي ان تكون غير المسنين ، وجعل 3 − 4 منصات للمساعدة في دعم coverslip. - خلايا الماصة لاعلي ولأسفل عده مرات لتعطيل كتل الخلايا وضمان الثقافة مختلطة بشكل جيد. ماصه 1 μL من الثقافة الفرعية من الخطوة 1.3 علي لوحه.
ملاحظه: تتطلب أعاده بناء شكل الخلية خلايا فرديه لا تلامس الخلايا الأخرى. إذا كان استخدام المرحلة ثابته أو عاليه كثافة الخلايا الثقافات ، قد يكون من الضروري تمييع عينه 1:10 قبل وضعه علي لوحه. - السماح للهواء العينة الجافة لمده 5 − 10 دقيقه. تاكد من امتصاص القطرة بالبالكامل في الوسادة. إذا بقي اي سائل ، فان الخلايا تتحرك حولها في السائل ولا يمكن ان يكون العمر.
- وضع زلة غطاء علي القمه من منصات.
- ختم زلة الغطاء مع VaLaP ذاب بالفرشاة بلطف حول حافه زلة الغطاء مع مسحه من القطن. تاكد من إبقائه بعيدا عن اعلي زلة الغطاء حيث سيتم لمس الهدف. سوف VaLaP تتصلب في غضون ثوان ، وختم العينة.
- صوره علي الفور العينة.
ملاحظه: يجب ان تكون العينة غير المسنين بمجرد اعداد الشريحة. الخلايا يمكن ان تنمو علي منصات ، وإذا كانت تقسم أعاده الإنشاءات سيكون أكثر صعوبة.
3. متطلبات imaging
- تاكد من ان محور z أو التركيز من المجهر يمكن ان تجعل حركات دقيقه اقل من 50 نانومتر. استخدام مراحل z بيزو (انظر جدول المواد) ، وهي متاحه علي المجاهر الصف البحوث ، لان أجهزه التركيز الميكانيكية النموذجية غير قادره علي توفير هذه الدقة.
ملاحظه: علي افتراض معيار أخذ العينات نيكويست-شانون20، واحد يحتاج إلى ان يكون القدرة علي نقل 0.5 x أصغر حجم الخطوة المطلوبة ، أو 2x التردد المكاني المطلوب. بالنسبة للخطوات 100 nm اللازمة في هذا البروتوكول ، مطلوب مرحله بدقه 50 نانومتر أو اقل. -
تاكد من ان المجهر يحتوي علي هدف 100x مع الحد الأدنى من الفتحة العددية (NA) من 1.45.
- جمع الأكوام z من بين 200 − 400 خلايا مختلفه لضمان الحصول علي ما يكفي من الخلايا للتطبيقات المصب.
ملاحظه: يعتمد عدد الخلايا المطلوبة علي التغير الأساسي لعينه الفائدة. بعض الخلايا التي تم جمعها في هذه المرحلة لن تجعل من خلال خطوات أعاده البناء.
- جمع الأكوام z من بين 200 − 400 خلايا مختلفه لضمان الحصول علي ما يكفي من الخلايا للتطبيقات المصب.
- تاكد من ان المكدس z يطابق الإعدادات المستخدمة لقناه الشكل إذا تم قياس قناه فلورية ثانويه (البروتين ، التسمية الايضيه ، الخ).
4-التصوير
- ادراج الشريحة مختومه علي المجهر والسماح لها الجلوس لمده 5 دقائق لتتوازن درجه الحرارة مع المناطق المحيطة بها ، لان غرفه المجهر قد تكون في درجه حرارة مختلفه من غرفه اعداد عينه.
-
خذ الفلورسنت z-كومه من العينة.
ملاحظه: يجب ان المكدس z تغطيه العينة بالبالكامل مع تباعد z اقل من عمق الحقل. ل 1.45 NA 100x الهدف و ~ 1 ميكرون سميكه e. القولونية الخلايا ، 40 الخطوات في 100 nm لكل خطوه العمل بشكل جيد. بالنسبة للخلايا أو الخلايا الكبيرة التي لا تقع بشكل مسطح تماما علي السطح ، قد يكون من الضروري 50 أو أكثر من الخطوات. تضمين خطوات كافيه والتاكد من ان العينة غير واضحة تماما أعلاه وتحتها.- استخدام البرنامج المرتبط بالمجهر (انظر جدول المواد) للسيطرة علي المجهر.
- التركيز علي منتصف الخلية باستخدام عجلات التركيز المجهر. تحت الاستحواذ ND تحقق من مربع z لاتخاذ z-كومه. انقر فوق زر الصفحة الرئيسية لتعيين منتصف الخلية كنقطه البداية. تعيين حجم الخطوة إلى 0.1 μm وتعيين النطاق إلى 4 μm. تاكد من تعيين الجهاز Z إلى المرحلة بيزو.
- تعيين القناات الفلورية تحت نافذه لأمدا إلى الإعدادات لجزيئات الفلورسنت يجري imaged. في هذه التجربة تم استخدام GFP و mCherry.
ملاحظه: خذ كومه z اضافيه مع نفس حجم الخطوة ونطاقها في القناة اللونية الثانية إذا رغبت في التوزيع ثلاثي الابعاد لقناه فلورية اضافيه. في هذه التجربة ، تم استخدام mCherry سيتوبلازمي لتحديد شكل الخلية واستخدمت Mcherry-GFP كقناة اللون الثاني21. - تاكد من تعيين ترتيب التجربة إلى لأمدا (سلسله z) بحيث سيستغرق مكدس z كامله في كل قناه اللون قبل التبديل.
- انقر فوق تشغيل الآن لبدء الحصول علي الصورة وحفظ الملف onece واحد أو كليهما z-مكدسات كامله.
- الانتقال إلى منطقه جديده علي لوحه وكرر الخطوات 4.2.2-4.2.5.
5. أعاده بناء الخلايا
- اقتصاص الخلايا الفردية وحفظ الصور كملف tiff مكدس بحيث توجد خليه واحده فقط لكل ملف. تاكد من ان هذه الخلية معزولة جيدا عن اي خلايا أخرى (اي تقريبا 5x نصف العرض الكامل لوظيفة التعتيم في xy.
ملاحظه: يمكن القيام بذلك باستخدام برنامج تحليل الصور المتاحة بحريه (انظر جدول المواد).- رسم مربع حول خليه فرديه وتكرار تلك الخلية 2x ، مره واحده لكل قناه. تاكد من تحديد مربع المكدس الزائد المكرر وتغيير القناة إلى اما 1 أو 2 ، مع التاكد من ان الشرائح تتضمن المكدس z بأكمله.
ملاحظه: إذا كان التصوير فقط علي شكل الخلايا وليس بروتين فلوري إضافي ، فان قناه واحده فقط ستكون موجودة. - مره واحده كل مكدسات متاحه انتقل إلى الصور | مكدسات | الاداات | سلسله للجمع بين الصور مع قناه البروتين أولا وقناه الشكل الثانية.
- حفظ الصورة الجديدة كملف tiff.
- رسم مربع حول خليه فرديه وتكرار تلك الخلية 2x ، مره واحده لكل قناه. تاكد من تحديد مربع المكدس الزائد المكرر وتغيير القناة إلى اما 1 أو 2 ، مع التاكد من ان الشرائح تتضمن المكدس z بأكمله.
- قياس وظيفة طمس المجهر باستخدام الانكسار المحدودة الخرز الفلورسنت22. هذا يحتاج إلى القيام به لكل المجهر والمجهر الهدف ولكن يمكن ان يؤديها قبل أو بعد التصوير عينات من الفائدة.
- متوسط معا عده حبات مستقله مع بعض التدخل اليدوي باستخدام البرمجيات المتاحة (انظر جدول المواد).
ملاحظه: يجب ان يكون المنتج النهائي صوره ثلاثية الابعاد لوظيفة التعتيم بنفس التباعد xyz مثل عينات الفائدة.
- متوسط معا عده حبات مستقله مع بعض التدخل اليدوي باستخدام البرمجيات المتاحة (انظر جدول المواد).
- تشغيل البرامج النصية أعاده بناء شكل خليه التواء إلى الامام باستخدام البرنامج المتوفر. يمكن تحميل أحدث إصدار من هذه البرامج النصية بحريه من https://github.com/PrincetonUniversity/shae-cellshape-public.
- قم بعمل مجلد داخل مجلد علي سطح المكتب يحتوي علي الصور التي تم اقتصاصها والملف cell_shape_settings_tri من shae-cellshape-عام/exampleData_tri.
- قم بتحرير cell_shape_setting_tri للحصول علي الإعدادات الصحيحة لتجربه الفائدة. بالنسبة لهذه التجربة ، يتضمن ملف الإعدادات الأسطر التالية:
nm_per_pixel 70
Z_scale 0.65
stack_z_size 41
stack_t_size 1
Fstack_z_size 41
Fstack_t_size 1
stack_seperation_nm 100
Fstack_seperation_nm 100
psfScript-999 osuPSF20180726
تدرج 1
ملاحظه: يتم تنظيم هذا الملف النصي في المقاطع ويتم تحليل كل مقطع إلى المتغير الخاص به. في حين ان العديد من الإعدادات لا تحتاج إلى تغيير من التجربة إلى التجربة ، يجب علي المرء التاكد من ان حجم المكدس z (stack_z_size للشكل ، Fstack_z_size للبروتين من الفائدة) ، التباعد من المكدس z (stack_seperation_ nm، Fstack_seperation_nm) ، والتحول البؤري النسبي من المجهر (Z_scale)23، وحجم بكسل في xy (nm_per_pixel) ، واسم البرنامج النصي الذي يحمل وظيفة طمس المجهر (psfscript ) تطابق التجربة. يجب تعيين حقل التدرج إلى 1 إذا كانت قناه الشكل ممتلئة سيتوبلاسميكالي و 0 إذا كانت كائنا ملطخا بالغشاء. - تشغيل Cell_shape_detector3dConvTriFolder الدالة (shae-cellshape-العام/Cellشابيدتكتوريتري/) مع السلسلة إلى موقع المجلد متبوعا برقم الخلية لبدء تشغيل ، وعدد الخلايا التي تريد تشغيلها.
ملاحظه: سيبدو مثال للإدخال كما يلي: Cell_shape_detector3dConvTriFolder (' المسار إلى المجلد مع الصور التي تم اقتصاصها ' ، بدء الفهرس في المجلد ، # الخلايا). قد تستغرق الخلية النموذجية ما بين 5 − 20 دقيقه لأعاده البناء إلى التقارب والانتهاء.
- شاشه أعاده بناء الخلايا للتاكد من انها صحيحه قبل استخدام الخلايا لأي تحليل إحصائي.
- تشغيل الشاشات (shae-cellshape-العام/Shae-fitViewerGui/) لعرض بصريا أعاده بناء الخلايا الفردية.
- انقر فوق زر تحديد المجلد عند فتح واجهه المستخدم الرسوميه (GUI) ، ثم حدد المجلد مع ملفات بيانات أعاده الإنشاء (TRI. حصيره) التي تم إنشاؤها في الخطوة 5.3.
- حدد المربع المجاور لأعاده إنشاء الخلية إذا ظهرت خليه مشوه أو لم تتلاقي بشكل كامل (الشكل 3). هذا يمكن ان يبدو وكانه خليه مع ثقب ، والجانب المسطح ، أو فرع الخروج منه. سيؤدي هذا إلى إلحاق "العلم" باسم الملف بحيث يمكن استبعاده من اي تحليل المصب.
ملاحظه: يمكن مقارنه الخلية التي أعيد بناؤها بالصور الاصليه. وهذا يمكن ان يكون مهما بشكل خاص إذا كانت الخلايا الخاصة بك تاتي من العديد من السكان غير متجانس من الاشكال.
- تشغيل انريتشمينتسموثينجسبليني (shae-cellshape-العامة/) لإنشاء ملف إثراء التركيز النسبي للبروتين من الفائدة كداله لانحناء غوسيه علي السطح.
- حدد كل مجلد باستخدام ملفات ثلاثية ال5.3.3 تم إنشاؤها في الخطوة.
- حدد الملف المنحني (5.5.1) الذي تم إنشاؤه حديثا.
ملاحظه: سيتم إنشاء ملف منحني. حصيره لكل مجلد تم تحديده في 5.5.1. ستعرض جميع نبذات الإثراء علي رسم بياني واحد. إذا كانت الرسومات البيانية الفردية مطلوبه من تشغيل 5.5 لكل مجلد.
ملاحظه: بالاضافه إلى التوطين الهندسي الدقيق للبروتين الفلوري ، هناك العديد من الطرق الأخرى لتحليل البيانات من القناة الثانوية ، بما في ذلك عد عدد وحجم واتجاه الكائنات4.
Representative Results
البكتيريا تاتي في مجموعه واسعه من الاشكال والاحجام التي قد تحدد وظائفها في الطبيعة1. ونتيجة هذا الاجراء هي تمثيل ثلاثي الابعاد دقيق للخلايا من التواء الاماميه لكومه z من الصور (الشكل 1). هذا الأسلوب مهم بشكل خاص عند التعامل مع الخلايا المنحنية (الشكل 2) ، أو مع خلايا علي شكل غير طبيعي (الشكل 4ا) ، كما لا يعكس تمثيل 2d انحناء الخلايا بدقه. من أجل استخدام طريقه التواء الاماميه (الشكل 1ا) ، يجب ان تكون الخلايا اما ملطخه بالمحيطيا أو ان يكون لديها وصمه الخلوية (الشكل 2ب اليسار مقابل اليمين).
يظهر الشكل 4 توطين المحارب في الخلية. وقد تم الانصهار gfp إلى البروتين الاكتين البكتيرية mreb21 من أجل دراسة التعريب الدقيق في كل من نوع البرية ومتحولة e. القولونية الخلايا4. لأنه يرتبط بالغشاء ، فان التصوير ثلاثي الابعاد مطلوب لأعاده إنتاج موضعه بإخلاص في الخلية. من خلال جعل هذه القياسات في 3D ، تمكنا من أعاده بناء الاشكال من كل من النوع البري والخلايا المتحولة Rodz (الشكل 4ا). وقد تبين ان توطين MreB قد اثري في تقوسات الصغيرة ، وهي ميزه هندسية لا يمكن قياسها الا بالابعاد الثلاثية ، بطريقه تعتمد علي RodZ (الشكل 4ب).
الشكل 1: يعيد أسلوب التواء إلى الامام الخلايا بدون معرفه مسبقه بشكل الخلية. (ا) الناتج النهائي للأسلوب هو أعاده بناء خليه ثلاثية الابعاد مشتقه بمقارنه شكل الاختبار بوظيفة التعتيم المعايرة الخاصة بالمجهر. ويقارن هذا الأمر بالمكدس z الملاحظ حتى تتطابق الصورة الثلاثية الابعاد الملاحظة مع الشكل الافتراضي. الصورة المعروضة هنا هو تجسيد لأعاده بناء خليه واحده c. كريسينتوس . (ب) يستكمل خط أنابيب التعمير بشكل متكرر المواضع المقدرة للعناصر السطحية استنادا إلى رصه الصورة المرصودة. للحصول علي تفاصيل حسابيه كامله للأسلوب ، راجع نغوين3. (ج) يبدا خط التعمير بدون معرفه مسبقه بشكل الخلية ويستكمل الموقع وعدد القمم السطحية ليطابق الكومة z الملحوظة. تظهر الصور التمثيلية من كل 30 خطوه خلال عمليه أعاده الاعمار ثلاثية الابعاد من ثلاث زوايا مختلفه للخلية كوليرا . يتم تحديث المواضع السطحية لهذا الشكل لتقليل الفرق بين المكدسات التي تمت محاكاتها والتي تمت مراقبتها. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: أعاده البناء التمثيلي ثلاثي الابعاد لثلاثه أنواع مختلفه من البكتيريا التي تتشكل. ويمكن اجراء أعاده البناء ثلاثية الابعاد من الخلايا مع غشاء الملونة (اليسار) أو مليئه فلوكوفيري السيتوبلازمي (الحق). شكل وانحناء الخلية البداية ليست مهمة ، كما قضيب عازمه ، قضيب الملتوية ، أو قضيب مستقيم كلها قادره علي ان يعاد بناؤها بدقه. ويتم تلوين الأسطح المعاد بناؤها علي أساس انحناء غوسيه المحلي للسطح. شريط مقياس = 1 μm. الرجاء النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: يمكن ان تفشل أعاده الإنشاءات لأسباب متعددة. ويجب فحص الخلايا للتاكد من ان خوارزميه أعاده البناء متقاربة إلى نتيجة معقولة. اليسار = نوع البرية ممثل (اعلي) و Rodz متحولة (أسفل) e. القولونية الخلايا التي مرت مراقبه الجودة. الحق = الخلايا التي فشلت في أعاده بناء بشكل صحيح ولم يمر مراقبه الجودة. وتظهر خمس فئات من التقارب الفاشل: ' 1 ' الخلايا القريبة جدا من حافه منطقه الزراعة التي تؤدي إلى ترسيم حاد ، ' 2 ' خلايا قريبه جدا من خليه أخرى ، ' 3 ' الخلايا التي أنتجت الكريات ، ' 4 ' الخلايا التي لم تمضي في الفترة الاولي نقطه التارتينغ ، و (v) أخطاء أخرى غير معروفه. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: بيانات تمثيليه تبين توطين البروتين لهندسي الخلوية المحددة. (ا) ثلاثه ابعاد الخلايا التي أعيد بناؤها من نوع البرية و rodz e. القولونية الخلايا مع انحناء غوسيه وكثافة الفلورية mreb عرض. شريط مقياس = 1 μm. (ب) قطع التخصيب من النوع البري والخلايا القولونية . وتظهر القيم > 1 الإثراء والقيم < 1 التي تظهر نضوب MreB من هذه المناطق الخلوية بالنسبة للتغطية الموحدة للخلية. المناطق المظللة تشير إلى متوسط ± 90 ٪ الفاصل الثقة التمهيد من الوسط. منحني كل سلاله هو شريحة تجانس مكعب ويتم اقتطاعها باستخدام عتبه احتمال لتقوسات المدقع من p > 5 x 10-3. وقد تم تعديل هذا الرقم من (براتون وآخرون) 4. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Discussion
ومن الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول الحصول علي صور عاليه الجودة. لأعاده بناء الخلايا بشكل صحيح ، يجب ان يكون هناك ما يكفي من عدم الوضوح فوق وتحت الخلية. ولذلك ، فانه من الضروري ان المكدس z المتخذة يغطي مسافة كبيره بما فيه الكفاية. يمكن تعديل عدد الخطوات المتخذة اثناء الحصول علي الصورة لكل سلاله. علي سبيل المثال ، الخلايا e. القولونية المحذوفة ل rodz هي أوسع وتتطلب المزيد من الخطوات ، التالي ، مسافة أكبر من الخلايا نوع البرية. إذا كانت العينة الانجرافات اثناء اكتساب الصورة ، وأعاده الاعمار يمكن ان يكون لها أخطاء كبيره. ولذلك ، فمن المهم ان ندع الشريحة تاتي إلى التوازن الحراري مع المجهر قبل التصوير لتجنب الانجراف خلال اكتساب z-كومه. يجب ان تكون الخلايا غير المصابين علي منصات مع انخفاض الفلورية. مكونات الوسائط ، مثل تلك الموجودة في متوسط LB الشائعة ، لها الفلورية التي يمكن ان تسبب مشاكل عند محاولة أعاده بناء الخلايا. كثافة الخلايا علي لوحه التصوير مهم لان عمليه أعاده البناء يتم تنفيذها بشكل مستقل علي كل خليه. عدد قليل جدا من الخلايا سوف تزيد من الوقت اللازم للحصول علي صور لعدد كاف من الخلايا ، في حين ان العديد من الخلايا سوف يؤدي إلى حقول التصوير التي هي كثيفه جدا لزراعه الخلايا الفردية بسهوله. ونظرا لعدم أعاده بناء جميع الخلايا بشكل صحيح ، ينبغي ان تكون الخلايا الاضافيه غير موجودة اثناء مرحله الاقتناء وينبغي فرز جميع النواتج قبل المضي قدما في التحليل الإحصائي (الشكل 3).
العديد من القيود لهذه الطريقة التقنية. علي المجهر لاستخدامها ، يجب علي المرء ان يكون الهدف الذي لديه فتحه رقميه عاليه (عاده > 1.4) ، لان هذا يتيح التقطيع البصرية علي نطاق حجم البكتيريا. بالاضافه إلى ذلك ، يجب ان تكون مجهزه المجهر مع مرحله بيزو التي يمكن ان تتخذ خطوات صغيره ودقيقه في الاتجاه z. وعلاوة علي ذلك ، في حين انه ليس من الضروري ، ينصح بشده الوصول إلى الموارد الحسابية عاليه الانتاجيه لتشغيل برنامج تحليل الصور لأنه سيتم تقليل وقت المعالجة لأعاده بناء الخلايا.
أحد القيود المفاهيمية للأسلوب هو انه يجب اختيار موازين الطاقة الصحيحة لترجيح نعومه البناء بالنسبة لمعدل الاشاره إلى الضوضاء للصور. للتحقق من اختيار المعلمات ، يجب قياس احجام واشكال الخلايا باستخدام أساليب مستقله مثل المجهر الكترون الإرسال (TEM) أو المجهر القوه الذرية (فؤاد). وكدليل علي المبدا ، تم اجراء أعاده بناء الخلايا ثلاثية الابعاد اما علي فؤاد لاختبار دقه z (< 50 نانومتر) أو علي شبكه TEM لاختبار دقه xy (< 30 نانومتر)3. وهذا النهج المترابط يستغرق وقتا طويلا ومكلفا. وقد يكون النهج الأبسط لصوره عينات قياسيه مثل الخلايا نوع البرية أو 1 μm الخرز كرويه. ويمكن استخدام القطر والكروية لأعاده البناء لضمان صحة الحجم وموازين الطاقة المستخدمة في أعاده الاعمار.
هذه ليست الطريقة الوحيدة التي تسعي لاستخراج المعلومات المكانية عاليه الدقة من الصور المجهرية الفلورية. العديد من المقالات الاستعراضية تصف التطورات الاخيره في مجال المجهر الفائق24،25. تقنيات تعزيز القرار مثل تفكيك المجهر26، الغزل القرص المجهر البؤري27، أعاده تعيين بكسل28، والمجهر الاضاءه المهيكلة (SIM)29 تسعي لتحسين القرار من صور التي حصلت عليها المجهر. وهذه الأساليب لا تتنافى مع النهج المقدم. مؤخرا تم تكييف هذه الطريقة للسماح للصور المستندة إلى SIM كمدخلات9. في حين ان طريقه التواء إلى الامام تشترك في بعض الدعائم مع المجهر غير الحلزوني ، فانه يحتوي علي مخرجات مختلفه تماما. في حين ان النهج مثل تفكيك المجهر تسعي إلى تحسين القرار من الصورة ، وهذا النهج لا تولد صوره ولكن بدلا من أعاده بناء شكل خليه مع دقه 50 نانومتر تقريبا. ويمكن لتقنيات المجهر النشط أحاديه الجزيء التي تعتمد علي عينات قليله التسمية ان توفر مستويات اعلي من الدقة المكانية من هذه الطريقة. في كثير من الحالات ، وهذه النهج جزيء واحد يتطلب الاستفادة المثلي من ثوابت الفلورسنت ويمكن ان تتطلب وقتا طويلا الاستحواذ ، مما يجعلها صعبه الاستخدام مع عينات حيه أو ديناميكية. كل من هذه الطرق ياتي مع تحذير واحد أو أكثر ان هذا الأسلوب لا. علي سبيل المثال, الفوائد المعلن عنها من قبل الغزل القرص المجهر البؤري ليست كما تنطبق علي أحاديه الخلايا البكتيرية, حيث لا يوجد الكثير من ضوء الطائرة. وعلاوة علي ذلك ، يوفر هذا الأسلوب خط أنابيب للحصول علي الاشكال الخلية 3D دقيقه وتوطين البروتين دون الحاجة إلى اي فلوبهورس المتخصصة. هذا الأسلوب لديه الحد الأدنى من متطلبات الاجهزه (اي ، z بيزو ، عاليه الهدف NA) ويتطلب سوي عشرات الصور في الوقت الواحد ، مما يسمح للمرء ان التحقيق بسهوله الهياكل 3D ديناميكية6.
وهناك عدد متزايد من النهج لدراسة تنظيم الخلايا البكتيرية في الهياكل ثلاثية الابعاد. وتشمل هذه النهج المفاهيمي مماثله لهذه التي تستفيد من جوده عاليه, 3d الصور الفلورية30,31,32. يتطلب هذا النهج خلايا معزولة جيدا ولا يجعل الافتراضات المسبقة حول الهندسة الخلوية. ومع ذلك ، للانتقال إلى المجاميع الخلوية الكثيفة أو الاغشيه البيولوجية ، يفترض ان تكون الخلايا مثل قضيب. يتيح هذا العرض الأقل دقه امكانيه التحقق من ترتيبات التعبئة للخلايا ، علي الرغم من ان الكثافة العالية للخلايا في البيوفيلم تمنع تحليل التعريب الخلوي لعوامل محدده.
في المستقبل ، قد يكون من المثير للاهتمام لوضع اطار لدمج جزيء واحد ونهج واسعه المجال مع هذه التقنية 3D أعاده البناء. وعلاوة علي ذلك ، قد يكون من الممكن ادراج هذا النهج التواء إلى الامام مع أدوات تقسيم الرؤية اليه32 للسماح باعاده بناء مجموعات خلايا أكثر كثافة.
لماذا تطورت الخلايا إلى اشكال محدده هي قضية معقده يجب ان تعكس البيئة المعقدة التي يعيشون فيها. يتطلب فهم تطور ووظيفة اشكال الخلايا أخذ قياسات دقيقه ودقيقه لتلك الاشكال ، وهو ما يوفره هذا الأسلوب.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
ونود ان نشكر جيفري نغوين وجوشوا شاهيفيتز للمساعدة في تطوير هذه الطريقة.
التمويل: RMM-المعاهد القومية للصحة F32 GM103290-01A1 ، BPB-مركز غلين للبحوث الشيخوخة ومؤسسه العلوم الوطنية في 1734030.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 nm fluorescent beads | Invitrogen | F8795 | these are used to measure the blurring function of the microscope |
| Agarose | sigma-Aldrich | A9539 | |
| Cotton Swab | Puritan Medical Products Company LLC | S304659 | used to appy VaLaP |
| Cover Slips | VWR | 16004-302 | |
| Fiji | ImageJ | https://fiji.sc | used to cro cells |
| FM4-64 | Invitrogen | LST3166 | membrane dye used to stain cells |
| Huygens Software | Scientific Volume Imaging | Huygens essential or professional | Use to measure blurring function of microscope |
| Lanolin | Sigma-Aldrich | L7387 | combine with paraffin and petroleum jelly to make VaLaP |
| LB growth medium | BD Difco | DF0446173 | |
| M63 medium | US Biological | M1015 | |
| MATLAB | Mathworks | Needed to run forward convolution scripts | |
| Microscope Slides | Fisher | 12-550-133 | |
| NIS Elements | Nkon | ||
| Paraffin | Sigma-Aldrich | 327212 | |
| Petroleum Jelly | Equate | 49035-038-27 | |
| Piezo z stage | Nikon | 77011589 | |
| Pipet tips -p200 | USA Scientific | 1111-0730 | |
| Pipet tips- p10 | USA Scientific | 1111-3730 |
References
- Young, K. D. The Selective Value of Bacterial Shape. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 70 (3), 660-703 (2006).
- Persat, A., Stone, H. A., Gitai, Z. The Curved Shape of Caulobacter crescentus Enhances Surface Colonization in Flow. Nature Communications. 5, 3824 (2014).
- Nguyen, J. P., Bratton, B. P., Shaevitz, J. W. Bacterial Cell Wall Homeostasis: Methods and Protocols. Hong, H. J. , Springer. New York. 227-245 (2016).
- Bratton, B. P., Shaevitz, J. W., Gitai, Z., Morgenstein, R. M. MreB Polymers and Curvature Localization are Enhanced by RodZ and Predict E. coli's Cylindrical Uniformity. Nature Communications. 9 (1), 2797 (2018).
- Ouzounov, N., et al. MreB Orientation Correlates with Cell Diameter in Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (5), 1035-1043 (2016).
- Morgenstein, R. M., et al. RodZ links MreB to Cell Wall Synthesis to Mediate MreB rotation and Robust Morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 12510-12515 (2015).
- Ursell, T. S., et al. Rod-Like Bacterial Shape is Maintained by Feedback Between Cell Curvature and Cytoskeletal Localization. Proceeding of the National Academy of Science U.S.A. 111 (11), E1025-E1034 (2014).
- Bartlett, T. M., et al. A Periplasmic Polymer Curves Vibrio cholerae and Promotes Pathogenesis. Cell. 168 (1-2), 172-185 (2017).
- Taylor, J. A., et al. Distinct Cytoskeletal Proteins Define Zones of Enhanced Cell Wall Synthesis in Helicobacter pylori. bioRxiv. , 545517 (2019).
- Egan, A. J. F., Vollmer, W. The Physiology of Bacterial Cell Division. Annals of the New York Academy of Science. 1277 (1), 8-28 (2013).
- Adams, D. W., Errington, J. Bacterial Cell Division: Assembly, Maintenance and Disassembly of the Z ring. Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 642-653 (2009).
- Werner, J. N., Gitai, Z., Melvin, I. S., Brian, R. C., Alexandrine, C. High-Throughput Screening of Bacterial Protein Localization. Methods in Enzymology. 471, 185-204 (2010).
- de Pedro, M. A., Quintela, J. C., Höltje, J. V., Schwarz, H. Murein Segregation in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 179 (9), 2823-2834 (1997).
- Hussain, S., et al. MreB Filaments Align Along Greatest Principal Membrane Curvature to Orient Cell Wall Synthesis. eLife. 7, e32471 (2018).
- Wong, F., et al. Mechanical Strain Sensing Implicated in Cell Shape Recovery in Escherichia coli. Nature Microbiology. 2, 17115 (2017).
- Wong, F., Garner, E. C., Amir, A. Mechanics and Dynamics of Translocating MreB Filaments on Curved Membranes. eLife. 8, e40472 (2019).
- Quint, D. A., Gopinathan, A., Grason, G. M. Shape Selection of Surface-Bound Helical Filaments: Biopolymers on Curved Membranes. Biophysical Journal. 111 (7), 1575-1585 (2016).
- Colavin, A., Shi, H., Huang, K. C. RodZ Modulates Geometric Localization of the Bacterial Actin MreB to Regulate Cell Shape. Nature Communications. 9 (1), 1280 (2018).
- Valap Sealant. , Cold Spring Harbor Protocols. http://cshprotocols.cshlp.org/content/2015/2/pdb.rec082917 (2015).
- Shannon, C. E. Communication in the Presence of Noise. Proceedings of the IRE. 37 (1), 10-21 (1949).
- Billings, G., et al. De Novo Morphogenesis in L-Forms Via Geometric Control of Cell Growth. Mol Microbiol. 93 (5), 883-896 (2014).
- Sturrman, N. Measuring a Point Spread Function. , iBiology. https://www.ibiology.org/talks/measuring-a-point-spread-function (2012).
- Bratton, B. P., Shaevitz, J. W. Simple Experimental Methods for Determining the Apparent Focal Shift in a Microscope System. PLOS ONE. 10 (8), e0134616 (2015).
- Moerner, W. E., Shechtman, Y., Wang, Q. Single-molecule Spectroscopy and Imaging over the decades. Faraday Discussions. 184, 9-36 (2015).
- Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. Fluorescence Nanoscopy in Cell Biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18, 685 (2017).
- Sarder, P., Nehorai, A. Deconvolution Methods for 3-D Fluorescence Microscopy Images. IEEE Signal Processing Magazine. 23 (3), 32-45 (2006).
- Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Methods in Cell Biology. Waters, J. C., Wittman, T. 123, Academic Press. 153-175 (2014).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, 1205 (2015).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the Lateral Resolution Limit by a Factor of Two Using Structured Illumination Microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Lee, M. K., Rai, P., Williams, J., Twieg, R. J., Moerner, W. E. Small-Molecule Labeling of Live Cell Surfaces for Three-Dimensional Super-Resolution Microscopy. Journal of the American Chemical Society. 136 (40), 14003-14006 (2014).
- Yan, J., Sharo, A. G., Stone, H. A., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. Vibrio cholerae Biofilm Growth Program and Architecture Revealed by Single-Cell Live Imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), E5337-E5343 (2016).
- Wang, J., et al. Bact-3D: A level set segmentation approach for dense multi-layered 3D bacterial biofilms. 2017 IEEE International Conference on Image Processing (ICIP). , 330-334 (2017).
